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第59讲　基因工程的基本工具和
基本操作程序
[课标要求]
1.概述基因工程是在遗传学、微生物学、生物化学和分子生物学等学科基础上发展而来的。
2.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。
3.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测鉴定等步骤。
4.活动:DNA的提取和鉴定。
5.活动:利用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段并完成电泳鉴定,或运用软件进行虚拟PCR实验。
考点一
基因工程的基本工具
1.基因工程的概念
基础知识·整合
目的基因
基因重组
分子
2.基因工程的基本工具
(1)限制性内切核酸酶(也称“限制酶”)。
磷酸二酯键
黏性末端
(2)DNA连接酶。
磷酸二酯键
黏性末端
黏性末端
(3)载体。
质粒
限制酶切割位点
深挖教材
1.判断正误
(1)(选择性必修3 P71正文)切割质粒的限制性内切核酸酶均能特异性地识别6个核苷酸序列。(　　)
×
【提示】 大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成,也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。
(2)(选择性必修3 P72正文)限制性内切核酸酶能识别特定的核苷酸序列,而DNA连接酶不能识别。(　　)
(3)(选择性必修3 P72正文)常用E.coli DNA连接酶连接平末端或黏性末端。
(　　)
√
×
【提示】 E.coli DNA连接酶连接平末端的效率极低,一般不用于连接平末端。
(4)(选择性必修3 P72正文)被用作载体的质粒都是在天然质粒的基础上进行人工改造的。(　　)
√
(5)(选择性必修3 P74~75拓展应用2)限制酶能识别特定的核苷酸序列,不同的限制酶切割不能产生相同的黏性末端。(　　)
×
【提示】 不同的限制酶切割也可能产生相同的黏性末端。
2.规范表达
(1)(选择性必修3 P71正文拓展)限制酶主要来源于原核生物,为什么不能切割自身的DNA分子
【提示】 限制酶具有特异性,即一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列,并在特定位点进行切割。原核生物DNA分子中不存在自身限制酶的识别序列,或其识别序列已被修饰。
(2)(选择性必修3 P72正文拓展)DNA连接酶和DNA聚合酶功能上有何不同
【提示】 DNA连接酶连接的是两个DNA片段,而DNA聚合酶是把单个的脱氧核苷酸连接到已有的DNA片段上;DNA聚合酶起作用时需要以一条DNA链为模板,而DNA连接酶不需要模板。
重难知识·透析
1.图解限制酶的选择原则
(1)不破坏目的基因原则:如图甲中可选择PstⅠ,而不选择SmaⅠ。
(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则:质粒作为载体必须具备标记基因,所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构,如图乙中不选择SmaⅠ。若载体上有两个及以上的标记基因,则可合理对其中一些标记基因进行酶切破坏,从而达到比一个标记基因更高的筛选成功率,防止只有一个标记基因时出现的“假阳性”(即未成功导入目的基因的载体也能正常表达标记基因,造成无效筛选)。
(3)善用“双酶切”,注意方向性:目的基因所在序列和载体上存在多种酶切位点时,一般需要选择在目的基因所在序列和载体上都存在切割位点的两种不同的限制酶,对目的基因所在序列和载体进行剪切,即“双酶切法”。其优点和作用是:①防止目的基因环化;②避免目的基因与载体反向连接,即用DNA连接酶连接后形成的重组DNA分子上,目的基因和载体启动子的方向(或描述为“RNA聚合酶的移动方向”)必须是相同的,否则目的基因导入后无法正常表达。如图甲、乙也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。
(4)巧用“同尾酶”:同尾酶指来源不同,但能产生相同黏性末端的限制酶。当不适合选择某种限制酶时,可用其同尾酶替换,以获得相同的黏性末端。
2.根据质粒的特点确定限制酶的种类
3.根据限制酶的切割位点选择Ti质粒
图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取,丙Ti质粒宜选取(设切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ),分析如下:
4.抗生素抗性基因的筛选原理
载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。在受体细胞的培养体系中加入相应抗生素就可以筛选出转入重组载体并稳定表达的受体细胞,原理如图所示。
说明:目的基因要转入的受体细胞不能具有相关抗生素的抗性。
能力1　分析基因工程的基本工具,培养理解能力及获取信息能力
1.(2024·湖南卷,5)某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时,发现DNA完全没有被酶切,分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是(　　)
A.限制酶失活,更换新的限制酶
B.酶切条件不合适,调整反应条件如温度和酶的用量等
C.质粒DNA突变导致酶识别位点缺失,更换正常质粒DNA
D.酶切位点被甲基化修饰,换用对DNA甲基化不敏感的限制酶
B
关键能力·提升
【解析】 限制酶失活会使DNA完全不被酶切,此时应更换新的限制酶;酶切条件不合适可能使酶失活,无法发挥作用,应调整反应条件如温度和pH等,调整酶的用量没有作用;质粒DNA突变会导致限制酶识别位点缺失,进而造成限制酶无法进行切割,此时应更换为正常质粒DNA;质粒DNA上酶切位点被甲基化修饰,会导致对DNA甲基化敏感的限制酶无法进行酶切,此时应换用对DNA甲基化不敏感的限制酶。
2.(2025·汕头月考)含氨苄青霉素抗性基因(AmpR)的质粒、含有目的基因的DNA片段及相关限制酶酶切位点如图所示。在构建基因表达载体(重组质粒),并转化到受体菌中的实践中,某同学选用EcoRⅠ和MfeⅠ分别对质粒和含目的基因的DNA片段进行双酶切。下列对这种操作的优点的叙述,正确的是(　　)
A.可以避免质粒或者目的基因自身环化
B.可以避免目的基因与质粒反向连接
C.可以避免一个质粒中连续接入多个目的基因
D.可以避免受体菌的EcoRⅠ和MfeⅠ将所需重组质粒中的目的基因切割下来
D
【解析】 两种限制酶切割后得到的黏性末端一致,不能避免质粒或者目的基因自身环化,也不能避免目的基因与质粒反向连接;两种限制酶切割后得到的黏性末端一致,不能避免一个质粒中连续接入多个目的基因;若质粒EcoRⅠ酶切位点处与目的基因MfeⅠ酶切处连接,质粒MfeⅠ酶切位点处与目的基因EcoRⅠ酶切处连接,则正好将目的基因正向连接,这样的重组质粒,既无EcoRⅠ识别位点,又无MfeⅠ识别位点,故可以避免受体菌的EcoRⅠ和MfeⅠ将所需重组质粒中的目的基因切割下来。
考点二
基因工程的基本操作程序
1.目的基因的筛选与获取
(1)筛选合适的目的基因。
①目的基因:在基因工程的设计和操作中,用于改变 或获得
等的基因。主要是指 的基因。
②筛选方法:从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。
(2)利用PCR获取和扩增目的基因。
①原理: 。
基础知识·整合
受体细胞性状
预期表达产物
编码蛋白质
DNA半保留复制
②条件。
参与的组分 在DNA复制中的作用
解旋酶(体外用 代替) 打开DNA双链
DNA母链 提供DNA复制的模板
合成DNA子链的原料
催化合成DNA子链
2种引物 使DNA聚合酶能够从引物的 端开始连接脱氧核苷酸
高温
4种脱氧核苷酸
耐高温的DNA聚合酶
3′
③过程。
两种引物
耐高温的DNA聚合酶
④结果:上述三步反应完成后,一个DNA分子就变成了 个DNA分子,随着循环次数的增多,DNA分子以指数形式增加。
两
2.基因表达载体的构建——基因工程的核心
(1)构建基因表达载体的目的。
①使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且遗传给下一代。②使目的基因能够 和发挥作用。
表达
(2)基因表达载体的组成。
RNA聚合酶
转录
(3)基因表达载体的构建过程。
同种
产生
相同末端
DNA连接酶
3.将目的基因导入受体细胞
提醒　 农杆菌转化法中涉及的基因的两次拼接和两次导入:第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上,第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上;第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌,第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA导入受体细胞。
4.目的基因的检测与鉴定
PCR
抗原一抗
体杂交
深挖教材
1.判断正误
(1)(选择性必修3 P76正文)目的基因均为编码蛋白质的基因。(　　)
×
(2)(选择性必修3 P77相关信息)引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的双链核酸。(　　)
【提示】 目的基因主要是指编码蛋白质的基因,也可以是一些具有调控作用的因子如启动子、终止子等。
×
【提示】 引物为短单链核酸。
(3)(选择性必修3 P78~79图3-5)PCR通过调节温度来控制DNA双链的解聚及模板与引物的结合。(　　)
(4)(选择性必修3 P80正文)基因表达载体中目的基因的上游应含有启动子。
(　　)
(5)(选择性必修3 P82正文)检测目的基因是否导入受体细胞可用抗原—抗体杂交技术。(　　)
√
√
×
【提示】 检测目的基因是否导入受体细胞的方法是PCR等技术。
2.规范表达
(1)(选择性必修3 P78~79图3-5拓展)PCR反应过程中,引物非常关键。请思考:
①PCR技术为什么需要引物
【提示】 DNA聚合酶不能从头开始合成DNA,只能从DNA链的3′端延伸DNA链。
②利用PCR技术扩增目的基因时需要两种引物,原因是什么
【提示】 目的基因的两条反向平行的链都作为模板,其碱基序列不同。
③若一个DNA分子在PCR中经过n轮循环,理论上需要消耗多少个引物 第n轮循环需要消耗多少个引物
【提示】 经过n轮循环需要消耗(2n+1-2)个引物,第n轮循环需要消耗2n个
引物。
(2)(选择性必修3 P81资料卡拓展)在用农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞的过程中,为什么一定要将目的基因插入Ti质粒的T-DNA上
【提示】 Ti质粒上的T-DNA也称为可转移的DNA,可转移至受体细胞,并且整合到受体细胞染色体DNA上。
重难知识·透析
1.PCR扩增过程中的循环图示与规律
循环次数 1 2 3 n
DNA分子数 2 4 8 2n
含引物A(或B)的
DNA分子数 1 3 7 2n-1
同时含引物A、B的DNA
分子数 0=21-2 2=22-2 6=23-2 2n-2
共消耗的
引物数量 2=21+1-2 6=22+1-2 14=23+1-2 2n+1-2
2.引物设计应注意的问题
(1)设计引物的依据:目的基因两端的核苷酸序列。
(2)引物设计时既要考虑目的基因序列,又要考虑载体序列,原因:为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接,需在引物的5′端加上限制酶的酶切位点。
(3)使用的一对引物的序列不相同,因为目的基因两端具有不同的核苷酸序列。
(4)引物设计的要求(或引物失效的原因)。
①每种引物内部不能发生局部碱基互补配对,原因:防止引物自身折叠。
②两种引物之间不能在局部发生碱基互补配对,原因:防止引物之间配对,导致引物不能同模板链结合。
(5)两种引物都结合在DNA模板链的3′端;脱氧核苷酸连接在引物的3′端进行延伸。
3.农杆菌转化法分析
(1)构建基因表达载体需要两种工具酶:限制酶和DNA连接酶。
(2)基因表达载体(重组质粒)导入农杆菌细胞时,要用Ca2+处理农杆菌细胞,使其处于感受态,有利于重组质粒的导入。
(3)将导入目的基因的受体细胞培育成完整的植株要用到植物组织培养技术。
能力2　分析具体情境中PCR的条件及过程,培养理解能力和获取信息能力
3.(2025·广东卷,7)Solexa测序是一种将PCR与荧光检测相结合的高通量测序技术。为了确保该PCR过程中,DNA聚合酶催化一个脱氧核苷酸单位完成聚合反应后,DNA链不继续延伸,应保护底物中脱氧核糖结构上的(　　)
A.1′-碱基 B.2′-氢
C.3′-羟基 D.5′-磷酸基团
C
关键能力·提升
【解析】 DNA复制时,子链延伸的方向是从5′→3′,即下一个脱氧核糖核苷酸的5′-磷酸基团与上一个脱氧核糖核苷酸的3′-羟基进行连接,故为了DNA聚合酶催化一个脱氧核苷酸单位完成聚合反应后,DNA链不继续延伸,应保护底物中脱氧核糖结构上的3′-羟基。
4.(2025·揭阳模拟)利用PCR 获得目的基因后,用限制酶EcoR Ⅰ同时处理目的基因与质粒,拼接后可得到重组基因表达载体,其部分DNA片段如图所示。下列有关引物的分析正确的是(　　)
A.通过PCR获取目的基因时,所选的引物可为引物2和引物3
B.检测目的基因是否插入质粒且方向是否正确时,应选用引物1 和引物4进行PCR
C.若设计的引物与模板不完全配对,可适当提高 PCR 复性的温度
D.DNA聚合酶能与引物结合,并从引物的5′端连接脱氧核苷酸
A
【解析】 引物结合在模板链的3′端,通过PCR获取目的基因时,所选的引物可为引物2和引物3;引物结合在模板链的3′端,检测目的基因是否插入质粒且方向是否正确时,应选用引物2 和引物4进行PCR;若设计的引物与模板不完全配对,可适当降低 PCR 复性的温度,以便引物与模板链结合;DNA聚合酶能与引物结合,并从引物的3′端连接脱氧核苷酸。
能力3　特定情境中分析基因工程的基本操作,培养综合运用能力及逻辑推理能力
5.(2025·福建卷,10)紫杉醇是红豆杉的代谢产物,会干扰纺锤体的正常功能。科研人员利用农杆菌将紫杉醇合成的相关基因导入烟草中,实现了紫杉醇前体物质的合成。下列叙述错误的是(　　)
A.农杆菌转化前应先使用Ca2+处理烟草细胞
B.紫杉醇合成的相关基因会整合到烟草染色体DNA上
C.紫杉醇因干扰肿瘤细胞的有丝分裂而具有抗癌作用
D.该技术的突破有利于红豆杉天然资源的保护
A
【解析】 利用含重组Ti质粒的农杆菌转化烟草细胞前,不需要使用Ca2+处理烟草细胞;利用农杆菌转化植物细胞时,农杆菌中重组Ti质粒上的含紫杉醇合成相关基因的T-DNA能转移到烟草细胞中,并将相关基因整合到烟草细胞的染色体DNA上;由题干可知,紫杉醇会干扰纺锤体的正常功能,从而影响肿瘤细胞的有丝分裂,抑制肿瘤细胞增殖,起到抗癌作用;生产紫杉醇的传统方法是从红豆杉的树皮和树叶中提取,会破坏红豆杉植物资源,而利用转基因烟草合成紫杉醇的前体物质生产紫杉醇,有利于红豆杉天然资源的保护。
6.(2024·广东卷,21)驹形杆菌可合成细菌纤维素(BC)并将其分泌到胞外组装成膜。作为一种性能优异的生物材料,BC膜应用广泛。研究者设计了酪氨酸酶(可催化酪氨酸形成黑色素)的光控表达载体,将其转入驹形杆菌后构建出一株能合成BC膜并可实现光控染色的工程菌株,为新型纺织原料的绿色制造及印染工艺升级提供了新思路(图一)。回答下列问题。
(1)研究者优化了培养基的　 　　　　(答两点)等营养条件,并控制环境条件,大规模培养工程菌株后可在气液界面处获得BC菌膜(菌体和BC膜的复合物)。
碳源、氮源
【解析】 (1)培养基的营养物质包括水、无机盐、碳源、氮源等,研究者培养的驹形杆菌可合成细菌纤维素(主要是C、H、O)并将其分泌到胞外组装成膜(膜主要成分有蛋白质,主要元素是C、H、O、N),所以需要优化培养基的碳源、氮源等营养条件,并控制环境条件。
(2)研究者利用T7噬菌体来源的RNA聚合酶(T7RNAP)及蓝光光敏蛋白标签,构建了一种可被蓝光调控的基因表达载体(光控原理见图二a,载体的部分结构见图二b)。构建载体时,选用了通用型启动子PBAD(被工程菌RNA聚合酶识别)和特异型启动子PT7(仅被T7RNAP识别)。为实现蓝光控制染色,启动子①②及③依次为　　　　　　 　　,理由是　
　 。
PT7、PBAD和PBAD
基因2和基因3正常表达无活性
产物,被蓝光激活后再启动基因1表达
【解析】 (2)基因2和基因3在通用型启动子PBAD的激活下正常表达,使T7RNAP被激活,此时基因1表达后形成黑色素,从而实现光控染色。
(3)光控表达载体携带大观霉素(抗生素)抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素,其作用为　　 　　　(答两点)。
抑制杂菌;去除丢失质粒的菌株
【解析】 (3)光控表达载体携带大观霉素(抗生素)抗性基因。长时间培养容易出现杂菌污染,抗生素具有抑制杂菌的作用;工程菌繁殖过程中质粒复制不同步可能出现丢失的问题,加入大观霉素后有去除丢失质粒的菌株的作用。
(4)根据预设的图案用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间,随后将其转至染色池处理,发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色,其原因是
　。
该处细胞中T7RNAP激活,酪氨酸酶表达并合成黑色素
【解析】 (4)由(2)分析可知,细胞中T7RNAP激活,酪氨酸酶表达并合成黑色素,故用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间,随后将其转至染色池处理,发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色。
(5)有企业希望生产其他颜色图案的BC膜。按照上述菌株的构建模式提出一个简单思路:
　。
将酪氨酸酶替换成催化其他色素合成的酶(或把基因1换成控制
其他色素合成的基因)
【解析】 (5)由(2)分析可知,题干信息的设计思路最终BC膜被染成黑色,希望生产其他颜色图案的BC膜,则需要将酪氨酸酶替换成催化其他色素合成的酶(或把基因1换成控制其他色素合成的基因)。
考点三
活动:DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定
1.DNA的粗提取与鉴定
(1)基本原理。
不溶于
2mol/L
实验基础·梳理
二苯胺
(2)操作流程。
体积相等的、预冷的体积分数
为95%
2mol/L的NaCI
二苯胺
2.DNA片段的扩增及电泳鉴定
(1)实验基础。
①PCR原理:利用了 原理,通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。
②电泳:DNA分子具有可解离的基团,在一定的pH下,这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下,这些带电分子会向着与它所带电荷 的电极移动,这个过程就是电泳。
③PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的 等有关。
DNA的热变性
相反
大小和构象
(2)PCR实验操作步骤。
(3)DNA的电泳鉴定:凝胶中的DNA分子通过染色,可以在波长为 的紫外灯下被检测出来。
微量移液器
底部
300 nm
深挖教材
1.判断正误
(1)(选择性必修3 P74~75探究·实践)提取DNA时,如果没有鸡血材料,可用兔血代替。(　　)
×
(2)(选择性必修3 P74~75探究·实践)DNA与蛋白质都溶于酒精。(　　)
×
【提示】 兔为哺乳动物,其成熟红细胞中没有细胞核。
【提示】 DNA不溶于酒精,某些蛋白质溶于酒精。
(3)(选择性必修3 P74~75探究·实践)向DNA溶液中加入适量二苯胺,混匀后溶液变蓝。(　　)
×
【提示】 用二苯胺鉴定DNA时,需要沸水浴加热5 min,冷却后观察颜色变化。
(4)(选择性必修3 P84~85探究·实践)在凝胶中DNA分子的迁移速率只与DNA分子的大小有关。(　　)
×
【提示】 在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。
(5)(选择性必修3 P84~85探究·实践)PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水等都要经高压蒸汽灭菌后使用。(　　)
√
2.规范表达
(1)(选择性必修3 P74~75探究·实践拓展)过滤研磨液用纱布不用滤纸的原因是什么
【提示】 DNA会吸附在滤纸上,影响提取DNA的量。
(2)(选择性必修3 P84~85探究·实践拓展)如果电泳鉴定结果未出现扩增条带,可能是哪些原因造成的
【提示】 未出现扩增条带可能的原因有模板DNA含有蛋白质杂质或Taq DNA聚合酶的抑制剂;Taq DNA聚合酶失活;引物出现质量问题,浓度不合适; Mg2+浓度过低;变性温度低,变性时间短等。
能力4　分析实验基本操作及注意事项,培养实验探究能力
7.(2023·广东卷,11)“DNA粗提取与鉴定”实验的基本过程是:裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是(　　)
A.裂解:使细胞破裂释放出DNA等物质
B.分离:可去除混合物中的多糖、蛋白质等
C.沉淀:可反复多次以提高DNA的纯度
D.鉴定:加入二苯胺试剂后即呈现蓝色
D
关键能力·提升
【解析】 裂解是加蒸馏水让细胞吸水涨破,释放出DNA等物质;DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同,能溶于2 mol/L的NaCl溶液,将溶液过滤,即可将混合物中的多糖、蛋白质等与DNA分离;DNA不溶于酒精,而某些蛋白质溶于酒精,可以反复多次用酒精沉淀出DNA,提高DNA纯度;将DNA溶解于NaCl溶液,加入二苯胺试剂,沸水浴五分钟,待冷却后,能呈现蓝色。
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融合基因的原理及应用
[情境链接]
1.融合基因的原理
将不同的基因编码区首尾相连构成融合基因,从而进行基因表达。通过这项技术将一个报告系统(基因表达产物发光或者具有特殊的反应等易于筛选检测的性质,并且其中基因的序列已知)与另一个目的基因相融合,置于相同的控制条件下表达,从而通过报告系统来衡量目的基因产物的结构、功能及调控过程。
2.PCR与融合基因
通过设计连接两段基因包括中间接头在内的碱基序列作为引物,从而利用引物重叠互补,通常这两个基因的引物中有一段碱基序列互补。该技术要使用四条引物(如图所示),其中引物2和3的部分碱基(白色部分)是可以互补配对的。分别利用引物1和2、引物3和4进行PCR后,得到的DNA片段可以通过引物2和3互补的碱基杂交在一起,再在DNA聚合酶的作用下延伸,就能成为一条完整的DNA片段。最后,用引物1和4进行扩增得到由两个DNA片段融合的基因。
[迁移应用]
1.(2025·潮州模拟)某科研小组采用PCR 技术构建了红色荧光蛋白基因(dsred2)和α-淀粉酶基因(amy)的dsred2-amy融合基因,其过程如图所示,其中引物②和引物③中部分序列
(灰色区域)可互补配对。下列说法错误的是(　　)
A.利用PCR技术扩增基因时不需要解旋酶来打开DNA 双链
B.不能在同一反应体系中进行dsred2基因和amy基因的扩增
C.dsred2基因和amy基因混合后只能得到一种类型的杂交链
D.杂交链延伸得到dsred2-amy融合基因的过程不需要加引物
C
【解析】 利用PCR技术扩增基因时,高温变性使DNA双链解旋,不需要解旋酶来打开DNA 双链;引物②与③之间的结合会干扰引物和模板链的结合,从而影响PCR过程,因此不能在同一个反应体系中进行dsred2 基因和amy基因的扩增;dsred2基因和amy基因混合可以得到两种类型的杂交链(分别是3′端互补和5′端互补);杂交链延伸得到dsred2-amy融合基因的过程中,不需要加入引物,DNA聚合酶可以两条母链作为子链合成的引物在其3′端添加脱氧核苷酸。
2.(2025·揭阳月考)水稻雄性不育系在育种中具有重要的应用价值。研究者试图寻找更多的雄性不育基因。
(1)研究者获得一株雄性不育突变株 S221,与纯合可育植株杂交,后代表型及分离比为不育株∶可育株=1∶1,表明S221不育性为　　　　性状且受核内
　　　　对等位基因控制。
显性
1
【解析】 (1)雄性不育突变株 S221,与纯合可育植株杂交,后代表型及分离比为不育株∶可育株=1∶1,表明S221为杂合子,表示出的不育性为显性性状且受核内1对等位基因控制。
(2)对S221的不育基因进行精细定位,发现不育单株8号染色体的S基因上游插入了一段DNA片段(简称M 片段)。
①研究者利用　　　　技术扩增得到M片段和S基因,M片段、S基因分别用限制酶　 　　　处理,在　　　 　的作用下形成融合片段,构建表达载体(如图1),最终获得转基因株系1,相同
方法获得只插入S基因的转基因株系2。
PCR
BamHⅠ、Bgl Ⅱ
DNA连接酶
图1
【解析】 (2)①研究者利用PCR技术扩增得到M片段和S基因,据图1分析,M片段、S基因分别用BamHⅠ、Bgl Ⅱ限制酶处理(若S基因也用BamHⅠ处理,则融合片段中间存在Bgl Ⅱ识别序列,融合片段插入质粒载体前用Bgl Ⅱ和SacⅠ切割,会破坏融合片段),在DNA连接酶的作用下形成融合片段。
图1
②观察并比较水稻花穗、花药和花粉粒的发育情况,发现与野生型植株相比,株系1的花穗变小、花药变短、无成熟花粉粒,株系2无明显差异。本实验的目的是 　。
探究水稻雄性不育是否由M片段插入S基因上游导致
【解析】 ②与野生型植株相比,人为转入M片段+S基因的株系1的花穗变小、花药变短、无成熟花粉粒(雄性不育),只转入S基因的株系2无明显差异,可判断本实验的目的是探究水稻雄性不育是否由M片段插入S基因上游导致。
(3)为了研究M片段的功能,研究者将一系列片段分别与Luc基因融合构建表达载体导入水稻原生质体,检测Luc基因的表达水平,操作及结果见图2。
图2结果表明 　。
M片段可以启动并且与S 基因启动子共同促进Luc基因表达
图2
【解析】 (3)据图2分析,第2组有M片段但无启动子的情况下,Luc基因仍有较高表达,第3组Luc基因表达水平最高,说明M片段可以启动并且与S 基因启动子共同促进Luc基因表达。
图2
(4)进一步研究发现,不育株中S基因编码的蛋白参与花药绒毡层细胞中凋亡抑制基因的表达调控。结合本研究,推测突变株S221雄性不育的机理是
　。
在雄性不育突变株中,M片段插入S基因的上游,启动并增强S基因表达,从而导致花药绒毡层细胞中凋亡抑制基因表达下调,凋亡细胞数量增加,花穗变小、花药变短、无成熟花粉粒,进而导致雄性不育
【解析】 (4)由于不育株中S基因编码的蛋白参与花药绒毡层细胞中凋亡抑制基因的表达调控,推测突变株S221雄性不育的机理为在雄性不育突变株中, M片段插入到S基因的上游,启动并增强S基因表达,从而导致花药绒毡层细胞中凋亡抑制基因表达下调,凋亡细胞数量增加,花穗变小、花药变短、无成熟花粉粒,进而导致雄性不育。

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