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专题03 基因工程（选择题60道）
一、单选题
1．关于“DNA的粗提取与鉴定”实验， 下列说法错误的是（ ）
A．过滤液沉淀过程在4℃冰箱中进行是为了防止 DNA 降解
B．DNA 既溶于 2mol/L NaCl 溶液也溶于蒸馏水
C．粗提取的DNA 中含有核蛋白、多糖等杂质
D．将粗提取的 DNA 溶于2mol/L NaCl溶液中， 加入二苯胺试剂 DNA 被染成蓝色
【答案】D
【分析】DNA的粗提取与鉴定的实验原理是：
①DNA的溶解性，DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的氯化钠溶液中的溶解度不同，利用这一特点可以选择适当浓度的盐溶液可以将DNA溶解或析出，从而达到分离的目的；
②DNA不溶于酒精溶液，细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，利用这一原理可以将蛋白质和DNA进一步分离；
③在沸水浴的条件下DNA遇二苯胺会呈现蓝色。
【详解】A、低温时DNA酶的活性较低，过滤液沉淀过程在4℃冰箱中进行是为了防止DNA降解，A正确；
B、DNA 既溶于 2mol/L NaCl 溶液也溶于蒸馏水，且溶解度较高，B正确；
C、粗提取的DNA 中含有核蛋白、多糖等杂质，因此为了获得纯度较高的DNA需要进一步提纯，C正确；
D、将粗提取的 DNA 溶于2mol/L NaCl溶液中， 加入二苯胺试剂 后经过水浴加热可发现DNA 被染成蓝色，D错误。
故选D。
2．质粒是基因工程中常用的分子载体。下列有关质粒的说法正确的是（　　）
A．质粒是广泛存在于细菌细胞中的一种单链环状DNA分子
B．质粒的复制和表达都遵循中心法则和碱基互补配对原则
C．细菌质粒的复制过程一定是在宿主细胞外独立进行
D．大多数天然质粒都不需要人工改造，可以直接作为载体使用
【答案】B
【分析】常用的运载体：质粒、噬菌体、动植物病毒，其中质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。
【详解】A、质粒是存在于许多细菌以及酵母菌（真核细胞）中的有自主复制能力的小型环状DNA分子，A错误；
B、质粒的本质是DNA，质粒的复制和表达都遵循中心法则，也遵循碱基互补配对原则，B正确；
C、细菌质粒可以自我复制，也可整合到宿主细胞上一起复制，C错误；
D、天然的质粒通常不能直接作为载体，基因工程中用到的质粒都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的，D错误。
故选B。
3．Cre酶是一种重组酶，LoxP 是能被 Cre酶识别的特异DNA 序列。Cre/LoxP重组酶系统能够实现特异位点的基因敲除、基因插入等操作。一般而言，当一条 DNA 链上存在两个相同的 LoxP 序列且方向相同时，Cre酶能有效切除两个位点间的 DNA 序列，如图所示。下列说法正确的是（　　）
A．Cre酶能将两个核糖核苷酸之间的磷酸二酯键断开
B．无 Cre酶存在的细胞因 STOP 的作用而无法发出荧光
C．当有两个相同的 LoxP 序列时 Cre酶就能有效切除一个
D．启动子能启动绿色荧光基因翻译荧光蛋白的过程
【答案】B
【分析】基因的表达包括转录和翻译两个步骤，转录是指以DNA的一条链为模板，按照碱基互补配对原则，合成RNA的过程。翻译是指以mRNA为模板，合成具有一定氨基酸排列顺序的蛋白质的过程。
【详解】A、结合题意可知，Cre酶能将特定部位的两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键断开，A错误；
B、题意显示，当一条 DNA 链上存在两个相同的 LoxP 序列且方向相同时，Cre酶能有效切除两个位点间的 DNA 序列，图中的终止子会被切除，若无 Cre酶存在，则图中STOP 的作用会导致荧光蛋白基因不能表达，进而无法发出荧光，B正确；
C、当有两个相同的 LoxP 序列且方向相同时 ，Cre酶就能有效切除两个位点间的 DNA 序列，包括其中的一个 LoxP ，C错误；
D、启动子能启动绿色荧光基因的转录过程，D错误。
故选B。
4．限制酶和DNA连接酶是基因工程的工具酶，以下说法正确的是（　　）
A．大多数限制酶识别的核苷酸序列由6个核糖核苷酸组成
B．不同来源的限制酶可能识别相同的序列，甚至有相同的切点
C．DNA连接酶能将单个核苷酸连接到已有的核苷酸片段上
D．E·coliDNA连接酶既能连接黏性末端，也能连接平末端
【答案】B
【分析】基因工程最基本的工具：①基因的“剪刀”---限制酶；基因的“针线”---DNA连接酶；③基因的运载体---质粒、噬菌体、动植物病毒等。
【详解】A、大多数限制酶识别的核苷酸序列由6个脱氧核糖核苷酸组成的，A错误；
B、不同来源的限制酶可能是同一种限制酶，可以识别相同的识别序列，甚至有相同的切点，B正确；
C、DNA连接酶可以连接两个DNA片段，而DNA聚合酶能将单个核苷酸连接到已有的核苷酸片段上，C错误；
D、E·coliDNA连接酶只能连接黏性末端，不能连接平末端，D错误。
故选B。
5．研究者获得导入S基因的基因编辑小鼠的过程如下图所示，下列相关叙述正确的是（　　）

A．过程①一般需要用促性腺激素处理
B．过程②是在雌鼠a的输卵管内完成
C．过程③需将表达载体注射到子宫中
D．过程④需抑制雌鼠b对植入胚胎的免疫排斥
【答案】A
【分析】胚胎移植的生理学基础：①动物发情排卵后，同种动物的供、受体生殖器官的生理变化是相同的。这就为供体的胚胎移入受体提供了相同的生理环境。②早期胚胎在一定时间内处于游离状态。这就为胚胎的收集提供了可能。③受体对移入子宫的外来胚胎不发生免疫排斥反应。这为胚胎在受体的存活提供了可能。④供体胚胎可与受体子宫建立正常的生理和组织联系，但供体胚胎的遗传特性在孕育过程中不受影响。
【详解】A、过程①用促性腺激素对供体进行超数排卵处理，获得更多的卵母细胞，A正确；
B、过程②是体外受精，体外受精是将获能的精子和培养成熟的卵子置于适当的培养液中共同培养一段时间，来促使它们完成受精，B错误；
C、③是导入含S基因的表达载体，应该将含S基因的表达载体通过显微注射法注射至小鼠的受精卵中，C错误；
D、受体对移入子宫的外来胚胎不发生免疫排斥反应，故过程④不需要抑制雌鼠b对植入胚胎的免疫排斥，D错误。
故选A。
6．Cre-loxP系统能实现特定基因的敲除（如图1）。把几种荧光蛋白基因和Cre酶能识别并切割的序列（loxP1和loxP2）串在一起，构建表达载体T（如图2）。部分荧光蛋白基因会被Cre酶随机“剪掉”，且两个loxP1之间或两个loxP2之间的基因，最多会被Cre酶敲除一次，剩下的部分得以表达，随机呈现不同的颜色。下列说法错误的是（　　）

A．Cre酶切下一个待敲除基因的过程，需要破坏四个磷酸二酯键
B．若小鼠细胞含一个表达载体T（不含Cre酶），其肌肉组织细胞呈红色
C．若小鼠细胞含一个表达载体T（含Cre酶），其脑组织细胞呈红色或黄色或蓝色
D．若小鼠细胞含两个表达载体T（含Cre酶），其一个细胞内可能随机出现两种颜色
【答案】B
【分析】1、基因工程至少需要三种工具：限制性核酸内切酶（限制酶）、DNA连接酶、运载体。
2、基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。
【详解】A、DNA单链上相邻的两个脱氧核苷酸之间通过磷酸二酯键相连，DNA由两条单链螺旋缠绕形成，Cre酶切下一个待敲除基因的过程中，需要切断基因前后两端，因此需要破坏四个磷酸二酯键，A正确；
B、据图可知，小鼠有编码红、黄、蓝荧光蛋白的基因，前端有脑组织特异性表达的启动子，肌肉细胞不会表达颜色基因，故若小鼠细胞含一个表达载体T(不含Cre酶)，其肌肉组织细胞呈无色，B错误；
C、1oxP1、1oxP2位置如图2黑白三角符号所示，两个loxP1和两个loxP2之 间的基因最多会被Cre酶敲除一次，将含Cre酶的病毒注入小鼠体内，Cre酶表达情况不同，识别的loxP不同，则有可能未敲除荧光蛋白基因，此时为红色(同不含Cre酶时)，也有可能敲除两个loxP1之间的红色荧光蛋白基因，此时为黄色，也有可能敲除两个1oxP2之间的红色和黄色荧光蛋白基因，此时为蓝色，因而不同脑细胞会差异表达红色、黄色或蓝色荧光蛋白基因，C正确；
D、小鼠脑组织细胞内有2个相同表达载体T(含Cre酶)，Cre酶对每个DNA片段随机剪切，因而细胞的颜色由细胞内两种荧光蛋白的颜色叠加而成，故其脑组织细胞可能出现两种颜色，D正确。
故选B。
7．基因工程、细胞工程都可以克服远缘杂交不亲和的障碍，在农作物新品选育等方面具有广阔的前景和较高的应用价值。下列叙述错误的是（　　）
A．实验室中将目的基因导入植物细胞采用最多、最有效的方法是显微注射法
B．农杆菌转化法的原理是 Ti 质粒中的 T-DNA 具有转移到受体细胞并整合到受体细胞 DNA 上的特性
C．植物体细胞杂交诱导原生质融合时常用聚乙二醇（PEG）做诱导剂
D．含有目的基因的细胞或融合形成的杂种细胞能培育成植株的理论基础是细胞的全能性
【答案】A
【分析】将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
【详解】A、显微注射法是实验室中将目的基因导入动物细胞采用最多、最有效的方法，A错误；
B、农杆菌的Ti质粒存在T-DNA片段，它具有可转移到受体细胞并整合到受体细胞的染色体DNA上，B正确；
C、常用化学诱导法聚乙二醇（PEG）诱导植物原生质体的融合，C正确；
D、植物组织培养的原理是细胞的全能性，D正确。
故选A。
8．DNA测序时，先将待测单链DNA模板、引物、有关酶、4种脱氧核苷三磷酸（dNTP，N代表A、T、C、G，能提供能量并作为DNA复制的原料）均加入4个试管中，再分别加入一定量的含放射性同位素标记的ddNTP（ddGTP、ddATP、ddCTP、ddTTP）。不同于dNTP的是，ddNTP的五碳糖的3位不含羟基。在DNA合成时ddNTP随机与dNTP竞争核苷酸链延长位点，并终止DNA的延伸，从而形成不同长度的一系列终止处带有放射性同位素标记的DNA链。下图是DNA测序时得到含放射性标记的子代DNA的电泳图谱。下列相关说法错误的是（　　）
A．反应体系中的引物为单链，DNA聚合酶从引物的3'端连接脱氧核苷酸
B．ddNTP终止子链延伸，其原理可能是其五碳糖的3'位不含羟基，无法连接新的脱氧核苷酸
C．图中加入ddCTP的一组中，可以形成3种长度的子链
D．图中子代DNA的碱基序列是5'-GATCCGAAT-3'
【答案】D
【分析】基因检测是指通过检测生物体中的DNA序列，以了解生物体基因状况的技术手段。双脱氧链终止法是DNA测序的基本方法，其原理是：核酸模板在核酸聚合酶、带有3′-OH末端的单链核苷酸引物、四种dNTP存在的条件下复制或转录时，如果在反应系统中分别引入单一种类的ddNTP（即2、3双脱氧核苷三磷酸，在脱氧核糖的3′位置缺少一个羟基，故不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键），只要ddNTP掺入链端，该链就停止延长，末端掺入dNTP的片段可继续延长。
【详解】A、引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸；PCR反应体系中的引物为单链，DNA聚合酶从引物的3'端连接脱氧核苷酸，A正确；
B、题干信息可知，ddNTP的五碳糖的3位不含羟基，在DNA合成时ddNTP随机与dNTP竞争核苷酸链延长位点，并终止DNA的延伸，可见ddNTP终止子链延伸，其原理可能是其五碳糖的3'位不含羟基，无法连接新的脱氧核苷酸，B正确；
C、在DNA合成时ddNTP随机与dNTP竞争核苷酸链延长位点，并终止DNA的延伸，根据电泳图谱可知，待测DNA的碱基序列中含有2个C（胞嘧啶），且C（胞嘧啶）不在DNA的末端，故利用上图中待测DNA序列，加入ddCTP的一组中，可以形成34种长度的子链，除了题图所示两种长度的子链还包括完整的子链长度，C正确；
D、ddNTP的3号碳上没羟基，参与聚合反应后无法与游离脱氧核苷酸形成磷酸二酯键，因此ddNTP一旦参与聚合反应，则DNA单链延伸即终止，因此可知左上角的第一个G所在位置为3'端（第一位），依据图中碱基的排序可知，图中子代DNA的碱基序列是3'-GATCCGAAT-5'，D错误。
故选D。
9．New Phytologist杂志发表了我国科学家有关大豆对盐胁迫响应的分子调控机制，过程如图所示。研究发现，miR160a可通过切割GmARF16基因转录的mRNA使大豆具有耐盐性。下列叙述错误的是（　　）

A．大豆的不耐盐与耐盐这对性状受多对基因共同决定
B．若GmMYC2基因启动子甲基化程度增加可提高耐盐性
C．脯氨酸含量增加可增大根部细胞渗透压引起耐盐性增强
D．miR160a通过碱基互补配对原则识别mRNA并断裂氢键
【答案】D
【分析】由图可知，GmARF16基因转录的mRNA可以激活GmMYC2基因的表达，GmMYC2基因的表达产物bHLH转录因子抑制脯氨酸的合成，从而使大豆表现出不耐盐的性状。
【详解】A、大豆的不耐盐与耐盐受GmARF16基因、GmMYC2基因等多对基因共同决定，A正确；
B、若GmMYC2基因启动子甲基化程度增加，会抑制bHLH转录因子的产生，故脯氨酸合成增加，大豆耐盐性增加，B正确；
C、脯氨酸含量增加可增大根部细胞渗透压，如果外部环境含盐量一定程度的增加，细胞依然可以吸收水分，故大豆耐盐性增强，C正确；
D、miR160a可通过切割GmARF16基因转录的mRNA，故miR160a通过碱基互补配对原则识别mRNA并断裂磷酸二酯键，D错误。
故选D。
10．东南景天中的HMA3基因能编码Cd（镉）转运蛋白，Cd转运蛋白能将土壤中的Cd吸收进体内，现欲将东南景天中的HMA3基因转入栾树，以增强栾树对 Cd的富集能力，从而有 效治理Cd污染，科研人员利用下图结构构建重组DNA，图1为HMA3基因所在DNA示意图，图2为质粒结构示意图，下列叙述正确的是（ ）
A．欲获取HMA3基因，可用引物1、引物2进行PCR循环至少2轮获得
B．用凝胶电泳鉴定PCR产物，引物1、引物2扩增的产物可得3条条带
C．构建含HMA3和GFP基因的重组质粒，需在引物上添加BglⅡ和HindⅢ的识别序列
D．用含潮霉素的培养基筛选受体细胞，能生长的为含重组质粒的受体细胞
【答案】C
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。
（4）目的基因的检测与鉴定。
【详解】A、欲获取HMA3基因，可用引物1、引物2进行PCR循环至少3轮获得，A错误；
B、 用凝胶电泳鉴定PCR产物，引物1、引物2扩增的产物可能会得到引物带、引物二聚体带、目的扩增产物带和非目的扩增产物带等多条不同的条带，B错误；
C、构建含HMA3和GFP基因的重组质粒时，需要有启动子和终止子序列，又不破坏GFP基因，因此需要在引物上添加BglⅡ和HindⅢ的识别序列，C正确；
D、用含潮霉素的培养基筛选受体细胞，能生长的为含重组质粒或不含重组质粒的受体细胞，这两种都有可能，D错误 。
故选C。
11．目的基因和载体如果用同一种限制酶处理，连接时会出现正反接的情况，为鉴定筛选出的表达载体中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR后，结合电泳技术鉴定，图示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，其中目的基因为长度300bp的片断。下列有关说法不正确的是（　　）

A．PCR退火温度不宜太低，避免引物错配和模板链形成双链
B．电泳条带迁移的位置和速度与DNA分子的大小、带电量和构象有关
C．选取引物甲丙，扩增出450bp长度片断时，可以说明目的基因正接
D．选取引物甲乙，扩增出400bp长度片断时，可以说明目的基因反接
【答案】C
【分析】PCR是利用 DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按 碱基互补配对的原则结合，再调 温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶 沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。
【详解】A、退火是在高温解旋后降低温度让引物与模板链结合，退火温度不宜太低，避免引物错配和模板链形成双链，A正确；
B、电泳条带迁移的位置和速度与DNA分子的大小、带电量和构象有关，如电泳一段时间后，较大的DNA分子迁移距离小，离加样孔近，而较小的DNA分子迁移距离大，离加样孔远，B正确；
C、由于使用的引物是甲和丙，没有与基因相应位置配对，因此不管基因正接还是反接，均为450bp，C错误；
D、选取引物甲乙，扩增出400bp长度片断时，可以说明目的基因反接，若正接的话，扩增出来的长度应该是100bp，D正确。
故选C。
12．THP9基因是野生玉米中控制高蛋白含量的优良基因，研究者利用基因工程技术将THP9基因转到玉米细胞内，从而获得转基因高蛋白玉米新品种。已知图中THP9基因转录的方向为从左往右。下列相关叙述错误的是（ ）
EcoRⅠ BamHⅠ KpnⅠ MfeⅠ Hind Ⅲ
A．THP9基因有2个游离的磷酸基团，而且游离的磷酸基团在5′端
B．构建基因表达载体时，用MfeⅠ、HindⅢ切割质粒，用EcoRⅠ、HindⅢ切割目的基因
C．利用PCR技术获取THP9基因时应选择引物1和引物4
D．为了检测转基因玉米新品种的培育是否成功，需要在个体水平上检测其蛋白质含量
【答案】C
【分析】由图分析可知，要保证将目的基因切割下来，但是又不破坏目的基因，不能选择MfeⅠ切割目的基因，要保证质粒结构的完整性，不能选择BamHⅠ切割质粒。
【详解】A、THP9基因有2个游离的磷酸基团，而且游离的磷酸基团在每一条链的5′端，A正确；
B、构建基因表达载体时，用MfeⅠ、HindⅢ切割质粒时，形成的黏性末端分别是AATT-3'和AGCT-3'，用EcoRⅠ、HindⅢ切割目的基因时，形成的黏性末端分别是AATT-3'和AGCT-3'，形成的黏性末端对应相同，可以成功将目的基因插入质粒，同时避免目的基因自身环化和随意连接，B正确；
C、利用PCR技术扩增基因时，引物从5'端朝着3'端延伸,故应与模板链3'端配对，故应选择引物2和引物3，C错误；
D、为了检测转基因玉米新品种的培育是否成功，需要在个体水平上检测玉米蛋白质含量，D正确。
故选C。
13．人血白蛋白在临床上被广泛应用。我国科学家通过生物工程技术在水稻胚乳中提取到人血白蛋白，其流程如下图所示。下列叙述正确的是（　　）
A．PCR扩增时需要DNA模板、引物、耐高温的RNA聚合酶等条件
B．过程①需用农杆菌转化法将人血白蛋白基因直接导入水稻胚乳细胞中
C．过程①需将目的基因与胚乳中特异性表达基因的启动子等调控元件重组
D．过程②改变生长素和细胞分裂素的浓度及比例不影响细胞的脱分化过程
【答案】C
【分析】据图可知，①过程是将人血白蛋白基因导入水稻组织细胞，常用的方法有农杆菌转化法、花粉管通道法等，②是通过组织培养将含人血白蛋白基因的水稻组织细胞培养为水稻植株，③是从水稻胚乳中提取人血白蛋白。
【详解】A、PCR扩增时需要DNA模板、引物、耐高温的DNA聚合酶、脱氧核苷酸等条件，A错误；
B、将目的基因导入植物细胞常用的方法有农杆菌转化法、花粉管通道法等，过程①可用农杆菌转化法将含有人血白蛋白基因的基因表达载体导入水稻细胞中，通过植物组织培养获得转基因水稻，所以受体细胞并不是水稻胚乳细胞，B错误；
C、我国科学家通过生物工程技术在水稻胚乳中提取到人血白蛋白，过程①在构建基因表达载体时，需将目的基因与胚乳中特异性表达的基因的启动子等调控元件重组，从而使目的基因在水稻的胚乳细胞中特异性表达，C正确；
D、过程②进行植物组织培养，主要包括脱分化和再分化过程，生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键激素，改变它们的浓度及比例对脱分化和再分化过程均有影响，D错误。
故选C。
14．下图中的①②③表示培育番茄新品种的三种育种方法。下列有关说法错误的是（ ）
A．方法①和③的育种原理都是基因重组
B．方法②诱导单倍体的过程中细胞全能性的表达与植物激素密切相关
C．方法③中的抗病基因导入受体细胞常用细菌中的质粒做运载体
D．把目的基因与质粒相结合，只能用相同的限制酶分别处理目的基因和质粒
【答案】D
【分析】根据题意和图示分析可知：方法①为杂交育种，原理为基因重组；②是单倍体育种，原理为染色体变异；③是通过基因工程技术将抗病基因导入叶肉细胞，原理为基因重组。
【详解】A、方法①和③分别是杂交育种和基因工程育种，其育种原理都是基因重组，A正确；
B、方法②是单倍体育种，诱导单倍体的过程是利用了植物组织培养，细胞全能性的表达与植物激素密切相关，B正确；
C、方法③为基因工程育种，将抗病基因导入受体细胞常用细菌中的质粒做运载体，C正确；
D、不同的限制酶切割质粒和目的基因若能产生相同的黏性末端，也可以将目的基因与质粒连接构建基因表达载体，D错误。
故选D。
15．在基因工程操作中，常用原核生物作为受体细胞，其中以大肠杆菌应用最为广泛。某动物体内有科研人员所需要的目的基因，欲将该基因导入大肠杆菌的质粒中保存。该质粒上有EcoRI、XhoI、Mun I、Sal I和 NheI限制酶识别序列，相关结构的示意图如下。下列叙述错误的是（ ）

注：LacZ基因编码产生的β-半乳糖苷酶可以分解X-gaI产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。
A．启动子位于基因的上游，是RNA聚合酶识别和结合的部位
B．操作过程宜保留氨苄青霉素抗性基因，将目的基因插入LacZ基因中
C．在设计PCR引物时，应在两种引物的5'端添加SalI和NheI限制酶识别序列
D．在添加氨苄青霉素和X-gaI的培养基上生长的白色菌落为导人重组质粒的大肠杆菌
【答案】C
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。
【详解】A、启动子位于基因的上游，是RNA聚合酶识别和结合的部位，A正确；
B、由于图中有两个EcoRI的酶切位点，不能选择，所以宜保留氨苄青霉素抗性基因，将目的基因插入LacZ基因中，B正确；
C、SalI和NheI会破坏目的基因，都不能选择，因此只能选择XhoI和MunI，但是目的基因没有这两种酶的识别序列，所以在设计PCR引物时，应在引物的5'端添加限制酶XhoI和MunI的识别序列，C错误；
D、目的基因的插入位置是在lacZ基因中，会破坏lacZ基因的结构，不能产生β-半乳糖苷酶，底物X-gaI不会被分解。所以筛选导入重组质粒的大肠杆菌时，只有导入了质粒的大肠杆菌才能在添加了氨苄青霉素的培养基上生长。又因为目的基因的插入破坏了lacZ基因的结构，底物X-gaI不会被分解，故在添加了氨苄青霉素和X-gaI的培养基上生长的白色菌落为导入重组质粒的大肠杆菌，D正确。
故选C。
16．干扰素是一种具有干扰病毒复制作用的糖蛋白，目前主要用于治疗慢性乙型、丙型肝炎等。我国科学家用基因工程的方法从大肠杆菌中获得了人干扰素，如图为科学家构建的人干扰素基因表达载体。下列叙述正确的是（ ）
A．基因表达载体上的启动子是 DNA 聚合酶识别和结合的部位
B．图中未标出终止子，其作用是使翻译过程在需要的地方停下来
C．用同种限制酶切割干扰素基因和载体的目的是产生相同的末端
D．构建基因表达载体时，T4DNA 连接酶可恢复被限制酶切开的氢键
【答案】C
【分析】1、DNA连接酶：主要是连接DNA片段之间的磷酸二酯键，起连接作用，在基因工程中起作用。
2、限制酶：从DNA链的内部进行切割，分为限制性内切酶和非限制性内切酶。
【详解】A、基因表达载体上的启动子是 RNA 聚合酶识别和结合的部位，用于驱动基因的转录，A错误；
B、图中未标出终止子，其作用是使转录过程在需要的地方停下来，B错误；
C、用同种限制酶切割干扰素基因和载体的目的是产生相同的末端，便于基因表达载体的构建，C正确；
D、构建基因表达载体时，T4DNA 连接酶可恢复被限制酶切开的磷酸二酯键，D错误。
故选C。
17．常规PCR只能扩增两引物间的DNA区段，要扩增已知DNA序列两侧的未知DNA序列，可用反向PCR技术。反向PCR技术扩增的原理如图所示。下列叙述错误的是（　　）
A．酶切阶段，L中不能含有酶切时所选限制酶的识别序列
B．环化阶段，可选用E.coli DNA连接酶或T4 DNA连接酶
C．图中引物，应选择引物1和引物4，且二者间不能互补配对
D．PCR扩增，每轮循环前应加入限制酶将环状DNA切割成线状
【答案】D
【分析】PCR只能扩增两端序列已知的基因片段，反向PCR可扩增中间一段已知序列，而两端序列未知的基因片段。酶切时用限制性内切酶，环化时用DNA链接酶，再用引物和DNA聚合酶扩增。在环化后，通过一对方向相反的引物实现已知序列两侧基因序列的扩增。
【详解】A、在酶切阶段，已知序列L中不能含有酶切时所选限制酶的识别序列，不然会将已知序列L切断，造成序列识别混乱，A正确；
B、T4 DNA连接酶或E.coli DNA连接酶都可以用来连接黏性末端，因此环化阶段，可选用E.coli DNA连接酶或T4 DNA连接酶，B正确；
C、PCR过程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3'端通过碱基互补配对结合，为保证延伸的是已知序列两侧的未知序列，应该选择引物1和引物4，且二者间不能互补配对，C正确；
D、PCR的扩增只需要第一次循环前加入足够的限制酶，并不需要每轮都加入，D错误。
故选D。
18．下图分别表示某种质粒和含目的基因的DNA片段，利用相关工具酶将二者构建成基因表达载体并导入受体菌。几种可供使用的限制酶识别序列及其切割位点为EcoRⅠ：-G↓AATTC-；BamHⅠ：-G↓GATCC-；BclⅠ：-T↓GATCA-；Sau3AⅠ：-↓GATC-；SmaⅠ：-CCC↓GGG-。

注：TetR表示四环素抗性基因；AmpR表示氨苄青霉素抗性基因。
下列关于构建基因表达载体时限制酶的选择及其相关叙述，错误的是（ ）
A．若单独使用SmaI，则目的基因表达的产物可能不相同
B．若单独使用SmaⅠ，则含有目的基因的受体菌不能在氨苄青霉素培养基中生长
C．若选择BamHⅠ和SmaI，能在四环素培养基中生长的受体菌一定含有目的基因
D．若用EcoRI和BclⅠ切割质粒，则需用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割含目的基因的DNA
【答案】C
【分析】限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，形成黏性末端或平末端。
【详解】A、用同一种限制酶切割质粒和含目的基因的DNA片段后，目的基因可能会反向连接到质粒上，因此目的基因表达的产物可能不相同，A正确；
B、若单独使用SmaⅠ切割质粒和含目的基因的DNA片段，会破坏质粒上的氨苄青霉素抗性基因，使含有目的基因的受体菌不能在氨苄青霉素培养基中生长，B正确；
C、若选择BamHⅠ和SmaⅠ切割质粒和含目的基因的DNA片段，重组质粒上含有正常的四环素抗性基因：能在四环素培养基中生长的受体菌有可能获得了重组质粒，也有可能获得的是普通质粒，C错误；
D、含目的基因的DNA片段上没有BclⅠ的识别序列，不能使用BclⅠ切割含目的基因的DNA片段，但Sau3AⅠ切割DNA后产生的黏性末端与BclⅠ相同，故若用EcoRⅠ和BclⅠ切割质粒，则需用EcoRⅠ和Sau3AI切割含目的基因的DNA片段，D正确。
故选C。
19．抗原检测阴性但临床仍然高度怀疑新冠病毒感染的患者，医生会建议做核酸检测。该检测实际采用的技术是 RT-PCR，病毒刺突蛋白编码序列如下图所示，科研人员为该PCR 分 别设计了引物 A ( 5’-CC C．TGTATGGGGTTCTAA - 3') 和 引物B(5'-ACG…ACT①TTA②CTGGTGCAG-3'),已知引物 A 中 ATG 对应起始密码子，引物B中 TTA 对应终止密码子，标记基因可以插入刺突蛋白编码序列的首端或末端。下列叙述正确的是（ ）

A．获取新冠病毒的遗传物质后直接进行 PCR 扩增以节省出报告时间
B．若标记基因需要插入引物B的①或②位置中，则应选择②位置
C．用琼脂糖凝胶电泳来鉴定 PCR 后的产物，电泳结束后可在凝胶上直接观察到相应条带
D．为避免杂菌污染，PCR 实验过程中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行干热灭菌
【答案】B
【分析】PCR原理：在解旋酶作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。PCR反应过程是：变性→复性→延伸。
【详解】A、新冠病毒是 RNA 病毒，需要先逆转录为DNA 后再进行扩增，A错误；
B、引物B中TTA对应终止密码子，标记基因可以插入刺突蛋白编码序列的首端或末端，所以标记基因需要插入引物B的②位置，B正确；
C、PCR后需要将凝胶放在紫外灯下才可看到相应条带，C错误；
D、为避免外源 DNA 等因素的污染，PCR实验过程中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水必须进行高压灭菌，D错误。
故选B。
20．利用基因工程技术使哺乳动物成为乳腺生物反应器，以生产所需要的药品，如转基因动物生产人的生长激素。科学家培养转基因动物成为乳腺生物反应器时，下列说法错误的是（ ）
A．利用显微注射法将人的生长激素基因导入受体哺乳动物体内
B．需要将乳腺中特异表达的基因的启动子与目的基因重组在一起
C．动物必须是雌性才能满足要求
D．动物需要进入泌乳期才能成为“批量生产药物的工厂”
【答案】A
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA—分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】A、利用显微注射法将人的生长激素基因（重组DNA）导入到受精卵中，A错误；
B、需要将乳腺蛋白基因的启动子与目的基因重组在一起，使目的基因只在乳腺组织中特异性表达，B正确；
C、雌性才能泌乳，故动物必须是雌性才能满足要求，C正确；
D、由于目的基因只在乳腺组织中特异性表达，因此受体动物需要进入泌乳期才能成为“批量生产药物的工厂”，D正确。
故选A。
21．通过基因工程技术，可以将抗草甘膦基因导入大豆，培育出抗除草剂作物。下列相关叙述，错误的是（ ）
A．构建基因表达载体时要用到耐高温的DNA聚合酶和DNA连接酶
B．可以用农杆菌转化法将目的基因导入受体细胞
C．培育过程需要借助植物组织培养技术
D．需要在个体水平上对目的基因进行检测和鉴定
【答案】A
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】A、构建基因表达载体不需要耐高温的DNA聚合酶，需要的是限制性内切核酸酶和DNA连接酶，A错误；
B、可以用农杆菌转化法将目的基因导入受体植物细胞，B正确；
C、培育出抗除草剂作物培育过程需要借助植物组织培养技术，C正确；
D、在培育过程中需要在个体水平上对目的基因进行检测和鉴定，D正确。
故选A。
22．下列有关基因工程应用的说法，错误的是（ ）
A．将外源生长激素基因导入动物体内可提高动物生长速率
B．将必需氨基酸含量多的蛋白质基因导入农作物，提高农产品的品质
C．利用基因工程技术，得到的乳腺生物反应器可以解决很多重要的药品的生产问题
D．用转基因动物作为器官移植的供体时，由于导入的是调节因子，而不是目的基因，因此无法抑制抗原的合成
【答案】D
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测和个体水平上的鉴定。
【详解】A、将外源生长激素基因导入动物体内可提高动物生长速度，因为生长激素基因表达的生长激素能促进动物的生长发育，A正确；
B 、将必需氨基酸含量多的蛋白质基因导入农作物，提高农产品的品质，因为蛋白质中必需氨基酸含量多是蛋白质品质高的标志，主要是由于必需氨基酸不能在人体内合成，只能从食物中获取，B正确；
C、利用基因工程技术，将决定药物产生的相关基因导入到受精卵中，得到的乳腺生物反应器可以解决很多重要的药品的生产问题，C正确；
D、用转基因动物作为器官移植的供体时，将某种调节因子导入器官供体基因组，可以抑制抗原决定基因的表达，再结合克隆技术，就能培育出不会引起免疫排斥反应的转基因克隆器官，D错误；
故选D。
23．基因编辑是一种基因工程技术，CRISPR/Cas9基因编辑技术，可以实现对DNA的定点切割，其工作原理如下图所示，向导RNA引导Cas9蛋白到一个特定的基因位点并剪切DNA。研究发现CRISPR-Cas9系统广泛存在于细菌细胞内，下列说法错误的是（ ）

A．细菌体内的Cas9能切割外源DNA保护自身，类似于限制酶
B．可通过CRISPR/Cas9技术敲除突变基因根治猫叫综合征等遗传病
C．Cas9对不同目标DNA进行编辑时，应使用不同的向导RNA
D．Cas9蛋白剪切DNA片段的精确性随着向导RNA长度的延长而增加
【答案】B
【分析】1、基因工程的基本操作程序有四步：①目的基因的获取，②基因表达载体的构建，③将目的基因导入受体细胞，④目的基因的检测与鉴定。
2、基因工程的三种工具：限制性核酸内切酶（限制酶）、DNA连接酶、运载体。
3、标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。
【详解】A、题干可知细菌体内的Cas9能切割外源DNA保护自身，类似于限制酶，也可以切割DNA，A正确；
B、通过CRISPR/Cas9技术可以敲除突变的基因而达到根除致病基因的目的，但猫叫综合征是由人体的5号染色体结构部分缺失导致的，B错误；
C、Cas9对不同目标DNA进行编辑时，因为不同DNA的碱基序列不同，应使用不同的向导RNA，C正确；
D、向导RNA与目标DNA结合的前提条件是RNA序列与DNA序列精准结合，如果向导RNA过短，则基因组中能与之结合的DNA序列就会越多，出现Cas9结合剪切多个基因的现象，因此Cas9蛋白剪切DNA片段的精确性随着向导RNA长度的延长而增加，D正确。
故选B。
24．研究发现，为心梗患者注射适量t-PA蛋白会诱发颅内出血，但若将t-PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，能显著降低出血等副作用，改良后的t-PA蛋白成为心梗和脑血栓的急救药。下图所示，通过基因工程大量制备改良药物t-PA蛋白，下列说法错误的是（ ）

A．制备改良t-PA蛋白的过程属于蛋白质工程
B．利用重组pCLY11质粒可获得牛乳腺生物反应器
C．选用限制酶XmaI和BglⅡ切割质粒pCLY11，构建重组质粒
D．成功导入重组质粒的受体细胞在含有新霉素的培养基上能存活，且呈现蓝色
【答案】D
【分析】1、基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。包括四个基本程序：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细 胞、目的基因的检测与鉴定。
2、蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。
【详解】A、蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。依题意，改良后的药物t-PA蛋白将t-PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸改良而来，因此，制备改良t-PA蛋白的过程属于蛋白质工程，A正确；
B、科学家将药用蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起，通过显微注射的方法导入哺乳动物的受精卵中，由这个受精卵发育成的转基因动物在进入泌乳期后，可以通过分泌乳汁来生产所需要的药物，这称为乳腺生物反应器或乳房生物反应器。因此，利用重组pCLY11质粒也可获得牛乳腺生物反应器，B正确；
C、t-PA改良基因的黏性末端如图所示，则所选的限制酶所获得的切口应与t-PA改良基因的黏性末端相同，因此需选用限制酶XmaI和BglⅡ切开质粒pCLY11，C正确；
D、结合图示可知，限制酶XmaI和BglⅡ会破坏质粒pCLY11上的mlacZ，但不会破坏新霉素抗性基因，导入重组质粒的大肠杆菌具有新霉素抗性，但由于mlacZ基因被破坏，没有相应产物，因而菌落呈现白色，D错误。
故选D。
25．蛋白质工程中对蛋白质分子进行设计时，主要包括哪几种（ ）
①进行少数氨基酸的替换
②对不同来源的蛋白质的拼接
③从预期蛋白质的功能出发去推测氨基酸排列顺序
④直接改变蛋白质的空间结构
A．①③④ B．①②③ C．②③④ D．①②④
【答案】B
【分析】蛋白质工程是通过修改基因或创造合成新基因来改变生物的遗传和表达性状，合成新的蛋白质，蛋白质工程从属于基因工程，蛋白质工程是第二代基因工程。
【详解】①对已知结构的蛋白质进行少数氨基酸的替换，属于蛋白质工程中的分子设计,①正确；
②对不同来源的蛋白质分子进行拼接组装属于蛋白质工程，②正确；
③从预期蛋白质的功能出发去推测氨基酸排列顺序，属于蛋白质工程的基本途径，③正确；
④因为蛋白质分子通常较大，直接改变蛋白质的空间结构不易操作，因此蛋白质工程是在基因的水平上实现的，④错误。
故选B。
26．蛋白质工程是新崛起的一项生物工程，又称第二代基因工程。下图为蛋白质工程的流程。下列有关叙述错误的是（　　）
A．蛋白质工程就是根据人们需要，直接对蛋白质进行加工改造
B．蛋白质工程是通过基因改造或基因合成等方法，对现有蛋白质进行改造或制造一种新的蛋白质
C．①②过程为转录和翻译
D．蛋白质工程是从④开始的
【答案】A
【分析】1、蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。
2、蛋白质工程的过程：预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有氨基酸序列→找到对应的脱氧核苷酸序列（基因）。
3、根据中心法则分析题图：图中①表示转录过程，②表示翻译过程。
【详解】AB、蛋白质工程并不是直接对蛋白质进行加工修饰的，蛋白质工程是通过基因修饰或基因合成等方法，对现有蛋白质进行改造，A错误，B正确；
C、基因通过①转录形成mRNA，之后经过②翻译形成多肽链，C正确；
D、蛋白质工程是从预期蛋白质功能开始的，即④，D正确。
故选A。
27．瑞典科学家斯万特·帕博凭借对已灭绝古人类基因组和人类进化的发现荣获2022年诺贝尔奖生理学或医学奖。他在研究过程中使用了大引物PCR构建定点突变，其过程如图。下列相关叙述正确的是（ ）

A．进行PCR扩增需要的酶有解旋酶和耐高温的DNA聚合酶
B．利用该技术将某功能蛋白的结构改变属于蛋白质工程
C．第二轮PCR所用的引物为第一轮PCR所产生的DNA的两条链
D．PCR子链的延伸过程都是从引物的5'端开始的
【答案】B
【分析】1、PCR原理：在解旋酶作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程．DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。
2、PCR反应过程是：变性→复性→延伸。
【详解】A、进行PCR扩增需要的酶是耐高温的DNA聚合酶，不需要解旋酶，A错误；
B、欲将某功能蛋白的结构改变，应设计诱变引物，该过程属于蛋白质工程，B正确；
C、第一轮产物作第二轮PCR扩增的大引物外，第二轮PCR仍需加入的引物是另一种侧翼引物，以便进行另一条链的延伸，C错误；
D、PCR子链的延伸过程都是从5’开始的，引物与产物互补配对，因此都从引物的3’端开始的，D错误。
故选B。
28．干扰素是一种具有干扰病毒复制作用的糖蛋白，可以用于治疗病毒的感染和癌症，但体外保存相当困难。如图是利用蛋白质工程设计生产干扰素的流程图，据图分析下列叙述错误的是（　　）
A．图中构建新的干扰素模型的主要依据是新的干扰素的预期功能
B．图中新的干扰素基因必须插入到质粒上的启动子和终止子之间才能表达
C．图中改造干扰素结构的实质是改造干扰素基因的结构
D．图中各过程并没有涉及基因工程技术
【答案】D
【分析】蛋白质工程概念及基本原理
（1）蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。（基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质）。
（2）蛋白质工程崛起的缘由：基因工程只能生产自然界已存在的蛋白质。
（3）蛋白质工程的基本原理：它可以根据人的需求来设计蛋白质的结构，又称为第二代的基因工程。
（4）基本途径：预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有氨基酸序列→找到对应的脱氧核苷酸序列（基因），最终还是回到基因工程上来解决蛋白质的合成。
【详解】A、蛋白质工程的主要依据是蛋白质的预期功能，因此图中构建新的干扰素模型的主要依据是蛋白质的预期功能，A正确；
B、启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，从而驱动转录，而终止子提供转录终止的信号，故新的干扰素基因必须插入质粒上的启动子和终止子之间才能表达，B正确；
C、蛋白质工程的实质是对基因进行操作，因此图中改造干扰素结构的实质是改造干扰素基因的结构，C正确；
D、题图中从“人工合成DNA”到“在受体细胞中表达”的过程运用了基因工程技术，D错误。
故选D。
29．下列关于蛋白质工程说法不正确的是（　　）
A．蛋白质工程的设计与实施遵循中心法则
B．蛋白质工程可对酶的底物专一性、热变性、碱变性等加以改变
C．原则上只能生产自然界中已存在的蛋白质，而这种蛋白质完全符合人们生产和生活的需要
D．蛋白质工程在农业方面可以增加粮食产量、研发新型农药
【答案】C
【分析】蛋白质工程以蛋白质分子结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造或制造一种新的蛋白质。蛋白质工程的流程：预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有氨基酸序列→据氨基酸序列推出脱氧核苷酸序列（基因）→DNA合成。
【详解】A、蛋白质工程的设计与实施遵循中心法则，A正确；
B、可以通过蛋白质工程修饰相应的基因改变酶的底物专一性、热变性、碱变性等，B正确；
C、蛋白质工程生产出的蛋白质不一定完全符合人们生产和生活的需要，C错误；
D、蛋白质工程在农业方面可以增加粮食产量、研发新型农药，D正确。
故选C。
30．为探究M基因的功能，科研人员利用基因工程技术将M基因导入拟南芥中，培育出转M基因拟南芥植株，相关流程如图所示，其中b过程利用了PCR技术。下列相关叙述错误的是（ ）

A．a、b过程中所需要的酶分别是逆转录酶和耐高温的DNA聚合酶
B．b过程中将温度降至50℃左右的目的是将双链DNA解聚为单链
C．e过程中，Ti质粒的T-DNA可携带着M基因转移到拟南芥细胞中
D．获得的转M基因拟南芥植株自交，子代可能会发生性状分离
【答案】B
【分析】PCR原理：在高温作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的，实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。
【详解】A、根据图示分析，a过程以mRNA为模板合成DNA，是逆转录过程，需要逆转录酶的催化，b过程为利用PCR技术扩增M基因，该过程需要耐高温的DNA聚合酶催化，A正确；
B、PCR过程中，每次循环可分为变性、复性和延伸三步，其中变性是指当温度超过90℃时，双链DNA解聚为单链，复性是指当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，B错误；
C、在农杆菌转化法中，将目的基因插入农杆菌Ti质粒的T-DNA中，T-DNA可携带着目的基因转移到受体细胞中，C正确；
D、若获得的转M基因拟南芥植株的细胞中只有一条染色体上含有M基因，相当于杂合子，则其自交会发生性状分离，D正确。
故选B。
31．关于基因结构、功能和应用的叙述，错误的是（ ）
A．PCR技术可以检测目的基因在受体细胞中是否转录和翻译
B．基因指导合成的具有催化活性的物质中，其化学本质不一定相同
C．基因工程中的抗逆性基因常来自于极端微生物
D．基因中的嘧啶数和嘌呤数不一定相等
【答案】A
【分析】酶大多是蛋白质，少数是RNA。经过自然选择，极端微生物中含有抗逆性基因的概率较。基因一般是有遗传效应的DNA片段，也有可能是有遗传效应的RNA片段。
【详解】A、利用分子杂交，PCR技术可以检测目的基因在受体细胞中是否转录，但不能检测是否翻译，A错误；
B、基因指导合成的具有催化活性的物质（酶）中，其化学本质不一定相同，有的是蛋白质有的是RNA，B正确；
C、经过自然选择，极端微生物中含有抗逆性基因的概率较大，基因工程中的抗逆性基因常来自于极端微生物，C正确；
D、基因有可能是有遗传效应的RNA片段，如RNA病毒，其嘧啶数和嘌呤数一般不相等，D正确。
故选A。
32．PCR技术在生物工程中应用广泛，PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。下列有关叙述正确的是（ ）
A．PCR过程中用到了缓冲液，缓冲液中一般要添加Mg2+用于激活RNA聚合酶
B．PCR反应体系中须加入耐高温的DNA聚合酶，该酶可在复性过程起作用
C．限制酶切割质粒前后，质粒的长度不变，故无法通过电泳检测质粒是否被切开
D．若采用PCR技术对一个双链目的基因进行扩增，则第n代复制共需要引物2n个
【答案】D
【分析】利用PCR可以在体外进行DNA片段的扩增。PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。一次PCR一般要经历30次循环。
【详解】A、PCR过程中用到了缓冲液，缓冲液中一般要添加Mg2+用于激活DNA聚合酶，A错误；
B、PCR反应体系中须加入耐高温的DNA聚合酶，该酶主要在延伸过程起作用，B错误；
C、因为质粒被切开后可能成为多个DNA片段，相对分子质量彼此不同，因而可通过电泳检测，C错误；
D、PCR技术大量扩增目的基因时，第n次复制形成2"个DNA，相当于新合成2n-1个DNA分子，合成一个DNA分子需要两个引物，因此需要的引物数目为2n-1x2=2n，D正确。
故选D。
33．科研人员利用农杆菌转化法将抗病毒蛋白基因C 导入番木瓜，培育出转基因抗病番木瓜，所用的 Ti 质粒如图所示。下列叙述正确的是（ ）
A．该技术的原理是农杆菌的拟核DNA 与番木瓜基因发生重组
B．构建基因表达载体需要限制酶和耐高温的 DNA 聚合酶
C．可利用 PCR 技术筛选出含有抗病毒蛋白基因C 的受体细胞
D．可利用卡那霉素抗性基因检测是否成功构建抗病毒番木瓜
【答案】C
【分析】农杆菌转化法：农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有感染能力。当植物体受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞，这时农杆菌中的 Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上。据此如果将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞，并将其插入到植物细胞中染色体的DNA上，使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。
【详解】A、农杆菌的拟核DNA不会与番木瓜基因发生重组，和番木瓜基因发生重组的是其质粒上的基因，A错误；
B、构建重组质粒需要限制酶和DNA连接酶，B错误；
C、可利用 PCR 技术扩增目的基因，进而筛选出含有抗病毒蛋白基因C的受体细胞，C正确；
D、因为转入番木瓜的是重组Ti质粒的T-DNA，其中不含卡那霉素抗性基因，因此转基因抗病番木瓜不含有卡那霉素抗性基因，故不具有卡那霉素抗性，D错误。
故选C。
34．斑点印迹杂交是一种简单的DNA分子杂交技术，其技术流程如图。据此分析，下列说法正确的是（　　）
A．p和q片段的杂交双链区域形成过程中有氢键和磷酸二酯键生成
B．p和q片段能够杂交的主要原因是两单链的碱基排列顺序相同
C．放射性自显影技术可显示原培养皿中含目的基因的菌落位置
D．斑点印迹杂交技术可用于检测目的基因是否在受体细胞中成功表达
【答案】C
【分析】目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA-分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质-抗原-抗体杂交技术。
【详解】A、p和q杂交过程中，双链区域会有氢键形成，但不会形成磷酸二酯键，A错误；
B、杂交是因为两单链的碱基可以互补配对，B错误；
C、斑点印迹杂交技术是将目的基因片段用放射性同位素或荧光进行标记，与受体细胞的基因组DNA进行杂交，如果目的基因整合到受体细胞上，那么标记基因就会与其结合，通过放射性自显影就可以检测出整合有目的基因的受体细胞。所以该技术可以显示原培养基中含目的基因的菌落位置，C正确；
D、斑点印迹杂交是一种简单的DNA分子杂交技术，该技术可以检测目的基因的导入和转录，但无法用于检测目的基因是否在受体细胞中表达，目的基因是否在受体细胞中表达常用抗原-抗体杂交法，D错误。
故选C。
35．CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术，在单链向导RNA（SgRNA）引导下，Cas9基因表达产生的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，切割DNA双链以敲除目标基因（靶基因）或插入新的基因，其工作原理如下图所示。下列分析正确的是（　　）
A．Cas9蛋白的剪切对象是目标基因组序列中与SgRNA互补的DNA单链
B．若设计的SgRNA基因越短，则该基因编辑技术的精准度越高
C．对不同目标DNA进行编辑时，使用Cas9蛋白和相同的SgRNA进行基因编辑
D．其他DNA序列含有与SgRNA互补配对的序列，造成SgRNA错误结合而脱靶
【答案】D
【分析】基因工程技术的基本步骤：1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；4、目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：（1）检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；（2）检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】A、Cas9蛋白属于内切酶，其剪切对象是具有特定序列的DNA双链，A错误；
B、据题意分析，无法确定设计的SgRNA基因长短与该基因编辑技术的精准度，B错误；
C、由图可知，SgRNA具有识别作用，在对不同目标DNA进行编辑时，应使用Cas9蛋白和“不同”的sgRNA结合进而实现对不同基因的编辑，C错误；
D、CRISRP Cas9基因编辑技术有时存在编辑出错而造成脱靶，其最可能的原因是其他DNA序列也含有与向导RNA（sgRNA）互补配对的序列，造成向导RNA（sgRNA）错误结合而脱靶，D正确。
故选D。
36．如图为转基因抗虫烟草的培育流程，下列叙述正确的是（　　）
A．培育过程①需要使用纤维素酶和果胶酶
B．培育过程②将重组Ti质粒导入烟草细胞前需要使用CaCO3处理农杆菌
C．培育过程③④仅通过调节植物激素可诱导愈伤组织再生出新植株
D．可通过观察害虫吞食转基因烟草后的存活情况进行个体水平检测
【答案】D
【分析】据图分析，图示为转基因抗虫烟草的培育流程，其中①表示基因表达载体的构建过程，②表示将目的基因导入受体细胞的过程，③④表示再分化形成完整植株的过程。
【详解】A、过程①表示基因表达载体的构建过程，即形成重组Ti质粒的过程，需要使用限制酶和DNA连接酶，不需要纤维素酶和果胶酶，A错误；
B、过程②是将目的基因导入受体细胞的过程，在将重组Ti质粒导入烟草细胞前需要先使用CaCl2处理农杆菌，B错误；
C、过程③④为再分化形成植株的过程，该过程中需要通过调节营养物质和植物激素的配比，从而实现由愈伤组织诱导出芽和根的顶端分生组织的目的，并由此再生出新植株，C错误；
D、可通过进行个体水平的检测判断转基因抗虫烟草是否培育成功，即让害虫吞食转基因烟草，观察害虫的存活情况进行判断，D正确。
故选D。
37．为实现高效降解厨余垃圾中纤维素的目的，科研人员将纤维素内切葡聚糖前基因 导入蕊酵母中，获得能高效表达EGⅢ基因的工程菌，图示中BamHT、EcoRI、SalI为限制酶。下整列相关叙述错误的是（ ）
A．构建重组质粒需用到，BamHI、SalI和DNA连接酶.
B．筛选目的菌时，所用的培养基中应含有氨苄青霉素
C．培育该工程菌与培育三倍体充子西瓜所运用的原理相同
D．质粒中的启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位
【答案】C
【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：目的基因的获取；基因表达载体的构建；将目的基因导入受体细胞；目的基因的检测与表达。从分子水平上检测目的基因的方法：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。
【详解】A、据图可知，EcoRI会破坏目的基因，因此构建重组质粒需用到BamHI、SalI，然后用DNA连接酶进行拼接，A正确；
B、SalI会破坏卡那霉素抗性基因，筛选出目的菌时，所用培养基中应含有氨苄青霉素，B正确；
C、培育该工程菌运用的原理是基因重组，培育三倍体无子西瓜所运用的原理是染色体数目变异，C错误；
D、质粒中的启动子是一段特殊序列的DNA片段，是RNA聚合酶识别和结合的部位，D正确。
故选C。
38．Southern印迹杂交是进行基因组 DNA 特定序列定位的通用方法。其基本方法是：利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的 DNA 片段，将凝胶上的 DNA变性并在原位将单链DNA 片段转移至硝酸纤维膜上并固定，再与放射性标记的探针进行杂交，利用放射自显影检测特定DNA分子。根据信息判断下列说法中错误的是（　　）

A．限制性内切酶消化 DNA片段时破坏了相邻两个核苷酸分子之间的磷酸二酯键
B．转移至硝酸纤维膜上的 DNA片段中有2 个游离的磷酸基团
C．标记探针与硝酸纤维膜上的 DNA 分子部分碱基序列互补
D．可用 Southern印迹杂交法从基因组文库中获取目的基因
【答案】B
【分析】限制酶能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并使特定的磷酸二酯键断开。双链DNA分子中有两个游离的磷酸基团，单链DNA分子中有一个游离的磷酸基团。探针可以和变性的DNA分子进行杂交，依据碱基互补配对原则。Southern印迹杂交可对基因组 DNA 特定序列定位，可从基因组文库中获取目的基因。
【详解】A、限制性内切酶切割DNA分子内部核苷酸分子之间的磷酸二酯键，A正确；
B、转移至硝酸纤维膜上的 DNA片段是单链DNA分子，其中有1 个游离的磷酸基团，B错误；
C、核酸探针通过氢键与待检测基因片段进行连接，进行碱基互补配对，C正确；
D、放射性标记的探针进行杂交，利用放射自显影检测特定DNA分子，可用 Southern印迹杂交法从基因组文库中获取目的基因，D正确。
故选B。
39．如图是利用奶牛乳腺生产人血清白蛋白的图解，下列相关说法不正确的是（　　）
A．常用胰蛋白酶将奶牛组织分散成单个细胞
B．常用显微注射技术将人血清白蛋白基因导入受体细胞
C．图中M过程应该包括早期胚胎培养、胚胎移植等过程
D．在重组细胞中检测到人血清白蛋白基因，说明目的基因在受体细胞中完成了表达
【答案】D
【分析】乳腺生物反应器即人类通过对某种动物的遗传基因进行改造，使这些动物的乳腺可以产生和分泌出人们所需要的某些物质，可以节省建设厂房和购买仪器设备费用，可以减少生产程序和环境污染，因此这里所说的“某结构’是指该动物的遗传基因。“乳腺生物反应器”的优点是：①动物的基因组成和人类相似，从人类染色体上切下来的任何基因都可以直接转移到动物体内；②动物乳腺细胞可以是任何基因正确表达，并正确进行后加工；③用动物乳腺生产外源蛋白质产量很高。用动物乳腺生产药品不需要产品提纯，不需要复杂设备，动物吃的是草，生产的是奶，奶中含有珍贵的蛋白质，因此，“乳腺生物反应器”是人们公认的、最理想的生物反应器。
【详解】A、动物细胞培养过程，需要先用胰蛋白酶或胶原蛋白酶将细胞分散成单个细胞，A正确；
B、将目的基因导入动物细胞，最常用的方法是显微注射技术，因此常用显微注射技术将人血清白蛋白基因导入受体细胞，B正确；
C、题图中M过程为将重组细胞形成胚胎后移植的过程，应该包括早期胚胎培养、胚胎移植等过程，C正确；
D、重组细胞中检测到人血清白蛋白基因，说明目的基因已导入受体细胞中，不一定完成表达，D错误。
故选D。
40．将马铃薯胰蛋白酶抑制剂基因Pin Ⅱ导入杨树细胞，培育成了抗虫杨树。如图表示含目的基因的DNA分子和农杆菌质粒，图中Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Neor表示新霉素抗性基因，箭头表示识别序列完全不同的4种限制酶的切割位点。下列叙述不正确的是（ ）
A．目的基因插入到质粒的T- DNA上，才能整合到受体细胞染色体中
B．为使目的基因与质粒高效重组，最好选用EcoRⅠ和PstⅠ
C．成功导入重组质粒的细胞会表现为不抗氨苄青霉素、抗新霉素
D．转化了的杨树细胞在合适条件下经脱分化即可形成抗虫杨树
【答案】D
【分析】题图分析：为使目的基因与质粒高效重组，防止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化，最好选用两种不同的限制酶作用于含目的基因的DNA和质粒，要想切割出目的基因，限制酶应该位于目的基因的两侧；又因为限制酶PstⅠ和限制酶TthⅢⅠ分别位于标记基因Ampr和NeOr中，因此限制酶PstⅠ和限制酶TthⅢⅠ不能同时使用，即一定需要用到限制酶EcoRⅠ；如果限制酶EcoRⅠ和TthⅢⅠ同时使用，会破坏质粒中的标记基因NeOr，同时会切除复制原点。因此只能选用EcoRⅠ和PstⅠ切割目的基因和质粒，然后再在DNA连接酶的作用下形成重组质粒。。
【详解】A、农杆菌中的Ti质粒上的T -DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上，因此，目的基因插入到质粒的T- DNA上，可整合到受体细胞染色体中，A正确；
B、为保证目的基因的完整性，不能选用BamHⅠ；为防止自身环化，应选用目的基因两侧的两种不同的限制酶；重组质粒中至少要保留一个抗性基因，TthⅢ1和PstⅠ只能选其中一个；因此可选用EcoRⅠ和TthⅢ1或者EcoRⅠ和PstⅠ；为保留重组质粒中的复制原点，最好选用EcoRⅠ和PstⅠ，B正确；
C、用EcoRⅠ和PstⅠ切割会破坏氨苄青霉素抗性基因，但不会破坏新霉素抗性基因，因此成功导入重组质粒的细胞会表现为不抗氨苄青霉素，但能抗新霉素，C正确；
D、转化了的杨树细胞在合适条件下经脱分化与再分化可形成抗虫杨树，D错误。
故选D。
二、多选题
41．融合PCR技术采用具有互补末端的引物，形成具有重叠链的PCR产物，通过PCR产物重叠链的延伸，从而将不同来源的任意DNA片段连接起来。其原理如图所示，据图分析正确的是（　　）
A．上述过程中使用的引物P2和P3的碱基需要完全互补配对
B．设计引物的目的是为了能够从其3'端开始连接脱氧核苷酸
C．融合PCR的第一步两条链重叠部位可互为另一条链的引物
D．若融合PCR的第二步获得128个融合基因，理论上该过程消耗了254个引物
【答案】BCD
【分析】PCR是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。
【详解】A、上述过程中使用的引物P2和P3的碱基不需要完全互补配对，只需要与DNA的两条模板链的两端互补配对即可，A错误；
B、引物为一段核苷酸，引物与DNA模板链结合后，能够从其3＇端开始连接脱氧核苷酸，开始子链的合成，B正确；
C、结合图示可知，融合PCR的第一步两条链重叠部位即互补配对，可互为另一条链的引物，C正确；
D、若融合PCR的第二步获得了128个融合基因，引物数目和新合成的子链数目相同，即该过程消耗了128×2-2=254个引物，D正确。
故选BCD。
42．B型血友病患者因缺乏凝血因子IX（FIX）导致凝血功能障碍。某腺病毒（AAV）是一种单链DNA病毒，野生型AAV无致病性、免疫原性弱、有复制缺陷，需要辅助病毒进行复制，可作为B型血友病基因治疗的载体。如图为重组AAV病毒制备及治疗过程示意图（HEK293细胞是人的某种细胞）。下列叙述正确的是（ ）

A．图中目的基因是FIX基因，质粒1~3可通过农杆菌转化法导入HEK293细胞
B．HEK293细胞为重组AAV病毒的增殖提供了DNA模板、酶、ATP、氨基酸等
C．重组AAV病毒以胞吞方式进入人体的肝细胞，携带的目的基因在细胞核中完成转录
D．培养HEK293细胞的培养液需定期更换，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成伤害
【答案】CD
【分析】基因工程的基本操作程序有四步：①目的基因的获取，②基因表达载体的构建，③将目的基因导入受体细胞，④目的基因的检测与鉴定。
【详解】A、农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞常用的方法，而HEK293细胞是人的某种细胞，A错误；
B、HEK293细胞无法为重组AAV病毒的增殖提供DNA模板，B错误；
C、从图示信息可以看出，重组AAV病毒以胞吞方式进入人体的肝细胞，携带的目的基因在细胞核中完成转录，最终合成FIX，C正确；
D、培养HEK293细胞的培养液需定期更换，以便清除代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成伤害，D正确。
故选CD。
43．链霉菌是一种异养需氧型的细菌， 为利用链霉菌生产药物 A，研究者构建重组 DNA 并导入链霉菌。重组 DNA 含启动子 P、药物 A 基因和 Neo 基因（卡那霉素抗性基因）。培养和筛选过程如下图所示。
下列叙述不正确的是（ ）
A．实验所用培养基需要先调 pH 再行高压蒸汽灭菌后才能使用
B．稀释后涂布时应用涂布器沾取少量菌液并均匀地涂布在培养基的表面
C．卡那霉素抗性强弱与药物A基因的表达量呈正相关
D．应选用培养基b 的菌株进一步鉴定以生产药物 A
【答案】BD
【分析】1、基因工程的原理是基因重组，基因工程的基本操作程序为：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞，目的基因的检测与鉴定；
2、稀释平板涂布法的操作：⑴将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中；⑵取少量菌夜（不超过0.1ml）滴加到培养基表面；⑶将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却8~10s；⑷用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面，涂布时可转动培养皿，使菌液分布均匀。
【详解】A、培养基应先调pH再进行灭菌，否则会被再次污染，所以在制培养基时，都是要先调pH后高压蒸汽灭菌，A正确；
B、先取少量菌液滴加到培养基表面，再用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面，B错误；
C、药物A基因和Neo基因（卡那霉素抗性基因）共用一个启动子，二者共同表达，所以卡那霉素抗性强弱可反映药物A基因的表达量，二者呈正相关，C正确；
D、诱变处理后将菌液稀释后涂布，在含不同浓度卡那霉素的培养基上各接种等量同一稀释度的培养液，应该选择含卡那霉素浓度最高的培养基（即d）上所长出的菌落，其生产药物A的能力也较强，D错误。
故选BD。
44．科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒，该质粒的部分结构如图所示，其中J基因序列表达J蛋白，V5编码序列表达短肽V5。下列叙述错误的是（ ）
A．作为基因表达载体，该重组质粒通常还需具有标记基因等结构
B．用F2、R2作引物进行PCR检测，可确定J基因插入方向是否正确
C．通过启动子的位置和引物的方向可判断该融合基因转录的模板是a链
D．该启动子高度甲基化对该基因在受体细胞中表达J-V5融合蛋白有利
【答案】BD
【分析】基因工程的关键步骤是构建基因表达载体，基因表达载体主要由启动子、目的基因、标记基因和终止子组成，其中标记基因用于筛选重组DNA分子，可以是四环素、氨苄青霉素等抗性基因，也可以是荧光蛋白基因或产物能显色的基因。
【详解】A、基因表达载体的构建启动子是为了启动下游基因的“表达”，表达首先需要转录，因此RNA聚合酶识别和结合的部位才是转录的起始。作为运载体必须具备的条件：①要具有限制酶的切割位点；②要有标记基因（如抗性基因），以便于重组后重组子的筛选；③能在宿主细胞中稳定存在并复制；④是安全的，对受体细胞无害，而且要易从供体细胞分离出来，图中甲有启动子和终止子等，因此质粒还需具备的结构有限制酶的切割位点、标记基因、复制原点等，A正确；
B、据图甲可知，引物F2与R1或F1与R2结合部位包含J基因的碱基序列，因此推测为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，进行PCR检测时，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物F2和R1或F1与R2，B错误；
C、根据图上启动子和终止子的位置可知转录方向是图上从左向右，对应的模板链方向应该是3’-5’，因此为a链，C正确；
D、该启动子高度甲基化使得该基因无法被转录，因此对该基因在受体细胞中表达J-V5融合蛋白不利，D错误。
故选BD。
45．科研人员构建了可表达J-V5 融合蛋白的重组质粒并进行了检测，其中 V5 编码序列表达一种标签短肽V5．图乙表示重组质粒正确表达后用抗J蛋白抗体和抗 V5 抗体分别检测相应蛋白的结果。下列说法正确的是（ ）
A．若用PCR 法确定J基因是否正确连接到质粒中，应选择的引物组合为F1和R1
B．若b链是J基因转录的模板链，则可推知引物F1与图甲中J基因a链相应部分的序列相同
C．若导入受体细胞的启动子发生甲基化修饰，则可以抑制DNA聚合酶对启动子的识别和结合
D．图乙条带1表明细胞内表达了J-V5融合蛋白，条带2所检出的蛋白不是由重组质粒上的J基因表达的
【答案】BD
【分析】基因表达载体的结构：①启动子：RNA聚合酶识别和结合的位点，用于驱动RNA转录；②终止子：使转录停止的“信号灯”；③标记基因：便于重组DNA分子的筛选；④目的基因；复制原点。
【详解】A、引物F2和R1或F1和R2结合部位包含J基因的碱基序列，因此若用PCR 法确定J基因是否正确连接到质粒中，应选择的引物组合为F2和R1或F1与R2，A错误；
B、b是模板链，而根据图上启动子和终止子的位置可知转录方向是图上从左向右，对应的模板链方向应该是3’-5'，非模板链（也就是a链）是5'-3'；考虑到DNA复制的方向是子链的5’-3'，引物基础上延伸的方向肯定是5'-3'，所以引物结合的单链其方向是3'-5'；图中F1是前引物，在左侧，所以其配对的单链是3’-5'的b链，故其序列应该与a链相应部分的序列相同，B正确；
C、启动子是转录时RNA聚合酶的识别和结合位点，因此若导入受体细胞的启动子发生甲基化修饰，则可以抑制 RNA 聚合酶对启动子的识别和结合，C错误；
D、抗体会与相应的蛋白发生特异性结合，故图乙条带1表明细胞内表达了J-V5融合蛋白，条带2检测不出短肽V5，说明条带2所检出的蛋白不是由重组质粒上的J基因表达的，D正确。
故选BD。
46．CD47是一种跨膜糖蛋白，肺癌、结肠癌等多种肿瘤细胞表面的CD47含量明显高于正常细胞。为此科学家研究并制备了抗CD47单克隆抗体，以抑制肿瘤细胞表面CD47蛋白的活性，从而促进巨噬细胞吞噬肿瘤细胞。提取肿瘤细胞的mRNA，通过RT-PCR技术扩增获得大量CD47基因，再利用基因工程、单克隆抗体制备以获得大量抗CD47单克隆抗体。相关叙述正确的是（　　）
A．RT-PCR过程需要逆转录酶和耐高温的DNA聚合酶
B．CD47基因必须插入重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制
C．细胞B是从经免疫处理的小鼠体内获取的B淋巴细胞
D．上述方法生产的CD47与肿瘤细胞表面的CD47往往具有不同的结构
【答案】ACD
【分析】 单克隆抗体的制备：注射特定抗原、从小鼠的脾脏中获得产生特定抗体的B淋巴细胞、将B淋巴细胞与骨髓瘤细胞诱导融合、用特定选择培养基筛选出杂交瘤细胞、再利用克隆化培养和抗体检测获得足够多数量的能分泌所需抗体的细胞、将该细胞在体外培养或者注射到小鼠腹腔内增殖、从细胞培养液或小鼠腹水中获取大量单克隆抗体。
【详解】A、提取肿瘤细胞的mRNA，通过RT-PCR技术扩增获得大量CD47基因，需要用逆转录酶以RNA为模板合成DNA片段，再利用耐高温的DNA聚合酶进行基因扩增，A正确；
B、CD47基因必须插入复制原点才能进行复制，B错误；
C、细胞B是从经免疫处理的小鼠体内获取的B淋巴细胞，能够产生抗CD47抗体，C正确；
D、大肠杆菌为原核生物，其细胞中没有内质网和高尔基体，因此大肠杆菌分泌的CD47蛋白，其形成过程中没有经过内质网和高尔基体的加工；肿瘤细胞中有内质网和高尔基体，所以肿瘤细胞产生的CD47，其形成过程经过了内质网和高尔基体的加工，因此两种不同方式合成的蛋白质往往具有不同的结构，D正确。
故选ACD。
47．下表为几种限制酶的识别序列及其切割位点，由此推断，下列说法正确的是（ ）
限制酶名称 识别序列和切割位点 限制酶名称 识别序列和切割位点
BamH I 5'-G↓GATCC -3' Kpn I 5' - CGTAC↓C-3'
EcoR I 5' -C↓AATTC -3' Sau3A I 5'-↓GATC-3'
Hind II 5' - GTY↓RAC -3' Sma I 5'- CCC↓GGG -3'
注：Y为C或T，R为A或G。
A．HindII能识别GTCAAC序列，也能识别GTTAAC序列
B．Sau3A I和EcoRI破坏的都是识别序列中心轴线处的磷酸二酯键
C．BamHI和KpnI两种限制酶可识别相同的序列但切割后形成不同的黏性末端
D．HindII、SmaI两种限制酶的切割位点在识别序列中心轴线上，因而形成平末端
【答案】AD
【分析】限制酶能识别特定的脱氧核苷酸序列，并在特定的位点进行切割，切割后可能形成黏性末端或平末端。
【详解】A、当Y为C，R为A时，Hind II的识别序列为GTCAAC序列，当Y为T，R为A时，识别序列为GTTAAC序列，A正确；
B、Sau3A I识别序列为5'-↓GATC-3'，切割后形成的末端为黏性末端GATC-3'，破坏的是识别序列中心轴线两侧的磷酸二酯键，B错误；
C、BamHI和KpnI两种限制酶识别序列不同，但切割后可形成相同的黏性末端GATC -3'，C错误；
D、由表格可知，HindII、SmaI两种限制酶的切割位点在识别序列中心轴线上，因而形成平末端，D正确。
故选AD。
48．为研究水稻D基因的功能，研究者将T-DNA插入D基因中，致使该基因失活，失活后基因记为d。为验证F植株基因型（DD、Dd、dd），研究者根据D基因T-DNA的序列设计了3种引物。随机选取F植株若干，提取各植株的总DNA分别用引物“I+II”组合（A组）及“I+I”组合（B组）进行PCR扩增，检测是否扩增（完整的T-DNA过大，不能完成PCR扩增）。下列叙述正确的是（ ）
A．引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸
B．PCR扩增需要2种引物，确保特异地复制处于两个引物之间的DNA序列
C．若A组进行PCR可完成扩增，B组不能，则相应植株的基因型是DD
D．若A、B组进行PCR均可完成扩增，则相应植株的基因型是Dd
【答案】AB
【分析】PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术，利用的原理是DNA复制。
【详解】A、DNA聚合酶只能够从脱氧核苷酸链的3'端开始连接脱氧核苷酸，故需要加入引物，A正确；
B、PCR扩增是以两条链为模板，两条链两端碱基序列不同，故需要2种引物，确保特异地复制处于两个引物之间的DNA序列，B正确；
CD、分析题图，引物I与T-DNA配对，且与T-DNA（即d基因）上面一条链配对即，引物II与D基因右端配对，也是与上面一条链配对，使用引物I和引物II扩增的是同一条链，因此使用引物“I+II”组合（A组）及“I+I”组合（B组）进行PCR扩增，均不能成功扩增，CD错误。
故选AB。
49．科研人员构建了可表达J-V5 融合蛋白的重组质粒并进行了检测，其中 V5 编码序列表达标签短肽V5。图乙表示重组质粒正确表达后用抗J蛋白抗体和抗 V5 抗体分别检测相应蛋白的结果。下列说法正确的是（ ）

A．用PCR 法确定J基因是否正确连接到质粒中，图甲中可供选择的的引物组合有2种
B．若b链是J基因转录的模板链，则可推知引物F1与图甲中J基因a 链相应部分的序列相同
C．若导入受体细胞的启动子发生甲基化修饰，则可以抑制 DNA 聚合酶对启动子的识别和结合
D．图乙条带 1 表明细胞内表达了 J-V5 融合蛋白，条带 2 所检出的蛋白不是由重组质粒上的J基因表达的
【答案】ABD
【分析】 基因表达载体的结构：启动子：是RNA聚合酶识别和结合的位点，用于驱动RNA转录；终止子：使转录停止的“信号灯”；标记基因：便于重组DNA分子的筛选；目的基因；复制原点。
【详解】A、用PCR 法确定J基因是否正确连接到质粒中，需使用相应的引物，如果出现J基因相关的PCR产物，则说明成功连接，图甲中可供选择的的引物组合有2种：F1、R2或F2、R1，A正确；
B、b是模板链，而根据图上启动子和终止子的位置可知转录方向是图上从左向右，对应的模板链方向应该是3’-5'，非模板链（也就是a链）是5'-3'；考虑到DNA复制的方向是子链的5’-3'，引物基础上延伸的方向肯定是5'-3'，所以引物结合的单链其方向是3'-5'；图中F1是前引物，在左侧，所以其配对的单链是3’-5'的b链，故其序列应该与a链相应部分的序列相同，B正确；
C、启动子是转录时RNA聚合酶的结合位点，若导入受体细胞的启动子发生甲基化修饰，则可以抑制 RNA 聚合酶对启动子的识别和结合，C错误；
D、图乙条带 1 表明细胞内表达了 J-V5 融合蛋白，条带 2 检测不出短肽V5，说明条带 2 所检出的蛋白不是由重组质粒上的J基因表达的，D正确。
故选ABD。
50．光敏色素基因在调节作物生长发育中具有重要作用。为探讨玉米中光敏色素基因A（含大约256个碱基对）在棉花种质资源创制中的利用价值，研究人员将A基因转入到棉花中，利用对棉花受体细胞进行检测，并通过电泳技术分析结果。该过程所用质粒与含光敏色素基因的DNA上相关限制酶的酶切位点分别如图甲、乙所示，电泳检测结果如图丙。下列相关叙述错误的是（ ）
A．操作过程中需要用到的工具有限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体
B．构建表达载体时应选用BamHI和HindⅢ这两种限制酶
C．PCR反应过程中每次循环都要经历目的各不相同的两次升温和一次降温
D．由图丙电泳结果可知，1、2、3、4号转基因棉花均培育成功
【答案】BD
【分析】基因工程的基本操作程序是：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。
【详解】A、该操作需借助基因工程才能实现，因此操作过程中需要用到的工具有限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体，A正确；
B、由图可知：构建基因表达载体时，应选用BclⅠ和HindⅢ这两种限制酶，若用BamHⅠ，则目的基会因为产生相同的末端而出现自身环化的现象，B错误；
C、PCR反应过程中每次循环都要经历目的各不相同的两次升温（第一次使目的基因变性，第二次使目的基因延伸）和一次降温（使目的基因复性），C正确；
D、光敏色素基因A含大约256个碱基对，由图丙电泳结果可知，1、2、3、4号均导入光敏色素基因A成功，但转基因棉花是否培育成功还需要进行生物个体水平上的鉴定，D错误。
故选BD。
51．科研人员将酿酒酵母质粒上的丙酮酸脱氢酶基因（PD）替换为植物乳杆菌中的乳酸脱氢酶基因（LPG），可获得乳酸乙酯（白酒香味的主要来源）高产菌株，过程如图。下列分析合理的是（　　）

A．转入的LPG基因表达产物不能影响酿酒酵母的活性
B．LPG基因替换质粒上的PD基因需要两端携带相同基因片段
C．标记基因Ampr可检测是否成功构建乳酸乙酯高产菌株
D．可以利用PCR技术筛选含有LPG基因的受体细胞
【答案】ABD
【分析】分析题图：图示是采用基因工程技术将酿酒酵母质粒上的丙酮酸脱氢酶基因(PD)替换为植物乳杆菌中的乳酸脱氢酶基因(L-PG)，从而获得乳酸乙酯高产菌株。
【详解】A、目的基因表达产物不能影响受体细胞的生存和活性，因此转入的L-PG基因表达产物不能影响酿酒酵母活性，A正确；
B、LPG基因替换质粒上的PD基因需要两端携带相同基因片段，即相同的黏性末端，B正确；
C、标记基因Ampr可筛选含有目的基因的受体细胞，但不能检测是否成功构建乳酸乙酯高产菌株，C错误；
D、PCR技术是一项体外扩增基因的技术，依据碱基互补配对原则，可以用于筛选含有L-PG基因的受体细胞，D正确。
故选ABD。
52．为获得转G3-GFP融合基因纯合小鼠，科研人员将绿色荧光蛋白（GFP）基因和G3基因拼接到一起（如图1），然后导入小鼠受精卵，再通过PCR和琼脂糖凝胶电泳检测了新生小鼠的基因型（如图2）。下列说法错误的是（ ）
A．基因表达时图1中基因的启动子区和编码区均能转录
B．拼接GFP基因和G3基因时需要限制酶和DNA连接酶
C．由图可知，PCR检测时选择的引物是引物1和引物3
D．图2中的小鼠乙是转入G3-GFP融合基因的纯合小鼠
【答案】AC
【分析】PCR技术是聚合酶链式反应的缩写，是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
【详解】A、基因表达时图1中基因编码区能转录，启动子区不转录，A错误；
B、构建目的基因的表达载体时，需要采用限制性内切核酸酶和DNA连接酶，故将GFP基因整合到野生型小鼠G3基因一端时，需要的酶主要有限制性内切核酸酶、DNA连接酶，B正确；
C、由图可知，PCR检测时选择的引物是引物1和引物2，C错误；
D、选择引物1和引物2进行扩增，整合GFP基因后，核酸片段变长，2号个体只有大片段，所以2号个体是G3-GFP融合基因纯合子，D正确。
故选AC。
53．下图为通过DNA分子杂交鉴定某特定DNA是否导入细菌的示意图。下列叙述错误的是（ ）

A．根据培养皿中菌落数可以准确计算样品中含有的活菌实际数目
B．重组质粒与探针能进行分子杂交是因为碱基排列在DNA分子内侧
C．放射自显影结果可显示原培养皿中含有特定DNA的细菌菌落位置
D．外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制
【答案】ABD
【分析】分析题图：图示为通过DNA分子杂交鉴定含有某特定DNA的细菌克隆示意图，先采用DNA分子杂交鉴定含有某特定DNA的细菌，再采用放射自显影显示原培养皿中含有特定DNA的细菌菌落位置，最后进行克隆化培养。
【详解】A、通过菌落数只能大约推测活菌数，不能准确计算样品中含有的活菌实际数目，A错误；
B、重组质粒与探针能进行分子杂交是因为DNA分子的碱基互补配对原则，该过程中DNA分子需要解旋为单链暴露碱基与探针配对，B错误；
C、放射自显影结果可以显示原培养皿中含有特定DNA的细菌菌落位置，因为菌落附着在膜上的位置是固定的，放射自显影后可以一一对应起来，C正确；
D、外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能表达，而复制需要有复制原点，D错误。
故选ABD。
54．为获得导入R基因的转基因小鼠，科研人员进行了如下图所示的操作过程。相关叙述正确的是（ ）
A．过程①需用促性腺激素处理以获得更多的卵母细胞
B．过程②操作中通常需多个表达载体和多个受精卵
C．过程③需使用药物抑制雌鼠b对植入胚胎的免疫排斥
D．过程④处理的目的是使多只雌鼠b处于受孕准备状态
【答案】ABD
【分析】1、动物发情排卵后，同种动物的供、受体生殖器官的生理变化是相同的。这就为供体的胚胎移入受体提供了相同的生理环境。
2、受体对移入子宫的外来胚胎不发生免疫排斥反应。这为胚胎在受体的存活提供了可能。
【详解】A、为了胚胎移植成功往往需要更多的卵母细胞，所以过程①用促性腺激素对供体进行超数排卵处理，A正确；
B、将目的基因导入受体细胞用多个表达载体和多个受精卵可以提高成功率，所以过程②操作中通常需多个表达载体和多个受精卵，B正确；
C、受体对移入子宫的外来胚胎不发生免疫排斥反应，故过程③不需要抑制雌鼠b对植入胚胎的免疫排斥，C错误；
D、胚胎移植成功需要受体和供体达到相同的生理状态，所以过程④处理的目的是使多只雌鼠b处于受孕准备状态，D正确。
故选ABD。
55．“DNA粗提取与鉴定”实验的基本过程是：裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述正确的是（　　）
A．裂解：使细胞破裂释放出DNA等物质
B．分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等
C．沉淀：可反复多次以提高DNA的纯度
D．鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色
【答案】ABC
【分析】DNA粗提取和鉴定的原理：
1、DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同（DNA在0.14mol/L的氯化钠中溶解度最低）；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精。
2、DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性不同。
3、DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。
【详解】A、裂解是加蒸馏水让细胞吸水涨破，释放出DNA等物质，A正确；
B、DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2mol/L的NaCl溶液， 将溶液过滤，即可将混合物中的多糖、蛋白质等与DNA分离，B正确；
C、DNA不溶于酒精，而某些蛋白质溶于酒精，可以反复多次用酒精沉淀出DNA，提高DNA纯度，C正确；
D、将DNA溶解于NaCl，加入二苯胺试剂，需要沸水浴加热，待冷却后，能呈现蓝色，D错误。
故选ABC。
56．我国科学家研究发现，真核细胞的核基因表达调节机制——内含子miRNA通过下调转录因子来调控基因的表达，图甲和图乙是发生在细胞核内的正向和反向调节机制模式图。请据所学知识分析，下列叙述正确的是
A．内含子miRNA是在分专题03 基因工程（综合题30道）
1．土壤盐渍化会影响水稻生长发育，研究人员将水稻耐盐碱基因OsMYB56导入不耐盐碱水稻品种吉粳88中，培育耐盐碱水稻新品种，其操作流程及可能用到的限制酶如图所示，其中TetR为四环素抗性基因，AmpR中为氨苄青霉素抗性基因，①～⑤表示操作过程。回答下列问题：
限制酶 BamHⅠ BclⅠ SmaⅠ Sau3AⅠ
识别位点及切割位点 -G↓GATCC- -T↓GATCA- -CCC↓GGG -↓GATC-
(1)在构建基因表达载体时，为防止目的基因和质粒的自身环化，最好使用 （填“1种”或“2种”）限制酶，由图表可知，使用的限制酶是 。
(2)过程②中需要先用 处理根瘤农杆菌，使根瘤农杆菌处于 （填生理状态），以便将基因表达载体导入细胞。
(3)过程③中利用了质粒中的T-DNA 的特点过程④中，从愈伤组织到幼苗的培养过程需要的激素主要有生长素和 ，该过程还需要光照，其作用是 （答出1点）。
【答案】(1) 2种 BclⅠ和SmaⅠ
(2) Ca2+（或CaCl2） 感受态（或能吸收周围环境中的DNA分子的状态）
(3) 可转移至受体细胞，并将其整合到受体细胞的染色体DNA上 细胞分裂素 诱导叶绿素的形成，满足叶绿体利用光能制造有机物的需要
【分析】基因工程基本操作程序：目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）据图可知，质粒中的两个标记基因TetR和AmpR中都含有限制酶BamHⅠ的识别序列，如果用限制酶BamHⅠ，会破坏质粒中的两个标记基因，为防止质粒自身环化，保证OsMYB56基因和酶切后的质粒定向连接，需要用两种酶，因此过程①可以选择限制酶BclⅠ和SmaⅠ。
（2）过程②中需要先用Ca2+处理根瘤农杆菌，使根瘤农杆菌处于能吸收周围环境中的DNA分子的状态，以便将基因表达载体导入细胞。
（3）农杆茵细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA(可转移的DNA)转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上，因此质粒中的T-DNA具有可转移至受体细胞，并将其整合到受体细胞的染色体DNA上的特点。根据农杆菌的这种特点，如果将目过程④中，从愈伤组织到幼苗的培养过程需要的激素主要有生长素和细胞分裂素。光照能诱导叶绿素的形成，满足叶绿体利用光能制造有机物的需要，该过程中还需要光照条件。
2．二苯乙烯苷是我国传统药材何首乌特有的药效成分，具有抗氧化、清除自由基等功效。合成二苯乙烯苷的关键酶是芪合酶（STS），为获得大量的STS，研究人员利用质粒（如图2）将STS基因（如图1）转化到大肠杆菌细胞内进行表达。回答下列问题：

(1)利用PCR扩增STS基因时应选择的引物是 ，为使STS基因与质粒正确连接，在设计PCR引物时需在所选引物的 （填“3′”或“5′”）端分别增加相应限制酶的酶切位点，同时选用两种限制酶 切割质粒。
(2)将重组质粒导入大肠杆菌细胞内进行表达，需将大肠杆菌用 处理，以增大细胞壁的通透性，使 容易进入受体细胞。
(3)可将转化后的大肠杆菌接种到含 的培养基上进行筛选。能在该培养基上形成菌落的大肠杆菌是否一定含有STS基因？请判断并说明理由： 。除用选择培养基外，检测转基因是否成功的生物技术还有 （答2种）。
【答案】(1) 引物2和引物3 5' XhoI和NdeI
(2) Ca2+ 含有STS基因的重组质粒（或周围环境中的DNA）
(3) 氨苄青霉素 不一定，含氨苄青霉素抗性基因的未重组载体（空白质粒）也可导入大肠杆菌，使大肠杆菌在培养基上形成菌落 PCR技术（电泳）、抗原一抗体杂交技术、分子杂交技术
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术，个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）根据引物由5'→3'方向延伸，可知扩增目的基因需使用引物2和引物3。为使STS基因与质粒正确连接，在设计PCR引物时需在所选引物的5′端分别增加相应限制酶的酶切位点，以确保目的基因两侧与质粒有相同的酶切位点。质粒中存在三种限制酶切位点，其中限制酶SacⅠ会破坏抗生素标记基因，因此切割质粒可用限制酶XhoI和NdeI切割。
（2）将目的基因导入大肠杆菌中，常用Ca2+处理，使其处于一种容易吸收周围DNA的状态，使含有STS基因的重组质粒容易进入受体细胞。
（3）质粒上含有氨苄青霉素抗性基因，可将转化后的大肠杆菌接种到含氨苄青霉素的培养基上进行筛选。能在此培养基上形成的菌落可能是含氨苄青霉素抗性基因的未重组载体导入大肠杆菌，使大肠杆菌在培养基上形成菌落。检测目的基因是否成功导入受体细胞并成功表达，可采用PCR技术、抗原—抗体杂交技术和核酸分子杂交技术。
3．1965年中国科学家人工合成了具有生物活性的结晶牛胰岛素，摘取了人工合成蛋白质的桂冠。人胰岛素基因表达的最初产物是一条肽链构成的前胰岛素原，经下图1所示的过程形成具生物活性的胰岛素。此后科学家又提出了利用基因工程改造大肠杆菌生产人胰岛素的两种方法：AB法是根据胰岛素A、B两条肽链的氨基酸序列人工合成两种DNA片段，利用工程菌分别合成两条肽链后将其混合自然形成胰岛素；BCA法是利用胰岛B细胞中的mRNA得到胰岛素基因，表达出胰岛素原后再用特定酶切掉C肽段。这两种方法使用同一种质粒作为载体。请据下图分析并回答下列问题：

(1)由于密码子具有简并性，AB法中人工合成的两种DNA片段均有多种可能的序列。 （填“AB”、“BCA”或“AB和BCA”）法获取的目的基因中不含人胰岛素基因启动子。
(2)图2是利用基因工程生产人胰岛素过程中使用的质粒及目的基因的部分结构。为使目的基因与载体正确连接，在设计PCR引物时可添加限制酶 的识别序列。通过上述方法获得人的胰岛素基因后，需要通过PCR技术进行扩增，已知胰岛素基因左端①处的碱基序列为-CCTTTCAGCTCA-，则其中一种引物设计的序列是5’ 3’。
(3)β-半乳糖苷酶可以分解无色的X-gal产生蓝色物质使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。经Ca2+处理的大肠杆菌与重组质粒混合培养一段时间后，采用 法将大肠杆菌接种到添加了 的培养基上筛选出 色的菌落即为工程菌种。
【答案】(1)AB和BCA
(2) XhoⅠ和MunⅠ -CTCGAGCCTTTCAGCTCA-
(3) 稀释涂布平板 氨苄青霉素和X-gaⅠ 白色
【分析】PCR是聚合酶链式反应的简称，指在引物指导下由酶催化的对特定模板（克隆或基因组DNA）的扩增反应，是模拟体内DNA复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的一种技术；因为DNA合成时，新链的延伸方向是5’→3’，因此，设在计PCR引物时需要在5’端加上酶切位点。
【详解】（1）由于密码子具有简并性，同一个氨基酸可能有多个密码子编码，对应的碱基序列可能有多种，所以以肽链为模板合成DNA时可能具有多种序列。由于启动子是不转录的，此外转录产生的肽链经过加工起始的一段大部分会被切除，所以以肽链或mRNA为模板合成的DNA分子上都不具有启动子，所以AB和BCA法获取的目的基因中不含人胰岛素基因启动子。
（2）为使目的基因与载体正确连接，因为目的基因中含有Sa1I和NheI酶切位点，因此，结合质粒中含有的限制酶识别系列，在设计PCR引物时可添加限制酶XhoⅠ和MunⅠ的识别序列。目的基因要插在启动子和终止子之间，以便目的基因能够正常表达，为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，可使用不同的限制酶共同切割目的基因和质粒。通过上述方法获得人的胰岛素基因后，需要通过PCR技术进行扩增，已知胰岛素基因左端①处的碱基序列为-CCTTTCAGCTCA-，则其中一种引物设计的序列是5’ -CTCGAGCCTTTCAGCTCA-3’。引物是一小段能与DNA母联的一段碱基序列互补配对的段单链核酸。因为DNA合成时，新链的延伸方向是5’到3’，因此在设计引物时要在5’端加上酶切位点。
（3）β-半乳糖苷酶可以分解无色的X-gal产生蓝色物质使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。经Ca2+处理的大肠杆菌与重组质粒混合培养一段时间后，其目的是提高转化的效率，为筛选成功导入目的基因的受体细胞，其操作为：为了获得单菌落可采用稀释涂布平板法将大肠杆菌接种到添加了氨苄青霉素和X-gaⅠ的培养基上，由于重组质粒中含有抗氨苄青霉素的基因，且IacZ基因被破坏，因此能在该培养基上生长且不能使X-gal变为蓝色的菌落为目的菌，即从培养基上筛选出白色的菌落即为工程菌种。
4．凝乳酶是奶酪生产中的关键性酶，它能水解多肽链中苯丙氨酸和甲硫氨酸之间的肽键以促使牛奶凝结来生产奶酪；提取凝乳酶的传统方法是从未断奶小牛的胃黏膜里提取．此方法产量低且昂贵。如今科学家运用基因工程技术，将编码该酶的基因转移到了微生物细胞中，实现了牛凝乳酶的批量生产。图1和图2表示质粒和凝乳酶基因的结构示意图，如表为不同限制酶识别的碱基序列及切割位点。回答下列相关问题：

限制酶 PvitⅡ K pnⅠ EcoRⅠ PstⅠ Bam HⅠ Sau3AⅠ
识别序列 CAG↓CTG G↓GTACC G↓AATTC CTGC↓AG G↓GATCC ↓GATC
(1)获取小牛胃黏膜的单细胞需要将剪碎的小牛胃黏膜用 处理；对获得的单细胞进行培养时需要定期更换培养液，目的是 。从培养的牛胃黏膜细胞中提取 ，再逆转录形成DNA，再以此DNA为模板利用PCR技术获得凝乳酶基因。
(2)将图2中的凝乳酶基因与图1质粒构建基因表达载体时，最好选择 切割目的基因和质粒，并利用 （只写1种）连接酶进行连接。若将该基因表达载体导入受体细胞后，凝乳酶基因能稳定存在但不能表达，原因可能是 。
(3)可用非转基因牛凝乳酶作为对照检验由酵母菌发酵工程生产的凝乳酶的活性。已知凝乳酶能催化乳汁凝固，将一定量的凝乳酶与一定量的乳汁混合，控制 （写出2点）等条件适宜，观察凝乳需要的时间越 （填“长”或“短”），说明凝乳酶的活性越高。
【答案】(1) 胰蛋白酶（或胶原蛋白酶） 去除代谢产物，防止细胞代谢产物积累对细胞自身造成伤害 总mRNA
(2) PvitⅡ T4DNA连接酶 没有启动子,没有拼接到受体细胞的DNA上
(3) 温度、pH 短
【分析】1、基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；（3）将目的基因导入受体细胞；（4）目的基因的检测与鉴定；
2、动物细胞悬液的制备方法：取动物胚胎或幼龄动物器官、组织，将材料剪碎，并用胰蛋白酶或用胶原蛋白酶处理，形成分散的单个细胞，将处理后的细胞移入培养基中配成一定浓度的细胞悬浮液。
【详解】（1）要获得小牛胃黏膜的单细胞需要将剪碎的小牛胃黏膜组织用胰蛋白酶(或胶原蛋白酶)处理；对获得的单细胞进行培养时需要定期更换培养液，目的是去除代谢产物，防止细胞代谢产物积累对细胞自身造成伤害；从培养的牛胃黏膜细胞中提取总mRNA再逆转录形成DNA，再以此DNA为模板利用PCR技术获得凝乳酶基因；
（2）由图1和图2可知，质粒和含目的基因的DNA分子中都有限制酶PvitⅡ的酶切位点，因此将图2中的凝乳酶基因与图1质粒构建基因表达载体时，最好选择限制酶PvitⅡ切割目的基因和质粒，以产生相同的黏性末端，且为平末端，所以用T4DNA连接酶进行连接；若将该基因表达载体导入受体细胞后，凝乳酶基因能稳定存在但不能表达，原因可能是没有启动子，没有拼接到受体细胞的DNA分子上，导致该基因无法表达；
（3）检验由酵母菌发酵工程生产的凝乳酶的活性时，将一定量的凝乳酶与一定量的乳汁混合，要控制温度、pH等影响酶活性的条件；如果凝乳酶的活性越高，则凝乳需要的时间就越短。
5．水稻胚乳可作为生物反应器用于开发功能性产品。从猪瘟病毒抗原蛋白的预期功能出发，研究小组设计其预期的结构，推测应有的氨基酸序列，合成新的基因X。利用PCR技术对其进行扩增并连接启动子1，形成Z片段。把Z片段插入Ti质粒的T-DNA中，将构建好的基因表达载体导入水稻细胞完成转化，在胚乳中获得相应蛋白，最终将蛋白进一步加工为植物源猪瘟疫苗。相关信息如图所示。

回答下列问题。
(1)研究小组通过PCR扩增Z片段，延伸过程中，4种脱氧核苷酸在 催化作用下合成新的DNA链。酶切时，限制酶识别序列的重叠会降低切割效率。为构建基因表达载体，选择限制酶HindⅢ和 进行切割，可使Z片段插入T-DNA的效率最高。为使基因能够正常表达，质粒上的N和J应都为 。
(2)为获得含蛋白X的水稻材料，首先诱导水稻种子脱分化形成 ，然后通过 的侵染，使目的基因进入水稻细胞并完成转化，再将其转接到含特定激素的培养基上，诱导其 形成具有根、茎、叶的完整植株。
(3)为验证水稻中目的基因X是否表达（转录和翻译），分子水平上的检测方法有 （答出2点即可）。
(4)从猪瘟病毒抗原蛋白的预期功能出发，合成基因X，进而得到猪瘟疫苗的过程属于 工程的范畴。
【答案】(1) 耐高温的DNA聚合酶（Taq DNA聚合酶） EcoR Ⅰ 终止子
(2) 愈伤组织 农杆菌 再分化
(3)通过PCR技术检测水稻细胞中目的基因X是否转录出了mRNA；从转基因水稻中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交检测是否翻译出了蛋白质
(4)蛋白质
【分析】1、基因工程是一项体外DNA重组技术，需要借助限制酶、 DNA 连接酶和载体等工具才能进行。它的基本操作程序包括：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定。
2、PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
3、蛋白质工程是基因工程的延伸，是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。
【详解】（1） PCR是根据DNA半保留复制的原理在体外进行DNA复制的技术，其过程为：变性-复性-延伸，在子链延伸过程中，4种脱氧核苷酸要在耐高温的DNA聚合酶催化下合成新的子代DNA链。依题意，酶切时，限制酶识别序列的重叠会降低切割效率。Xba Ⅰ与Hind Ⅲ识别序列有重叠，不符合题目要求。EcoR Ⅴ所切末端为平末端，连接效率低，不符合题目要求。EcoR Ⅰ识别序列与Hind Ⅲ识别序列无重叠，产生的切口是黏性末端，连接效率相对平末端高。为使基因能够正常表达，基因结构的上游和下游各有启动子和终止子，因此，N和J应都为终止子。
（2）为获得含蛋白X的水稻材料，首先诱导水稻种子脱分化形成愈伤组织，然后通过农杆菌的侵染，使目的基因进入水稻细胞并完成转化，再将其转接到含特定激素的培养基上，诱导其再分化形成具有根、茎、叶的完整植株。
（3） 为验证水稻中目的基因X是否表达（转录和翻译），可通过PCR技术检测水稻细胞中目的基因X是否转录出了mRNA；可从转基因水稻中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交检测是否翻译出了蛋白质。
（4）蛋白质工程是基因工程的延伸，是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。因此，从猪瘟病毒抗原蛋白的预期功能出发，合成基因X，进而得到猪瘟疫苗的过程属于蛋白质工程的范畴。
6．In-Fusion技术是一项新型的无缝克隆技术。技术关键是要在目的基因两端构建与线性化质粒末端相同的DNA序列（即同源序列，通常为15~20bp），然后用In—Fusion酶（能识别双链线性化DNA片段5'→3'末端16个碱基，并使其降解）处理即可实现无缝连接。它的操作步骤（如图）大致为：①利用PCR技术将质粒线性化；②PCR扩增出两端含线性化质粒同源序列的目的基因；③目的基因与线性化质粒同源区域在In—Fusion酶作用下形成重组质粒；④将重组质粒导入受体细胞。回答下列问题：

(1)过程①需要用到的酶是 ，质粒线性化前后所含有的游离磷酸基团的个数分别为 个。
(2)过程③中，同源序列1、2中的碱基序列不同，这样设计的好处是 。
(3)过程④中，用 处理大肠杆菌，以便重组质粒导入受体细胞。重组质粒利用大肠杆菌细胞中的DNA聚合酶和 酶，实现完全环化。
(4)通过检测大肠杆菌的致死率可反映其转化后的抗性效果。在含 的液体培养基中培养一段时间，然后分别用显微镜计数法和稀释涂布平板法进行计数，计数结果分别是M、N，则致死率可用 ×100%表示，此结果较真实值偏高。
【答案】(1) 耐高温的DNA聚合酶（或TaqDNA聚合酶） 0、2
(2)防止目的基因反向连接，防止线性化质粒或目的基因自身环化
(3) Ca2+ DNA连接酶
(4) 氨苄青霉素 （M-N）/M
【分析】分析题图：①是将质粒线性化；②使PCR扩增出两端含线性化质粒同源序列的目的基因；③使目的基因与线性化质粒同源区域在In-Fusion酶作用下形成重组质粒；④是将重组质粒导入受体细胞。
【详解】（1）过程①是利用两种引物进行的质粒线性化过程，该过程属于PCR技术的应用，故需要TaqDNA聚合酶；环状质粒无游离磷酸基团，一条DNA链含有一个游离的磷酸基团；线性化DNA是双链，则含有2个游离的磷酸基团，故质粒线性化前后所含有的游离磷酸基团的个数分别0和2。
（2）过程③是基因表达载体的构建过程，该过程中，同源序列1、2中的碱基排序不同，这样设计的好处是防止目的基因反向连接，防止线性化质粒或目的基因的自身环化，以保证目的基因能够正确连接并表达。
（3）Ca2+能促进细菌摄取外源的DNA，常使用CaCl2溶液制备感受态细胞，进而转入外源DNA，故过程④中，用Ca2+处理大肠杆菌，以便重组质粒导入受体细胞。DNA连接酶能将DNA片段连接成一个重组DNA分子，故重组质粒利用大肠杆菌细胞中的DNA聚合酶和DNA连接酶，实现完全环化。
（4）在含氨苄青霉素的液体培养基中培养一段时间，然后分别用显微镜计数法（死菌和活菌均被计数）和稀释涂布平板法（用于活菌计数）进行计数。由于在用稀释涂布平板法计数时，当两个或多个细胞连在一起时，在平板上观察到的是一个菌落，故若计数结果分别是M、N，致死率可用（M-N）/M×100％表示，会导致N偏小，进而导致此结果较真实值偏大。
7．研究人员利用一种从某生物体内分离出的抗盐碱基因，通过基因工程、植物细胞工程等现代生物技术，培育出了抗盐碱大豆，使大豆能在盐碱地中正常生长，提高了大豆的产量。下图为培育流程，其中①~⑥为不同过程，其中AmpR为氨苄青霉素抗性基因，AluⅠ、SmaⅠ、HindⅢ和PstⅠ为限制酶。根据所学知识，回答下列问题：
(1)不用限制酶AluⅠ切割抗盐碱基因的原因是 。用限制酶切割抗盐碱基因和质粒时，选择SmaⅠ和PstⅠ比只选择PstⅠ的优点是 （答出两点）。
(2)研究人员用AluⅠ切割原质粒得到7.7kb的DNA片段，切割重组质粒得到3.0kb、4.8kb的DNA片段；SmaⅠ和PstⅠ切割原质粒得到2.3kb、5.4kb的DNA片段（注意：DNA片段大小与图中所画比例一致），则抗盐碱基因的长度为 。
(3)利用PCR技术可获取大量目的基因，PCR反应体系中有两种引物，在复性时引物会结合到互补DNA链上，对两种引物的设计要求之一是 ；除引物外，PCR反应体系中还需要加入 （答出两点）。
(4)将目的基因导入植物细胞时，常采用农杆菌转化法，将目的基因插入Ti质粒中。利用Ti质粒，通过农杆菌转化法可将抗盐碱基因导入大豆愈伤组织细胞的理论依据是 。
(5)为了筛选出成功导入重组质粒的农杆菌，1号培养基中需要加入的物质是 。诱导组织细胞脱分化的是 号培养基。图中④⑤⑥过程，所利用的生物技术的理论基础是 。
【答案】(1) 限制酶AluⅠ切割会破坏抗盐碱基因 防止目的基因和质粒反向连接；防止目的基因、质粒自身环化
(2)2.4kb
(3) 两种引物之间不能碱基互补配对 模板、dNTP、Taq DNA聚合酶、PCR缓冲液等
(4)农杆菌中Ti质粒上的T-DNA能转移并整合至植物细胞染色体DNA上
(5) 氨苄青霉素 3 植物细胞具有全能性
【分析】据图分析，图示为利用基因工程和细胞工程培育出抗盐碱大豆的过程，其中①表示构建基因表达载体；②表示将目的基因导入农杆菌细胞；③表示筛选含有目的基因的农杆菌；④表示脱分化形成愈伤组织的过程；⑤⑥表示幼苗培育成成体的过程。
【详解】（1）据图可知，抗盐碱基因中包含了AluⅠ限制酶识别序列，若用限制酶AluⅠ切割则会破坏抗盐碱基因；选择Sma I和Pst I两种限制酶分别切割抗盐碱基因和质粒，抗盐碱基因与质粒各自能形成不能互补配对的两个黏性末端，同时抗盐碱基因与质粒之间的黏性末端又能互补配对，相比只选择PstⅠ一种酶进行切割的优点是可防止目的基因和质粒反向连接、防止目的基因、质粒自身环化。
（2）研究人员用AluⅠ切割原质粒得到7.7kb的DNA片段，可知原质粒的长度为7.7kb，切割重组质粒得到3.0kb、4.8kb的DNA片段，可知重组质粒的长度为7.8kb，重组质粒是用SmaⅠ和PstⅠ酶切后构建而来，且DNA片段大小与图中所画比例一致，已知SmaⅠ和PstⅠ切割原质粒得到2.3kb、5.4kb的DNA片段，故抗盐碱基因替换了原质粒中2.3kb的DNA片段，故抗盐碱基因的长度为7.8-5.4=2.4kb。
（3）利用PCR技术可获取大量目的基因，PCR反应体系中有两种引物，在复性时引物会结合到互补DNA链上，对两种引物的设计要求之一是两种引物之间不能碱基互补配对，以防止引物之间结合形成双链，降低引物与DNA模板链结合的效率；PCR反应体系中除引物外，还包括模板、dNTP、Taq DNA聚合酶、PCR缓冲液等。
（4）Ti质粒上的T-DNA具有可转移的特性，当农杆菌侵染大豆愈伤组织细胞时，农杆菌中Ti质粒上的T-DNA包括插入其中的目的基因可转移并整合至受体细胞染色体DNA上。
（5）据图分析，质粒中含有氨苄青霉素抗性基因，故含重组质粒的农杆菌具有抗氨苄青霉素的特性，所以为了筛检成功导入重组质粒的农杆菌，1号培养基需要加入氨苄青霉素；外植体经脱分化可形成愈伤组织，据图分析，3号培养基可诱导组织细胞脱分化形成愈伤组织；图中④⑤⑥过程，为植物的组织培养技术，所利用的理论基础是植物细胞具有全能性。
8．某真菌的W基因可编码一种可高效降解纤维素的酶，已知图乙中W基因转录方向是从左往右。为使放线菌产生该酶，以图甲中质粒为载体，进行重组DNA技术的相关操作。回答下列问题：
限制酶 BamHⅠ EcoRⅠ MfeⅠ KpnⅠ HindⅢ
识别序列及切割位点（5′-3′） G↓GATTC G↓AATTC C↓AATTG GGTAC↓C A↓AGCTT
(1)若要从土壤中筛选出纤维素分解菌，需要配制以为 唯一碳源的固体培养基并进行灭菌处理。为便于筛选可在培养基中加入 染料。
(2)限制酶主要是从 （填“真核生物”或“原核生物”）中分离纯化出来的。结合上述图表分析应使用限制酶 切割图甲中质粒，使用限制酶切割 图乙中含W基因的DNA片段，以获得能正确表达W基因的重组质粒。
(3)与质粒中启动子结合的酶是 。启动子通常具有物种特异性，在质粒中插入W基因，其上游启动子应选择 （填生物类型）启动子，有利于W基因在目的菌中的表达产生高效降解纤维素的酶。
(4)W基因转录的模板链是 （填“甲链”或“乙链”）。利用PCR技术对W基因进行扩增时子链延伸的方向是 。
【答案】(1) 纤维素 刚果红
(2) 原核生物 MfeI、HindⅢ EcoRI、HindⅢ
(3) RNA聚合酶 放线菌
(4) 乙链 5'→3'
【分析】一个基因表达载体的组成，除目的基因、标记基因外，还必须有启动子、终止子等。启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游紧挨转录的起始位点，它是RNA聚合酶识别和结合的部位。有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质。
【详解】（1）纤维素分解菌能分解纤维素为葡萄糖作为碳源，其他微生物不能分解纤维素，可以用纤维素为唯一碳源的培养基筛选纤维素分解菌。筛选纤维素分解菌可用刚果红染料，刚果红可与纤维素反应形成红色复合物。
（2）限制酶主要是从原核生物分离纯化出来的。根据题图信息“图中W基因转录方向是从左往右”、“质粒启动子到终止子方向为顺时针”，故重组质粒的启动子应在W基因左侧，终止子应在W基因右侧，W基因右侧只能用HindⅢ切割，W基因左侧有BamHI、KpnI、EcoRI三种酶切位点，结合质粒情况及切割位点识别序列，应使用限制酶MfeI、HindⅢ切割图中质粒，使用限制酶EcoRI、HindⅢ切割图中含W基因的DNA片段，以获得能正确表达W基因的重组质粒，因为限制酶MfeI和限制酶EcoRI切割露出相同的粘性末端。
（3）启动子启动基因的转录，故与质粒中启动子结合的酶是RNA聚合酶；根据题干信息“启动子通常具有物种特异性”，目标是使放线菌产生高效降解纤维素的酶，故应选择放线菌的质粒，在质粒中插入W基因，其上游启动子应选择放线菌启动子。
（4）W基因转录方向是从左向右，mRNA链的合成方向为5'→3'，与乙链从左向右3'→5'互补，故W基因转录的模板链是乙链。利用PCR技术扩增目的基因的原理是DNA半保留复制，子链延伸方向为5'→3'。
9．微生物天然产物的合成依赖于基因组中的合成基因，这些编码特定产物的基因通常聚集排列，形成生物合成基因簇。已知阿卡波糖生物合成基因簇全长大约41kb，研究人员的操作步骤如下：
①通过设计合适的gRNA结合Cas9酶在体外对基因组进行精准切割，释放完整的基因簇片段；
②借助酵母菌将完整基因簇与P质粒进行正确连接形成重组质粒（58kb），并实现基因簇的克隆；
③将重组质粒导入放线菌，获得基因簇过表达的工程菌株。
请回答下列问题：
(1)图1中Cas9酶相当于 酶，步骤②是基因工程基本操作程序中的 （填步骤）。
(2)酵母菌的纯培养通常包括配制培养基、 、 、分离和培养等步骤，图1中进行初步阳性筛选的方法是 。
(3)科研人员设计5对引物如图2，通过PCR技术来验证阿卡波糖生物合成基因簇的完整性。请用“+”表示会出现相应扩增产物，“-”表示不会出现相应扩增产物，预期重组质粒的PCR结果并补充完成下表 。
引物对 1 2 3 4 5
扩增产物
(4)相同条件下，将基因簇过表达的工程菌株与正常菌株同时进行发酵培养，一段时间后，对比两培养瓶中阿卡波糖的含量。经多次验证，均发现前者产量更低，这与实验预期相违背，推测其可能原因是 。
【答案】(1) 限制/限制性内切核酸 构建基因表达载体
(2) 灭菌 接种 在培养基中添加安普霉素进行初步筛选
(3)
引物对 1 2 3 4 5
扩增产物 — — ＋ ＋ ＋
(4)培养条件不利于工程菌株的生长（质粒过大不利于工程菌株的生长）
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）结合题意可知，Cas9酶在体外对基因组进行精准切割，故图1中Cas9酶相当于限制酶（限制性内切核酸），破坏磷酸二酯键，步骤②是基因工程基本操作程序中的基因表达载体的构建，也是基因工程的核心步骤。
（2）酵母菌的纯培养通常包括配制培养基、灭菌、接种、分离和培养等步骤，图1中进行初步阳性筛选的方法是用含安普霉素的培养基进行筛选，能存活下来的则是阳性细菌。
（3）结合图1，质粒中的DNA复制为逆时针，再根据图2中各引物对的分布以及阿卡波糖生物合成基因簇所插入的位置可知，引物1、2不会出现相应扩增产物，而引物3、4、5会出现相应扩增产物，即：预期结果为：
引物对 1 2 3 4 5
扩增产物 - - + + +
。
（4）依据题意，相同条件下，将基因簇过表达的工程菌株与正常菌株同时进行发酵培养，一段时间后，对比两培养瓶中阿卡波糖的含量。经多次验证，均发现前者产量更低，这与实验预期相违背，推测其可能原因是培养条件不利于工程菌株的生长（质粒过大不利于工程菌株的生长）。
10．在医药领域，单克隆抗体在疾病诊断和病原体鉴定中发挥重要作用，但鼠源的单抗容易在人体内引发人抗鼠抗体反应(HAMA)，从而消弱其治疗的有效性。科学家对鼠源杂交瘤抗体进行改造，生产出效果更好的鼠一人嵌合抗体，主要流程如下图所示。回答下列有关问题：
(1)抗体由两条L链和两条H链组成，每条链都含V区和C区，其中决定抗体特异性的是 区。
(2)获取VL基因和VH基因时，通常先从生长状态良好的杂交瘤细胞中提取总RNA，再通过反转录法来合成。图中的Sp2/0细胞最可能是 细胞。
(3)为了便于嵌合基因与载体连接，需在扩增嵌合基因时在引物的 端加上特定的限制性酶切位点，且常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，主要目的是 。
(4)上述基因表达载体中，除含有嵌合基因外，还应含有启动子和 （答出两个即可），其中启动子的作用是 。
【答案】(1)V
(2)骨髓瘤
(3) 5′ 使DNA片段能定向插入表达载体，减少自连
(4) 标记基因、终止子、复制原点 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动转录
【分析】单克隆抗体的制备：
1、细胞来源：B淋巴细胞:能产生特异性抗体，在体外不能无限繁殖;骨髓瘤细胞:不产生专一性抗体，体外能无限繁殖。
2、杂交瘤细胞的特点：既能大量增殖，又能产生特异性抗体。
3、两次次筛选：①筛选得到杂交瘤细胞(去掉未杂交细胞以及自身融合的细胞)；②筛选出能够产生特异性抗体的细胞群。
4、两次抗体检测:专一抗体检验阳性。
5、提取单克隆抗体：从培养液或小鼠腹水中提取。
6、单克隆抗体的优点：特异性强、灵敏度高，并可能大量制备。
【详解】（1）抗体由两条L链和两条H链组成，每条链都含V区和C区，V区有人源C区，其中决定抗体特异性的是V区。
（2）获取VL基因和VH基因时，通常先从生长状态良好的杂交瘤细胞中提取mRNA（总RNA），再通过反转录法来合成。图中的Sp2/0细胞最可能是骨髓瘤细胞。
（3）为了便于嵌合基因与载体连接，需在扩增嵌合基因时在引物的5′端加上特定的限制性酶切位点，为了使DNA片段能定向插入表达载体，减少自连，常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点。
（4）基因表达载体中，除含有嵌合基因外，还应含有启动子和标记基因、终止子、复制原点，其中启动子的作用是RNA聚合酶识别和结合的部位。
11．HNFlα基因突变可引发糖尿病等疾病。HNFlα的第249位丝氨酸（S249）是其重要功能位点，为进一步研究S249的重要性，研究人员将249位丝氨酸（S）突变为丙氨酸（A），成功构建了人源HNF1αS249A转基因小鼠。下图为基因表达载体部分结构示意图，Myc为标记基因，引物F和R之间的序列长度为386bp碱基对。回答下列问题：

(1)CMV位于HNFlαcDNA上游，据此推测CMV的功能为 。
(2)为保证HNFlαcDNA准确插入载体，可利用PCR技术在其两端添加限制酶识别序列 ，应将限制酶识别序列添加在引物的 （填“5'”或“3'”）端。
(3)获得HNFlαcDNA后，可利用cDNA中间序列设计引物实现定点突变目的，从而制备HNFlα-S249AcDNA．已知HNFlα中248、249、250三个氨基酸对应的密码子序列为ACCUCUGUG，丙氨酸对应的密码子有GCU、GCC、GCG、GCA四种，为了保证引物与模板的结合效率及突变目的，请设计其中一个引物： 。
(4)利用上述基因表达载体制备转基因小鼠，请用文字和箭头写出制备流程图 。
(5)提取转基因小鼠DNA作为模板，利用引物F和R进行PCR技术扩增，经过琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。若出现 结果，初步证明转基因小鼠模型构建成功。
【答案】(1)RNA聚合酶的识别和结合位点，驱动HNF1αcDNA的转录
(2) Hind Ⅲ和Xba Ⅰ 5
(3)ACCGCTGTG或TGGCGACAC
(4)基因表达载体→显微注射→受精卵→培养→早期胚胎→胚胎移植→代孕小鼠子宫→转基因小鼠
(5)一条386bp的DNA条带
【分析】1、PCR获取目的基因时，引物的作用是界定目的基因，为DNA聚合酶提供结合位点并使DNA聚合酶能够从引物的3'端连接脱氧核苷酸。
2、科学设计引物是PCR能否成功的关键。若引物的碱基过多或引物的G、C含量过高，会造成PCR的效率偏低，收获的目的基因较少，原因是C、G之间含有3个氢键，引物与模板链结合过于紧密，变性时引物不易与模板链脱离（影响变性）。
【详解】（1）根据题意可知，CMV位于HNFlαcDNA上游，由此推测CMV可能是RNA聚合酶的识别和结合位点，驱动HNF1αcDNA的转录。
（2）为保证HNFlαcDNA准确插入载体，可利用PCR技术在其两端添加限制酶识别序列Hind Ⅲ和Xba Ⅰ，由于DNA聚合酶只能从引物的3 端开始催化脱氧核苷酸连接，故应将限制酶识别序列添加在引物的5 端。
（3）根据题意可知，HNFlα中248、249、250三个氨基酸对应的密码子序列为ACCUCUGUG，丙氨酸对应的密码子有GCU、GCC、GCG、GCA四种，为了保证引物与模板的结合效率及突变目的，则其中一个引物序列可为ACCGCTGTG或TGGCGACAC。
（4）利用上述基因表达载体制备转基因小鼠时，制备流程为基因表达载体→显微注射→受精卵→培养→早期胚胎→胚胎移植→代孕小鼠子宫→转基因小鼠。
（5）根据题意可知，引物F和R之间的序列长度为386bp碱基对，提取转基因小鼠DNA作为模板，利用引物F和R进行PCR技术扩增，经过琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，如果出现了一条386bp的DNA条带，初步证明转基因小鼠模型构建成功。
12．类胡萝卜素因众多营养保健功能而具有很高的商业价值与应用前景。现研究人员通过构建含有β-胡萝卜素酮化酶基因bkt的表达载体，转化莱茵衣藻（一种真核绿藻）以提高其类胡萝卜素产量。请回答下列问题：

(1)为了同时保留衣藻内源性启动子H-R及终止子RBCS2，应选用限制酶 对质粒pUCBKT-P和pH105进行酶切，原因是 。再利用DNA连接酶将酶切下的基因片段连接成表达载体。
(2)可利用 （填技术）大量扩增bkt基因，该技术需要在添加 离子的缓冲液中扩增基因。若产物中除了目的基因外有其他DNA片段存在，从引物角度考虑，原因可能是 。
(3)用含奇霉素的抗性培养基对转化后的莱茵衣藻进行筛选，因不同种类的绿藻对抗生素敏感浓度不同，所以要设计 的奇霉素进行实验，观察并确定 。
(4)以下是利用某两种限制酶进一步对提取的莱茵衣藻DNA进行单酶切和双酶切后的电泳结果。据此推测，提取的DNA总长度是 bp，两种限制酶切割位点之间的最短距离是 bp。

【答案】(1) Pamc Ⅰ和Xba Ⅰ 双酶切在保证目的基因的插入时还能避免目的基因自身环化和随意连接
(2) PCR 镁 引物较小，特异性较低，同时扩增出目的基因和其他DNA片段
(3) 不同浓度 菌落大小及透明圈大小
(4) 800 200
【分析】基因工程的基本工具包括限制酶、DNA连接酶和分子运输车。选择限制酶应不破坏目的基因和标记基因，尽可能保证目的基因正向插入，提高成功率。
【详解】（1）由图可知，为了同时保留衣藻内源性启动子H-R及终止子RBCS2，选择的限制酶切割位点应在启动子和终止子之间，同时双酶切在保证目的基因的插入时还能避免目的基因自身环化和随意连接，故限制酶选择为Pamc Ⅰ和Xba Ⅰ。
（2）可利用PCR大量扩增bkt基因，该技术需要在缓冲液中添加镁离子。若产物中除了目的基因外有其他DNA片段存在，从引物角度考虑，原因可能是引物较小，特异性较低，同时扩增出目的基因和其他DNA片段。
（3）用含奇霉素的抗性培养基对转化后的莱茵衣藻进行筛选，因不同种类的绿藻对抗生素敏感浓度不同，需要设计不同浓度的奇霉素进行实验，观察并确定菌落大小及透明圈大小，以筛选出抗奇霉素的绿藻。
（4）用不同酶对DNA进行单酶切时，得到一条DNA片段，说明原DNA是环状DNA，且总长度为800bp，用酶Ⅰ和酶Ⅱ联合切割时，获得的DNA片段长度分别为600bp和200bp，故两种限制酶切割位点之间的最短距离是200bp。
13．甜菜是我国重要的糖料作物之一。为提高甜菜的光合效率和产量，科研人员构建了携带SBPase基因（编码卡尔文循环的关键酶）的表达载体（图1），通过基因工程对甜菜进行遗传改造。回答下列问题：
(1)构建表达载体并导入农杆菌：获取目的基因后利用PCR技术进行扩增，经凝胶电泳鉴定后，回收其中包含目的基因的DNA片段。然后使用限制性核酸内切酶切割 ，将带有黏性末端的酶切产物纯化回收后，用 连接。图1基因表达载体中没有标注出来的基因结构是 （填一个即可）。经过一系列步骤后，将测序正确的重组质粒导入农杆菌。
(2)获取抗性植株：将含有重组质粒的农杆菌与甜菜叶柄共培养一段时间后，先将外植体放在含有羧苄霉素和头孢霉素的培养基中初步培养，目的是 ，再转入含有 的筛选培养基中获得抗性植株。此过程中使用抗生素时需要注意的事项是 。
(3)为从分子水平上检测抗性植株是否含有目的基因，对抗性植株进行PCR后检测，检测结果如图2。CK+组是选用含 的质粒作为阳性对照。
(4)取阳性无菌苗叶片提取总RNA，将RNA逆转录成cDNA，再以cDNA为模板，利用目的基因引物进行PCR以检测 。
【答案】(1) 质粒和目的基因（包含目的基因的DNA片段） DNA连接酶 复制原点（启动子、终止子）
(2) 杀灭农杆菌（抑制农杆菌生长、抑制农杆菌、抑菌） 卡那霉素 注意抗生素的种类、剂量及作用时间等
(3)目的基因
(4)目的基因的表达情况（目的基因是否转录成功、目的基因是否转录出mRNA）
【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。
【详解】（1）使用限制性核酸内切酶切割质粒和目的基因，使其产生相同的粘性末端；将带有黏性末端的酶切产物使用DNA连接酶连接，催化磷酸二酯键的形成；图1中为表达载体，需要酶切位点、标记基因、复制原点（启动子、终止子）等，图中未标出的为复制原点（启动子、终止子）。
（2）将外植体放在含有羧苄霉素和头孢霉素的培养基中初步培养，是为了杀灭农杆菌；再转入含有卡那霉素的筛选培养基中，由于重组质粒含有抗性基因，因此能获得重组细胞，进而获得抗性植株；抗生素起到筛选重组质粒的作用，使用时需注意抗生素的种类、剂量及作用时间等。
（3）CK+组为阳性质粒，与1-8转基因植株的条带一致，含有目的基因，故CK+组是选用含目的基因的质粒作为阳性对照。
（4）利用目的基因引物进行PCR以检测目的基因是否转录出mRNA，若转录成功，则能逆转录成cDNA，能结合目的基因相应的引物扩增出相应的条带。
14．反刍动物的瘤胃中含有分解纤维素的微生物，科研小组从瘤胃中分离培养分解纤维素的微生物的流程如图所示。

回答下列问题：
(1)以纤维素为 的选择培养基进行I过程，培养基常用的灭菌方法是 。
(2)将I过程得到的菌液接种到充满N2的密闭试管中进行Ⅱ过程，培养一段时间后可在试管壁的薄层培养基上获得单菌落。与Ⅰ相比，Ⅱ所用培养基中还需要添加的物质是 。培养瘤胃微生物时，除考虑营养物质外，还要考虑 、 和渗透压等条件。
(3)分离出某真菌的W基因可编码一种可高效降解纤维素的酶，已知图中W基因转录方向是从左向右，启动子通常具有物种特异性，为使大肠细菌产生该酶，在质粒中插入W基因，其上游启动子应选择 的启动子，以图中质粒为载体，进行转基因操作。不同限制酶的识别序列及切割位点如表所示。

限制酶 BamHI EcoRI MfeI KpnI HindIII
识别序列和切割位点 G↓GATTC G↓AATTC C↓AATTG GGTAC↓C A↓AGCTT
①W基因转录的模板链是 。利用PCR技术对W基因进行扩增时子链延伸的方向是 。
②与质粒中启动子结合的酶是 。启动子通常具有物种特异性，在质粒中插入W基因，其上游启动子应选择 的启动子。
③限制酶主要是从 中分离纯化出来的。应使用限制酶 切割图中质粒，使用限制酶 切割图中含W基因的DNA片段，以获得能正确表达W基因的重组质粒。
【答案】(1) 唯一碳源 湿热灭菌
(2) 琼脂 温度 pH
(3) 乙链 5'→3' RNA聚合酶 大肠杆菌 原核生物 MfeI、HindⅢ EcoRI、HindⅢ
【分析】一个基因表达载体的组成，除目的基因、标记基因外，还必须有启动子、终止子等。启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游紧挨转录的起始位点，它是RNA聚合酶识别和结合的部位。有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质。
【详解】（1）据题意可知，上图是科研小组从瘤胃中分离培养分解纤维素的微生物的流程，因此得到瘤胃提取物后，将其放入以纤维素为唯一碳源的选择培养基进行I过程。灭菌是指用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物（包括芽孢和孢子），常用的方法有灼烧灭菌、干热灭菌、湿热灭菌，培养基常用灭菌方法是湿热灭菌。
（2）将I得到的菌液接种到充满N2的密闭试管II中，培养一段时间后可在试管壁的薄层培养基上获得单菌落。与I相比，II所用培养基为固体培养基，需要添加的物质是琼脂。微生物的培养条件有适宜的营养物质(碳源、氮源、无机盐等)、温度、pH、渗透压(控制培养液的浓度)等，因此培养瘤胃微生物时，除考虑营养物质外，还要考虑温度、pH和渗透压等条件。
（3）①W基因转录方向是从左向右，mRNA链的合成方向为5'→3'，与乙链从左向右3'→5'互补，故W基因转录的模板链是乙链。利用PCR技术扩增目的基因的原理是DNA半保留复制，子链延伸方向为5'→3'。
②启动子启动基因的转录，故与质粒中启动子结合的酶是RNA聚合酶；根据题干信息“启动子通常具有物种特异性”，目标是使大肠杆菌产生高效降解纤维素的酶，故应选择大肠杆菌的质粒，在质粒中插入W基因，其上游启动子应选择大肠杆菌启动子。
③限制酶主要是从原核生物中分离纯化出来的；根据题图信息“图中W基因转录方向是从左往右”、“放线菌质粒启动子到终止子方向为顺时针”，故重组质粒的启动子应在W基因左侧，终止子应在W基因右侧，W基因右侧只能用HindⅢ切割，W基因左侧有BamHI、KpnI、EcoRI三种酶切位点，结合质粒情况及切割位点识别序列，应使用限制酶MfeI、HindⅢ切割图中质粒，使用限制酶EcoRI、HindⅢ切割图中含W基因的DNA片段，以获得能正确表达W基因的重组质粒。
15．研究人员利用水稻细胞培育能产生人 HIV 抗体2G12 的水稻胚乳细胞生物反应器，其基本流程包括表达载体的构建、农杆菌转化、水稻细胞转化、转基因植株的筛选等。
(1)为成功构建表达载体，需在人工合成的人 HIV 抗体2G12 基因首端添加启动子，你的选择是 （填字母），依据是 。
A．人 B 细胞启动子
B．HIV启动子
C．水稻胚乳细胞启动子
D．农杆菌启动子
(2)潮霉素对原核细胞和真核细胞的生长都有抑制作用。据此分析，下图所示重组T-DNA片段中潮霉素抗性基因为基因表达载体中的 ，其作用是 。

(3)目的基因插入染色体的具体位置通常具有不确定性，可采用反向PCR 技术检测。下图是利用这一技术分析人 HIV 抗体2G12 基因插入染色体位置的流程图。

欲得到图中环状 DNA，过程Ⅰ酶切时 （填“能”或“不能”） 利用不同限制酶。由图中环状DNA至少经过 轮循环才能得到图示链状产物。
(4)与其他工程技术相比，利用水稻生产人 HIV 抗体2G12 的优势有 （答两点即可）。
【答案】(1) C 水稻胚乳细胞启动子在水稻胚乳细胞中更容易被RNA聚合酶识别和结合而驱动转录
(2) 标记基因 鉴别和筛选成功导入人HIV抗体2G12 基因的农杆菌和水稻细胞
(3) 能 3
(4)产量高；成本低；不受性别限制；不需要专业培养设备
【分析】基因工程的操作步骤有：目的基因的获取、构建基因表达载体、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测和鉴定。检测目的基因是否导入受体细胞可采用PCR技术，检测目的基因是否表达可采用抗原抗体杂交或个体水平检测。
【详解】（1）利用水稻细胞培育能产生人 HIV 抗体2G12 的水稻胚乳细胞生物反应器，水稻胚乳细胞启动子在水稻胚乳细胞中更容易被RNA聚合酶识别和结合而驱动转录，C正确，ABD错误。
故选C。
（2）潮霉素抗性基因可用于鉴别和筛选成功导入人HIV抗体2G12 基因的农杆菌和水稻细胞，潮霉素抗性基因为基因表达载体中的标记基因。
（3）有些限制酶切割形成的黏性末端相同，故能利用不同限制酶切割，环状DNA的两条链为母链，根据DNA半保留复制的特点，PCR过程一般需要经过3轮循环才能得到图示链状产物。
（4）利用水稻细胞培育能产生人 HIV 抗体2G12 的水稻胚乳细胞生物反应器，具有产量高；成本低；不受性别限制；不需要专业培养设备等优点。
16．大肠杆菌能进入实体瘤核心并保持较强活性，科研人员期望利用大肠杆菌构建一种基因表达可控的工程菌，期望用于人体特定部位实体瘤的免疫治疗。
(1)科研人员利用温度敏感型转录调控蛋白构建温控表达的质粒系统，如下图。

①利用来自λ噬菌体的温度敏感型转录抑制因子Tcl42作为“开关”构建温控抑制元件，在 （选填“λ噬菌体”、“大肠杆菌”或“人”）中具强活性的启动子pLac可以使Tcl42持续性表达，抑制启动子pRL；当控温至42℃时才开启特定基因的表达。
②Tcl42开关仅在加热时瞬时激活特定基因，而免疫疗法需要数周才能见效，所以设计了“基因电路”——一次短暂的温度激活后可维持长期的基因表达。其核心基因包括重组酶Bxb1基因、分泌型αPD-L1蛋白基因（该蛋白可用免疫治疗）等。
请选择相关选项完善该“基因电路”的技术路线： 及质粒，获基因电路 → 受体菌37℃时，蛋白Tcl42抑制启动子pRL → → 免疫元件无功能（不表达αPD-L1） → → 解除蛋白Tcl42对启动子pRL的抑制→ → →细菌合成GFP，并分泌大量αPD-L1。
A、重组酶Bxb1基因不表达 B、菌体升温至42℃时
C、用不同的限制酶、DNA连接酶分别处理温控抑制元件、重组元件、免疫元件
D、启动子p7启动荧光蛋白GFP基因、αPD-L1基因的转录
E、重组酶Bxb1基因表达，进而引起启动子p7两侧发生重组
(2)科研人员用 处理大肠杆菌，使其处于感受态，从而将“基因电路”质粒导入菌体内，经过培养、涂布后，筛选 （选项），由此成功构建用于免疫治疗的温控工程菌（EcT）。
A、含有四环素的培养基上形成的菌落 B、具有绿色荧光的菌落
C、同时具有A和B特征的菌落 D、具有A或B特征的菌落均可
(3)使用聚焦超声（FUS）装置，可以使动物特定范围的组织快速升温至42℃，从而实现体内微生物治疗的温度控制。为验证上述温控工程菌的治疗肿瘤效果，选取若干组生理状态相近的小鼠，经过7天的成瘤建模后，分别进行如下处理，并检测记录小鼠体内肿瘤体积。
第1组：注射生理盐水，2天后FUS处理；
第2组：注射温控工程菌，2天后FUS处理。请评价并完善实验方案 。
最终证明温控工程菌可被FUS处理局部激活，并具有持续性肿瘤免疫治疗效果。
(4)若期望将上述温控工程菌用于临床实验，还需利用小鼠开展 方面的研究。
【答案】(1) 大肠杆菌 C A B E D
(2) Ca2+ A
(3)该实验方案无法排除改造后的温控工程菌在未热激活状态对肿瘤生长的影响，应增设温控工程菌在未热激活状态的对照组
(4)温控工程菌或温控工程菌 +FUS对哺乳动物重要脏器（肝、肾、神经系统等）的影响；与现行临床药物相比，效果是否具有优势；温控工程菌在非FUS处理部位是否有非特异性激活
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；
（4）目的基因的检测与鉴定：
分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因——DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原-抗体杂交技术。
个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）①“基因电路”的技术路线实验的目的是利用温度敏感型转录调控蛋白构建温控表达的大肠杆菌质粒系统，因此，使Tcl42持续性表达的具强活性的启动子pLac应该来自大肠杆菌。
②“基因电路”的技术路线要起作用，第一步要构建“基因电路”，因此要先用不同的限制酶、DNA连接酶分别处理温控抑制元件、重组元件、免疫元件及质粒，使这些元件能够连接成“基因电路”；依题意，当温度不到42℃时具强活性的启动子pLac可以使Tcl42持续性表达，抑制启动子pRL，则与其构成一个表达单位的重组酶Bxb1基因不表达 。重组酶的作用位点在免疫元件中，重组酶Bxb1基因不表达，则αPD-L1不表达，免疫元件无功能；当控温至42℃时解除蛋白Tcl42对启动子pRL的抑制，重组酶Bxb1基因表达，进而引起启动子p7两侧发生重组，启动子p7启动荧光蛋白GFP基因、αPD-L1基因的转录。从而使细菌合成GFP，并分泌大量αPD-L1。综合以上分析，“基因电路”的技术路线是：C、用不同的限制酶、DNA连接酶分别处理温控抑制元件、重组元件、免疫元件及质粒，获基因电路 → 受体菌37℃时，蛋白Tcl42抑制启动子pRL →A、重组酶Bxb1基因不表达→ 免疫元件无功能（不表达αPD-L1） →B、菌体升温至42℃时→ 解除蛋白Tcl42对启动子pRL的抑制→E、重组酶Bxb1基因表达，进而引起启动子p7两侧发生重组→D、启动子p7启动荧光蛋白GFP基因、αPD-L1基因的转录→细菌合成GFP，并分泌大量αPD-L1。
（2）在基因工程操作中，常用原核生物作为受体细胞，其中以大肠杆菌应用最为广泛。研究人员一般先用Ca2+ 处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后将“基因电路”质粒导入菌体内。依题意，重组的质粒中带有抗四环素的抗性基因，因此，可含有四环素的培养基来筛选含重组质粒的受体细胞，能在该培养基上形成的菌落就是成功构建用于免疫治疗的温控工程菌菌落，A符合题意，BCD不符合题意。
故选A。
（3）依题意，该实验的目的是验证上述温控工程菌的治疗肿瘤效果，但若按照题意实验，则无法排除改造后的温控工程菌在未热激活状态对肿瘤生长的影响，因此，应增设一组温控工程菌在未热激活状态的对照组。
（4）若期望将上述温控工程菌用于临床实验，则还要检验工程菌的优势、作用效果、安全性等方面的影响实验。因此，还需利用小鼠开展温控工程菌或温控工程菌 +FUS对哺乳动物重要脏器（肝、肾、神经系统等）的影响；与现行临床药物相比，效果是否具有优势；温控工程菌在非FUS处理部位是否有非特异性激活方面的研究。
17．酵母菌是木糖醇生产菌，生产木糖醇时， 发酵体系的温度会因产热而升高。研究人员筛选高温诱导启动子，构建高温诱导启动子－木糖还原酶基因（XYL1）表达载体并导入酵母菌，用以生产木糖醇。
(1)启动子是 的识别和结合部位。为筛选高温诱导启动子，研究人员选择A1~A7共7个待选启动子并构建了“启动子－绿色荧光蛋白基因”表达载体， 然后导入酵母菌中。 高温条件下， 研究人员根据重组菌的 选出了A1启动子。
(2)XYL1含有内含子（基因编码区中不能表达的片段），获取无内含子 XYLl（cXYL1）的方法是 。 为将cXYLl正向插入质粒中，cXYL1的上游和下游应分别构建限制酶的酶切位点，构建方法是 。 双酶切验证重组质粒上含有“A1－cXYL1”时，应选择的限制酶是 ， 电泳结果应出现与分子大小相符的 个条带。
(3)研究人员分别在测定了重组菌的木糖还原酶活性，实验应以 为酶活性指标。若重组菌构建成功，实验结果应为 。
【答案】(1) RNA 聚合酶 绿色荧光强度
(2) 获取mRNA， 逆转录为cDNA， 然后 PCR 获取cXYLl 将限制酶序列构建在两引物的 5'端， 然后 PCR BamH1、Kpn I 2
(3) 单位时间内木糖醇的生成量（或：单位时间内木糖的消耗量） 木糖醇的生产速率： 42℃>37℃>30℃（或： 木糖的消耗速率 42℃<37℃<30℃）
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）启动子是RNA 聚合酶的识别和结合部位，能驱动基因的转录过程。为筛选高温诱导启动子，研究人员选择A1~A7共7个待选启动子并构建了“启动子－绿色荧光蛋白基因”表达载体， 其中绿色荧光蛋白基因作为标记基因，然后导入酵母菌中。 高温条件下， 研究人员根据重组菌的绿色荧光强度选出了A1启动子，荧光强度越高说明在高温条件下生长快，因而更能适应高温环境。
（2）XYL1含有内含子，内含子是基因编码区中不能表达的片段，则获取无内含子 XYLl（cXYL1）的方法应该是首先获取mRNA， 然后逆转录出cDNA， 然后 PCR 获取cXYLl，这是利用了成熟的mRNA中只包含外显子部分转录出的RNA设计的。 为将cXYLl正向插入质粒中，需要在cXYL1的上游和下游应分别构建限制酶的酶切位点，即需要将限制酶序列构建在两引物的 5'端， 然后进行PCR扩增。 双酶切验证重组质粒上含有“A1－cXYL1”时，应选择的限制酶是BamH1、Kpn I，因为这两种限制酶位于融合基因的两侧，经过酶切后重组质粒可获得两个不同的DNA片段，因此电泳结果会出现于预期条带分子大小相符的2个条带。
（3）研究人员分别在 30°C、37°C、42°C 测定了重组菌的木糖还原酶活性，根据实验目的可知，本实验中应以单位时间内木糖醇的生成量为酶活性指标。若重组菌构建成功，由于重组菌耐高温，则实验结果应为木糖醇的生产速率： 42℃>37℃>30℃。
18．猴病毒40（SV-40）AgT基因表达的抗原AgT可以阻断小鼠抑癌基因的信号通路，诱导小鼠发生前列腺癌。科学家利用生物技术手段制备了前列腺癌转基因小鼠动物模型，为前列腺癌的发生、发展规律和防治研究提供了重要的平台。回答下列问题：
(1)下图为SV-40DNA分子的部分结构，利用PCR技术扩增AgT基因，应选择引物1和 ，将该DNA分子加入到PCR扩增仪中，要获得8个等长的AgT基因片段，至少要经历 次循环。

(2)构建基因表达载体时，通常需要将目的基因与人工构建的诱导型启动子结合，其目的是 。
(3)若需大量制备前列腺癌转基因小鼠，可以利用胚胎移植技术。通常导入了目的基因的小鼠受精卵细胞在体外发育至 时期才能用于胚胎移植，移植前应对供体小鼠和受体小鼠做 处理，目的是 。
【答案】(1) 引物4 4/四
(2)当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达
(3) 桑葚胚或囊胚 同期发情 使供体和受体生殖器官的生理变化同步，为供体的胚胎移入受体提供相同的生理环境
【分析】目的基因的获取和构建基因表达载体一般要同种限制酶。培育转基因动物时，往往采用受精卵作为受体细胞，因为受精卵的全能性最高。因为自然界所有生物共用一套遗传密码子，所以一种生物的基因能在另一种生物体内表达。
【详解】（1）利用PCR技术扩增AgT基因，应选择引物1和引物4，因为子链的延伸是沿着引物的5’向3‘端延伸的，等长的目的基因片段数目＝2n—2n（n为循环次数），故该DNA分子加入到PCR扩增仪中，要获得8个等长的AgT基因片段，至少要经历4次循环，经过4次循环后得到的等长的引物之间的序列的数目为24-2×4＝8个。
（2）构建基因表达载体时，通常需要将目的基因与人工构建的诱导型启动子结合，这是因为，当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达，进而实现转基因的目标。
（3）若需大量制备前列腺癌转基因小鼠，可以利用胚胎移植技术。通常将导入了目的基因的小鼠受精卵细胞在体外发育至桑葚胚或囊胚时期才能用于胚胎移植，也可进行胚胎分割，而后再进行移植，移植前应对供体小鼠和受体小鼠做同期发情处理，这样可以保证供体和受体生殖器官的生理变化同步，为供体的胚胎移入受体提供相同的生理环境，提高胚胎移植的成功率。　
19．径柳匙叶草是一种泌盐植物。科研工作者将径柳匙叶草液泡膜Na+/K+逆向转运蛋白基因（TaNHX2基因）转移到棉花细胞内，获得了转基因耐盐棉花新品种。图1是获取的含有目的基因的DNA片段，Sau3AI、EcoRI、BamHI为三种限制酶，图中箭头所指为三种限制酶的切点；图2是三种限制酶的识别序列与酶切位点示意图；图3是土壤农杆菌中用于携带目的基因的Ti质粒结构示意图，请分析回答问题：
(1)将含有径柳匙叶草不同基因的DNA片段导入受体菌的群体中储存，再根据TaNHX2基因的特定核苷酸序列从中提取图1的片段，此法为从 中获取目的基因。
(2)不能在径柳匙叶草根尖分生区细胞中获得TaNHX2基因的mRNA，其原因是 。
(3)若用BamHI切割图1所示的DNA片段，获得目的基因，则需选用 切割图3所示质粒，以便构建基因表达载体，该方案的缺陷是 。故切割图1所示DNA片段的最佳方案是选用 酶。
(4)为了检测技术成果，科研工作者在个体水平的检测方法是 。
【答案】(1)基因文库
(2)Na+/K+逆向转运蛋白位于液泡膜上，径柳匙叶草根尖分生区细胞中TaNHX2基因不能表达
(3) Sau3AI 出现目的基因和质粒的自我环化、目的基因在质粒上的连接方向不确定 EcoRI和BamHI
(4)将转基因棉花种植在盐碱地，观察其生长状况
【分析】基因工程技术的基本步骤：目的基因的获取；基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样；目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）根据题意分析，该获取目的基因的方法是将不同基因的DNA片段导入受体菌的群体中储存，再根据TaNHX2基因的特定核苷酸序列从中提取图1的片段，因此该方法为从基因文库中获取目的基因。
（2）Na+/K+逆向转运蛋白位于液泡膜上，径柳匙叶草根尖分生区细胞中TaNHX2基因不能表达，因此不能在径柳匙叶草根尖分生区细胞中获得TaNHX2基因的mRNA。
（3）分析图2可知，Sau3AⅠ与BamHⅠ酶切后产生的黏性末端相同，故若用BamHⅠ切割图1所示的DNA片段获得目的基因，则需选用Sau3AⅠ切割图3所示质粒，以便构建基因表达载体；但该方案由于切出后的目的基因和质粒两端的黏性末端相同，故容易出现目的基因和质粒的自我环化、目的基因在质粒上的连接方向不确定的缺陷；为了防止这种现象的出现，应选择不同的限制酶切割目的基因的两侧以及质粒，结合图1和图3分析，应该选择EcoRI和BamH I切割图1所示DNA片段，EcoRI和Sau3A I切割图3质粒。
（4）转基因的目的是为了获得了转基因耐盐棉花新品种，为了检测技术成果，可以将转基因棉花种植在盐碱地，观察其生长状况。
20．虾青素可由β-胡萝卜素在β-胡萝卜素酮化酶（BKT）和β-胡萝卜素羟化酶（CRTR-B）的作用下转化而来，具有抗衰老、增强免疫、保护心血管等功能，杜氏盐藻是单细胞浮游植物，生长快，易培养，能大量合成β-胡萝卜素，科研人员将BKT基因和CRTR-B 基因导入杜氏盐藻，构建杜氏盐藻细胞工厂高效生产虾青素。
(1)获取目的基因：雨生红球藻是天然虾青素重要来源，提取雨生红球藻的总 DNA为 ， 设计特异性引物扩增 BKT基因和CRTR-B 基因，此过程需要 酶的催化。
(2)构建转化载体：“无缝克隆法”是构建重组质粒的新方法，指利用同源重组酶将末端具有 一致同源序列的线性化载体和目的基因连接形成重组质粒，图1表示利用“无缝克隆法”向质粒中插入抗除草剂基因的基本过程。
I．PCR获取抗除草剂基因过程中，为确保基因两端具有所需同源序列，需在引物的 端添加对应的同源序列 。若要确保抗除草剂基因能够从重组质粒中切除，还 需要在基因两侧加入限制酶识别序列，则所需引物（5，一3，）的序列应为： 。
A．同源序列十特异性扩增引物序列十限制酶识别序列
B．同源序列十限制酶识别序列十特异性扩增引物序列
C．特异性扩增引物序列十限制酶识别序列十同源序列
Ⅱ．科研人员利用“无缝克隆法" 同时将 BKT基因和CRTR-B 基因插入质粒，形成的重 组质粒对应部位如图2所示，推测此过程扩增 BKT基因所用的引物为 ； 扩 增CRTR-B基因所用的引物为 ；
Ⅲ．最终形成的重组质粒如图3所示，其中atpA启动子和 psbA启动子均为杜氏盐藻叶 绿体启动子，选用内源性启动子的目的是 ；
Ⅳ．与传统的酶切法构建重组质粒相比，“无缝克隆法"具备的优势有 。
(3)准备受体细胞：选取初始杜氏盐藻涂布到杜氏盐藻固体培养基进行培养，一段时间后，挑取生长状态良好的单藻落到杜氏盐藻液体培养基中继续培养，期间可取藻液滴入 ，在显微镜下进行计数，两次培养的目的分别为 、 。
(4)目的基因导入及相关检测：采用基因枪法将重组质粒导入杜氏盐藻叶绿体，一段时间后，用含 的培养基筛选已转化的杜氏盐藻，通过相关技术检测是否成功表达 。
(5)叶绿体转化是植物基因工程的新热点，叶绿体的诸多特点为叶绿体转化提供优势，如叶 绿体基因组小，功能清晰，使基因操作方便；叶绿体细胞具有自我复制功能，一个植物细 胞可含有多个叶绿体，每个叶绿体中含有多个基因组，可大大提高 ；另外，叶绿体基因位于细胞质中，可有效避免 。
【答案】(1) 模板 Taq DNA聚合酶
(2) 5， B ①③/③① ⑥⑧/⑧⑥ 防止基因沉默 ， 确保目的基因能表达 可同时导入多个外源基因；不受限制酶识别序列的限制 ， 可在载体的任意位点插入目的基因
(3) 血细胞计数板 纯化杜氏盐藻 扩大培养杜氏盐藻
(4) 除草剂 β-胡萝卜素酮化酶和 β-胡萝卜素羟化酶
(5) 目的基因的表达量 基因污染
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）因雨生红球藻是天然虾青素重要来源，是目的基因的来源，故可提取雨生红球藻的总 DNA为模板，设计特异性引物扩增其 DNA中的 BKT基因和CRTR-B 基因，此过程需要 Taq DNA聚合酶的催化。
（2）根据题意，“无缝克隆法”是指利用同源重组酶将末端具有一致同源序列的线性化载体和目的基因连接形成重组质粒。
I 根据 PCR扩增的原理，在 PCR过程中，为确保基因两端具有所需同源序列，需在5’ 端添加对应的同源序列；根据题意，若要确保抗除草剂基因能够从重组质粒中切除，则所需引物（5’一 3’）的序列应为“同源序列十限制酶识别序列十特异性扩增引物序列”。
故选B。
Ⅱ 根据图2所示，要通过“无缝克隆法”同时将 BKT基因和CRTR-B 基因插入质粒，则要保证BKT基因一侧有一致同源序列，另一侧能带上CRTR-B 基因，因此扩增 BKT基因所用的引物为①③ ； 同理，扩增CRTR-B基因所用的引物为⑥⑧。
Ⅲ 启动子是转录的起始信号，选用内源性启动子的目的是防止基因沉默，确保目的基因能表达。
Ⅳ 根据题意，与传统的酶切法构建重组质粒相比，“无缝克隆法”具备的优势是“可同时导入多个外源基因”“不受限制酶识别序列的限制”“可在载体的任意位点插入目的基因”等。
（3）因杜氏盐藻是单细胞浮游植物，因此可用血细胞计数板进行显微观察计数；选取初始杜氏盐藻涂布到杜氏盐藻固体培养基进行培养的目的是纯化杜氏盐藻，挑取生长状态良好的单藻落到杜氏盐藻液体培养基中继续培养的目的是扩大培养杜氏盐藻。
（4）筛选已转化的杜氏盐藻的培养基是选择培养基，其中含除草剂；再通过抗原—抗体杂交实验检测是否成功表达 β-胡萝卜素酮化酶和 β-胡萝卜素羟化酶。
（5）因每个叶绿体中含有多个基因组，可大大提高目的基因的表达量；且叶绿体基因位于细胞质中，一般不能稳定遗传，因此可避免基因污染。
21．双生病毒是一类世界范围内广泛发生的植物DNA病毒，其自身仅编码有限的遗传信息，需依赖与植物复杂的相互作用才能完成其生活史。有研究表明本氏烟的NbWhirly1基因是一个双生病毒的感病基因，因此可以利用转基因的方法抑制NbWhirly1基因的表达，即基因沉默，从而达到控制病害的效果。具体操作为：利用RNAi技术（RNA干扰技术），以本氏烟的NbWhirly1基因作为RNAi的干扰片段，构建RNAi重组载体，通过农杆菌转化法，将表达载体导入目的植株，获得沉默NbWhirly1基因的转基因烟草。RNAi技术的作用原理如下图所示：
(1)要获得目的基因，可从 中提取 ，再通过 的方法获得cDNA，通过PCR技术扩增目的基因片段，并通过 次拼接，最终获得重组RNAi载体。
(2)由图可知，RNAi技术是通过抑制 过程来抑制基因的表达，图2中正反义目的基因转录场所发生在 。据图分析RISC能与靶序列碱基互补配对的原因是 。
(3)理论上导入只含反义NbWhirly1基因片段不含正义NbWhirly1基因片段的表达载体也能抑制本氏烟细胞内NbWhirly1基因的表达，试分析其作用机制 。研究表明图1重组方式比上述方式抑制效果更佳，据图2分析原因 。
【答案】(1) 本氏烟 mRNA 逆转录 2
(2) 翻译 本氏烟的细胞核 RISC中的siRNA能与靶序列mRNA碱基配对
(3) 反义NbWhirly1基因转录的反义RNA，也能与本氏烟细胞内NbWhirly1基因转录的mRNA互补配对，从而抑制基因的表达。 正义基因表达形成mRNA，RISC与mRNA结合，以siRNA为引物，RdRP催化形成新的双链RNA，分解形成更多的siRNA，能与本氏烟细胞内NbWhirly1基因转录的mRNA互补配对，抑制基因的表达效率更高。
【分析】1.PCR技术：概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。原理：DNA复制。前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一对引物。条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）。过程：①高温变性（90℃以上）：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；②低温复性（50℃左右）：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸（72℃左右）：合成子链。
2.基因工程的工具：（1）限制酶：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。（2）DNA连接酶：连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键。（3）运载体：常用的运载体：质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒。
【详解】（1）由题意可知，本实验中的目的基因为本氏烟的NbWhirly1基因，因此要获得目的基因，可从本氏烟中提取mRNA，再通过逆转录的方法获得cDNA，通过PCR技术扩增目的基因片段，并通过2次拼接，即先正义目的基因片段和反义目的基因片段拼接，再与转运体拼接，最终获得重组RNAi载体。
（2）由图可知，反义RNA可以与NbWhirly1基因的mRNA发生碱基互补配对，阻止其与核糖体的结合，因此RNAi技术是通过抑制翻译来抑制基因的表达，图2中正反义目的基因转录场所发生本氏烟的细胞核。据图分析RISC能与靶序列碱基互补配对的原因是RISC中的siRNA能与靶序列mRNA碱基配对。
（3）反义NbWhirly1基因转录的反义RNA，也能与本氏烟细胞内NbWhirly1基因转录的mRNA互补配对，从而抑制基因的表达，因此导入只含反义NbWhirly1基因片段不含正义NbWhirly1基因片段的表达载体也能抑制本氏烟细胞内NbWhirly1基因的表达。从图2可知，RISC与mRNA结合，以siRNA为引物，RdRP催化形成新的双链RNA，分解形成更多的siRNA，能更多的与本氏烟细胞内NbWhirly1基因转录的mRNA互补配对，因此图1正义基因与反义基因重组，正义基因表达形成更多的mRNA，从而产生更多siRNA，抑制基因的表达效率更高。
22．丙型肝炎是由丙型肝炎病毒（HCV）引起的一种传染病，其包膜蛋白中包含6个保守序列Bp蛋白和抗原表位R9蛋白。免疫佐剂热敏肠毒素B单位（LTB）是一种免疫增强剂。为研制针对HCV的多肽疫苗，某研究小组拟先构建针对该病毒的多表位疫苗基因的重组质粒，操作流程如图1、图2所示。请分析回答下列问题：
(1)图1为利用融合PCR技术获得LTB-R9-Bp融合基因的过程，反应体系中需加入待扩增的模板、引物、原料以及 。请在下图中标出②过程两条模板链的5'端和3'端 。
(2)获得LTB-R9-Bp融合基因后，若要大量扩增该序列，可选择图中引物 继续进行PCR。
(3)图2构建融合基因表达载体时，质粒上除了复制起点、标记基因和多个限制酶的识别序列外，还需要有 。将得到的重组质粒导入经过低温、低浓度的Ca2+处理的大肠杆菌，完成转化实验，该处理的作用是 。
(4)若利用转基因植物生产该疫苗，首先要将目的基因插入农杆菌质粒的 中，将含重组质粒的农杆菌和经消毒处理的外植体在MS培养基中共同培养，再利用 技术培养成植株，最后可采用 法检测该植物是否产生多肽抗原。
【答案】(1) 耐高温的DNA聚合酶
(2)引物P1和引物P4
(3) 启动子和终止子 增大细胞膜通透性，促进细菌摄取外源DNA
(4) T-DNA 植物组织培养 抗原抗体杂交
【分析】基因工程的操作步骤：(1)目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；(2)基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤。基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；(3)将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样，将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。(4)目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因-DNA分子杂交技术。②检测目的基因是否转录出了mRNA-分子杂交技术。③检测目的基因是否翻译成蛋白质：抗原-抗体杂交技术，个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）应用PCR技术可以对目的基因进行体外大量扩增，反应体系中应提供模板、引物、4种的dNTP、耐高温的DNA聚合酶，同时通过控制温度实现DNA的解聚，使DNA复制在体外反复进行。由图中颜色可判断，上面一条链为引物P1延伸的链，下面一条链为引物P4延伸的链，子链延伸方向为5'-3'端，标记如下：

（2）根据目的基因的颜色可知，可选择引物P1和引物P4继续进行PCR。
（3）基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因、复制起点、多个限制酶的识别序列等。为了增大细胞膜通透性，促进细菌摄取外源DNA，将得到的重组质粒导入低温、低浓度的CaCl2处理的大肠杆菌，完成转化实验。
（4）若利用转基因植物生产该疫苗，首先将目的基因插入农杆菌质粒的T-DNA中，将含重组质粒的农杆菌和经消毒处理的外植体在MS培养基中共培养，再利用植物组织培养技术培养成植株，最后可采用抗原抗体杂交法检测该植物是否产生多肽抗原。
23．临床上亮氨酸的检测及亮氨酸氨基肽酶活性的检测常用到亮氨酸脱氢酶。为提高亮氨酸脱氢酶产量，研究人员在亮氨酸脱氢酶基因中加入某种酵母菌基因的强启动子Pax，以探究双启动子对亮氨酸脱氢酶产量的影响。大致过程如图所示，回答下列问题。
(1)组成亮氨酸脱氢酶基因的单体是 ，利用PCR技术扩增此基因时，有人根据基因的碱基序列设计了“5'-ATGGAG-3'、5'-AAATGT-3'”的一对引物，结果未获得此目的基因，从引物的角度分析可能的原因是 （写出2点）。
(2)由图2分析，为保证强启动子和质粒1正确连接，利用PCR扩增Pax时需要在引物的5'端添加限制酶的识别序列，添加的序列由5'→3'的序列分别为 。进行①时，需用到相应限制酶和DNA连接酶，其中连接酶作用的底物为下图中的 （填“A”或“B”或“A和B”）。
A． B．
(3)将构建的重组质粒导入经 处理的大肠杆菌中，然后接种到添加有卡那霉素的培养基上进行筛选。从功能角度看这种培养基属于 培养基，为了便于筛选，作为受体细胞的大肠杆菌满足的条件是 。
(4)对比导入了质粒1和重组质粒的大肠杆菌，后者亮氨酸脱氢酶的产量显著提高。有人认为还不足以说明双启动子能显著提高亮氨酸脱氢酶的产量，原因是 。
【答案】(1) 脱氧核苷酸/脱氧核糖核苷酸 引物序列太短，特异性不强；引物方向错误
(2) 5'CATATG3' 、 5'GGATCC3' B
(3) Ca2+ 选择 不能抗卡那霉素（或不含卡那霉素抗性基因）
(4)未做亮氨酸脱氢酶基因只有强启动子的亮氨酸脱氢酶产量
【分析】1、基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。
（4）目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）基因通常是有遗传效应的DNA片段，因此组成亮氨酸脱氢酶基因的单体是脱氧核苷酸。根据题意可知，根据基因的碱基序列设计了“5'-ATGGAG-3'、5'-AAATGT-3'”的一对引物，结果未获得此目的基因，可能是因为引物序列太短，特异性不强，此外也可能是引物方向错误，无法获得目的基因。
（2）由图2分析，为保证强启动子和质粒1正确连接，利用PCR扩增Pax时需要在引物的5'端添加限制酶的识别序列，根据图示分析可知，需要添加NdeⅠ和BamHⅠ，即添加的序列由5'→3'的序列分别5'CATATG3'、5'GGATCC3'，需用到相应限制酶和DNA连接酶，其中连接酶作用的底物为下图中的B。
（3）将构建的重组质粒导入经钙离子处理的大肠杆菌中，然后接种到添加有卡那霉素的培养基上进行筛选。从功能角度看这种培养基属于选择培养基。根据题意为了便于筛选，作为受体细胞的大肠杆菌不能含卡那霉素抗性基因。
（4）根据题意可知，对比导入了质粒1和重组质粒的大肠杆菌，后者亮氨酸脱氢酶的产量显著提高，但是未做亮氨酸脱氢酶基因只有强启动子的亮氨酸脱氢酶产量，无法与双启动子的亮氨酸脱氢酶产量进行对比，不足以说明双启动子能显著提高亮氨酸脱氢酶的产量。
24．蒂蛀虫是荔枝的重要害虫。科研人员培育转基因抗虫荔枝的过程如下图1所示。图2是SalI、HindⅢ和BamHI三种限制酶的识别序列和切割位点。请回答下列问题：
(1)与RNA相比，质粒特有的化学成分是 ；抗氨苄青霉素基因的作用是 。
(2)研究人员采用了如下图巢式PCR技术获取抗虫基因，巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应（PCR），使用两对PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物（也称外引物）扩增片段和普通PCR相似。第二对引物称为巢式引物（因为他们在第一次PCR扩增片段的内部，也称内引物）结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。
①PCR扩增时加入引物的原因是 ，在最后一个循环结束后通常还需要维持72℃5min的目的是 ，PCR产物常采用 来鉴定。
②相比于常规PCR，巢式PCR获得错误目标产物概率 ，这是因为 。
③为了使抗虫基因定向插入质粒中，第二次PCR扩增时需要在两个引物5'端分别添加的序列是 ，不添加在引物3'端的原因是 。
(3)科研人员采用农杆菌转化法将抗虫基因导入荔枝细胞，由于农杆菌中的 ，能携带目的基因进入受体细胞，并将目的基因整合到受体细胞 上。
(4)培育出的荔枝是否具有抗虫性状，可采用鉴定方法是 。
【答案】(1) 脱氧核糖和胸腺嘧啶 便于筛选含重组DNA分子的受体细胞
(2) Taq酶只能催化单个脱氧核苷酸连接到已有的核苷酸链3’端上 充分延伸子链 琼脂糖凝胶电泳 低 如果利用外引物扩增产生了错误片段，则巢式（内）引物能在错误片段上进行配对的概率低 AAGCTT和GTCGAC 使引物的3’端与模板链严格互补配对，保证子链的延伸
(3) Ti质粒含有一段T-DNA 染色体DNA
(4)采摘转基因抗虫荔枝叶片饲喂蒂蛀虫，观察蒂蛀虫的存活情况
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测和个体水平上的鉴定。
【详解】（1）质粒的本质为小型环状的DNA片段，与RNA相比，质粒特有的化学成分是脱氧核糖和胸腺嘧啶；抗氨苄青霉素基因可作为标记基因，标记基因的作用为便于筛选含重组DNA分子的受体细胞。
（2）①由于Taq酶只能催化单个脱氧核苷酸连接到已有的核苷酸链3’端上，故PCR扩增时加入引物，延伸过程的温度一般为72℃，最后一个循环结束后通常还需要维持72℃5min的目的是充分延伸子链，琼脂糖凝胶电泳能将不同分子量的DNA分开，PCR产物常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定。
②如果利用外引物扩增产生了错误片段，则巢式（内）引物能在错误片段上进行配对的概率低，故巢式PCR获得错误目标产物概率低。
③由图1可知，BamHI会破坏目的基因，所以可以用SalI、HindⅢ两种限制酶切割目的基因的两端及质粒，可防止目的基因和质粒的自我环化或反向连接，所以第二次PCR扩增时需要在两个引物5'端分别添加的序列是AAGCTT和GTCGAC。子链延伸的方向为5'端→3’端，为了使引物的3’端与模板链严格互补配对，保证子链的延伸，故不添加在引物3'端。
（3）农杆菌含有Ti质粒，Ti质粒含有一段T-DNA，T-DNA能携带目的基因进入受体细胞，并将目的基因整合到受体细胞的染色体DNA上。
（4）培育出的荔枝是否具有抗虫性状，可从个体水平做抗性实验鉴定，鉴定方法是采摘转基因抗虫荔枝叶片饲喂蒂蛀虫，观察蒂蛀虫的存活情况。
25．“脑彩虹”是一项最新的大脑成像技术， 通过荧光蛋白“点亮”大脑内的神经元， 帮助科学家了解大脑。该技术利用 Cre/loxP 系统标记神经元。Cre/loxP 系统是在基因或染色体水平上对生物基因进行遗传改造的一种技术。

(1)图 1 是利用 Cre/ loxP 系统敲除基因的过程。loxP 序列具有方向性，由中间的间隔序列和两侧的反向重复序列组成。其中决定 loxP 方向的序列是 。当某一个 DNA片段上待敲除基因的两端存在同向 loxP 序列时， Cre 酶识别并结合到 loxP 序列的反向重复序列区。两个 loxP 序列的间隔序列被 Cre 酶定点切开， 4 个黏性末端序列交错两两连接， 其中待敲除基因两端的序列进行连接， 连接时形成的化学键是 ， 敲除的基因片段会形成 （填“线状”或“环状”）结构， 保留的 DNA片段中是否还存在 loxP序列？ （填“是”或“否”）
(2)若经 Cre 酶作用使得 2 个 loxP 位点间的序列发生反转， 其原因可能是 。
(3)现以小鼠为材料，利用“脑彩虹”技术研究其大脑内的神经元。研究者需先用 酶处理三种荧光蛋白基因、两种 loxP 序列， 将它们与脑组织特异表达启动子 M 相连接，构建图 2 所示的基因表达载体，再用显微注射法将该基因表达载体导入小鼠的 中，进而得到仅含一个图 2 所示片段的转基因小鼠， 再经过进一步操作， 获得纯合的转基因小鼠 a。
(4)图 2 所示序列的两个 loxP1 之间或两个 loxP2 之间的基因， 只会被 Cre 酶识别并切割一次。为使脑组织细胞中 Cre 酶的表达受调控， 研究者将 Cre 酶基因与启动子 N（由信号分子 X 开启） 连接， 经一系列操作， 获得纯合转基因小鼠 b， 将纯合小鼠 a 和 b 杂交，得到 F1。
①无信号分子 X 作用时， F1脑组织和其他组织细胞的颜色分别是 、 。
②有信号分子 X 作用时， F1出现“脑彩虹”， 请阐述机理： 。
【答案】(1) 中间的间隔序列 磷酸二酯键 环状 是
(2)两个 loxP 序列方向相反
(3) 限制酶和 DNA 连接 受精卵
(4) 黄色 无色 F1为杂合子，有编码黄色、红色、蓝色荧光蛋白的基因、loxP1、loxP2 及Cre 酶基因；有信号分子 X时，启动 Cre酶表达

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