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第2节　微生物的培养技术及应用
第1课时　微生物的基本培养技术
[学习目标]　1.基于牛肉膏蛋白胨培养基的实例分析,说明培养基的概念、种类及营养成分的种类和作用。2.通过学习消毒和灭菌的方法,认识二者的异同,阐明灭菌是获得纯净的微生物培养物的前提,认同无菌技术能保持无菌物品与无菌区域不被其他微生物污染。3.运用微生物纯培养原理和无菌技术,通过平板划线法对酵母菌分离、纯化。
一、微生物及培养条件
1.微生物:难以用肉眼观察的微小生物的统称,包括细菌、真菌和病毒等。
2.研究和应用微生物的前提是防止杂菌污染,获得纯净的微生物培养物。
3.实验室培养微生物的条件
(1)要为人们需要的微生物提供合适的营养和环境条件。
(2)要确保其他微生物无法混入,并将需要的微生物分离出来。
二、培养基的配制
1.培养基的概念、用途和类型
提醒　固体培养基中的琼脂仅作为凝固剂,不能为微生物生长提供能量和碳源。
2.培养基的营养构成
(1)主要营养物质:水、碳源、氮源和无机盐。
(2)其他条件:满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及O2的需求。如下表:
微生物 乳酸杆菌 霉菌 细菌 厌氧 微生物
特殊 需求 添加 维生素 pH调 至酸性 pH调至 中性或 弱碱性 无氧
三、无菌技术
1.获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染。
2.消毒与灭菌的比较
3.连线无菌技术的常用方法及适用对象
【提示】 ①—c—Ⅳ,①—d—Ⅱ,①—e—Ⅴ,②—a—Ⅰ,②—b—Ⅲ,②—f—Ⅵ
四、微生物的纯培养
1.概念理解
2.酵母菌的纯培养
(1)实验原理。
①菌落:分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体。
②获得单菌落的方法:采用平板划线法和稀释涂布平板法能将单个微生物分散在固体培养基上,经培养得到单菌落。
(2)方法步骤。
3.倒平板和平板划线法的操作
(1)倒平板的具体操作。
提醒　倒平板是将熔化后的培养基倒入培养皿冷却凝固形成培养基固体平面的过程,而不只是将培养皿倒置。
(2)平板划线法的具体操作。
判断正误
(1)培养基中的碳源物质可能同时作为氮源。(　　)
【答案】 √
(2)有些微生物在培养时,培养基中可能不需要加入氮源。(　　)
【答案】 √
(3)只要是没有生物活性的材料就必须采用高压蒸汽灭菌。(　　)
【答案】 ×
【提示】 没有生物活性的材料不一定要用高压蒸汽灭菌法灭菌,如玻璃器皿可用干热灭菌法灭菌。
(4)培养基分装到培养皿后再进行湿热灭菌。(　　)
【答案】 ×
【提示】 应将配制好的培养基先进行湿热灭菌,再在无菌环境中将其分装到培养皿中。
(5)倒平板时,应将打开的皿盖放到一边,以免培养基溅到皿盖上。(　　)
【答案】 ×
【提示】 倒平板时,将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙,将培养基倒入培养皿,立即盖上皿盖。
(6)配制培养基时应先灭菌再调pH。(　　)
【答案】 ×
【提示】 配制培养基时应先调pH再灭菌,否则易有杂菌污染。
任务一　分析培养基的种类和营养构成
　　培养微生物需要适宜的营养物质,下表是某培养基的配方,分析回答下列问题。
组分 牛肉膏 蛋白胨 NaCl 琼脂 水
用量 5 g 10 g 5 g 20 g 定容至 1 000 mL
(1)根据培养基的物理性质划分,该培养基属于固体培养基,理由是该培养基的配方中含有凝固剂琼脂。
(2)该培养基中提供碳源和氮源的物质是什么,为什么培养基需要氮源
【提示】 牛肉膏和蛋白胨,培养基中的氮元素是微生物合成蛋白质、核酸等物质必需的。
(3)该培养基培养的微生物同化作用类型是异养型微生物,理由是该微生物的碳源和氮源是有机物。
(4)下表是某微生物培养基的成分,请分析该培养基可用来培养哪种微生物 理由是什么
成分 (NH4)2SO4 KH2PO4 FeSO4 CaCl2 H2O
含量 0.4 g 4.0 g 0.5 g 0.5 g 100 mL
【提示】 此培养基可用来培养自养型微生物。培养基中没有提供碳源,微生物利用空气中的CO2做碳源。
核心归纳
1.培养基的成分和作用
营养 物质 定义 作用 主要来源
碳源 提供碳元素的物质 构成生物体的细胞物质和一些代谢物,有些也是异养生物的能源物质 无机碳源:CO2、NaHCO3等; 有机碳源:糖类、石油、牛肉膏等
氮源 提供氮元素的物质 合成蛋白质、核酸以及含氮的代谢物 无机氮源:N2、NH3、铵盐、硝酸盐等;有机氮源:尿素、蛋白胨等
水 在生物体内含量很高的无机物 不仅是优良的溶剂,而且可维持生物大分子结构的稳定 —
无机盐 为微生物提供除碳、氮以外的各种重要元素,包括大量元素和微量元素 是细胞的组成成分、生理调节物质、某些化能自养菌的能源、酶的激活剂等 无机化合物
2.培养基的特点、种类和用途
典型例题
1.(2025·周口检测)下列有关微生物培养基种类及配制原则的叙述,正确的是(　　)
[A]任何培养基都必须含有碳源、氮源、水、无机盐及特殊的营养物质
[B]液体培养基可用于观察菌落,固体培养基可用于工业生产
[C]微生物的生长除了受营养因素影响,还受pH、O2、渗透压等的影响
[D]淀粉可作为所有微生物的碳源
【答案】 C
【解析】 培养基不一定都含有碳源、氮源,自养型微生物可以利用无机碳源(如CO2)合成自身所需的含碳有机物,自生固氮菌能够独立将空气中的氮气固定为含氮化合物;一般来说,固体培养基表面有一定的硬度,便于细菌在其表面生长形成单个的菌落,所以固体培养基常用于观察菌落;而液体培养基中微生物可以与营养物质充分接触,更有利于微生物的生长繁殖,所以液体培养基常用于工业生产;不同的微生物对碳源的需求不同,某些微生物不能分解利用淀粉,而只能利用葡萄糖、果糖、蔗糖和麦芽糖等糖类。
2.不同的微生物对营养物质的需求各不相同。下列有关一种以CO2为唯一碳源的自养型微生物所需营养的描述中,错误的是(　　)
[A]氮源物质为该微生物提供必要的氮元素
[B]碳源物质也是该微生物的能源物质
[C]无机盐是该微生物不可缺少的营养物质
[D]水是该微生物的营养要素之一
【答案】 B
【解析】 微生物生长繁殖需要氮源,氮源物质为该微生物提供必要的氮元素;该微生物所利用的碳源物质是CO2,无法继续氧化、分解释放能量,不能作为微生物的能源物质;无机盐是微生物生长繁殖不可缺少的营养物质;生物的生命活动离不开水,水是该微生物的营养要素之一。
【易错提醒】
有关培养基营养物质的四点提醒
(1)培养不同的微生物所需要的营养物质可能不同。
①自养型微生物的培养基主要以无机营养为主。
②异养型微生物的培养基主要以有机营养为主。
(2)对异养微生物来说,含C、H、O、N的化合物通常既是碳源,又是氮源。
(3)微生物需要补充特殊营养物质,是由于缺乏合成这些物质所需要的酶或合成能力有限。
(4)能利用无机物合成含碳有机物的是自养型生物,反之为异养型生物。
任务二　对比分析微生物培养中的消毒和灭菌
　　无菌技术包括消毒和灭菌,借助于不同的灭菌和消毒手段,可不同程度地减少或杀灭环境中的微生物,确保微生物研究和生产顺利进行。回答下列有关问题。
(1)选择以下材料或用具所用的无菌技术。
①吸管　②培养基　③培养皿　④实验操作者的双手　⑤烧瓶　⑥接种针　⑦试管　⑧接种环　⑨玻璃棒
消毒:④;灼烧灭菌:⑥⑧;干热灭菌:①③⑤⑦⑨;湿热灭菌:②。
(2)进行化学消毒时,某人认为酒精浓度越高,消毒效果可能越好,于是他用了体积分数为95%的酒精进行消毒,他的做法对吗 为什么
【提示】 不对。用酒精消毒时,体积分数为70%～75%的酒精消毒效果较好,原因是酒精浓度过高时,菌体表面的蛋白质会凝固成一层保护膜,使酒精不能渗入其中。
(3)牛奶的消毒常采用巴氏消毒法,与煮沸消毒法相比,这种方法的优点是什么
【提示】 在达到消毒目的的同时,营养物质损失较少。
(4)无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染,还有什么作用
【提示】 无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。
核心归纳
不同消毒方法的特点
典型例题
3.无菌技术应围绕着如何避免杂菌的污染展开,主要包括消毒和灭菌。下列关于无菌操作的叙述,正确的是(　　)
[A]无菌技术可以有效避免操作者自身被微生物感染
[B]用紫外线照射可以消除物体内部的全部微生物
[C]配制好培养基后将其分装到培养皿中,再进行湿热灭菌
[D]用巴氏消毒法处理食品后会将所有的细菌或芽孢杀死
【答案】 A
【解析】 无菌操作技术既可以用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染,又可以有效避免操作者自身被微生物感染;消毒是指使用较温和的物理、化学和生物等方法杀死物体体表或内部的一部分微生物的过程,紫外线消毒不能消除物体内部的全部微生物,巴氏消毒法也不能杀死食品中的所有细菌或芽孢;为了防止杂菌污染,应将配制好的培养基先进行湿热灭菌,再在无菌环境中将其分装到培养皿中。
4.在生产、生活和科研实践中,经常通过消毒和灭菌来避免杂菌的污染。回答下列问题。
(1)在实验室中,玻璃和金属材质的实验器具　　　　(填“可以”或“不可以”)放入干热灭菌箱中进行干热灭菌。
(2)密闭空间内的空气可采用紫外线照射消毒,其原因是紫外线能　　　　　　　　。在照射前,适量喷洒　　　　,可强化消毒效果。
(3)水厂供应的自来水通常是经过　　　　(填“氯气”“乙醇”或“高锰酸钾”)消毒的。
【答案】 (1)可以
(2)破坏核酸结构　(苯酚或煤酚皂溶液等)消毒液
(3)氯气
【解析】 (1)干热灭菌是指将物品放入干热灭菌箱内,在160～170℃的热空气中维持1～
2 h。耐高温和需要保持干燥的物品,如玻璃器皿(如吸管、培养皿等)、金属用具等,可采用干热灭菌的方法。(2)接种室、接种箱或超净工作台在使用前,可以用紫外线照射30 min,紫外线能破坏微生物的核酸结构,从而杀死物体表面或空气中的微生物。在照射前,适量喷洒苯酚或煤酚皂溶液等消毒液,可以加强消毒效果。(3)自来水通常是用氯气进行消毒的。
任务三　掌握酵母菌纯培养的实验操作方法
探究1　分析倒平板的实验操作,提高实验操作能力
　　倒平板是微生物学实验中的一项基本操作,主要用于培养微生物。 它需要将培养基冷却至50 ℃左右,然后倒入平板中,使培养基均匀分布在平板上,以便于后续的微生物接种和培养。结合倒平板的操作程序回答有关问题。
(1)如图1所示,需要使锥形瓶的瓶口通过火焰的原因是通过灼烧灭菌,防止瓶口的微生物污染培养基。
(2)培养基灭菌后,需要冷却到50 ℃左右时,才能用来倒平板。为什么要冷却至50 ℃左右 可用什么办法来估计培养基的温度
【提示】 倒平板时高于50 ℃会烫手,低于50 ℃时若不及时操作,琼脂会凝固。估计培养基的温度为50℃左右的方法是用手触摸盛有培养基的锥形瓶,感觉温度下降到刚刚不烫手即可。
(3)如图2所示,培养基冷凝后,为什么要将平板倒置
【提示】 培养基冷凝后,皿盖上会凝结水珠,将平板倒置,既可以防止皿盖上的水珠落入培养基,又可以避免培养基中的水分过快挥发。
探究2　分析平板划线法的原理和操作,提高理解能力
　　下图是平板划线操作的示意图,据图回答下列问题。
(1)用字母和箭头表示平板划线操作的正确步骤d→b→f→a→e→c→h→g。
(2)为什么在操作的第一步以及从第二次划线开始,每次划线之前都要灼烧接种环
【提示】 操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物;从第二次划线开始,每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后,接种环上残留的菌种,使下一次划线时,接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端,从而通过划线次数的增加,使每次划线时菌种的数目逐渐减少,以便得到单个菌落。
(3)在划线操作结束时,还需要灼烧接种环吗 为什么
【提示】 需要,划线结束后灼烧接种环,能及时杀死接种环上残留的菌种,避免细菌污染环境和感染操作者。
(4)在灼烧接种环之后,为什么要等其冷却后再进行划线
【提示】 以免接种环温度太高,杀死菌种。
(5)在第二次以及其后的划线操作时,为什么总是从上一次划线的末端开始划线
【提示】 划线后,线条末端细菌的数目比线条起始处要少,每次从上一次划线的末端开始,能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少,最终能得到由单个微生物繁殖而来的菌落。
(6)接种结束后,为什么要将一个未接种的培养基和一个已接种的培养基放在恒温培养箱一起培养24～48 h,未接种的培养基表面如果有菌落生长,说明了什么
【提示】 培养未接种培养基的作用是做对照,若未接种的培养基培养后无菌落生长,说明培养基的制备是成功的。若有菌落形成,说明培养基灭菌不彻底,或培养基被污染了,需要重新制备。
核心归纳
平板划线操作的注意事项
(1)灼烧接种环,待其冷却后才能伸入菌液,以免温度太高杀死菌种。
(2)第二次及其以后的划线操作总是从上一次划线末端开始,能使微生物的数目随着划线次数的增加而逐渐减少,最终得到由单个微生物繁殖而来的菌落。
(3)划线时最后一区不要与第一区相连。
(4)划线用力大小要适当,防止用力过大将培养基划破。
典型例题
5.(2025·昆明检测)在自然界中分布有各种微生物,而研究和应用微生物的前提是进行微生物的纯培养。工业上大规模生产酸奶时,需先获得单一乳酸菌菌种。下列相关操作正确的是(　　)
[A]培养基灭菌后,需调至中性或弱碱性
[B]培养基需冷却到室温时才能用来倒平板
[C]采用平板划线法接种时划线5个区则需要灼烧接种环5次
[D]接种后的平板需倒置,放入恒温培养箱中培养
【答案】 D
【解析】 培养细菌时,一般需要将培养基调至中性或弱碱性,调pH之后再进行高压蒸汽灭菌;培养基需冷却到50 ℃左右时,才能用来倒平板;采用平板划线法接种乳酸菌时,若完成5次划线,需要灼烧接种环6次;接种后的平板需倒置培养,防止培养皿皿盖上凝结的水珠滴落和培养基水分挥发过快。
6.(2024·湖南卷)微生物平板划线和培养的具体操作如图所示,下列操作正确的是(　　)
[A]①②⑤⑥ [B]③④⑥⑦
[C]①②⑦⑧ [D]①③④⑤
【答案】 D
【解析】 由题图可知,②中拔出棉塞后应握住棉塞上部;⑥中划线时不能将培养皿的皿盖完全打开,应只打开一条缝隙;⑦中划线时第5次的划线不能与第1次的划线相连;⑧中平板应倒置培养。
随堂检测反馈
1.(2025·广州检测)下列关于微生物培养基的叙述,错误的是(　　)
[A]制备固体培养基,一般需在液体培养基中加入琼脂
[B]微生物在固体培养基表面生长形成的菌落,可以用肉眼观察到
[C]根据微生物对碳源需要的差别,使用不同碳源的培养基
[D]培养基中的营养物质浓度越高,对微生物的增殖越有利
【答案】 D
【解析】 制备固体培养基,一般需在液体培养基中加入适量的凝固剂——琼脂;菌落是由微生物在固体培养基表面或内部生长形成的肉眼可见的、具有一定形态结构的细胞群体;不同微生物对碳源的需求不同,有的主要利用淀粉,有的主要利用葡萄糖或果糖,还有的可直接利用空气中的CO2;培养基中的营养物质浓度过高,微生物会通过渗透作用失水,对微生物的增殖不利。
2.下列关于倒平板的叙述,错误的是(　　)
[A]待培养基冷却至50 ℃左右时倒平板
[B]倒平板整个过程应在酒精灯火焰旁进行
[C]完全打开培养皿皿盖,快速将培养基倒入培养皿
[D]为避免水滴滴入培养基,平板应倒过来放置
【答案】 C
【解析】 待培养基冷却至50 ℃左右时倒平板,这个温度既不会烫死菌种,也不会使培养基很快凝固;倒平板整个过程应在酒精灯火焰旁进行,利用火焰周围的高温形成无菌区,降低杂菌污染的风险;用拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙,而不是完全打开皿盖,完全打开皿盖容易导致杂菌污染;为避免水滴滴入培养基,平板应倒过来放置,这样可以防止冷凝水滴落造成培养基污染。
3.如图是微生物平板划线示意图,划线的顺序为1→2→3→4→5,下列说法正确的是(　　)
[A]除第一次划线外,每次划线的始端需与上次划线的末端相交
[B]1和5划线可以如图所示,也可以相连在一起
[C]每次划线前都需要灼烧接种环,划线后则不需要
[D]只有在5区域才可以得到所需菌落
【答案】 A
【解析】 第二次及以后的划线总是从上次划线的末端开始,使微生物的数目随着划线次数的增加而逐步减少,最终能得到由单个微生物繁殖而来的菌落;第一次划线区微生物较多,划线时注意不能将最后一区即5区的划线与第一区即1区相连,否则可能无法获得单菌落;划线结束后需要灼烧接种环,清除残留在接种环上的菌种,防止微生物污染环境和感染操作者;由题图可知,5区域是最后一个区域,有可能在5区域获得单菌落,但其他区域也可能形成单菌落。
4.(2025·哈尔滨检测)防止杂菌污染,获得纯净的微生物培养物,是研究和应用微生物的前提。下列叙述错误的是(　　)
[A]接种箱或超净工作台在使用前,可以用紫外线照射30 min,以杀死物体表面或空气中的微生物
[B]牛奶使用巴氏消毒法处理,在100 ℃煮30 min,既可以杀死牛奶中的微生物,又不破坏营养成分
[C]在实验室中,不可吃东西、喝水,离开实验室一定要洗手,以防止被微生物感染
[D]使用后的培养基丢弃前一定要进行灭菌处理,以免污染环境
【答案】 B
【解析】 不同于煮沸消毒法,巴氏消毒法处理的温度不是很高,一般在63～65 ℃消毒
30 min或72～76 ℃处理15 s或80～85 ℃处理10～15 s,能杀死牛奶中的绝大多数微生物且基本不破坏牛奶的营养成分。
5.回答下列与细菌培养相关的问题。
(1)在细菌培养时,培养基中能同时提供碳源、氮源的成分是　　　　(填“蛋白胨”“葡萄糖”或“NaNO3”)。通常,制备培养基时要根据所培养细菌的不同来调节培养基的pH,其原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。硝化细菌在没有碳源的培养基上　　　　(填“能”或“不能”)生长,原因是　　　　　　　　　　　　　。
(2)单个细菌在平板上会形成菌落,研究人员通常可根据菌落的形状、大小、颜色等特征来初步区分不同种的微生物,原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　 　。
(3)使用后的培养基在丢弃前需要经过　　　　　　　　　　　　处理,这种处理可以杀死丢弃物中所有的微生物。
【答案】 (1)蛋白胨　不同细菌生长繁殖所需的最适pH不同　能　硝化细菌可以利用空气中的CO2作为碳源
(2)在一定的培养条件下,不同种微生物表现出各自稳定的菌落特征　
(3)灭菌
【解析】 (1)葡萄糖只能为细菌提供碳源,NaNO3主要为细菌提供无机盐,而蛋白胨既可以为细菌提供碳源,也可以为细菌提供氮源;由于不同的细菌生长繁殖的最适pH是不同的,因此制备培养基时要根据所培养的细菌的不同来调节培养基的pH;硝化细菌属于化能自养型微生物,其可以利用氨氧化释放的能量将空气中的CO2固定为有机物,因此硝化细菌可以在无碳源的培养基中生长。
(2)由于不同类型的微生物都有其独特的细胞形态,因而其菌落形态特征也各异,因此可根据菌落的形态、大小、颜色等特征来初步区分不同种的微生物。
(3)使用后的培养基含有培养的微生物,丢弃前一定要进行灭菌处理,以杀死其中所有的微生物,从而避免污染环境。
　　为保障公共健康,需要定期对公共饮用水进行卫生检测。居于大肠中的各种细菌统称为大肠菌群,大肠菌群中的杆菌称为肠杆菌,大肠杆菌是肠杆菌中的一种。一般用大肠菌群作为水体受粪便污染的指示菌,饮用水的卫生标准之一是每100 mL 不得检出大肠菌群。若要确定饮用水是否合格,可采用膜过滤法检测饮用水中的大肠菌群,过程如下图所示:
(1)检测前需要进行无菌处理的材料用具有①②③④(填序号)。
①水样收集瓶　②滤膜　③培养基　④镊子　
⑤水样
(2)完成过滤后需将滤膜的A面(填“A面”或“B面”)接触配制好的培养基。
(3)将完成过滤之后的滤膜紧贴在培养基上,这属于微生物培养中的接种操作。为了检测该培养基灭菌是否彻底,对于该培养基应采用的检测方法是空白培养基倒置培养箱中培养,观察是否有菌落形成。
(4)培养基在37 ℃下培养20～22 h后进行观察。若观察到培养基上产生大肠菌群菌落,则此水不符合饮用水标准。
(5)某显色培养基可以检测肠杆菌中大肠杆菌的存在。该培养基中含有ONPG和MUG可作碳源,色氨酸可作为氮源。在检测大肠菌群时,检测指标如下表所示。
菌群 检测项目及原理
大肠菌群(有β-半乳糖苷酶) ONPG检测:β-半乳糖苷酶水解无色的ONPG为黄色物质
肠杆菌群(降解色氨酸为吲哚) 吲哚检测:吲哚可使特定显影剂显为绿色
大肠杆菌(有β-葡糖醛酸酶) MUG检测:β-葡糖醛酸酶降解MUG为具有荧光的物质
注:出现上述颜色变化为阳性,未出现上述颜色变化为阴性。
结合表中内容分析,若上述检测结果为D(填字母),则可以确定待测菌为大肠杆菌。
A.ONPG检测和吲哚检测为阳性,MUG检测为阴性
B.吲哚检测为阳性,ONPG检测和MUG检测为阴性
C.ONPG检测、MUG检测、吲哚检测均为阴性
D.ONPG检测、MUG检测、吲哚检测均为阳性
课时作业
(时间:30分钟　分值:54分)
第1～6题每题3分,第7～8题每题6分,共计30分。
基础对点练
知识点1　培养基的配制
1.下列关于微生物生长条件的叙述,错误的是(　　)
[A]培养乳酸杆菌时,需要在培养基中添加维生素
[B]培养霉菌时,一般需要将培养基调至酸性
[C]培养细菌时,一般需要将培养基调至中性或弱碱性
[D]培养乳酸菌时需要不断通入空气或氧气
【答案】 D
【解析】 乳酸菌为厌氧菌,培养乳酸菌时需要提供无氧环境,不需要通入空气或氧气。
2.(2025·长沙检测)下表是某培养基的配方。以下说法正确的是(　　)
编号 ① ② ③ ④ ⑤
成分 (NH4)2SO4 KH2PO4 FeSO4 CaCl2 H2O
含量 0.4 g 4.0 g 0.5 g 0.5 g 100 mL
[A]往往使用干热灭菌法对培养基进行灭菌
[B]此培养基可用来培养自养型微生物
[C]制备该培养基过程中,应灭菌后再倒平板
[D]培养基中添加KH2PO4的作用只是维持培养基的pH稳定
【答案】 B
【解析】 培养基的灭菌方法是湿热灭菌(或高压蒸汽灭菌);该培养基中缺乏碳源,可以用于培养自养型微生物;根据培养基的成分判断该培养基是液体培养基,制备过程不需要倒平板;KH2PO4不仅可以维持培养基的pH,还有利于维持培养基的渗透压的稳定、为微生物提供钾、磷元素。
知识点2　无菌技术和微生物的纯培养
3.(2025·绵阳月考)下列有关实验的操作中,错误的是(　　)
①煮沸消毒可以杀死微生物的营养细胞和部分芽孢
②接种操作要在酒精灯火焰附近进行
③对于不耐高温的液体,如牛奶,用巴氏消毒法消毒
④家庭制作葡萄酒时要将容器和葡萄都进行灭菌
⑤培养基可采用湿热灭菌法灭菌
⑥加入培养基中的指示剂和染料不需要灭菌
⑦接种环可采用火焰灼烧的方式灭菌
[A]①③ [B]②④ [C]⑤⑦ [D]④⑥
【答案】 D
【解析】 家庭制作葡萄酒利用的是附着在葡萄皮表面的野生型酵母菌,所以制作葡萄酒时不对葡萄进行灭菌,以免杀死酵母菌,④错误;指示剂和染料中可能混有微生物,故加入培养基前需灭菌,⑥错误。
4.采用平板划线法能将单个微生物分散在固体培养基上,下列有关平板划线操作的叙述,错误的是(　　)
[A]第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物
[B]再次划线前,灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种
[C]在第二区域内划线时,接种环上的菌种直接来源于菌液
[D]划线结束后,灼烧接种环,能及时杀死接种环上的菌种,避免微生物污染环境和感染操作者
【答案】 C
【解析】 从第二次划线开始,每次划线时接种环上的菌种直接来源于上次划线区域的
末端。
5.(2025·周口开学考)如图表示实验室中酵母菌纯培养的部分操作步骤,下列说法错误的是(　　)
[A]①②③步骤操作时需要在酒精灯火焰旁进行
[B]步骤①中待倒入的培养基冷却后盖上培养皿的皿盖
[C]步骤③中,每次划线前后都需对接种环进行灭菌处理
[D]划线接种结束后,将图④平板倒置后放入培养箱中培养
【答案】 B
【解析】 ①②③步骤操作时需要在酒精灯火焰旁进行,防止被杂菌污染;倒完培养基后立即盖上培养皿的皿盖,冷却后将平板倒过来放置;每次划线前后都需对接种环进行灭菌处理;划线接种结束后,将平板倒置后放入培养箱中培养,可防止皿盖上的水珠落入培养基造成污染。
6.在分离纯化大肠杆菌实验中,划线接种(甲)、培养结果(乙)如图所示。下列有关叙述错误的是(　　)
[A]甲中a区域为划线的起始位置
[B]接种前应对培养基进行湿热灭菌
[C]接种过程中至少需要对接种环灼烧5次
[D]连续划线的目的是获得单个细菌,以便形成单菌落
【答案】 A
【解析】 乙图呈现的培养结果是从d区域到a区域菌落逐渐减少,而形成单菌落的区域是划线的末端,所以a区域应为最后一次划线的位置;在培养微生物时为避免杂菌污染,培养基可采用湿热灭菌;划线前后都要对接种环灼烧,共划线4次,所以需要灼烧5次;平板划线法是分离单菌落的常用方法,划线将细菌分散,便于获得由单个细菌形成的单菌落。
综合提升练
7.枯草芽孢杆菌是一种需氧菌,可利用蛋白质和糖类,分解色氨酸形成吲哚,在遗传学研究中也有广泛应用。下列关于枯草芽孢杆菌纯培养过程的说法正确的是(　　)
[A]微生物的纯培养物就是不含有代谢废物的微生物培养物
[B]分离纯化过程中,使用液体培养基并振荡处理,更利于枯草芽孢杆菌的增殖
[C]该菌的培养基通常要先调至中性或弱碱性,再进行灭菌杀死内外所有的微生物
[D]在灭菌时,培养皿可采用灼烧灭菌法灭菌
【答案】 C
【解析】 由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物;分离纯化枯草芽孢杆菌应该使用固体培养基,液体培养基适用于枯草芽孢杆菌的扩大培养;枯草芽孢杆菌是细菌,培养细菌时通常需将培养基的pH调至中性或弱碱性,然后进行灭菌处理;在灭菌时,培养皿可采用干热灭菌法灭菌,但不能采用灼烧灭菌法灭菌。
8.生长图形法是一种测定微生物营养需求的简便方法。为探究某嗜热菌所需特殊营养物质的种类,某研究小组把该菌的悬浮液与不含任何特殊营养物质但含有其他必需营养物质的培养基混合后倒平板,然后在平板上划分数区,将甲、乙、丙三种特殊营养物质分别添加到不同区域,培养结果如图所示。下列说法不正确的是(　　)
[A]倒平板后直接培养可判断有无污染
[B]将所有平板放置在28 ℃下倒置培养并观察
[C]图示结果表明该菌需要特殊营养物质乙和丙
[D]生长图形法还可用于某些菌种的筛选
【答案】 B
【解析】 倒平板后不接种直接进行培养观察有无菌落的出现,可以判断培养基有无污染;该菌为嗜热菌,应放置在其适宜的高温条件下培养,而不是28 ℃;图中嗜热菌在添加了乙、丙特殊营养物质的区域生长,故该菌需要的特殊营养物质是乙和丙;不同的菌种所需的特殊营养物质不同,利用生长图形法可用于某些能利用特定营养物质的菌种的筛选。
9.(12分)扩展青霉是腐烂苹果中常见的微生物之一,其次生代谢物棒曲霉素(Pat)是一种具有致突变作用的毒素。为研究腐烂苹果中Pat的分布,研究人员进行了如图所示的实验,其中“病健交界处”为腐烂部位与未腐烂部位的交界处,取样分离的5个部位分别为①号、②号、③号、④号、⑤号。请回答下列问题。
(1)苹果腐烂部位的微生物除扩展青霉外,还有枯草杆菌。两种微生物在结构上的主要区别是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(2)活化扩展青霉菌种使用的培养基成分如下表,根据物理性质划分该培养基属于　　　　培养基,其中能为扩展青霉的生长繁殖提供能源的是　　　 　;NaNO3的作用是
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　(答2点)。
蔗糖 NaNO3 MgSO4 KCl FeSO4 KH2PO4 蒸馏水
30 g 2 g 0.5 g 0.5 g 0.01 g 1 g 1 000 mL
(3)用平板划线法分离扩展青霉时,划线的某个平板培养后第一划线区域的划线上都不间断地长满了菌落,其他区域的划线上却均无菌落。操作失误的原因可能是　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(4)接种扩展青霉前,应对苹果进行　　　　(填“消毒”或“灭菌”)处理。研究人员测定了病斑直径为 1 cm、2 cm、3 cm的苹果中①～⑤号部位的Pat含量,请推测最可能的结果:
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　;　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
【答案】 (除标注外,每空2分)
(1)扩展青霉有以核膜为界限的细胞核,枯草杆菌无此结构(1分)
(2)液体(1分)　蔗糖(1分)　为扩展青霉的生长提供氮源和无机盐、维持培养液的渗透压
(3)第一区域划线结束,接种环灼烧后未冷却或划线未从第一区域末端开始
(4)消毒(1分)　相同病斑情况下,离病斑越远的部位,Pat含量越低　相同部位病斑越大,Pat含量越高
【解析】 (2)活化扩展青霉菌种使用的培养基成分中没有凝固剂,故根据物理性质划分该培养基属于液体培养基。(3)从第二次划线开始,每次从上一次划线的末端开始划线,能使扩展青霉的数目随着划线次数的增加而逐步减少,最终能得到由单个细胞繁殖而来的菌落。若划线的某个平板培养后第一划线区域的划线上都不间断地长满了菌落,其他区域的划线上却均无菌落,可能是因为第一区域划线结束,接种环灼烧后未冷却或划线未从第一区域末端开始。(4)接种扩展青霉前,为了避免苹果上其他杂菌的污染,应对苹果进行消毒处理。由题图可知,①号为腐烂部位,②③④⑤依次距离腐烂部位越来越远,推测相同病斑情况下,①号部位的Pat含量最高,离腐烂部位越远的果肉中Pat含量越低;相同部位病斑越大,Pat含量越高。
10.(12分)(经典高考)化合物S被广泛应用于医药、食品和化工工业。用菌株C可生产S,S的产量与菌株C培养所利用的碳源关系密切。为此,某小组通过实验比较不同碳源对菌体生长和S产量的影响,结果见下表。回答下列问题。
碳源 细胞干重/(g/L) S产量/(g/L)
葡萄糖 3.12 0.15
淀粉 0.01 0.00
制糖废液 2.30 0.18
(1)通常在实验室培养微生物时,需要对所用的玻璃器皿进行灭菌,灭菌的方法有

(答出2点即可)。
(2)由实验结果可知,菌株C生长的最适碳源是　　　　　　　　　　　　　　;用菌株C生产S的最适碳源是　　　　　　　　　　　　　　　　　。菌株C的生长除需要碳源外,还需要　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　(答出2点即可)等营养物质。
(3)由实验结果可知,碳源为淀粉时菌株C不能生长,其原因是　　　　　　　　　　　。
(4)若以制糖废液作为碳源,为进一步确定生产S的最适碳源浓度,某同学进行了相关实验。请简要写出实验思路:　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　。
(5)利用制糖废液生产S可以实现废物利用,其意义是　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　。
【答案】 (除标注外,每空2分)
(1)干热灭菌、湿热灭菌(或高压蒸汽灭菌)
(2)葡萄糖(1分)　制糖废液(1分)　氮源、无机盐
(3)缺少淀粉酶　
(4)设计一系列不同浓度的制糖废液分别培养菌株C,测定不同浓度制糖废液中S产量,寻找S产量最大的碳源浓度,确定最适碳源浓度　
(5)减少污染、节省原料、降低生产成本
【解析】 (1)获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染,对所需的玻璃器皿进行灭菌,灭菌的方法有干热灭菌、湿热灭菌(或高压蒸汽灭菌)。(2)分析题干实验结果,以葡萄糖为碳源时,细胞干重最大,故菌株C生长的最适碳源是葡萄糖;以制糖废液为碳源时,S产量最高,故用菌株C生产S的最适碳源是制糖废液。微生物的生长需要水、无机盐、碳源、氮源以及特殊的营养物质,故菌株C的生长除需要碳源外,还需要氮源、无机盐等营养物质。(3)由实验结果可知,菌株C可以利用葡萄糖,但在以淀粉为碳源时,菌株C不能生长,说明菌株C无法利用淀粉,原因是菌株C不能合成淀粉酶,导致其无法利用淀粉。(4)以制糖废液作为碳源,进一步确定生产S的最适碳源浓度,可以以碳源浓度作为自变量,不同碳源浓度下S产量作为因变量,实验思路为设计一系列不同浓度的制糖废液分别培养菌株C,测定不同浓度制糖废液中S产量,寻找S产量最大的碳源浓度,从而确定最适碳源浓度。(共63张PPT)
第2课时　微生物的选择培养和计数
1.基于实例分析,说明选择培养基的概念,学会设计培养基来分离分解尿素的细菌。2.通过学习稀释涂布平板法,分析并总结分离微生物的过程。3.基于稀释涂布平板法和显微镜计数法,运用归纳与概括的科学方法,概述测定微生物数量的常用方法。4.基于微生物的选择培养和数量测定原理,对土壤中分解尿素的细菌分离并计数,对实验结果进行分析与评价。
[学习目标]
预习案·自主学习
一、选择培养基
1.自然界中目的菌株的筛选
(1)依据:根据目的菌株对生存环境的要求,到相应环境中去寻找。
(2)实例:PCR技术中用到的 的DNA聚合酶就是从热泉中筛选出的水生栖热菌中分离的。
耐高温
2.实验室中目的菌株的筛选
(1)原理:人为提供有利于 生长的条件(包括营养、温度和pH等),同时 其他微生物的生长。
(2)选择培养基:允许 生长,同时抑制或阻止
生长的培养基。
提醒　有些微生物可以利用其他微生物的代谢物生长繁殖,因此,能够在选择培养基上生长的不一定都是目的菌株。
目的菌
抑制或阻止
特定种类的微生物
其他种类微生物
二、微生物的选择培养
1.方法:稀释涂布平板法。
2.实验操作流程
0.1
酒精
酒精
燃尽
冷却
吸收
恒温培养箱
单菌落
三、微生物的数量测定
1.稀释涂布平板法
计数 原理 当样品的稀释度足够高时,培养基表面生长的一个单菌落,来源于样品稀释液中的 。通过统计平板上的 ,就能推测出样品中大约含有多少活菌
计数 方法 通常选用一定稀释范围的样品液进行培养,以保证获得菌落数为
、适于计数的平板。在 下,应至少对 个平板进行重复计数,然后求出平均值
计数 结果 统计的菌落数往往比活菌的实际数目 。原因是
一个活菌
菌落数
30～300
同一稀释度
3
少
当两个或多
个细胞连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落
2.显微镜直接计数法
细菌计数板
活菌数和死菌数
四、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
1.分离原理:土壤中的细菌之所以能分解尿素,是因为它们能合成 。利用 作为唯一氮源的选择培养基,可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。
脲酶
尿素
2.操作步骤
中性
3～8
1×104
1×105
1×106
1×103 ～ 1×107
30～300
30～37
菌落
数目稳定
特征
判断正误
(1)以尿素为唯一氮源的培养基是选择培养基。(　　)
√
×
【提示】 脲酶将尿素分解成NH3。
(2)脲酶能催化尿素分解产生N2,N2可作为细菌生长的氮源。(　　)
(3)在用涂布器涂布平板时,为了操作方便可完全打开培养皿的皿盖。(　　)
【提示】 为了防止杂菌污染,不能完全打开皿盖。
×
(4)利用显微镜直接计数法统计的细菌数量就是活菌的数量。(　　)
×
【提示】 利用显微镜直接计数法一般无法区分死菌和活菌。
(5)利用稀释涂布平板法统计菌落数目时,统计的菌落数就是活菌的实际数。
(　　)
【提示】 当两个或多个细胞连在一起时,只能观察并统计为一个菌落,因此利用稀释涂布平板法统计的菌落数往往比活菌的实际数目少。
×
探究案·互动探究
任务一　分析稀释涂布平板法的原理和操作
菌落总数可作为判定食品被污染程度的标志,也可以用于观察细菌在食品中繁殖的动态,以便对送检样品进行卫生学评估提供证据。下图是某样品培养简化流程图,请分析并回答下列问题。
(1)对样品悬液进行10倍梯度稀释的方法是
。
(2)涂布器一般是在酒精中浸泡,然后放在酒精灯火焰上灼烧灭菌,该操作的目的是 。
(3)下图是涂布平板操作的示意图,用字母和箭头表示涂布平板操作的正确步骤是 。
取1 mL样品上清液加入盛有
9 mL无菌水的试管中,依次等比稀释
杀死涂布器上的杂菌,防止杂菌污染
a→b→c→d
(4)图A和图B中,哪一个表示的是用稀释涂布平板法接种培养后得到的结果 稀释涂布平板法相比于平板划线法的优点是什么
【提示】 图B表示稀释涂布平板法接种培养后得到的结果。两种方法均可用于微生物的纯化,获取纯培养物,但稀释涂布平板法还可以用于微生物的计数。
「核心归纳」
1.平板划线法和稀释涂布平板法的比较
项目 平板划线法 稀释涂布平板法
图示
关键 操作 用接种环在固体培养基表面连续划线 ①一系列的梯度稀释;
②涂布平板
优点 操作简单,可以观察菌落特征,对混合菌进行分离 可以计数,可以观察菌落特征
缺点 不能计数 操作复杂,需将菌液进行一系列的梯度稀释,需涂布多个平板
相同点 都使用固体培养基,若没有特殊要求,两种方法都可以用来分离微生物
2.单菌落的获得
(1)利用平板划线法接种时,单菌落从最后划线的区域挑取。
(2)利用稀释涂布平板法接种时,只有合适的稀释度才能得到单菌落。
「典型例题」
1.(2025·广州检测)下列关于稀释涂布平板法相关操作的叙述,错误的是
(　　)
[A]可将涂布器末端浸在盛有体积分数为70%酒精的烧杯中
[B]涂布前取0.1 mL的菌液滴加到培养基表面
[C]将蘸有少量酒精的涂布器在火焰上灼烧,待酒精燃尽即可进行涂布
[D]用涂布器将菌液涂布在培养基表面时可转动培养皿使涂布均匀
C
【解析】 进行涂布平板操作前,要对涂布器进行灭菌,一般的做法是先将涂布器浸在盛有体积分数为70%酒精的烧杯中,然后将蘸有少量酒精的涂布器在火焰上灼烧,待酒精燃尽并冷却后再进行涂布,以免温度过高杀死菌种。
2.下图是纯化微生物时采用的两种接种方法接种后培养的效果图,下列相关叙述正确的是(　　)
[A]图甲三个平板中所用培养液的稀释倍数相同
[B]图甲、图乙均适合分离微生物,但图乙不适合对微生物进行计数
[C]图甲、图乙所用的接种工具分别是接种环和涂布器
[D]图乙每次划线应从同一起点开始以便使聚集的菌种逐步稀释后培养获得单菌落
B
【解析】 根据图甲中三个平板的菌落密度可知,三个平板中所用培养液的稀释倍数不同;图甲、图乙均可用于分离微生物,图乙是平板划线法接种后培养的效果图,不适合对微生物进行计数;稀释涂布平板法接种使用涂布器,平板划线法接种使用接种环;图乙从第二次划线开始,每次划线应从上一次划线的末端开始,以便使聚集的菌种逐步稀释后培养获得单菌落。
任务二　对比分析微生物数量测定的两种方法
下面是土壤中分解尿素的细菌的分离与计数的实验流程示意图。分析并回答有关问题。
(1)甲、乙两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。在对应稀释倍数为106的培养基中,得到以下两种统计结果:
①甲同学在该浓度下涂布了一个平板,统计的菌落数为230,该同学的统计结果是否真实可靠 为什么
【提示】 不真实。为增加实验的说服力与准确性,应设置重复实验,在同一稀释度下至少涂布3个平板,统计结果后计算平均值。
②乙同学在该浓度下涂布了3个平板,统计的菌落数分别为21、212、256,该同学将21舍去,然后取平均值。该同学对实验结果的处理是否合理 为什么
【提示】 不合理。微生物计数时,如果实验中出现重复实验的结果差别很大的情况,应分析实验过程中可能的影响因素,找出差异的原因,而不能简单地将结果舍弃后进行计数。
(2)某同学在三种稀释度下吸取0.1 mL的菌液涂布平板,统计菌落数,得到了以下的数据,试计算1 g 样品的活菌数。
项目 平板1 平板2 平板3
104 320 360 356
105 212 234 287
106 21 23 18
【提示】 105的稀释度下取0.1 mL菌液涂布的三个平板上的菌落数都为30～300,计算其平均值为(212+234+287)/3≈244。1 g样品中活菌数约为244÷0.1×105=2.44×108。
(3)实验中能以菌落数表示活菌数的原因是
。该实验所用计数方法的统计结果比实际值 (填“大”或“小”)。若用显微镜进行直接计数,统计结果比实际值 (填“大”或“小”)。
当样品稀释倍数足够高时,
培养基上的一个单菌落来源于一个活菌
小
大
「核心归纳」
稀释涂布平板法和显微镜直接计数法的比较
方法 稀释涂布平板法 显微镜直接计数法
原理 当样品的稀释度足够高时,培养基表面生长的一个菌落,来源于样品稀释液中的一个活菌,通过统计平板上的菌落数,就能推测出样品中大约含有多少活菌 利用特定的细菌计数板或血细胞计数板,在显微镜下观察、计数,然后再计算一定体积的样品中微生物的数量
「典型例题」
3.下列有关稀释涂布平板法和显微镜直接计数法的叙述,错误的是(　　)
[A]利用血细胞计数板计数属于显微镜直接计数法,其缺点是不能区分死菌与活菌
[B]两种计数方法,其统计值与实际值相比,均有差异,但差异原因不同
[C]两种计数方法均能在计数的同时观察到所研究微生物的形态特征
[D]当菌落数目稳定时,一般选取菌落数在30～300的平板进行计数
C
【解析】 用稀释涂布平板法计数时,当两个或多个细胞连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落,故而统计值比实际值小,用显微镜直接计数法计数时不能区分死菌和活菌,故统计的微生物数量往往大于实际的活菌数,因此两种计数方法的统计值与实际值相比,均有差异,但差异原因不同;稀释涂布平板法观察到的是菌落的形态特征,而不是微生物的形态特征,显微镜直接计数法观察到的是微生物的形态特征。
任务三　选择培养基与土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
组分 含量
KH2PO4 1.4 g
Na2HPO4 2.1 g
MgSO4·7H2O 0.2 g
葡萄糖 10.0 g
尿素 1.0 g
琼脂 15.0 g
H2O 定容至1 000 mL
(1)该培养基对微生物 (填“有”或“没有”)选择作用,判断依据是
。
(2)为什么分解尿素的微生物能在该培养基上生长
【提示】 分解尿素的微生物能合成脲酶,而脲酶可催化尿素分解产生NH3,
NH3可作为微生物生长的氮源。
该培养基
的配方中,尿素是唯一氮源,能够利用尿素的微生物能正常生长,不能利用尿素的微生物一般不生长
有
(3)利用上述培养基分离出的微生物都是能分解尿素的微生物吗 请说明理由。
【提示】 不一定;因为有些微生物可以利用能分解尿素的细菌的代谢物进行生长繁殖。
(4)尿素分解成NH3会使培养基的碱性增强,pH升高,因此可以通过检测培养基pH的变化来判断是否发生了该化学反应,进而判断该菌是否为尿素分解菌。依据以上原理,如何对分离得到的微生物是否是分解尿素的细菌作进一步鉴定
【提示】 在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂,接种并培养初步筛选的菌种,若菌落周围出现红色环带,则可说明该菌种能够分解尿素。
「核心归纳」
1.选择培养基与鉴别培养基的比较
项目 选择培养基 鉴别培养基
特殊 成分 加入不影响甚至促进目标微生物生长,而抑制或阻止其他微生物生长的化学物质 加入某种指示剂或化学药品(不影响微生物正常生长)
目的 抑制其他微生物的生长,促进目标微生物的生长 微生物的某种代谢物与培养基中的特定指示剂或化学药品发生反应
用途 培养、分离出目标微生物 鉴别目标微生物
举例 利用以尿素为唯一氮源的培养基可分离得到分解尿素的细菌 可用伊红—亚甲蓝琼脂培养基鉴定饮用水或乳制品中是否含有大肠杆菌(若有,则菌落呈深紫色,并带有金属光泽)
2.微生物筛选过程中必要的两种对照培养基及其作用
微生物筛选过程中,除选择培养基外,另外还需设置两组对照培养基,以提高实验的说服力和科学性。
对照组 作用 现象 结论
未接种的选择培养基 有无杂菌污染的判断 未接种的选择培养基中无菌落生长 未被杂
菌污染
接种的全营养培养基 选择培养基有无筛选作用的判断 全营养培养基上的菌落数大于选择培养基上的菌落数 选择培
养基具
有筛选作用
「典型例题」
4.(2025·济宁期中)下图为“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验操作流程,下列说法正确的是(　　)
[A]实验中选择培养基含有无机盐、葡萄糖、尿素、
蛋白胨、琼脂、水等物质
[B]培养基用高压蒸汽灭菌后,将pH调至中性或弱碱性
[C]平均每克土壤中分解尿素的细菌约为2.2×108个
[D]为判断培养基的选择作用,需设置未接种的培养基做对照
C
【解析】 培养基的营养成分应该包括碳源、氮源、水和无机盐等,实验目的是分离尿素分解菌,应该以尿素为唯一氮源,不应该含有其他氮源(如蛋白胨);将培养基的pH调至中性或弱碱性后,再高压蒸汽灭菌;将10 g土壤先稀释10倍,再进行梯度稀释10 000倍,然后取0.1 mL进行涂布平板,步骤④平板上统计的菌落数平均为(212+230+218)÷3=220(个),则每克土壤中尿素分解菌约为220÷0.1×100 000=2.2×108(个);为判断培养基的选择作用,需设置接种的全营养培养基做对照,若选择培养基上菌落数明显小于全营养培养基上的菌落数,说明选择培养基起到了选择作用。
5.(2025·成都期中)瘤胃是牛、羊等反刍动物具有的特殊的器官,其中的微生物多为厌氧菌,接触空气后会死亡。已知刚果红可以与纤维素形成红色复合物,但不与纤维素降解产物发生这种反应。研究人员对瘤胃中的纤维素分解菌进行了分离、鉴定,过程如下图所示。下列有关说法正确的是(　　)
[A]实验时,牛体内提取的瘤胃液不能使用干热灭菌,应使用湿热灭菌
[B]为分离出纤维素分解菌,甲、乙、丙培养基应以纤维素为唯一营养成分
[C]通过向乙和丁培养基中加入刚果红,可对纤维素分解菌进行鉴定和计数
[D]在甲、乙、丙、丁的培养基表面加入一层无菌石蜡能有效获得目标菌落
D
【解析】 从牛体内提取的瘤胃液不能灭菌,否则不能分离出目标微生物;为分离出纤维素分解菌,甲、乙、丙培养基应以纤维素为唯一碳源,还需要添加氮源等营养成分;由图可知,将菌液接种到乙培养基上所用的方法是平板划线法,该方法不能用于计数;瘤胃中缺少氧气,生活着多种厌氧微生物,在甲、乙、丙、丁的培养基表面加入一层无菌石蜡能隔绝空气,从而有效获得目标菌落。
思维导图
随堂检测反馈
1.(2025·沧州开学考)某些土壤细菌可将尿素[CO(NH2)2]分解为CO2和NH3,但分解产物CO2不能为该菌提供营养。下列关于配制用于分离这一菌种的选择培养基的成分,符合要求的是(　　)
[A]仅尿素 [B]尿素+葡萄糖
[C]仅葡萄糖 [D]牛肉膏蛋白胨
B
【解析】 从土壤中分离筛选能分解尿素的细菌时,其培养基中应以尿素为唯一氮源,而该菌不能利用CO2,故还应有葡萄糖(碳源)等营养成分。
2.(2023·广东卷)研究者拟从堆肥中取样并筛选能高效降解羽毛、蹄角等废弃物中角蛋白的嗜热菌。根据堆肥温度变化曲线(如图)和选择培养基筛选原理来判断,下列最可能筛选到目标菌的条件组合是(　　)
[A]a点时取样、尿素氮源培养基
[B]b点时取样、角蛋白氮源培养基
[C]b点时取样、蛋白胨氮源培养基
[D]c点时取样、角蛋白氮源培养基
D
【解析】 研究目的是筛选能高效降解羽毛、蹄角等废弃物中角蛋白的嗜热菌,因此目标菌既要耐高温,又要能够高效降解角蛋白,所以应在c点取样,并且用角蛋白氮源培养基进行选择培养。
3.(2025·贵州检测)图甲、图乙是微生物接种常用的两种方法,图丙是接种后培养的效果图解,下列相关叙述错误的是(　　)
A
[A]图甲、图乙中两种方法都可用于微生物的计数,且计数结果比实际结果偏小
[B]图甲、图乙中两种方法都需要将菌种接种在固体培养基上,并可能观察到单菌落
[C]图甲、图乙中培养使用后的培养基在丢弃前均需要进行灭菌处理,以免污染环境
[D]图丙所示结果只能由图乙中接种方法接种所得
【解析】 据图分析,图甲是平板划线法,图乙是稀释涂布平板法,图甲不能用于微生物的计数;这两种方法所用的接种工具分别是接种针和涂布器,都需要将菌种接种在固体培养基上,并可能观察到单菌落;图甲、图乙中培养使用后的培养基在丢弃前均需要进行灭菌处理,以免污染环境;图丙的菌落均匀分布,只能由图乙中接种方法接种所得。
4.下图为“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验中样品稀释示意图。据图分析下列叙述正确的是(　　)
[A]3号试管的菌落稀释倍数为103倍
[B]5号试管的结果表明每克土壤中目的菌数为 1.7×109个
[C]5号试管中稀释液进行平板培养得到的菌落平均数恰好为4号试管的10倍
[D]该方法和平板划线法分离到的都是尿素分解菌
B
【解析】 土样在锥形瓶中溶解时进行了10倍稀释,2号试管中的菌落稀释倍数为103倍,3号试管的菌落稀释倍数为104倍;5号试管进行稀释涂布平板法计数的结果表明每克土壤中目的菌数为(168+175+167)÷3÷0.1×106=
1.7×109(个);4号试管中菌液浓度更高,理论上平板培养得到的菌落平均数约是5号试管的10倍;该实验所用培养基是以尿素为唯一氮源的选择培养基,可分离得到尿素分解菌,但一些以尿素分解菌代谢物为营养的微生物也可在该培养基上生长。
5.(2025·永州检测)聚乙烯醇(PVA)是一种只含C、H、O的大分子有机物,在纺织行业的退浆废水、化工行业的生产废水中含量较高,且由于其生物降解困难的特性,使得废水处理难度较大。PVA能与碘作用产生蓝绿色复合物,PVA被微生物降解后无法形成复合物,在平板上出现以菌落为中心的透明圈。请回答下列问题。
(1)某实验小组尝试用稀释涂布平板法筛选得到PVA分解菌,需要在培养基中加入PVA作为　　 　　,再加入硝酸盐等其他营养物质,以及琼脂使培养基凝固。从培养基的作用来说,这种培养基属于　　　　培养基。
唯一碳源
选择
【解析】 (1)由于PVA分解菌能分解PVA获取碳元素,其他微生物不能利用PVA,所以在培养基中加入PVA作为唯一碳源,这样就可以筛选出PVA分解菌。这种培养基是根据微生物对营养物质的特殊需求,在培养基中加入特定的物质(PVA)来筛选特定的微生物(PVA分解菌),所以属于选择培养基。
(2)为了筛选出效果最好的PVA分解菌,在配制培养基时除了加入营养物质外,还需加入　　　制成蓝绿色平板,接种培养一段时间后,在平板上出现以菌落为中心的透明圈,如图甲所示,其中　　　菌落中的细菌分解PVA效果最好。
碘
【解析】 (2)由于PVA能与碘作用产生蓝绿色复合物,所以要在培养基中加入碘制成蓝绿色平板。图甲中菌落大小基本相同,但透明圈大小不同,透明圈越大,说明菌落周围的PVA被分解得越多,也就意味着该菌落中的细菌分解PVA的效果越好,故d菌落中的细菌分解PVA效果最好。
d
(3)用图乙所采用的方法进行计数时,实际活菌数　　　　(填“大于”“等于”或“小于”)统计结果,原因是　　　　　　　　　 　　　　　。
小于
【解析】 (3)图乙为显微镜直接计数,死菌、活菌均计算在内,实际活菌数小于统计结果。
显微镜计数时将死菌、活菌均计算在内
联系实际 迁移应用
手机现在已经成为人们离不开的通讯和娱乐工具,但手机表面分布较多的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等微生物,由于人体密切接触可能导致人患肠胃炎等疾病。有人认为手机细菌比马桶多。A、B两机构通过实验展示调查结果。回答下列相关问题。
(1)该实验需制备 (填“固体”或“液体”)培养基。据图,两机构均采用 法接种。
(2)两机构实验操作均正确,但结果截然不同,你认为原因是
。
固体
稀释涂布平板
可能是手机的
取样和马桶的取样(样本)都不相同
(3)取样面积如图所示,实验员测定某手机屏幕的细菌数量,将10 mL菌悬液进行梯度稀释,分别取 0.1 mL 稀释倍数为100的样品液接种到三个培养基上,培养一段时间后,统计菌落数分别为98、100、102,则该手机屏幕的细菌数为 个/cm2。该实验是否需要设置对照实验 若需要,请简要写出对照实验的设计方案;若不需要,请说明理由: ,
。
4×104
需要
取培养基涂布0.1 mL无菌水进行培养
(4)乙、丙两位工作人员用稀释涂布平板法分离细菌,在同一稀释倍数下得到以下结果:
乙涂布了3个平板,统计的菌落数分别是110、140和149,取平均值133。
丙涂布了3个平板,统计的菌落数分别是33、169和176,取平均值126。
这两位工作人员的结果中, 的结果可信度低,其原因是
。运用这种方法统计的结果往往比实际值偏小,理由是 。
实验结果中有1个
平板的计数与另2个相差悬殊
当两个或多个细胞连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落
丙第2课时　微生物的选择培养和计数
课时作业
(时间:30分钟　分值:55分)
第1～6题每题3分,第7～8题每题6分,共计30分。
基础对点练
知识点1　选择培养基及微生物的选择培养
1.研究人员利用无机盐、琼脂和石油配制培养基,欲培养出石油降解菌,以修复被石油污染的土壤。下列相关叙述中,错误的是(　　)
[A]这种培养基是一种选择培养基
[B]这种培养基的唯一碳源是石油
[C]能在该培养基上生长的微生物可能是石油降解菌
[D]石油降解菌在未被石油污染的土壤中含量较高
【答案】 D
【解析】 分离获得能降解石油的菌株的关键是用以石油作为唯一碳源的选择培养基进行培养;由于该培养基以石油作为唯一碳源,能在该培养基上生长的微生物可能是石油降解菌,此外有些以空气中二氧化碳为碳源的微生物也能在该培养基上生存;石油降解菌在被石油污染的土壤中含量较高。
2.筛选是分离和培养微生物常用的手段,下列有关培养基中不能筛选成功的是(　　)
[A]在全营养的LB培养基(普通培养基)中,筛选大肠杆菌
[B]在尿素固体培养基中,筛选能分解尿素的微生物
[C]用以纤维素为唯一碳源的培养基,筛选能分解纤维素的微生物
[D]在培养基中加入不同浓度的氯化钠,筛选抗盐突变的微生物
【答案】 A
【解析】 在全营养的LB培养基中,几乎所有细菌都能生长,不能筛选大肠杆菌;在以尿素为唯一氮源的固体培养基中,可以筛选能分解尿素的微生物;在以纤维素为唯一碳源的培养基中,可以筛选能分解纤维素的微生物;在培养基中加入不同浓度的氯化钠,只有抗盐突变的微生物才能生长,故可用于筛选抗盐突变的微生物。
3.微生物的接种方法最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法,下列关于两者区别的说法,正确的是(　　)
类别 平板划线法 稀释涂布平板法
① 需要接种环(灼烧灭菌) 需要涂布器(酒精消毒)
② 无须对菌液进行梯度稀释 对菌液进行系列梯度稀释
③ 能纯化微生物,不可计数 既能纯化微生物,又能计数
④ 最后的划线区域一定出现单菌落 稀释倍数足够大的菌液,涂布的平板才会出现单菌落
[A]②④ [B]③④ [C]①④ [D]②③
【答案】 D
【解析】 稀释涂布平板法用到的涂布器进行酒精浸泡消毒后要在涂布平板前进行灼烧灭菌;平板划线法不需要对菌液进行梯度稀释,稀释涂布平板法需要对菌液进行系列梯度稀释;平板划线法不能计算出菌液中的活菌数,稀释涂布平板法可计算菌液中的活菌数,二者都可纯化微生物;如果划线操作不规范,平板划线的最后划线区域不一定会出现单菌落。
知识点2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
4.(2025·肇庆月考)下列关于土壤中分解尿素的细菌的分离与计数实验的叙述,正确的是(　　)
[A]培养基应以尿素为唯一氮源,该细菌与硝化细菌所利用的碳源是相同的
[B]取样时应选择农田、菜地的表层土
[C]若在某一稀释度下测得的菌落数分别为18、234、276,则平均菌落数为176
[D]鉴定分解尿素的细菌,利用了尿素可被分解产生NH3,从而使pH升高的原理
【答案】 D
【解析】 分离分解尿素的细菌时应该用以尿素为唯一氮源的培养基,尿素分解菌为异养生物,而硝化细菌为自养生物,前者利用的是有机碳源,后者利用的是无机碳源,因此它们所利用的碳源是不同的;绝大多数细菌分布在距地表3～8 cm的土壤层,所以土壤取样时应铲去表层土;若同一稀释度下涂布,测得的菌落数分别为18、234、276,菌落差距太大,且有数值不在30～300范围内,直接用于求平均值会使结果不准确;鉴定分解尿素的细菌的原理是该种细菌能产生脲酶,脲酶能将尿素分解产生NH3,从而使pH升高,使酚红指示剂变红(酸碱指示剂变色)。
5.(2025·成都月考)某些土壤细菌可将尿素分解成CO2和NH3,NH3再转化为N等供植物吸收和利用。以下说法错误的是(　　)
[A]土壤中的细菌之所以能分解尿素,是因为它们能合成脲酶
[B]能分解尿素的细菌也能以尿素的分解产物CO2作为碳源
[C]为了筛选可分解尿素的细菌,在配制培养基时应选择尿素作为唯一氮源
[D]筛选分解尿素的细菌的培养基中KH2PO4的作用是提供无机盐、维持pH
【答案】 B
【解析】 能分解尿素的细菌属于异养型生物,不能以尿素的分解产物CO2作为碳源。
6.某兴趣小组尝试对土壤中分解尿素的细菌进行分离并计数,下列相关叙述正确的是(　　)
[A]制备选择培养基时,需加入尿素、琼脂、葡萄糖、硝酸盐等物质
[B]测定土壤中细菌的数量,一般选用107倍的稀释液进行平板培养
[C]若要判断选择培养基是否起到了选择作用,需要设置未接种的牛肉膏蛋白胨培养基做对照
[D]细菌一般在30～37 ℃的温度下培养1～2 d
【答案】 D
【解析】 分离土壤中分解尿素的细菌时,培养基中要加尿素(唯一的氮源),不能加硝酸盐;测定土壤中细菌的数量,一般选用104～106倍的稀释液进行平板培养,以保证平板上的菌落数适宜;若要判断选择培养基是否起到了选择作用,需设置接种了的没有选择作用的全营养培养基,如牛肉膏蛋白胨培养基做对照。
综合提升练
7.多环芳烃(PAHs)是一种不溶于水的有机物,在培养基中以微小的颗粒状存在,PAHs在土壤中的降解速率很慢,并具有致癌和致畸作用。科研人员欲从被PAHs污染的土壤中分离出高效降解PAHs的菌株,下列说法错误的是(　　)
[A]培养基甲为液体培养基,可扩大培养目的菌株
[B]培养基甲和培养基乙都以PAHs为唯一碳源,两者都是选择培养基
[C]③过程采用的接种方法可用于后期微生物的计数,计数结果往往偏大
[D]通过⑤获得的菌株,在培养基乙上形成的菌落周围存在透明圈
【答案】 C
【解析】 液体培养基可用于扩大培养,分析题图可知,培养基甲为液体培养基,可扩大培养目的菌株;实验目的是分离出高效降解PAHs的菌株,故培养基甲和培养基乙均应该是以PAHs为唯一碳源的选择培养基;③过程采用的接种方法为稀释涂布平板法,可用于后期微生物的计数,但由于两个或多个细胞连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落,会导致计数结果偏小;通过⑤获得的菌株能高效降解PAHs,而PAHs在培养基中以微小颗粒存在,故这些菌株在培养基乙上形成的菌落周围存在透明圈。
8.(2025·深圳检测)从马盲肠中分离出能够降解纤维素的厌氧细菌并对其进行鉴定,实验流程和结果如下图。下列叙述错误的是(　　)
注:刚果红可与纤维素形成红色复合物,当纤维素被分解后,复合物就无法形成,会出现透
明圈。
[A]①～③的培养基以纤维素为唯一碳源
[B]①～③应在无氧条件下倒置培养
[C]菌落甲分泌的纤维素分解酶的降解能力低于乙
[D]筛选出的菌株可研发为反刍动物的饲料添加剂
【答案】 C
【解析】 ①～③的培养基以纤维素为唯一碳源,能够对降解纤维素的细菌进行选择培养;氧气对厌氧细菌生长有抑制作用,因此①～③应在无氧条件下倒置培养;菌落甲的透明圈与菌落直径比值大于乙,因此菌落甲分泌的纤维素分解酶的降解能力高于乙;反刍动物食物中含有大量纤维素,且其消化道多为无氧环境,故从马盲肠中分离出能够降解纤维素的厌氧细菌,可研发为反刍动物的饲料添加剂。
9.(13分)(2025·烟台质检)尿素是一种高浓度氮肥,通过土壤中某些细菌分解为NH3,NH3再转化为N和N等被植物吸收利用。某同学要分离土壤中能分解尿素的细菌,并统计每克土壤样品中活菌数目,培养基配方如下:
KH2PO4 Na2HPO4 葡萄糖 尿素
1.4 g 2.1 g 10.0 g 1.0 g
MgSO4·7H2O 蛋白胨 琼脂
0.2 g 1.0 g 15.0 g
(1)根据培养基的成分分析,该同学能否分离出土壤中分解尿素的细菌 　　　　(填“能”或“不能”),原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(2)通常在实验室培养微生物时,需要对培养基、培养皿、接种环进行灭菌,灭菌方法依次是　　　　　　、　　　　　　、　　　　　　。培养细菌时,一般需要将培养基的pH调至　　　　　　。
(3)某同学取稀释倍数为106倍的菌液0.2 mL接种后,测得平板上菌落数为156、178和191,则每克样品中的菌落数为　　　　　　个。
(4)某同学在分离纯化土壤中分解尿素的细菌时,发现培养基上的菌落连成一片,最可能的原因是　　　　　　　 　　,为避免此种现象发生,正确的操作方法是
　　　　　 　　　　　。
(5)图1和图2是培养某细菌的结果图,其对应的接种方法分别是　　　　　　　　　和　　　　　　　　,这两种方法接种后培养基上都可以得到由单个细胞繁殖形成的　　　,其中,　　　(填“图1”或“图2”)所用的接种方法可用来对活菌进行计数。
【答案】 (每空1分)
(1)不能　尿素不是唯一氮源
(2)湿热灭菌法　干热灭菌法　灼烧灭菌法　中性或弱碱性
(3)8.75×108
(4)菌液浓度过高　对菌液进行多次梯度稀释
(5)稀释涂布平板法　平板划线法　菌落　图1
【解析】 (1)分离土壤中能分解尿素的细菌,培养基应以尿素为唯一氮源,该培养基中有蛋白胨,蛋白胨含氮元素,其他杂菌可利用蛋白胨中的氮源生长,所以不能筛选出只分解尿素的细菌。
(2)培养基常用湿热灭菌法灭菌,培养皿常用干热灭菌法灭菌,接种环常用灼烧灭菌法灭菌;不同微生物生长需要的pH存在差异,培养细菌时一般将培养基pH调至中性或弱碱性。
(3)分析题意,平板上菌落数的平均值为(156+178+191)÷3=175(个),根据公式每克样品中的菌落数=平板上菌落数的平均值÷涂布的菌液体积×稀释倍数,可得每克样品中的菌落数为175÷0.2×106=8.75×108(个)。
(4)培养基上菌落连成一片最可能的原因是菌液浓度过高,细菌过于密集;正确操作是对菌液进行多次梯度稀释,降低菌液浓度后再涂布。
(5)图2是平板划线法,通过连续划线将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面;图1是稀释涂布平板法,将菌液进行一系列梯度稀释后涂布到培养基表面;两种方法都能得到单个细胞繁殖形成的菌落,稀释涂布平板法可用于活菌计数。
10.(12分)(2025·赣州检测)一次性口罩主要成分是由C、H两种元素组成的聚丙烯纤维。研究人员欲从合适的土壤样品中筛选出能高效降解一次性口罩的细菌,设计了如图1所示的流程。请回答下列问题。
(1)图1中“甲”指的是　　　　　,目的是提高聚丙烯纤维降解菌的比例和密度,此过程使用的培养基中应以　　　　　　(填化合物名称)为唯一碳源,为增大菌体与培养基的接触面积,从物理性质看,该培养基应是　 。
(2)将分离纯化得到的不同菌种分别接种到鉴别培养基上,鉴别培养基中加入了能与聚丙烯纤维结合的显色剂。设不同菌种的菌落面积为s,菌落周围透明圈的面积为S,选择S/s的比值　　　的菌落,就是能高效降解一次性口罩的目的菌群。
(3)欲估算某土壤样品中有多少能高效降解一次性口罩的目的菌,接种平板时应用
　　　　　　　　法。根据图2操作能计算出1 g该土壤中约有　　 　　　个高效降解一次性口罩的目的菌。
【答案】 (每空2分)
(1)选择培养(或扩大培养)　聚丙烯纤维　液体培养基
(2)大
(3)稀释涂布平板　6.8×107
【解析】 (1)从用途看,为了提高聚丙烯纤维降解菌的比例和密度,图1中“甲”指的是选择培养(或扩大培养);本实验的目的是筛选出能高效降解一次性口罩的细菌,一次性口罩主要成分是由C、H两种元素组成的聚丙烯纤维,故在选择培养时培养基中应以聚丙烯纤维为唯一碳源;液体培养基有利于增大菌体与培养基的接触面积,从而实现目的菌的扩大
培养。
(2)由题意可知,当聚丙烯纤维被降解时无法与显色剂结合,形成透明圈,同等大小菌落形成的透明圈越大,说明该菌落降解聚丙烯纤维能力越强,设不同菌种的菌落面积为s,菌落周围透明圈的面积为S,选择S/s的比值大的菌落,就是能高效降解一次性口罩的目的菌群。
(3)微生物的接种方法有平板划线法和稀释涂布平板法,其中能够用于计数的是稀释涂布平板法;计数时应选择菌落数为30～300的平板进行统计,据图可知,符合要求的菌落数有62、68、74,且共稀释了105倍,算出1 g该土壤中目的菌约有(62+68+74)÷3÷0.1×105=
6.8×107(个)。第2节　微生物的培养技术及应用
第1课时　微生物的基本培养技术
课时作业
(时间:30分钟　分值:54分)
第1～6题每题3分,第7～8题每题6分,共计30分。
基础对点练
知识点1　培养基的配制
1.下列关于微生物生长条件的叙述,错误的是(　　)
[A]培养乳酸杆菌时,需要在培养基中添加维生素
[B]培养霉菌时,一般需要将培养基调至酸性
[C]培养细菌时,一般需要将培养基调至中性或弱碱性
[D]培养乳酸菌时需要不断通入空气或氧气
【答案】 D
【解析】 乳酸菌为厌氧菌,培养乳酸菌时需要提供无氧环境,不需要通入空气或氧气。
2.(2025·长沙检测)下表是某培养基的配方。以下说法正确的是(　　)
编号 ① ② ③ ④ ⑤
成分 (NH4)2SO4 KH2PO4 FeSO4 CaCl2 H2O
含量 0.4 g 4.0 g 0.5 g 0.5 g 100 mL
[A]往往使用干热灭菌法对培养基进行灭菌
[B]此培养基可用来培养自养型微生物
[C]制备该培养基过程中,应灭菌后再倒平板
[D]培养基中添加KH2PO4的作用只是维持培养基的pH稳定
【答案】 B
【解析】 培养基的灭菌方法是湿热灭菌(或高压蒸汽灭菌);该培养基中缺乏碳源,可以用于培养自养型微生物;根据培养基的成分判断该培养基是液体培养基,制备过程不需要倒平板;KH2PO4不仅可以维持培养基的pH,还有利于维持培养基的渗透压的稳定、为微生物提供钾、磷元素。
知识点2　无菌技术和微生物的纯培养
3.(2025·绵阳月考)下列有关实验的操作中,错误的是(　　)
①煮沸消毒可以杀死微生物的营养细胞和部分芽孢
②接种操作要在酒精灯火焰附近进行
③对于不耐高温的液体,如牛奶,用巴氏消毒法消毒
④家庭制作葡萄酒时要将容器和葡萄都进行灭菌
⑤培养基可采用湿热灭菌法灭菌
⑥加入培养基中的指示剂和染料不需要灭菌
⑦接种环可采用火焰灼烧的方式灭菌
[A]①③ [B]②④ [C]⑤⑦ [D]④⑥
【答案】 D
【解析】 家庭制作葡萄酒利用的是附着在葡萄皮表面的野生型酵母菌,所以制作葡萄酒时不对葡萄进行灭菌,以免杀死酵母菌,④错误;指示剂和染料中可能混有微生物,故加入培养基前需灭菌,⑥错误。
4.采用平板划线法能将单个微生物分散在固体培养基上,下列有关平板划线操作的叙述,错误的是(　　)
[A]第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物
[B]再次划线前,灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种
[C]在第二区域内划线时,接种环上的菌种直接来源于菌液
[D]划线结束后,灼烧接种环,能及时杀死接种环上的菌种,避免微生物污染环境和感染操作者
【答案】 C
【解析】 从第二次划线开始,每次划线时接种环上的菌种直接来源于上次划线区域的
末端。
5.(2025·周口开学考)如图表示实验室中酵母菌纯培养的部分操作步骤,下列说法错误的是(　　)
[A]①②③步骤操作时需要在酒精灯火焰旁进行
[B]步骤①中待倒入的培养基冷却后盖上培养皿的皿盖
[C]步骤③中,每次划线前后都需对接种环进行灭菌处理
[D]划线接种结束后,将图④平板倒置后放入培养箱中培养
【答案】 B
【解析】 ①②③步骤操作时需要在酒精灯火焰旁进行,防止被杂菌污染;倒完培养基后立即盖上培养皿的皿盖,冷却后将平板倒过来放置;每次划线前后都需对接种环进行灭菌处理;划线接种结束后,将平板倒置后放入培养箱中培养,可防止皿盖上的水珠落入培养基造成污染。
6.在分离纯化大肠杆菌实验中,划线接种(甲)、培养结果(乙)如图所示。下列有关叙述错误的是(　　)
[A]甲中a区域为划线的起始位置
[B]接种前应对培养基进行湿热灭菌
[C]接种过程中至少需要对接种环灼烧5次
[D]连续划线的目的是获得单个细菌,以便形成单菌落
【答案】 A
【解析】 乙图呈现的培养结果是从d区域到a区域菌落逐渐减少,而形成单菌落的区域是划线的末端,所以a区域应为最后一次划线的位置;在培养微生物时为避免杂菌污染,培养基可采用湿热灭菌;划线前后都要对接种环灼烧,共划线4次,所以需要灼烧5次;平板划线法是分离单菌落的常用方法,划线将细菌分散,便于获得由单个细菌形成的单菌落。
综合提升练
7.枯草芽孢杆菌是一种需氧菌,可利用蛋白质和糖类,分解色氨酸形成吲哚,在遗传学研究中也有广泛应用。下列关于枯草芽孢杆菌纯培养过程的说法正确的是(　　)
[A]微生物的纯培养物就是不含有代谢废物的微生物培养物
[B]分离纯化过程中,使用液体培养基并振荡处理,更利于枯草芽孢杆菌的增殖
[C]该菌的培养基通常要先调至中性或弱碱性,再进行灭菌杀死内外所有的微生物
[D]在灭菌时,培养皿可采用灼烧灭菌法灭菌
【答案】 C
【解析】 由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物;分离纯化枯草芽孢杆菌应该使用固体培养基,液体培养基适用于枯草芽孢杆菌的扩大培养;枯草芽孢杆菌是细菌,培养细菌时通常需将培养基的pH调至中性或弱碱性,然后进行灭菌处理;在灭菌时,培养皿可采用干热灭菌法灭菌,但不能采用灼烧灭菌法灭菌。
8.生长图形法是一种测定微生物营养需求的简便方法。为探究某嗜热菌所需特殊营养物质的种类,某研究小组把该菌的悬浮液与不含任何特殊营养物质但含有其他必需营养物质的培养基混合后倒平板,然后在平板上划分数区,将甲、乙、丙三种特殊营养物质分别添加到不同区域,培养结果如图所示。下列说法不正确的是(　　)
[A]倒平板后直接培养可判断有无污染
[B]将所有平板放置在28 ℃下倒置培养并观察
[C]图示结果表明该菌需要特殊营养物质乙和丙
[D]生长图形法还可用于某些菌种的筛选
【答案】 B
【解析】 倒平板后不接种直接进行培养观察有无菌落的出现,可以判断培养基有无污染;该菌为嗜热菌,应放置在其适宜的高温条件下培养,而不是28 ℃;图中嗜热菌在添加了乙、丙特殊营养物质的区域生长,故该菌需要的特殊营养物质是乙和丙;不同的菌种所需的特殊营养物质不同,利用生长图形法可用于某些能利用特定营养物质的菌种的筛选。
9.(12分)扩展青霉是腐烂苹果中常见的微生物之一,其次生代谢物棒曲霉素(Pat)是一种具有致突变作用的毒素。为研究腐烂苹果中Pat的分布,研究人员进行了如图所示的实验,其中“病健交界处”为腐烂部位与未腐烂部位的交界处,取样分离的5个部位分别为①号、②号、③号、④号、⑤号。请回答下列问题。
(1)苹果腐烂部位的微生物除扩展青霉外,还有枯草杆菌。两种微生物在结构上的主要区别是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(2)活化扩展青霉菌种使用的培养基成分如下表,根据物理性质划分该培养基属于　　　　培养基,其中能为扩展青霉的生长繁殖提供能源的是　　　 　;NaNO3的作用是
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　(答2点)。
蔗糖 NaNO3 MgSO4 KCl FeSO4 KH2PO4 蒸馏水
30 g 2 g 0.5 g 0.5 g 0.01 g 1 g 1 000 mL
(3)用平板划线法分离扩展青霉时,划线的某个平板培养后第一划线区域的划线上都不间断地长满了菌落,其他区域的划线上却均无菌落。操作失误的原因可能是　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(4)接种扩展青霉前,应对苹果进行　　　　(填“消毒”或“灭菌”)处理。研究人员测定了病斑直径为 1 cm、2 cm、3 cm的苹果中①～⑤号部位的Pat含量,请推测最可能的结果:
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　;　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
【答案】 (除标注外,每空2分)
(1)扩展青霉有以核膜为界限的细胞核,枯草杆菌无此结构(1分)
(2)液体(1分)　蔗糖(1分)　为扩展青霉的生长提供氮源和无机盐、维持培养液的渗透压
(3)第一区域划线结束,接种环灼烧后未冷却或划线未从第一区域末端开始
(4)消毒(1分)　相同病斑情况下,离病斑越远的部位,Pat含量越低　相同部位病斑越大,Pat含量越高
【解析】 (2)活化扩展青霉菌种使用的培养基成分中没有凝固剂,故根据物理性质划分该培养基属于液体培养基。(3)从第二次划线开始,每次从上一次划线的末端开始划线,能使扩展青霉的数目随着划线次数的增加而逐步减少,最终能得到由单个细胞繁殖而来的菌落。若划线的某个平板培养后第一划线区域的划线上都不间断地长满了菌落,其他区域的划线上却均无菌落,可能是因为第一区域划线结束,接种环灼烧后未冷却或划线未从第一区域末端开始。(4)接种扩展青霉前,为了避免苹果上其他杂菌的污染,应对苹果进行消毒处理。由题图可知,①号为腐烂部位,②③④⑤依次距离腐烂部位越来越远,推测相同病斑情况下,①号部位的Pat含量最高,离腐烂部位越远的果肉中Pat含量越低;相同部位病斑越大,Pat含量越高。
10.(12分)(经典高考)化合物S被广泛应用于医药、食品和化工工业。用菌株C可生产S,S的产量与菌株C培养所利用的碳源关系密切。为此,某小组通过实验比较不同碳源对菌体生长和S产量的影响,结果见下表。回答下列问题。
碳源 细胞干重/(g/L) S产量/(g/L)
葡萄糖 3.12 0.15
淀粉 0.01 0.00
制糖废液 2.30 0.18
(1)通常在实验室培养微生物时,需要对所用的玻璃器皿进行灭菌,灭菌的方法有

(答出2点即可)。
(2)由实验结果可知,菌株C生长的最适碳源是　　　　　　　　　　　　　　;用菌株C生产S的最适碳源是　　　　　　　　　　　　　　　　　。菌株C的生长除需要碳源外,还需要　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　(答出2点即可)等营养物质。
(3)由实验结果可知,碳源为淀粉时菌株C不能生长,其原因是　　　　　　　　　　　。
(4)若以制糖废液作为碳源,为进一步确定生产S的最适碳源浓度,某同学进行了相关实验。请简要写出实验思路:　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　。
(5)利用制糖废液生产S可以实现废物利用,其意义是　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　。
【答案】 (除标注外,每空2分)
(1)干热灭菌、湿热灭菌(或高压蒸汽灭菌)
(2)葡萄糖(1分)　制糖废液(1分)　氮源、无机盐
(3)缺少淀粉酶　
(4)设计一系列不同浓度的制糖废液分别培养菌株C,测定不同浓度制糖废液中S产量,寻找S产量最大的碳源浓度,确定最适碳源浓度　
(5)减少污染、节省原料、降低生产成本
【解析】 (1)获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染,对所需的玻璃器皿进行灭菌,灭菌的方法有干热灭菌、湿热灭菌(或高压蒸汽灭菌)。(2)分析题干实验结果,以葡萄糖为碳源时,细胞干重最大,故菌株C生长的最适碳源是葡萄糖;以制糖废液为碳源时,S产量最高,故用菌株C生产S的最适碳源是制糖废液。微生物的生长需要水、无机盐、碳源、氮源以及特殊的营养物质,故菌株C的生长除需要碳源外,还需要氮源、无机盐等营养物质。(3)由实验结果可知,菌株C可以利用葡萄糖,但在以淀粉为碳源时,菌株C不能生长,说明菌株C无法利用淀粉,原因是菌株C不能合成淀粉酶,导致其无法利用淀粉。(4)以制糖废液作为碳源,进一步确定生产S的最适碳源浓度,可以以碳源浓度作为自变量,不同碳源浓度下S产量作为因变量,实验思路为设计一系列不同浓度的制糖废液分别培养菌株C,测定不同浓度制糖废液中S产量,寻找S产量最大的碳源浓度,从而确定最适碳源浓度。第2课时　微生物的选择培养和计数
[学习目标]　1.基于实例分析,说明选择培养基的概念,学会设计培养基来分离分解尿素的细菌。2.通过学习稀释涂布平板法,分析并总结分离微生物的过程。3.基于稀释涂布平板法和显微镜计数法,运用归纳与概括的科学方法,概述测定微生物数量的常用方法。4.基于微生物的选择培养和数量测定原理,对土壤中分解尿素的细菌分离并计数,对实验结果进行分析与评价。
一、选择培养基
1.自然界中目的菌株的筛选
(1)依据:根据目的菌株对生存环境的要求,到相应环境中去寻找。
(2)实例:PCR技术中用到的耐高温的DNA聚合酶就是从热泉中筛选出的水生栖热菌中分离的。
2.实验室中目的菌株的筛选
(1)原理:人为提供有利于目的菌生长的条件(包括营养、温度和pH等),同时抑制或阻止其他微生物的生长。
(2)选择培养基:允许特定种类的微生物生长,同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培
养基。
提醒　有些微生物可以利用其他微生物的代谢物生长繁殖,因此,能够在选择培养基上生长的不一定都是目的菌株。
二、微生物的选择培养
1.方法:稀释涂布平板法。
2.实验操作流程
三、微生物的数量测定
1.稀释涂布平板法
计数 原理 当样品的稀释度足够高时,培养基表面生长的一个单菌落,来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数,就能推测出样品中大约含有多少活菌
计数 方法 通常选用一定稀释范围的样品液进行培养,以保证获得菌落数为30～300、适于计数的平板。在同一稀释度下,应至少对3个平板进行重复计数,然后求出平均值
计数 结果 统计的菌落数往往比活菌的实际数目少。原因是当两个或多个细胞连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落
2.显微镜直接计数法
四、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
1.分离原理:土壤中的细菌之所以能分解尿素,是因为它们能合成脲酶。利用尿素作为唯一氮源的选择培养基,可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。
2.操作步骤
判断正误
(1)以尿素为唯一氮源的培养基是选择培养基。(　　)
【答案】 √
(2)脲酶能催化尿素分解产生N2,N2可作为细菌生长的氮源。(　　)
【答案】 ×
【提示】 脲酶将尿素分解成NH3。
(3)在用涂布器涂布平板时,为了操作方便可完全打开培养皿的皿盖。(　　)
【答案】 ×
【提示】 为了防止杂菌污染,不能完全打开皿盖。
(4)利用显微镜直接计数法统计的细菌数量就是活菌的数量。(　　)
【答案】 ×
【提示】 利用显微镜直接计数法一般无法区分死菌和活菌。
(5)利用稀释涂布平板法统计菌落数目时,统计的菌落数就是活菌的实际数。(　　)
【答案】 ×
【提示】 当两个或多个细胞连在一起时,只能观察并统计为一个菌落,因此利用稀释涂布平板法统计的菌落数往往比活菌的实际数目少。
任务一　分析稀释涂布平板法的原理和操作
　　菌落总数可作为判定食品被污染程度的标志,也可以用于观察细菌在食品中繁殖的动态,以便对送检样品进行卫生学评估提供证据。下图是某样品培养简化流程图,请分析并回答下列问题。
(1)对样品悬液进行10倍梯度稀释的方法是取1 mL样品上清液加入盛有9 mL无菌水的试管中,依次等比稀释。
(2)涂布器一般是在酒精中浸泡,然后放在酒精灯火焰上灼烧灭菌,该操作的目的是杀死涂布器上的杂菌,防止杂菌污染。
(3)下图是涂布平板操作的示意图,用字母和箭头表示涂布平板操作的正确步骤是
a→b→c→d。
(4)图A和图B中,哪一个表示的是用稀释涂布平板法接种培养后得到的结果 稀释涂布平板法相比于平板划线法的优点是什么
【提示】 图B表示稀释涂布平板法接种培养后得到的结果。两种方法均可用于微生物的纯化,获取纯培养物,但稀释涂布平板法还可以用于微生物的计数。
核心归纳
1.平板划线法和稀释涂布平板法的比较
项目 平板划线法 稀释涂布平板法
图示
关键 操作 用接种环在固体培养基表面连续划线 ①一系列的梯度稀释; ②涂布平板
优点 操作简单,可以观察菌落特征,对混合菌进行分离 可以计数,可以观察菌落特征
缺点 不能计数 操作复杂,需将菌液进行一系列的梯度稀释,需涂布多个平板
相同点 都使用固体培养基,若没有特殊要求,两种方法都可以用来分离微生物
2.单菌落的获得
(1)利用平板划线法接种时,单菌落从最后划线的区域挑取。
(2)利用稀释涂布平板法接种时,只有合适的稀释度才能得到单菌落。
典型例题
1.(2025·广州检测)下列关于稀释涂布平板法相关操作的叙述,错误的是(　　)
[A]可将涂布器末端浸在盛有体积分数为70%酒精的烧杯中
[B]涂布前取0.1 mL的菌液滴加到培养基表面
[C]将蘸有少量酒精的涂布器在火焰上灼烧,待酒精燃尽即可进行涂布
[D]用涂布器将菌液涂布在培养基表面时可转动培养皿使涂布均匀
【答案】 C
【解析】 进行涂布平板操作前,要对涂布器进行灭菌,一般的做法是先将涂布器浸在盛有体积分数为70%酒精的烧杯中,然后将蘸有少量酒精的涂布器在火焰上灼烧,待酒精燃尽并冷却后再进行涂布,以免温度过高杀死菌种。
2.下图是纯化微生物时采用的两种接种方法接种后培养的效果图,下列相关叙述正确的是(　　)
[A]图甲三个平板中所用培养液的稀释倍数相同
[B]图甲、图乙均适合分离微生物,但图乙不适合对微生物进行计数
[C]图甲、图乙所用的接种工具分别是接种环和涂布器
[D]图乙每次划线应从同一起点开始以便使聚集的菌种逐步稀释后培养获得单菌落
【答案】 B
【解析】 根据图甲中三个平板的菌落密度可知,三个平板中所用培养液的稀释倍数不同;图甲、图乙均可用于分离微生物,图乙是平板划线法接种后培养的效果图,不适合对微生物进行计数;稀释涂布平板法接种使用涂布器,平板划线法接种使用接种环;图乙从第二次划线开始,每次划线应从上一次划线的末端开始,以便使聚集的菌种逐步稀释后培养获得单菌落。
任务二　对比分析微生物数量测定的两种方法
　　下面是土壤中分解尿素的细菌的分离与计数的实验流程示意图。分析并回答有关
问题。
(1)甲、乙两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。在对应稀释倍数为106的培养基中,得到以下两种统计结果:
①甲同学在该浓度下涂布了一个平板,统计的菌落数为230,该同学的统计结果是否真实可靠 为什么
【提示】 不真实。为增加实验的说服力与准确性,应设置重复实验,在同一稀释度下至少涂布3个平板,统计结果后计算平均值。
②乙同学在该浓度下涂布了3个平板,统计的菌落数分别为21、212、256,该同学将21舍去,然后取平均值。该同学对实验结果的处理是否合理 为什么
【提示】 不合理。微生物计数时,如果实验中出现重复实验的结果差别很大的情况,应分析实验过程中可能的影响因素,找出差异的原因,而不能简单地将结果舍弃后进行计数。
(2)某同学在三种稀释度下吸取0.1 mL的菌液涂布平板,统计菌落数,得到了以下的数据,试计算1 g 样品的活菌数。
项目 平板1 平板2 平板3
104 320 360 356
105 212 234 287
106 21 23 18
【提示】 105的稀释度下取0.1 mL菌液涂布的三个平板上的菌落数都为30～300,计算其平均值为(212+234+287)/3≈244。1 g样品中活菌数约为244÷0.1×105=2.44×108。
(3)实验中能以菌落数表示活菌数的原因是当样品稀释倍数足够高时,培养基上的一个单菌落来源于一个活菌。该实验所用计数方法的统计结果比实际值小(填“大”或“小”)。若用显微镜进行直接计数,统计结果比实际值大(填“大”或“小”)。
核心归纳
稀释涂布平板法和显微镜直接计数法的比较
方法 稀释涂布平板法 显微镜直接计数法
原理 当样品的稀释度足够高时,培养基表面生长的一个菌落,来源于样品稀释液中的一个活菌,通过统计平板上的菌落数,就能推测出样品中大约含有多少活菌 利用特定的细菌计数板或血细胞计数板,在显微镜下观察、计数,然后再计算一定体积的样品中微生物的数量
公式 每克样品中的菌落数=×M[C:某稀释度下平板上生长的平均菌落数;V:涂布平板时所用的稀释液的体积(mL);M:稀释倍数] 每毫升原菌液所含细菌数:每小格内平均菌数×400×104×稀释倍数
缺点 当两个或多个细胞连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落 不能区分细胞死活
结果 比实际值偏小 比实际值偏大
典型例题
3.下列有关稀释涂布平板法和显微镜直接计数法的叙述,错误的是(　　)
[A]利用血细胞计数板计数属于显微镜直接计数法,其缺点是不能区分死菌与活菌
[B]两种计数方法,其统计值与实际值相比,均有差异,但差异原因不同
[C]两种计数方法均能在计数的同时观察到所研究微生物的形态特征
[D]当菌落数目稳定时,一般选取菌落数在30～300的平板进行计数
【答案】 C
【解析】 用稀释涂布平板法计数时,当两个或多个细胞连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落,故而统计值比实际值小,用显微镜直接计数法计数时不能区分死菌和活菌,故统计的微生物数量往往大于实际的活菌数,因此两种计数方法的统计值与实际值相比,均有差异,但差异原因不同;稀释涂布平板法观察到的是菌落的形态特征,而不是微生物的形态特征,显微镜直接计数法观察到的是微生物的形态特征。
任务三　选择培养基与土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
　　尿素是一种重要的农业氮肥,尿素不能直接被农作物吸收,土壤中的某些细菌将尿素分解成NH3,NH3再转化为N、N等被植物吸收。以下是分离土壤中分解尿素的细菌的培养基配方,分析并回答有关问题。
组分 含量
KH2PO4 1.4 g
Na2HPO4 2.1 g
MgSO4·7H2O 0.2 g
葡萄糖 10.0 g
尿素 1.0 g
琼脂 15.0 g
H2O 定容至1 000 mL
(1)该培养基对微生物有(填“有”或“没有”)选择作用,判断依据是该培养基的配方中,尿素是唯一氮源,能够利用尿素的微生物能正常生长,不能利用尿素的微生物一般不生长。
(2)为什么分解尿素的微生物能在该培养基上生长
【提示】 分解尿素的微生物能合成脲酶,而脲酶可催化尿素分解产生NH3,NH3可作为微生物生长的氮源。
(3)利用上述培养基分离出的微生物都是能分解尿素的微生物吗 请说明理由。
【提示】 不一定;因为有些微生物可以利用能分解尿素的细菌的代谢物进行生长繁殖。
(4)尿素分解成NH3会使培养基的碱性增强,pH升高,因此可以通过检测培养基pH的变化来判断是否发生了该化学反应,进而判断该菌是否为尿素分解菌。依据以上原理,如何对分离得到的微生物是否是分解尿素的细菌作进一步鉴定
【提示】 在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂,接种并培养初步筛选的菌种,若菌落周围出现红色环带,则可说明该菌种能够分解尿素。
核心归纳
1.选择培养基与鉴别培养基的比较
项目 选择培养基 鉴别培养基
特殊 成分 加入不影响甚至促进目标微生物生长,而抑制或阻止其他微生物生长的化学物质 加入某种指示剂或化学药品(不影响微生物正常生长)
目的 抑制其他微生物的生长,促进目标微生物的生长 微生物的某种代谢物与培养基中的特定指示剂或化学药品发生反应
用途 培养、分离出目标微生物 鉴别目标微生物
举例 利用以尿素为唯一氮源的培养基可分离得到分解尿素的细菌 可用伊红—亚甲蓝琼脂培养基鉴定饮用水或乳制品中是否含有大肠杆菌(若有,则菌落呈深紫色,并带有金属光泽)
2.微生物筛选过程中必要的两种对照培养基及其作用
微生物筛选过程中,除选择培养基外,另外还需设置两组对照培养基,以提高实验的说服力和科学性。
对照组 作用 现象 结论
未接种的选择培养基 有无杂菌污染的判断 未接种的选择培养基中无菌落生长 未被杂 菌污染
接种的全营养培养基 选择培养基有无筛选作用的判断 全营养培养基上的菌落数大于选择培养基上的菌落数 选择培 养基具 有筛选 作用
典型例题
4.(2025·济宁期中)下图为“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验操作流程,下列说法正确的是(　　)
[A]实验中选择培养基含有无机盐、葡萄糖、尿素、蛋白胨、琼脂、水等物质
[B]培养基用高压蒸汽灭菌后,将pH调至中性或弱碱性
[C]平均每克土壤中分解尿素的细菌约为2.2×108个
[D]为判断培养基的选择作用,需设置未接种的培养基做对照
【答案】 C
【解析】 培养基的营养成分应该包括碳源、氮源、水和无机盐等,实验目的是分离尿素分解菌,应该以尿素为唯一氮源,不应该含有其他氮源(如蛋白胨);将培养基的pH调至中性或弱碱性后,再高压蒸汽灭菌;将10 g土壤先稀释10倍,再进行梯度稀释10 000倍,然后取0.1 mL进行涂布平板,步骤④平板上统计的菌落数平均为(212+230+218)÷3=220(个),则每克土壤中尿素分解菌约为220÷0.1×100 000=2.2×108(个);为判断培养基的选择作用,需设置接种的全营养培养基做对照,若选择培养基上菌落数明显小于全营养培养基上的菌落数,说明选择培养基起到了选择作用。
5.(2025·成都期中)瘤胃是牛、羊等反刍动物具有的特殊的器官,其中的微生物多为厌氧菌,接触空气后会死亡。已知刚果红可以与纤维素形成红色复合物,但不与纤维素降解产物发生这种反应。研究人员对瘤胃中的纤维素分解菌进行了分离、鉴定,过程如下图所示。下列有关说法正确的是(　　)
[A]实验时,牛体内提取的瘤胃液不能使用干热灭菌,应使用湿热灭菌
[B]为分离出纤维素分解菌,甲、乙、丙培养基应以纤维素为唯一营养成分
[C]通过向乙和丁培养基中加入刚果红,可对纤维素分解菌进行鉴定和计数
[D]在甲、乙、丙、丁的培养基表面加入一层无菌石蜡能有效获得目标菌落
【答案】 D
【解析】 从牛体内提取的瘤胃液不能灭菌,否则不能分离出目标微生物;为分离出纤维素分解菌,甲、乙、丙培养基应以纤维素为唯一碳源,还需要添加氮源等营养成分;由图可知,将菌液接种到乙培养基上所用的方法是平板划线法,该方法不能用于计数;瘤胃中缺少氧气,生活着多种厌氧微生物,在甲、乙、丙、丁的培养基表面加入一层无菌石蜡能隔绝空气,从而有效获得目标菌落。
随堂检测反馈
1.(2025·沧州开学考)某些土壤细菌可将尿素[CO(NH2)2]分解为CO2和NH3,但分解产物CO2不能为该菌提供营养。下列关于配制用于分离这一菌种的选择培养基的成分,符合要求的是(　　)
[A]仅尿素 [B]尿素+葡萄糖
[C]仅葡萄糖 [D]牛肉膏蛋白胨
【答案】 B
【解析】 从土壤中分离筛选能分解尿素的细菌时,其培养基中应以尿素为唯一氮源,而该菌不能利用CO2,故还应有葡萄糖(碳源)等营养成分。
2.(2023·广东卷)研究者拟从堆肥中取样并筛选能高效降解羽毛、蹄角等废弃物中角蛋白的嗜热菌。根据堆肥温度变化曲线(如图)和选择培养基筛选原理来判断,下列最可能筛选到目标菌的条件组合是(　　)
[A]a点时取样、尿素氮源培养基
[B]b点时取样、角蛋白氮源培养基
[C]b点时取样、蛋白胨氮源培养基
[D]c点时取样、角蛋白氮源培养基
【答案】 D
【解析】 研究目的是筛选能高效降解羽毛、蹄角等废弃物中角蛋白的嗜热菌,因此目标菌既要耐高温,又要能够高效降解角蛋白,所以应在c点取样,并且用角蛋白氮源培养基进行选择培养。
3.(2025·贵州检测)图甲、图乙是微生物接种常用的两种方法,图丙是接种后培养的效果图解,下列相关叙述错误的是(　　)
[A]图甲、图乙中两种方法都可用于微生物的计数,且计数结果比实际结果偏小
[B]图甲、图乙中两种方法都需要将菌种接种在固体培养基上,并可能观察到单菌落
[C]图甲、图乙中培养使用后的培养基在丢弃前均需要进行灭菌处理,以免污染环境
[D]图丙所示结果只能由图乙中接种方法接种所得
【答案】 A
【解析】 据图分析,图甲是平板划线法,图乙是稀释涂布平板法,图甲不能用于微生物的计数;这两种方法所用的接种工具分别是接种针和涂布器,都需要将菌种接种在固体培养基上,并可能观察到单菌落;图甲、图乙中培养使用后的培养基在丢弃前均需要进行灭菌处理,以免污染环境;图丙的菌落均匀分布,只能由图乙中接种方法接种所得。
4.下图为“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验中样品稀释示意图。据图分析下列叙述正确的是(　　)
[A]3号试管的菌落稀释倍数为103倍
[B]5号试管的结果表明每克土壤中目的菌数为 1.7×109个
[C]5号试管中稀释液进行平板培养得到的菌落平均数恰好为4号试管的10倍
[D]该方法和平板划线法分离到的都是尿素分解菌
【答案】 B
【解析】 土样在锥形瓶中溶解时进行了10倍稀释,2号试管中的菌落稀释倍数为103倍,
3号试管的菌落稀释倍数为104倍;5号试管进行稀释涂布平板法计数的结果表明每克土壤中目的菌数为(168+175+167)÷3÷0.1×106=1.7×109(个);4号试管中菌液浓度更高,理论上平板培养得到的菌落平均数约是5号试管的10倍;该实验所用培养基是以尿素为唯一氮源的选择培养基,可分离得到尿素分解菌,但一些以尿素分解菌代谢物为营养的微生物也可在该培养基上生长。
5.(2025·永州检测)聚乙烯醇(PVA)是一种只含C、H、O的大分子有机物,在纺织行业的退浆废水、化工行业的生产废水中含量较高,且由于其生物降解困难的特性,使得废水处理难度较大。PVA能与碘作用产生蓝绿色复合物,PVA被微生物降解后无法形成复合物,在平板上出现以菌落为中心的透明圈。请回答下列问题。
(1)某实验小组尝试用稀释涂布平板法筛选得到PVA分解菌,需要在培养基中加入PVA作为　　　　,再加入硝酸盐等其他营养物质,以及琼脂使培养基凝固。从培养基的作用来说,这种培养基属于　　　　培养基。
(2)为了筛选出效果最好的PVA分解菌,在配制培养基时除了加入营养物质外,还需加入
　　　制成蓝绿色平板,接种培养一段时间后,在平板上出现以菌落为中心的透明圈,如图甲所示,其中　　　菌落中的细菌分解PVA效果最好。
(3)用图乙所采用的方法进行计数时,实际活菌数　　　　(填“大于”“等于”或“小于”)统计结果,原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
【答案】 (1)唯一碳源　选择
(2)碘　d
(3)小于　显微镜计数时将死菌、活菌均计算在内
【解析】 (1)由于PVA分解菌能分解PVA获取碳元素,其他微生物不能利用PVA,所以在培养基中加入PVA作为唯一碳源,这样就可以筛选出PVA分解菌。这种培养基是根据微生物对营养物质的特殊需求,在培养基中加入特定的物质(PVA)来筛选特定的微生物(PVA分解菌),所以属于选择培养基。
(2)由于PVA能与碘作用产生蓝绿色复合物,所以要在培养基中加入碘制成蓝绿色平板。图甲中菌落大小基本相同,但透明圈大小不同,透明圈越大,说明菌落周围的PVA被分解得越多,也就意味着该菌落中的细菌分解PVA的效果越好,故d菌落中的细菌分解PVA效果最好。
(3)图乙为显微镜直接计数,死菌、活菌均计算在内,实际活菌数小于统计结果。
　　手机现在已经成为人们离不开的通讯和娱乐工具,但手机表面分布较多的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等微生物,由于人体密切接触可能导致人患肠胃炎等疾病。有人认为手机细菌比马桶多。A、B两机构通过实验展示调查结果。回答下列相关问题。
(1)该实验需制备固体(填“固体”或“液体”)培养基。据图,两机构均采用稀释涂布平板法
接种。
(2)两机构实验操作均正确,但结果截然不同,你认为原因是可能是手机的取样和马桶的取样(样本)都不相同。
(3)取样面积如图所示,实验员测定某手机屏幕的细菌数量,将10 mL菌悬液进行梯度稀释,分别取 0.1 mL 稀释倍数为100的样品液接种到三个培养基上,培养一段时间后,统计菌落数分别为98、100、102,则该手机屏幕的细菌数为4×104个/cm2。该实验是否需要设置对照实验 若需要,请简要写出对照实验的设计方案;若不需要,请说明理由:需要,取培养基涂布0.1 mL无菌水进行培养。
(4)乙、丙两位工作人员用稀释涂布平板法分离细菌,在同一稀释倍数下得到以下结果:
乙涂布了3个平板,统计的菌落数分别是110、140和149,取平均值133。
丙涂布了3个平板,统计的菌落数分别是33、169和176,取平均值126。
这两位工作人员的结果中,丙的结果可信度低,其原因是实验结果中有1个平板的计数与另2个相差悬殊。运用这种方法统计的结果往往比实际值偏小,理由是当两个或多个细胞连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落。
课时作业
(时间:30分钟　分值:55分)
第1～6题每题3分,第7～8题每题6分,共计30分。
基础对点练
知识点1　选择培养基及微生物的选择培养
1.研究人员利用无机盐、琼脂和石油配制培养基,欲培养出石油降解菌,以修复被石油污染的土壤。下列相关叙述中,错误的是(　　)
[A]这种培养基是一种选择培养基
[B]这种培养基的唯一碳源是石油
[C]能在该培养基上生长的微生物可能是石油降解菌
[D]石油降解菌在未被石油污染的土壤中含量较高
【答案】 D
【解析】 分离获得能降解石油的菌株的关键是用以石油作为唯一碳源的选择培养基进行培养;由于该培养基以石油作为唯一碳源,能在该培养基上生长的微生物可能是石油降解菌,此外有些以空气中二氧化碳为碳源的微生物也能在该培养基上生存;石油降解菌在被石油污染的土壤中含量较高。
2.筛选是分离和培养微生物常用的手段,下列有关培养基中不能筛选成功的是(　　)
[A]在全营养的LB培养基(普通培养基)中,筛选大肠杆菌
[B]在尿素固体培养基中,筛选能分解尿素的微生物
[C]用以纤维素为唯一碳源的培养基,筛选能分解纤维素的微生物
[D]在培养基中加入不同浓度的氯化钠,筛选抗盐突变的微生物
【答案】 A
【解析】 在全营养的LB培养基中,几乎所有细菌都能生长,不能筛选大肠杆菌;在以尿素为唯一氮源的固体培养基中,可以筛选能分解尿素的微生物;在以纤维素为唯一碳源的培养基中,可以筛选能分解纤维素的微生物;在培养基中加入不同浓度的氯化钠,只有抗盐突变的微生物才能生长,故可用于筛选抗盐突变的微生物。
3.微生物的接种方法最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法,下列关于两者区别的说法,正确的是(　　)
类别 平板划线法 稀释涂布平板法
① 需要接种环(灼烧灭菌) 需要涂布器(酒精消毒)
② 无须对菌液进行梯度稀释 对菌液进行系列梯度稀释
③ 能纯化微生物,不可计数 既能纯化微生物,又能计数
④ 最后的划线区域一定出现单菌落 稀释倍数足够大的菌液,涂布的平板才会出现单菌落
[A]②④ [B]③④ [C]①④ [D]②③
【答案】 D
【解析】 稀释涂布平板法用到的涂布器进行酒精浸泡消毒后要在涂布平板前进行灼烧灭菌;平板划线法不需要对菌液进行梯度稀释,稀释涂布平板法需要对菌液进行系列梯度稀释;平板划线法不能计算出菌液中的活菌数,稀释涂布平板法可计算菌液中的活菌数,二者都可纯化微生物;如果划线操作不规范,平板划线的最后划线区域不一定会出现单菌落。
知识点2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
4.(2025·肇庆月考)下列关于土壤中分解尿素的细菌的分离与计数实验的叙述,正确的是(　　)
[A]培养基应以尿素为唯一氮源,该细菌与硝化细菌所利用的碳源是相同的
[B]取样时应选择农田、菜地的表层土
[C]若在某一稀释度下测得的菌落数分别为18、234、276,则平均菌落数为176
[D]鉴定分解尿素的细菌,利用了尿素可被分解产生NH3,从而使pH升高的原理
【答案】 D
【解析】 分离分解尿素的细菌时应该用以尿素为唯一氮源的培养基,尿素分解菌为异养生物,而硝化细菌为自养生物,前者利用的是有机碳源,后者利用的是无机碳源,因此它们所利用的碳源是不同的;绝大多数细菌分布在距地表3～8 cm的土壤层,所以土壤取样时应铲去表层土;若同一稀释度下涂布,测得的菌落数分别为18、234、276,菌落差距太大,且有数值不在30～300范围内,直接用于求平均值会使结果不准确;鉴定分解尿素的细菌的原理是该种细菌能产生脲酶,脲酶能将尿素分解产生NH3,从而使pH升高,使酚红指示剂变红(酸碱指示剂变色)。
5.(2025·成都月考)某些土壤细菌可将尿素分解成CO2和NH3,NH3再转化为N等供植物吸收和利用。以下说法错误的是(　　)
[A]土壤中的细菌之所以能分解尿素,是因为它们能合成脲酶
[B]能分解尿素的细菌也能以尿素的分解产物CO2作为碳源
[C]为了筛选可分解尿素的细菌,在配制培养基时应选择尿素作为唯一氮源
[D]筛选分解尿素的细菌的培养基中KH2PO4的作用是提供无机盐、维持pH
【答案】 B
【解析】 能分解尿素的细菌属于异养型生物,不能以尿素的分解产物CO2作为碳源。
6.某兴趣小组尝试对土壤中分解尿素的细菌进行分离并计数,下列相关叙述正确的是(　　)
[A]制备选择培养基时,需加入尿素、琼脂、葡萄糖、硝酸盐等物质
[B]测定土壤中细菌的数量,一般选用107倍的稀释液进行平板培养
[C]若要判断选择培养基是否起到了选择作用,需要设置未接种的牛肉膏蛋白胨培养基做对照
[D]细菌一般在30～37 ℃的温度下培养1～2 d
【答案】 D
【解析】 分离土壤中分解尿素的细菌时,培养基中要加尿素(唯一的氮源),不能加硝酸盐;测定土壤中细菌的数量,一般选用104～106倍的稀释液进行平板培养,以保证平板上的菌落数适宜;若要判断选择培养基是否起到了选择作用,需设置接种了的没有选择作用的全营养培养基,如牛肉膏蛋白胨培养基做对照。
综合提升练
7.多环芳烃(PAHs)是一种不溶于水的有机物,在培养基中以微小的颗粒状存在,PAHs在土壤中的降解速率很慢,并具有致癌和致畸作用。科研人员欲从被PAHs污染的土壤中分离出高效降解PAHs的菌株,下列说法错误的是(　　)
[A]培养基甲为液体培养基,可扩大培养目的菌株
[B]培养基甲和培养基乙都以PAHs为唯一碳源,两者都是选择培养基
[C]③过程采用的接种方法可用于后期微生物的计数,计数结果往往偏大
[D]通过⑤获得的菌株,在培养基乙上形成的菌落周围存在透明圈
【答案】 C
【解析】 液体培养基可用于扩大培养,分析题图可知,培养基甲为液体培养基,可扩大培养目的菌株;实验目的是分离出高效降解PAHs的菌株,故培养基甲和培养基乙均应该是以PAHs为唯一碳源的选择培养基;③过程采用的接种方法为稀释涂布平板法,可用于后期微生物的计数,但由于两个或多个细胞连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落,会导致计数结果偏小;通过⑤获得的菌株能高效降解PAHs,而PAHs在培养基中以微小颗粒存在,故这些菌株在培养基乙上形成的菌落周围存在透明圈。
8.(2025·深圳检测)从马盲肠中分离出能够降解纤维素的厌氧细菌并对其进行鉴定,实验流程和结果如下图。下列叙述错误的是(　　)
注:刚果红可与纤维素形成红色复合物,当纤维素被分解后,复合物就无法形成,会出现透
明圈。
[A]①～③的培养基以纤维素为唯一碳源
[B]①～③应在无氧条件下倒置培养
[C]菌落甲分泌的纤维素分解酶的降解能力低于乙
[D]筛选出的菌株可研发为反刍动物的饲料添加剂
【答案】 C
【解析】 ①～③的培养基以纤维素为唯一碳源,能够对降解纤维素的细菌进行选择培养;氧气对厌氧细菌生长有抑制作用,因此①～③应在无氧条件下倒置培养;菌落甲的透明圈与菌落直径比值大于乙,因此菌落甲分泌的纤维素分解酶的降解能力高于乙;反刍动物食物中含有大量纤维素,且其消化道多为无氧环境,故从马盲肠中分离出能够降解纤维素的厌氧细菌,可研发为反刍动物的饲料添加剂。
9.(13分)(2025·烟台质检)尿素是一种高浓度氮肥,通过土壤中某些细菌分解为NH3,NH3再转化为N和N等被植物吸收利用。某同学要分离土壤中能分解尿素的细菌,并统计每克土壤样品中活菌数目,培养基配方如下:
KH2PO4 Na2HPO4 葡萄糖 尿素
1.4 g 2.1 g 10.0 g 1.0 g
MgSO4·7H2O 蛋白胨 琼脂
0.2 g 1.0 g 15.0 g
(1)根据培养基的成分分析,该同学能否分离出土壤中分解尿素的细菌 　　　　(填“能”或“不能”),原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(2)通常在实验室培养微生物时,需要对培养基、培养皿、接种环进行灭菌,灭菌方法依次是　　　　　　、　　　　　　、　　　　　　。培养细菌时,一般需要将培养基的pH调至　　　　　　。
(3)某同学取稀释倍数为106倍的菌液0.2 mL接种后,测得平板上菌落数为156、178和191,则每克样品中的菌落数为　　　　　　个。
(4)某同学在分离纯化土壤中分解尿素的细菌时,发现培养基上的菌落连成一片,最可能的原因是　　　　　　　 　　,为避免此种现象发生,正确的操作方法是
　　　　　 　　　　　。
(5)图1和图2是培养某细菌的结果图,其对应的接种方法分别是　　　　　　　　　和　　　　　　　　,这两种方法接种后培养基上都可以得到由单个细胞繁殖形成的　　　,其中,　　　(填“图1”或“图2”)所用的接种方法可用来对活菌进行计数。
【答案】 (每空1分)
(1)不能　尿素不是唯一氮源
(2)湿热灭菌法　干热灭菌法　灼烧灭菌法　中性或弱碱性
(3)8.75×108
(4)菌液浓度过高　对菌液进行多次梯度稀释
(5)稀释涂布平板法　平板划线法　菌落　图1
【解析】 (1)分离土壤中能分解尿素的细菌,培养基应以尿素为唯一氮源,该培养基中有蛋白胨,蛋白胨含氮元素,其他杂菌可利用蛋白胨中的氮源生长,所以不能筛选出只分解尿素的细菌。
(2)培养基常用湿热灭菌法灭菌,培养皿常用干热灭菌法灭菌,接种环常用灼烧灭菌法灭菌;不同微生物生长需要的pH存在差异,培养细菌时一般将培养基pH调至中性或弱碱性。
(3)分析题意,平板上菌落数的平均值为(156+178+191)÷3=175(个),根据公式每克样品中的菌落数=平板上菌落数的平均值÷涂布的菌液体积×稀释倍数,可得每克样品中的菌落数为175÷0.2×106=8.75×108(个)。
(4)培养基上菌落连成一片最可能的原因是菌液浓度过高,细菌过于密集;正确操作是对菌液进行多次梯度稀释,降低菌液浓度后再涂布。
(5)图2是平板划线法,通过连续划线将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面;图1是稀释涂布平板法,将菌液进行一系列梯度稀释后涂布到培养基表面;两种方法都能得到单个细胞繁殖形成的菌落,稀释涂布平板法可用于活菌计数。
10.(12分)(2025·赣州检测)一次性口罩主要成分是由C、H两种元素组成的聚丙烯纤维。研究人员欲从合适的土壤样品中筛选出能高效降解一次性口罩的细菌,设计了如图1所示的流程。请回答下列问题。
(1)图1中“甲”指的是　　　　　,目的是提高聚丙烯纤维降解菌的比例和密度,此过程使用的培养基中应以　　　　　　(填化合物名称)为唯一碳源,为增大菌体与培养基的接触面积,从物理性质看,该培养基应是　 。
(2)将分离纯化得到的不同菌种分别接种到鉴别培养基上,鉴别培养基中加入了能与聚丙烯纤维结合的显色剂。设不同菌种的菌落面积为s,菌落周围透明圈的面积为S,选择S/s的比值　　　的菌落,就是能高效降解一次性口罩的目的菌群。
(3)欲估算某土壤样品中有多少能高效降解一次性口罩的目的菌,接种平板时应用
　　　　　　　　法。根据图2操作能计算出1 g该土壤中约有　　 　　　个高效降解一次性口罩的目的菌。
【答案】 (每空2分)
(1)选择培养(或扩大培养)　聚丙烯纤维　液体培养基
(2)大
(3)稀释涂布平板　6.8×107
【解析】 (1)从用途看,为了提高聚丙烯纤维降解菌的比例和密度,图1中“甲”指的是选择培养(或扩大培养);本实验的目的是筛选出能高效降解一次性口罩的细菌,一次性口罩主要成分是由C、H两种元素组成的聚丙烯纤维,故在选择培养时培养基中应以聚丙烯纤维为唯一碳源;液体培养基有利于增大菌体与培养基的接触面积,从而实现目的菌的扩大
培养。
(2)由题意可知,当聚丙烯纤维被降解时无法与显色剂结合,形成透明圈,同等大小菌落形成的透明圈越大,说明该菌落降解聚丙烯纤维能力越强,设不同菌种的菌落面积为s,菌落周围透明圈的面积为S,选择S/s的比值大的菌落,就是能高效降解一次性口罩的目的菌群。
(3)微生物的接种方法有平板划线法和稀释涂布平板法,其中能够用于计数的是稀释涂布平板法;计数时应选择菌落数为30～300的平板进行统计,据图可知,符合要求的菌落数有62、68、74,且共稀释了105倍,算出1 g该土壤中目的菌约有(62+68+74)÷3÷0.1×105=
6.8×107(个)。(共72张PPT)
第2节　微生物的培养技术及应用
第1课时　微生物的基本
培养技术
1.基于牛肉膏蛋白胨培养基的实例分析,说明培养基的概念、种类及营养成分的种类和作用。2.通过学习消毒和灭菌的方法,认识二者的异同,阐明灭菌是获得纯净的微生物培养物的前提,认同无菌技术能保持无菌物品与无菌区域不被其他微生物污染。3.运用微生物纯培养原理和无菌技术,通过平板划线法对酵母菌分离、纯化。
[学习目标]
预习案·自主学习
一、微生物及培养条件
1.微生物:难以用肉眼观察的微小生物的统称,包括 等。
2.研究和应用微生物的前提是防止 ,获得纯净的 。
3.实验室培养微生物的条件
(1)要为人们需要的微生物提供合适的 条件。
(2)要确保其他微生物无法混入,并将 分离出来。
细菌、真菌和病毒
杂菌污染
微生物培养物
营养和环境
需要的微生物
二、培养基的配制
1.培养基的概念、用途和类型
营养物质
生长繁殖
培养、分离、鉴定、保存
代谢物
液体
固体
提醒　固体培养基中的琼脂仅作为凝固剂,不能为微生物生长提供能量和碳源。
2.培养基的营养构成
(1)主要营养物质:水、 和无机盐。
碳源、氮源
(2)其他条件:满足微生物生长对pH、 以及O2的需求。如下表:
微生物 乳酸杆菌 霉菌 细菌 厌氧
微生物
特殊 需求 添加 pH调 至 pH调至 无氧
特殊营养物质
维生素
酸性
中性或弱碱性
三、无菌技术
1.获得纯净的微生物培养物的关键是防止 。
2.消毒与灭菌的比较
杂菌污染
温和
强烈
一部分
所有的
3.连线无菌技术的常用方法及适用对象
【提示】 ①—c—Ⅳ,①—d—Ⅱ,①—e—Ⅴ,②—a—Ⅰ,②—b—Ⅲ,②—f—Ⅵ
四、微生物的纯培养
1.概念理解
微生
物的群体
单一个体
纯培养物
灭菌、接种
2.酵母菌的纯培养
(1)实验原理。
①菌落:分散的微生物在适宜的 表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的 。
②获得单菌落的方法:采用 法和 法能将单个微生物分散在固体培养基上,经培养得到单菌落。
固体培养基
子细胞群体
平板划线
稀释涂布平板
(2)方法步骤。
琼脂
蒸馏
水
干热灭菌箱
50℃
酒精灯火焰
单
恒温
3.倒平板和平板划线法的操作
(1)倒平板的具体操作。
通过
稍大于
倒过
来
提醒　倒平板是将熔化后的培养基倒入培养皿冷却凝固形成培养基固体平面的过程,而不只是将培养皿倒置。
(2)平板划线法的具体操作。
灼烧
火焰旁
火焰
接种环
蘸取
三至五
条平行线
接种环
末端
第一次
判断正误
(1)培养基中的碳源物质可能同时作为氮源。(　　)
√
(2)有些微生物在培养时,培养基中可能不需要加入氮源。(　　)
×
【提示】 没有生物活性的材料不一定要用高压蒸汽灭菌法灭菌,如玻璃器皿可用干热灭菌法灭菌。
√
(3)只要是没有生物活性的材料就必须采用高压蒸汽灭菌。(　　)
(4)培养基分装到培养皿后再进行湿热灭菌。(　　)
【提示】 应将配制好的培养基先进行湿热灭菌,再在无菌环境中将其分装到培养皿中。
×
(5)倒平板时,应将打开的皿盖放到一边,以免培养基溅到皿盖上。(　　)
×
【提示】 倒平板时,将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙,将培养基倒入培养皿,立即盖上皿盖。
(6)配制培养基时应先灭菌再调pH。(　　)
×
【提示】 配制培养基时应先调pH再灭菌,否则易有杂菌污染。
探究案·互动探究
任务一　分析培养基的种类和营养构成
培养微生物需要适宜的营养物质,下表是某培养基的配方,分析回答下列问题。
组分 牛肉膏 蛋白胨 NaCl 琼脂 水
用量 5 g 10 g 5 g 20 g 定容至
1 000 mL
(1)根据培养基的物理性质划分,该培养基属于 培养基,理由是
。
固体
该培养基的配方中含有凝固剂琼脂
(2)该培养基中提供碳源和氮源的物质是什么,为什么培养基需要氮源
【提示】 牛肉膏和蛋白胨,培养基中的氮元素是微生物合成蛋白质、核酸等物质必需的。
(3)该培养基培养的微生物同化作用类型是 ,理由是
。
异养型微生物
该微生物的碳源和氮源是有机物
(4)下表是某微生物培养基的成分,请分析该培养基可用来培养哪种微生物 理由是什么
【提示】 此培养基可用来培养自养型微生物。培养基中没有提供碳源,微生物利用空气中的CO2做碳源。
成分 (NH4)2SO4 KH2PO4 FeSO4 CaCl2 H2O
含量 0.4 g 4.0 g 0.5 g 0.5 g 100 mL
「核心归纳」
1.培养基的成分和作用
营养 物质 定义 作用 主要来源
碳源 提供碳元素的物质 构成生物体的细胞物质和一些代谢物,有些也是异养生物的能源物质 无机碳源:CO2、NaHCO3等;
有机碳源:糖类、石油、牛肉膏等
氮源 提供氮元素的物质 合成蛋白质、核酸以及含氮的代谢物 无机氮源:N2、NH3、铵盐、硝酸盐等;有机氮源:尿素、蛋白胨等
水 在生物体内含量很高的无机物 不仅是优良的溶剂,而且可维持生物大分子结构的稳定 —
无机盐 为微生物提供除碳、氮以外的各种重要元素,包括大量元素和微量元素 是细胞的组成成分、生理调节物质、某些化能自养菌的能源、酶的激活剂等 无机化合物
2.培养基的特点、种类和用途
「典型例题」
1.(2025·周口检测)下列有关微生物培养基种类及配制原则的叙述,正确的是(　　)
[A]任何培养基都必须含有碳源、氮源、水、无机盐及特殊的营养物质
[B]液体培养基可用于观察菌落,固体培养基可用于工业生产
[C]微生物的生长除了受营养因素影响,还受pH、O2、渗透压等的影响
[D]淀粉可作为所有微生物的碳源
C
【解析】 培养基不一定都含有碳源、氮源,自养型微生物可以利用无机碳源(如CO2)合成自身所需的含碳有机物,自生固氮菌能够独立将空气中的氮气固定为含氮化合物;一般来说,固体培养基表面有一定的硬度,便于细菌在其表面生长形成单个的菌落,所以固体培养基常用于观察菌落;而液体培养基中微生物可以与营养物质充分接触,更有利于微生物的生长繁殖,所以液体培养基常用于工业生产;不同的微生物对碳源的需求不同,某些微生物不能分解利用淀粉,而只能利用葡萄糖、果糖、蔗糖和麦芽糖等糖类。
2.不同的微生物对营养物质的需求各不相同。下列有关一种以CO2为唯一碳源的自养型微生物所需营养的描述中,错误的是(　　)
[A]氮源物质为该微生物提供必要的氮元素
[B]碳源物质也是该微生物的能源物质
[C]无机盐是该微生物不可缺少的营养物质
[D]水是该微生物的营养要素之一
B
【解析】 微生物生长繁殖需要氮源,氮源物质为该微生物提供必要的氮元素;该微生物所利用的碳源物质是CO2,无法继续氧化、分解释放能量,不能作为微生物的能源物质;无机盐是微生物生长繁殖不可缺少的营养物质;生物的生命活动离不开水,水是该微生物的营养要素之一。
【易错提醒】
有关培养基营养物质的四点提醒
(1)培养不同的微生物所需要的营养物质可能不同。
①自养型微生物的培养基主要以无机营养为主。
②异养型微生物的培养基主要以有机营养为主。
(2)对异养微生物来说,含C、H、O、N的化合物通常既是碳源,又是氮源。
(3)微生物需要补充特殊营养物质,是由于缺乏合成这些物质所需要的酶或合成能力有限。
(4)能利用无机物合成含碳有机物的是自养型生物,反之为异养型生物。
任务二　对比分析微生物培养中的消毒和灭菌
无菌技术包括消毒和灭菌,借助于不同的灭菌和消毒手段,可不同程度地减少或杀灭环境中的微生物,确保微生物研究和生产顺利进行。回答下列有关问题。
(1)选择以下材料或用具所用的无菌技术。
①吸管　②培养基　③培养皿　④实验操作者的双手　⑤烧瓶　⑥接种针　⑦试管　⑧接种环　⑨玻璃棒
消毒: ;灼烧灭菌: ;干热灭菌: ;湿热灭菌: 。
④
⑥⑧
①③⑤⑦⑨
②
(2)进行化学消毒时,某人认为酒精浓度越高,消毒效果可能越好,于是他用了体积分数为95%的酒精进行消毒,他的做法对吗 为什么
【提示】 不对。用酒精消毒时,体积分数为70%～75%的酒精消毒效果较好,原因是酒精浓度过高时,菌体表面的蛋白质会凝固成一层保护膜,使酒精不能渗入其中。
(3)牛奶的消毒常采用巴氏消毒法,与煮沸消毒法相比,这种方法的优点是什么
【提示】 在达到消毒目的的同时,营养物质损失较少。
(4)无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染,还有什么作用
【提示】 无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。
「核心归纳」
不同消毒方法的特点
「典型例题」
3.无菌技术应围绕着如何避免杂菌的污染展开,主要包括消毒和灭菌。下列关于无菌操作的叙述,正确的是(　　)
[A]无菌技术可以有效避免操作者自身被微生物感染
[B]用紫外线照射可以消除物体内部的全部微生物
[C]配制好培养基后将其分装到培养皿中,再进行湿热灭菌
[D]用巴氏消毒法处理食品后会将所有的细菌或芽孢杀死
A
【解析】 无菌操作技术既可以用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染,又可以有效避免操作者自身被微生物感染;消毒是指使用较温和的物理、化学和生物等方法杀死物体体表或内部的一部分微生物的过程,紫外线消毒不能消除物体内部的全部微生物,巴氏消毒法也不能杀死食品中的所有细菌或芽孢;为了防止杂菌污染,应将配制好的培养基先进行湿热灭菌,再在无菌环境中将其分装到培养皿中。
4.在生产、生活和科研实践中,经常通过消毒和灭菌来避免杂菌的污染。回答下列问题。
(1)在实验室中,玻璃和金属材质的实验器具　　　　(填“可以”或“不可以”)放入干热灭菌箱中进行干热灭菌。
可以
【解析】 (1)干热灭菌是指将物品放入干热灭菌箱内,在160～170℃的热空气中维持1～2 h。耐高温和需要保持干燥的物品,如玻璃器皿(如吸管、培养皿等)、金属用具等,可采用干热灭菌的方法。
(2)密闭空间内的空气可采用紫外线照射消毒,其原因是紫外线能
　　　　。在照射前,适量喷洒　　 　　,可强化消毒效果。
破坏核酸
结构
(苯酚或煤酚皂溶液等)消毒液
【解析】 (2)接种室、接种箱或超净工作台在使用前,可以用紫外线照射30 min,紫外线能破坏微生物的核酸结构,从而杀死物体表面或空气中的微生物。在照射前,适量喷洒苯酚或煤酚皂溶液等消毒液,可以加强消毒效果。
【解析】 (3)自来水通常是用氯气进行消毒的。
(3)水厂供应的自来水通常是经过　　　　(填“氯气”“乙醇”或“高锰酸钾”)消毒的。
氯气
任务三　掌握酵母菌纯培养的实验操作方法
探究1　分析倒平板的实验操作,提高实验操作能力
倒平板是微生物学实验中的一项基本操作,主要用于培养微生物。 它需要将培养基冷却至50 ℃左右,然后倒入平板中,使培养基均匀分布在平板上,以便于后续的微生物接种和培养。结合倒平板的操作程序回答有关问题。
(1)如图1所示,需要使锥形瓶的瓶口通过火焰的原因是
。
(2)培养基灭菌后,需要冷却到50 ℃左右时,才能用来倒平板。为什么要冷却至50 ℃左右 可用什么办法来估计培养基的温度
【提示】 倒平板时高于50 ℃会烫手,低于50 ℃时若不及时操作,琼脂会凝固。估计培养基的温度为50℃左右的方法是用手触摸盛有培养基的锥形瓶,感觉温度下降到刚刚不烫手即可。
通过灼烧灭菌,防止
瓶口的微生物污染培养基
(3)如图2所示,培养基冷凝后,为什么要将平板倒置
【提示】 培养基冷凝后,皿盖上会凝结水珠,将平板倒置,既可以防止皿盖上的水珠落入培养基,又可以避免培养基中的水分过快挥发。
探究2　分析平板划线法的原理和操作,提高理解能力
下图是平板划线操作的示意图,据图回答下列问题。
(1)用字母和箭头表示平板划线操作的正确步骤d→b→ 。
f→a→e→c→h→g
【提示】 操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物;从第二次划线开始,每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后,接种环上残留的菌种,使下一次划线时,接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端,从而通过划线次数的增加,使每次划线时菌种的数目逐渐减少,以便得到单个菌落。
(2)为什么在操作的第一步以及从第二次划线开始,每次划线之前都要灼烧接种环
【提示】 需要,划线结束后灼烧接种环,能及时杀死接种环上残留的菌种,避免细菌污染环境和感染操作者。
(3)在划线操作结束时,还需要灼烧接种环吗 为什么
(4)在灼烧接种环之后,为什么要等其冷却后再进行划线
【提示】 以免接种环温度太高,杀死菌种。
【提示】 划线后,线条末端细菌的数目比线条起始处要少,每次从上一次划线的末端开始,能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少,最终能得到由单个微生物繁殖而来的菌落。
(5)在第二次以及其后的划线操作时,为什么总是从上一次划线的末端开始划线
【提示】 培养未接种培养基的作用是做对照,若未接种的培养基培养后无菌落生长,说明培养基的制备是成功的。若有菌落形成,说明培养基灭菌不彻底,或培养基被污染了,需要重新制备。
(6)接种结束后,为什么要将一个未接种的培养基和一个已接种的培养基放在恒温培养箱一起培养24～48 h,未接种的培养基表面如果有菌落生长,说明了什么
「核心归纳」
平板划线操作的注意事项
(1)灼烧接种环,待其冷却后才能伸入菌液,以免温度太高杀死菌种。
(2)第二次及其以后的划线操作总是从上一次划线末端开始,能使微生物的数目随着划线次数的增加而逐渐减少,最终得到由单个微生物繁殖而来的菌落。
(3)划线时最后一区不要与第一区相连。
(4)划线用力大小要适当,防止用力过大将培养基划破。
「典型例题」
5.(2025·昆明检测)在自然界中分布有各种微生物,而研究和应用微生物的前提是进行微生物的纯培养。工业上大规模生产酸奶时,需先获得单一乳酸菌菌种。下列相关操作正确的是(　　)
[A]培养基灭菌后,需调至中性或弱碱性
[B]培养基需冷却到室温时才能用来倒平板
[C]采用平板划线法接种时划线5个区则需要灼烧接种环5次
[D]接种后的平板需倒置,放入恒温培养箱中培养
D
【解析】 培养细菌时,一般需要将培养基调至中性或弱碱性,调pH之后再进行高压蒸汽灭菌;培养基需冷却到50 ℃左右时,才能用来倒平板;采用平板划线法接种乳酸菌时,若完成5次划线,需要灼烧接种环6次;接种后的平板需倒置培养,防止培养皿皿盖上凝结的水珠滴落和培养基水分挥发过快。
6.(2024·湖南卷)微生物平板划线和培养的具体操作如图所示,下列操作正确的是(　　)
[A]①②⑤⑥ [B]③④⑥⑦
[C]①②⑦⑧ [D]①③④⑤
D
【解析】 由题图可知,②中拔出棉塞后应握住棉塞上部;⑥中划线时不能将培养皿的皿盖完全打开,应只打开一条缝隙;⑦中划线时第5次的划线不能与第1次的划线相连;⑧中平板应倒置培养。
思维导图
随堂检测反馈
1.(2025·广州检测)下列关于微生物培养基的叙述,错误的是(　　)
[A]制备固体培养基,一般需在液体培养基中加入琼脂
[B]微生物在固体培养基表面生长形成的菌落,可以用肉眼观察到
[C]根据微生物对碳源需要的差别,使用不同碳源的培养基
[D]培养基中的营养物质浓度越高,对微生物的增殖越有利
D
【解析】 制备固体培养基,一般需在液体培养基中加入适量的凝固剂——琼脂;菌落是由微生物在固体培养基表面或内部生长形成的肉眼可见的、具有一定形态结构的细胞群体;不同微生物对碳源的需求不同,有的主要利用淀粉,有的主要利用葡萄糖或果糖,还有的可直接利用空气中的CO2;培养基中的营养物质浓度过高,微生物会通过渗透作用失水,对微生物的增殖不利。
2.下列关于倒平板的叙述,错误的是(　　)
[A]待培养基冷却至50 ℃左右时倒平板
[B]倒平板整个过程应在酒精灯火焰旁进行
[C]完全打开培养皿皿盖,快速将培养基倒入培养皿
[D]为避免水滴滴入培养基,平板应倒过来放置
C
【解析】 待培养基冷却至50 ℃左右时倒平板,这个温度既不会烫死菌种,也不会使培养基很快凝固;倒平板整个过程应在酒精灯火焰旁进行,利用火焰周围的高温形成无菌区,降低杂菌污染的风险;用拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙,而不是完全打开皿盖,完全打开皿盖容易导致杂菌污染;为避免水滴滴入培养基,平板应倒过来放置,这样可以防止冷凝水滴落造成培养基污染。
3.如图是微生物平板划线示意图,划线的顺序为1→2→3→4→5,下列说法正确的是(　　)
[A]除第一次划线外,每次划线的始端需与上次划线的末端相交
[B]1和5划线可以如图所示,也可以相连在一起
[C]每次划线前都需要灼烧接种环,划线后则不需要
[D]只有在5区域才可以得到所需菌落
A
【解析】 第二次及以后的划线总是从上次划线的末端开始,使微生物的数目随着划线次数的增加而逐步减少,最终能得到由单个微生物繁殖而来的菌落;第一次划线区微生物较多,划线时注意不能将最后一区即5区的划线与第一区即1区相连,否则可能无法获得单菌落;划线结束后需要灼烧接种环,清除残留在接种环上的菌种,防止微生物污染环境和感染操作者;由题图可知,5区域是最后一个区域,有可能在5区域获得单菌落,但其他区域也可能形成单菌落。
4.(2025·哈尔滨检测)防止杂菌污染,获得纯净的微生物培养物,是研究和应用微生物的前提。下列叙述错误的是(　　)
[A]接种箱或超净工作台在使用前,可以用紫外线照射30 min,以杀死物体表面或空气中的微生物
[B]牛奶使用巴氏消毒法处理,在100 ℃煮30 min,既可以杀死牛奶中的微生物,又不破坏营养成分
[C]在实验室中,不可吃东西、喝水,离开实验室一定要洗手,以防止被微生物感染
[D]使用后的培养基丢弃前一定要进行灭菌处理,以免污染环境
B
【解析】 不同于煮沸消毒法,巴氏消毒法处理的温度不是很高,一般在63～65 ℃消毒30 min或72～76 ℃处理15 s或80～85 ℃处理10～15 s,能杀死牛奶中的绝大多数微生物且基本不破坏牛奶的营养成分。
5.回答下列与细菌培养相关的问题。
(1)在细菌培养时,培养基中能同时提供碳源、氮源的成分是　　　 　(填“蛋白胨”“葡萄糖”或“NaNO3”)。通常,制备培养基时要根据所培养细菌的不同来调节培养基的pH,其原因是　　　　　　　　　　　　　 　　　。硝化细菌在没有碳源的培养基上　　　　(填“能”或“不能”)生长,原因是
　　　　　　　　　　　　 　　　　。
蛋白胨
不同细菌生长繁殖所需的最适pH不同
能
硝化细菌可以利用空气中的CO2作为碳源
【解析】 (1)葡萄糖只能为细菌提供碳源,NaNO3主要为细菌提供无机盐,而蛋白胨既可以为细菌提供碳源,也可以为细菌提供氮源;由于不同的细菌生长繁殖的最适pH是不同的,因此制备培养基时要根据所培养的细菌的不同来调节培养基的pH;硝化细菌属于化能自养型微生物,其可以利用氨氧化释放的能量将空气中的CO2固定为有机物,因此硝化细菌可以在无碳源的培养基中生长。
(2)单个细菌在平板上会形成菌落,研究人员通常可根据菌落的形状、大小、颜色等特征来初步区分不同种的微生物,原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　 　。
在一定的培养条件下, 　
【解析】 (2)由于不同类型的微生物都有其独特的细胞形态,因而其菌落形态特征也各异,因此可根据菌落的形态、大小、颜色等特征来初步区分不同种的微生物。
不同种微生物表现出各自稳定的菌落特征
(3)使用后的培养基在丢弃前需要经过　　　　　　　处理,这种处理可以杀死丢弃物中所有的微生物。
灭菌
【解析】 (3)使用后的培养基含有培养的微生物,丢弃前一定要进行灭菌处理,以杀死其中所有的微生物,从而避免污染环境。
联系实际 迁移应用
为保障公共健康,需要定期对公共饮用水进行卫生检测。居于大肠中的各种细菌统称为大肠菌群,大肠菌群中的杆菌称为肠杆菌,大肠杆菌是肠杆菌中的一种。一般用大肠菌群作为水体受粪便污染的指示菌,饮用水的卫生标准之一是每100 mL 不得检出大肠菌群。若要确定饮用水是否合格,可采用膜过滤法检测饮用水中的大肠菌群,过程如下图所示:
(1)检测前需要进行无菌处理的材料用具有 (填序号)。
①水样收集瓶　②滤膜　③培养基　④镊子　⑤水样
(2)完成过滤后需将滤膜的 (填“A面”或“B面”)接触配制好的培养基。
(3)将完成过滤之后的滤膜紧贴在培养基上,这属于微生物培养中的 操作。为了检测该培养基灭菌是否彻底,对于该培养基应采用的检测方法是
。
①②③④
A面
接种
空白培养基倒置培养箱中培养,观察是否有菌落形成
(4)培养基在37 ℃下培养20～22 h后进行观察。若
,则此水不符合饮用水标准。
观察到培养基上产生
大肠菌群菌落
(5)某显色培养基可以检测肠杆菌中大肠杆菌的存在。该培养基中含有ONPG和MUG可作碳源,色氨酸可作为氮源。在检测大肠菌群时,检测指标如下表所示。
菌群 检测项目及原理
大肠菌群(有β-半乳糖苷酶) ONPG检测:β-半乳糖苷酶水解无色的ONPG为黄色物质
肠杆菌群(降解色氨酸为吲哚) 吲哚检测:吲哚可使特定显影剂显为绿色
大肠杆菌(有β-葡糖醛酸酶) MUG检测:β-葡糖醛酸酶降解MUG为具有荧光的物质
注:出现上述颜色变化为阳性,未出现上述颜色变化为阴性。
结合表中内容分析,若上述检测结果为 (填字母),则可以确定待测菌为大肠杆菌。
A.ONPG检测和吲哚检测为阳性,MUG检测为阴性
B.吲哚检测为阳性,ONPG检测和MUG检测为阴性
C.ONPG检测、MUG检测、吲哚检测均为阴性
D.ONPG检测、MUG检测、吲哚检测均为阳性
D

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