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第1节　重组DNA技术的基本工具
[学习目标]　1.阐明重组DNA技术所需的三种基本工具的作用。2.认同基因工程的诞生和发展离不开理论研究和技术创新。3.进行DNA的粗提取与鉴定。
一、基因工程的概念和诞生
1.基因工程的概念
2.基因工程的诞生和发展
(1)基因工程的诞生。
(2)基因工程的发展。
二、基因工程的操作工具
1.限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
2.DNA连接酶——“分子缝合针”
(1)作用:将两个DNA片段连接起来,恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。
(2)种类。
种类 来源 作用特点
E.coli DNA 连接酶 大肠 杆菌 这两类酶都能将双链DNA片段连接起来,但E.coli DNA连接酶连接具有平末端的DNA片段的效率要远远低于T4 DNA连接酶
T4 DNA 连接酶 T4噬 菌体
3.基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
(1)常用载体——质粒。
(2)其他载体:噬菌体、动植物病毒等。
(3)不同载体区别:不同载体的来源不同,在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小上也有很大差别。
三、DNA的粗提取与鉴定
1.实验原理
2.方法步骤
判断正误
(1)基因工程的原理是基因重组,利用基因工程可以实现定向变异。(　　)
【答案】 √
(2)限制性内切核酸酶均能特异性地识别6个核苷酸序列。(　　)
【答案】 ×
【提示】 大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成,也有少数限制酶的识别序列由
4个、8个或其他数量的核苷酸组成。
(3)DNA连接酶能将两碱基通过氢键连接起来。(　　)
【答案】 ×
【提示】 DNA连接酶能将两个DNA片段连接起来,恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
(4)作为载体的质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因。(　　)
【答案】 ×
【提示】 作为载体的质粒通常采用抗生素抗性基因作为筛选标记基因。
(5)载体的种类有质粒、噬菌体、动植物病毒等,其中动植物病毒必须是DNA病毒。(　　)
【答案】 √
(6)DNA粗提取时,洋葱研磨液经纱布过滤后,应在-4 ℃冰箱中放置几分钟。(　　)
【答案】 ×
【提示】 DNA粗提取时,洋葱研磨液经纱布过滤后,应在4 ℃冰箱中放置几分钟。
任务一　分析基因工程的理论基础和工具酶
探究1　分析基因工程的理论基础,提高理解能力
　　生长激素释放抑制激素可用于治疗肢端肥大症,最初只能从动物下丘脑提取。科学家以质粒为载体,将相关基因转入大肠杆菌。利用改造后的工程菌生产的该激素价格降为原来的几百分之一。在构建工程菌的过程中,需要获取生长激素释放抑制激素基因,并将其与质粒DNA拼接为重组DNA分子,再导入大肠杆菌中表达合成生长激素释放抑制激素。请分析以上材料并回答有关问题。
(1)为什么不同生物的DNA分子能拼接起来
【提示】 ①DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸。
②DNA分子都遵循碱基互补配对原则。
③双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构。
(2)为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞中表达
【提示】 ①基因是控制生物性状的遗传物质的结构和功能单位。
②遗传信息的传递都遵循中心法则。
③生物界共用一套遗传密码。
(3)基因工程操作导致的基因重组与有性生殖中的基因重组的主要区别是什么
【提示】 ①有性生殖中的基因重组是随机的,并且只能在同一物种间进行。
②利用基因工程可以在不同物种间进行基因重组,并且方向性强,可以定向地改变生物的性状。
探究2　分析限制性内切核酸酶和DNA连接酶的作用
　　有2个不同来源的DNA片段A和B,A片段用限制酶SpeⅠ进行切割,B片段分别用限制酶Hind Ⅲ、XbaⅠ、EcoRⅤ和XhoⅠ进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点
如图。
(1)请写出限制酶SpeⅠ、Hind Ⅲ、XbaⅠ和XhoⅠ切割形成的黏性末端。
【提示】
(2)同种限制酶切割产生的黏性末端是否相同 不同限制酶切割产生的黏性末端是否一定不同
【提示】 同种限制酶切割产生的黏性末端相同;不同的限制酶切割可能会产生相同的黏性末端。
(3)哪种限制酶切割B片段产生的DNA片段能与限制酶SpeⅠ切割A片段产生的DNA片段相连接 为什么 连接完成后,该重组DNA分子的新连接处能否再被所用的限制酶识别 为什么
【提示】 限制酶XbaⅠ;因为XbaⅠ与SpeⅠ切割产生的黏性末端相同。重组DNA分子不能再被所用的限制酶识别;因为所用的两种限制酶均不能识别该重组DNA分子的新连接处的脱氧核苷酸序列。
(4)DNA连接酶与DNA聚合酶的作用不同,下图为两种酶的作用示意图:
两种酶作用的不同点是DNA聚合酶的作用是将单个的脱氧核苷酸连接到已经形成的脱氧核苷酸链上,DNA连接酶的作用是连接两个双链DNA片段。
核心归纳
五种酶的比较
种类 作用底物 作用部位 形成产物
限制酶 双链 DNA分子 磷酸 二酯键 具有黏性末端 或平末端的双 链DNA片段
DNA 连接酶 双链 DNA片段 磷酸 二酯键 重组 DNA分子
DNA 聚合酶 脱氧核苷酸 和DNA片段 磷酸二 酯键 子代DNA 分子
解旋酶 双链 DNA分子 碱基对中 的氢键 单链 DNA分子
DNA (水解)酶 DNA分子 磷酸二 酯键 游离的脱 氧核苷酸
典型例题
1.(2025·广州检测)下图是几种不同限制酶切割DNA分子后形成的部分片段。下列叙述正确的是(　　)
[A]以上DNA片段是由4种限制酶切割后产生的
[B]②片段是在识别序列为的限制酶作用下形成的
[C]①和④两个片段在DNA聚合酶的作用下可形成重组DNA分子
[D]限制酶和DNA连接酶作用的部位都是磷酸二酯键
【答案】 D
【解析】 图中①④是同一种限制酶切割形成的,因此题中DNA片段是由3种限制酶切割后产生的;②片段是在识别序列为的限制酶作用下形成的;①④连接形成重组DNA分子需要的是DNA连接酶。
2.(2025·泰安期末)某线性DNA分子含有3 000个碱基对(bp),先用限制酶a切割,再把得到的产物用限制酶b切割,得到的DNA片段大小如下表。限制酶a和b的识别序列和切割位点如图所示。下列有关说法错误的是(　　)
a酶切割产物(bp) b酶再次切割产物(bp)
1 600;1 100;300 800;300
[A]在该DNA分子中,a酶与b酶的识别序列分别有3个和2个
[B]a酶与b酶切出的黏性末端可相互连接
[C]a酶与b酶切断的化学键均为磷酸二酯键
[D]a酶与b酶识别切割的序列不同体现了酶的专一性
【答案】 A
【解析】 分析题表可知,a酶可以把某线性DNA分子切成3段,说明该DNA分子中a酶的识别序列有2个,b酶把大小是1 600 bp的DNA切成大小分别为800 bp和800 bp 的两个片段,把大小是1 100 bp的DNA片段切成大小分别为800 bp和300 bp的两个片段,说明该DNA分子中b酶的识别序列有2个;a酶与b酶切出的黏性末端相同,用DNA连接酶可以将它们连接起来;a酶和b酶属于限制酶,限制酶切割的化学键都是磷酸二酯键;a酶与b酶识别切割的脱氧核苷酸序列不同,体现了酶的专一性。
任务二　分析载体需具备的条件和载体的选择
　　下图为大肠杆菌及质粒载体的结构模式图,据图思考下列问题。
(1)所有载体都是质粒吗
【提示】 不是;除了质粒外,载体还有动植物病毒和噬菌体等。
(2)将外源基因直接导入受体细胞可行吗 为什么
【提示】 不可行;因为目的基因直接导入受体细胞后,无法进行自我复制和稳定存在以及表达。
(3)根据标记基因的作用,有同学认为在含有某种抗生素的培养基中筛选出的存活的受体细胞不一定是导入目的基因的受体细胞,这种说法是否合理 并说明理由。
【提示】 合理;因为导入不含目的基因的载体的受体细胞也能在该培养基中存活。
核心归纳
标记基因的筛选原理
载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因,而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞,抗性基因在受体细胞内表达,受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上,能够生存的是被导入了载体的受体细胞。如图所示:
典型例题
3.(2025·广州检测)质粒是基因工程中最常用的目的基因运载工具。下列有关叙述正确的是(　　)
[A]质粒是只存在于细菌细胞质中能自我复制的小型环状双链DNA分子
[B]在所有的质粒上总能找到一个或多个限制酶切割位点
[C]携带目的基因的重组质粒只有整合到受体DNA上才会随后者的复制而复制
[D]质粒上的抗性基因常作为标记基因供重组DNA的筛选
【答案】 D
【解析】 质粒不只分布于原核生物中,在真核生物如酵母菌细胞内也有分布;并不是所有的质粒上都能找到限制酶的切割位点而成为适合运载目的基因的工具;重组质粒进入受体细胞后,可以在细胞内自我复制或整合到受体DNA上随后者的复制而复制。
4.(2025·茂名检测)某细菌质粒上有标记基因如图所示,通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转入成功。外源基因插入的位置不同,细菌在培养基上的生长情况也不同,如图是外源基因插入位置(插入点有a、b、c)示意图。请根据表中提供的细菌生长情况,推测①②③三种重组后细菌的外源基因插入点,正确的一组是(　　)
插入点 细菌在含氨苄青霉 素的培养基上的生长状况 细菌在含四环素 的培养基上的生长状况
① 能生长 能生长
② 能生长 不能生长
③ 不能生长 能生长
[A]①是c;②是b;③是a
[B]①是a和b;②是a;③是b
[C]①是a和b;②是b;③是a
[D]①是c;②是a;③是b
【答案】 A
【解析】 第①组细菌能在含氨苄青霉素的培养基上生长,说明氨苄青霉素抗性基因没有被破坏,细菌能在含四环素的培养基上生长,说明四环素抗性基因没有被破坏,由此可知,外源基因插入的位置是c;第②组细菌能在含氨苄青霉素的培养基上生长,说明氨苄青霉素抗性基因没有被破坏,细菌不能在含四环素的培养基上生长,说明四环素抗性基因被破坏,由此可知,外源基因插入位置是b;第③组细菌不能在含氨苄青霉素的培养基上生长,说明氨苄青霉素抗性基因被破坏,细菌能在含四环素的培养基上生长,说明四环素抗性基因没有被破坏,由此可知,外源基因插入的位置是a。
任务三　DNA的粗提取与鉴定
　　下图为DNA的粗提取与鉴定实验的部分操作流程。据图回答下列有关问题。
(1)选取洋葱作为实验材料时要充分地研磨,若研磨不充分,则对实验结果造成的影响是研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全,提取的DNA量变少,导致白色丝状物较少,用二苯胺试剂鉴定时蓝色不明显。兔血和鸡血提取DNA效果更好的是鸡血,理由是鸡血细胞的核DNA含量丰富,材料易得,而兔为哺乳动物,其成熟的红细胞无细胞核和线粒体,几乎不含DNA。
(2)上清液中为何要加入酒精 加入的酒精为什么要预冷
【提示】 DNA不溶于酒精,但某些蛋白质溶于酒精,利用该原理可初步分离DNA与蛋白质。酒精预冷的目的:一是抑制核酸水解酶活性,防止DNA降解;二是降低分子运动,易于形成沉淀析出;三是低温有利于增加DNA分子柔韧性,减少断裂。
(3)该实验进行了几次静置或离心,目的是什么 DNA是在上清液中还是在沉淀物中
【提示】 2次静置或离心,目的是将DNA和杂质分子分开。第1次操作后,DNA存在于上清液中;第2次操作后DNA存在于析出的白色丝状物或离心管管底的沉淀物中。
典型例题
5.下表关于“DNA的粗提取与鉴定”实验的表述,错误的是(　　)
选项 试剂 操作 作用
[A] 研磨液 与生物材料混合 提取溶 解DNA
[B] 2 mol·L-1 NaCl溶液 与提取出的DNA混合 溶解 DNA
[C] 预冷的酒精 加入离心后的上清液中 溶解 DNA
[D] 二苯胺试剂 加入溶解有DNA的 NaCl溶液中 鉴定 DNA
【答案】 C
【解析】 DNA不溶于酒精,加入预冷的酒精的目的是析出DNA。
6.某实验小组进行了“DNA的粗提取与鉴定”实验,实验流程如图所示。下列说法正确的是(　　)
[A]溶液甲是NaCl溶液,加入它的目的是溶解DNA
[B]溶液乙在使用时需用50~60 ℃水浴加热5 min
[C]实验也可用鸡血、猪血等动物组织作为材料
[D]粗提取的DNA中含有RNA、蛋白质等杂质
【答案】 D
【解析】 DNA不溶于酒精,加入溶液甲后获得的白色丝状物主要为DNA,故溶液甲为体积分数为95%的预冷的酒精;溶液乙为二苯胺试剂,使用时需要进行沸水浴加热;猪为哺乳动物,其成熟的红细胞无细胞核和线粒体,几乎不含DNA,故猪血不适合用作此实验的材料;粗提取的DNA中含有蛋白质、多糖和RNA等杂质。
随堂检测反馈
1.下列关于基因工程的叙述,错误的是(　　)
[A]基因工程的原理是基因重组,能按照人们的意愿定向改造生物的性状
[B]基因工程是在细胞水平上设计施工的,需要限制酶、DNA连接酶和载体
[C]基因工程的操作环境在生物体外,且能在不同物种间进行
[D]基因工程可以将外源基因导入不同种的生物体内,赋予生物新的遗传特性
【答案】 B
【解析】 基因工程是在DNA分子水平上设计施工的,需要限制酶、DNA连接酶和载体。
2.下列有关基因工程的工具的叙述,正确的是(　　)
[A]基因工程的载体都是质粒
[B]限制酶和其他酶一样具有专一性,只能识别特定的核苷酸序列
[C]噬菌体可以作为动物基因工程的载体
[D]天然质粒均可以直接用作载体将目的基因送入受体细胞
【答案】 B
【解析】 目前常用的载体有质粒、噬菌体和动植物病毒等;限制酶和其他酶一样具有专一性,只能识别特定的核苷酸序列,并在特定位点进行切割;噬菌体具有严格的宿主特异性,不会侵染动物细胞,因此不可作为动物基因工程的载体;天然质粒往往不能直接作为载体,要根据不同的目的和需求进行人工改造。
3.下表列举了几种限制酶的识别序列及其切割位点(箭头表示相关酶的切割位点)。下图是酶切后产生的几种末端。下列有关叙述错误的是(　　)
限制酶 AluⅠ BamHⅠ SmaⅠ Sau3AⅠ
识别序列 及其切 割位点
[A]表中4种限制酶均可破坏DNA分子中特定位置的磷酸二酯键
[B]表中4种限制酶中AluⅠ 、SmaⅠ切割目的基因后形成平末端
[C]②④⑤对应的识别序列均能被 BamHⅠ 识别并切割
[D]T4 DNA连接酶既能连接①和③,也能连接②和⑤
【答案】 C
【解析】 据图可知,②④⑤对应的识别序列均能被Sau3AⅠ识别并切割,②⑤对应的识别序列不能被BamHⅠ识别并切割,④对应的识别序列可被BamHⅠ识别并切割。
4.下列关于“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述,错误的是(　　)
[A]可选用新鲜的鸡血、猪肝等作为实验材料
[B]研磨液中2 mol/L的NaCl溶液有利于溶解DNA和去除杂质
[C]过滤液放入4 ℃冰箱或加入预冷的酒精都可抑制DNA酶的活性
[D]将析出的丝状物加入4 mL二苯胺试剂后沸水浴加热可出现蓝色
【答案】 D
【解析】 DNA粗提取实验需要选取DNA含量相对较高的材料,新鲜的鸡血、猪肝中DNA含量较高,这些材料都能用于该实验;DNA在2 mol/L的NaCl溶液中溶解度较高,研磨过滤后,DNA存在于滤液中,有利于去除杂质;将过滤液放入4 ℃冰箱或加入预冷的酒精的目的是抑制DNA酶的活性,避免DNA被水解;将析出的丝状物先溶于5 mL 2 mol/L NaCl溶液中,然后加入4 mL二苯胺试剂,混匀后沸水浴中加热可出现蓝色。
5.用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性,创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶,其中4种限制性内切核酸酶的切割位点如图所示。回答下列问题。
(1)常用的DNA连接酶有E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶。上图中　　　　　　酶切割后的DNA片段可以用E.coli DNA连接酶连接。上图中　　　　　　　　　酶切割后的DNA片段可以用T4 DNA连接酶连接。
(2)DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是　　　　　　。
(3)DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征。如质粒DNA分子上有复制原点,可以保证质粒在受体细胞中能　　　　　　;质粒DNA分子上有　　　　　　　　　　　,便于外源DNA插入;质粒DNA分子上有标记基因(如某种抗生素抗性基因),利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞,方法是　 　
。
【答案】 (1)EcoRⅠ、PstⅠ　EcoRⅠ、PstⅠ、SmaⅠ和EcoRⅤ　(2)磷酸二酯键　(3)自我复制　一个至多个限制酶的切割位点　用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞,能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞
【解析】 (1)限制酶EcoRⅠ和PstⅠ切割形成的是黏性末端,限制酶SmaⅠ和EcoRⅤ切割形成的是平末端,E.coli DNA连接酶与T4 DNA连接酶都能将双链DNA片段“缝合”起来,恢复被限制酶切开的磷酸二酯键,但E.coli DNA连接酶连接具有平末端的DNA片段的效率要远远低于T4 DNA连接酶。因此图中EcoR Ⅰ、PstⅠ切割后的DNA片段(黏性末端)可以用E.coli DNA连接酶连接,EcoRⅠ、PstⅠ、SmaⅠ和EcoRⅤ切割后的DNA片段均可以用T4 DNA连接酶连接。(2)DNA连接酶将两个DNA片段连接,形成磷酸二酯键。(3)质粒是小型环状的DNA分子,常作为基因工程中的载体,首先质粒上含有复制原点,能保证质粒在受体细胞中自我复制。质粒DNA分子上有一个至多个限制酶的切割位点,便于外源DNA的插入。利用抗生素可筛选出含质粒载体(含抗生素抗性基因)的宿主细胞,具体做法是用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞,能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞。
　　图1表示含有目的基因D的DNA片段长度(bp即碱基对)和部分碱基序列,图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列。现有MspⅠ、BamHⅠ、MboⅠ、SmaⅠ 4种限制性内切核酸酶,它们识别的碱基序列和酶切位点分别为 。
图1
图2
(1)限制性内切核酸酶切断的化学键所处的具体部位是DNA一条链上两个相邻的核苷酸之间。
(2)若用限制酶SmaⅠ完全切割图1所示DNA片段,其产物长度分别为537 bp、790bp和661bp。
(3)若图1中虚线方框内的碱基对被T—A碱基对替换,那么基因D就突变为基因d。从杂合子中分离出图1所对应的DNA片段,用限制酶SmaⅠ完全切割,产物中共有4种不同长度的DNA片段。
(4)若将图2中质粒和目的基因D通过同一种限制酶处理后进行连接,形成重组质粒,那么应选用的限制酶是BamHⅠ,理由是MspⅠ会破坏目的基因,MboⅠ会将质粒上的两个标记基因全破坏,BamHⅠ在目的基因两端和质粒的抗生素A抗性基因上有识别序列,用它处理后既能形成重组质粒,又利于筛选。
课时作业
(时间:30分钟　分值:53分)
第1~7题每题3分,第8~9题每题6分,共计33分。
基础对点练
知识点1　基因工程及其工具酶
1.(2025·宣城检测)下列关于转基因技术的叙述,错误的是(　　)
[A]能将不同物种优良性状集中到一起,定向地改造生物的遗传性状
[B]所有生物共用一套遗传密码是基因工程能够最终成功的重要前提
[C]艾弗里等人通过实验证明遗传物质是DNA可以说是基因工程的先导
[D]沃森、克里克解开了DNA复制、转录和翻译过程之谜,阐明了遗传信息流动的方向
【答案】 D
【解析】 梅塞尔森和斯塔尔用实验证明了DNA的半保留复制,克里克提出中心法则。
2.(2025·郑州检测)下列关于DNA重组技术基本工具的说法,正确的是(　　)
[A]DNA连接酶可催化脱氧核苷酸链间形成氢键
[B]限制酶切割DNA后一定能产生黏性末端
[C]病毒不能作为能将目的基因送入受体细胞的载体
[D]微生物中的限制性内切核酸酶通常对自身DNA无损害作用
【答案】 D
【解析】 DNA连接酶可催化脱氧核苷酸间形成磷酸二酯键;限制酶切割DNA后能产生黏性末端或平末端;质粒是基因工程中常用的载体,噬菌体、动植物病毒也可以作为基因工程的载体;微生物中的限制酶通常对自身DNA无损害作用,主要用于切割外源DNA。
3.如图所示的三个DNA片段依次表示EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三种限制酶的识别序列与切割位点。下列有关叙述错误的是(　　)
[A]三种限制酶切割产生的末端的长度大小相同
[B]这三种限制酶切割后形成的都是黏性末端
[C]BamHⅠ和Sau3AⅠ切割DNA片段形成的末端不能彼此连接
[D]图中的DNA片段被EcoRⅠ切割后,会增加两个游离的磷酸基团
【答案】 C
【解析】 用BamHⅠ和Sau3AⅠ切割DNA片段会形成相同的黏性末端,故BamHⅠ和Sau3AⅠ切割DNA片段形成的末端在DNA连接酶的作用下能按照碱基互补配对彼此
连接。
知识点2　基因进入受体细胞的载体
4.基因工程中常以质粒为载体,某质粒的结构如图所示,其中SmaⅠ、EcoRⅠ表示限制酶切割位点。下列相关叙述错误的是(　　)
[A]质粒是具有自我复制能力的环状双链DNA分子
[B]质粒上的限制酶切割位点可以供外源基因插入其中
[C]所有的天然质粒均可直接作为基因工程的载体
[D]除了质粒,噬菌体、动植物病毒也可作为基因工程的载体
【答案】 C
【解析】 基因工程中被用作载体的质粒,都是在天然质粒的基础上经过人工改造的。
5.质粒是基因工程中常用的分子载体。下列有关质粒的说法,错误的是(　　)
[A]在所有的质粒上都能找到一个或多个限制酶切割位点
[B]质粒的复制和表达都遵循中心法则和碱基互补配对原则
[C]质粒上的抗性基因常作为标记基因供重组DNA的鉴定和选择
[D]大多数天然质粒都需要人工改造,才可以作为载体使用
【答案】 A
【解析】 并不是在所有的质粒上都能找到一个或多个限制酶切割位点,因此有时需要人工添加;质粒的本质是DNA,质粒的复制和表达都遵循中心法则,也遵循碱基互补配对
原则。
知识点3　DNA的粗提取与鉴定
6.(2025·陕西检测)某兴趣小组利用鸡血细胞进行“DNA的粗提取与鉴定”实验,实验流程如下所示:
鸡血细胞→破碎细胞→获得滤液→去除杂质→进一步提纯→DNA鉴定
下列相关叙述正确的是(　　)
[A]若将鸡血细胞换成猪血细胞,实验效果可能会更佳
[B]将鸡血细胞置于生理盐水比置于蒸馏水中更易破碎并释放出内容物
[C]用2 mol/L的NaCl溶液提纯DNA,是因为有些蛋白质不溶于该溶液,而DNA可溶于该溶液
[D]将提取的DNA置于预冷酒精中并加入二苯胺反应,蓝色越深,说明DNA含量越高
【答案】 C
【解析】 猪血细胞中无细胞核及细胞器,不含有DNA,不能作为该实验的材料;与生理盐水相比,将鸡血细胞置于蒸馏水中,更容易吸水涨破,释放内容物;用2 mol/L的NaCl溶液提纯DNA,是因为有些蛋白质不溶于该溶液,而DNA可被该溶液溶解;DNA不溶于预冷的酒精,鉴定DNA时,应将DNA溶于2 mol/L的NaCl溶液中,且需沸水加热。
7.某同学选用新鲜洋葱为实验材料进行DNA的粗提取与鉴定实验,下列叙述错误的是(　　)
[A]研磨切碎的洋葱时加入适量的纤维素酶有利于DNA释放
[B]用预冷的体积分数为75%的酒精粗提取DNA
[C]丝状DNA能够溶解于2 mol·L-1的NaCl溶液
[D]沸水浴条件下DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色
【答案】 B
【解析】 植物细胞壁的成分主要是纤维素和果胶,研磨切碎的洋葱时加入适量的纤维素酶有利于破坏细胞壁,有利于DNA释放;DNA在95%的冷酒精中溶解度小,故向含DNA的滤液中加入预冷的体积分数为95%的酒精溶液,更有利于DNA析出;DNA在2 mol·L-1的NaCl溶液中溶解度大,故可用2 mol·L-1的NaCl溶液溶解白色丝状物DNA;二苯胺试剂可作为鉴定DNA的试剂,DNA和二苯胺试剂在沸水浴的条件下反应呈蓝色。
综合提升练
8.某细菌DNA分子上有4个Sau3AⅠ的酶切位点,经Sau3AⅠ处理后会形成4个大小不同的DNA片段。若是用BamHⅠ处理,则只会形成2个大小不同的DNA片段。Sau3AⅠ和BamHⅠ的识别序列及切割位点如下表所示。下列叙述不正确的是(　　)
限制酶名称 识别序列及切割位点
BamHⅠ G↓GATCC
Sau3AⅠ ↓GATC
[A]上述两种限制酶切割后可形成互补的黏性末端
[B]该DNA分子上有两个BamHⅠ的酶切位点
[C]黏性末端能通过T4 DNA连接酶连接
[D]若用两种酶共同处理,会形成6个大小不同的DNA片段
【答案】 D
【解析】 该DNA分子上有4个Sau3AⅠ的酶切位点,有2个BamHⅠ的酶切位点,但是BamHⅠ识别序列中包含Sau3AⅠ的识别序列,所以同时用两种酶共同处理,不会形成6个大小不同的DNA片段。
9.限制酶是重组DNA技术中重要的工具酶,下表为几种限制酶的识别序列及其切割位点,由此推断,下列说法错误的是(　　)
限制酶 名称 识别序列和 切割位点 限制酶 名称 识别序列和 切割位点
BamHⅠ 5′G↓GATCC3′ KpnⅠ 5′CGTAC↓C3′
EcoRⅠ 5′G↓AATTC3′ Sau3AⅠ 5′↓GATC3′
HindⅡ 5′GTN↓RAC3′ SmaⅠ 5′CCC↓GGG3′
BglⅡ 5′A↓GATCT3′ Acc65Ⅰ 5′G↓GTACC3′
注:N为C或T,R为A或G。
[A]表中只有HindⅡ、SmaⅠ两种限制酶可形成平末端
[B]BamHⅠ和Sau3AⅠ切割产生的DNA片段,经DNA连接酶连接后可以重新被Sau3AⅠ切割
[C]Acc65Ⅰ和KpnⅠ切割产生的黏性末端序列无法配对
[D]分别用Sau3AⅠ和BglⅡ切割同一种随机序列DNA,前者得到的片段数往往少于后者
【答案】 D
【解析】 表中只有HindⅡ、SmaⅠ两种限制酶的切割位点在识别序列的中间,所以只有HindⅡ、SmaⅠ两种限制酶可形成平末端;BamHⅠ和Sau3AⅠ切割形成的末端,可以相互连接,连接形成的DNA序列中还存在Sau3AⅠ的识别序列和切割位点,故能再被Sau3AⅠ切割;Acc65Ⅰ和KpnⅠ切割形成的黏性末端序列无法配对;Sau3AⅠ识别序列为4个碱基,而BglⅡ识别序列为6个碱基,而且Sau3AⅠ也能识别BglⅡ识别的序列,因此分别用Sau3AⅠ和BglⅡ切割同一种随机序列DNA,前者得到的片段数往往多于后者。
10.(8分)下图为DNA的粗提取与鉴定实验的相关操作。回答下列问题。
(1)图中实验材料A可以是　　　　等。
(2)将含有一定量杂质的DNA丝状物分别放入体积为2 mL的3种溶液中,经搅拌后过滤,获得下表所示的3种滤液,则含DNA最少的是滤液　　　　,原因是　　　　　　　 　
　　 　。
序号 溶液 操作 滤液
1 图中的B溶液 研磨搅拌 后过滤 E
2 物质的量浓度为 2 mol/L的NaCl溶液 搅拌后过滤 F
3 冷却的体积分数为 95%的酒精溶液 搅拌后过滤 G
(3)DNA鉴定的原理是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
【答案】 (每空2分)
(1)洋葱(合理即可)
(2)G　DNA不溶于酒精
(3)在沸水浴条件下,DNA与二苯胺试剂反应呈现蓝色
【解析】 (1)DNA的粗提取与鉴定实验中,原则上只要含有较多DNA的生物都可以作为实验材料,洋葱、菜花、香蕉、猪肝等都含有较多DNA,都可以作为该实验的材料。(2)图中B溶液为研磨液,DNA溶于研磨液中;DNA在物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液中溶解度较高,搅拌过滤后,DNA存在于得到的滤液中;DNA不溶于酒精,因此将DNA丝状物放入冷却的体积分数为95%的酒精溶液中,搅拌过滤后,DNA存在于丝状物中,滤液中几乎不含DNA,因此含DNA最少的是滤液G。(3)DNA鉴定的原理:在沸水浴的条件下,DNA与二苯胺试剂反应呈现蓝色。
11.(12分)下表中列出了几种限制性内切核酸酶的识别序列及其切割位点,图1、图2中箭头表示相关限制性内切核酸酶的切割位点。请回答下列问题。
限制性 内切核 酸酶 BamHⅠ Hind Ⅲ EcoRⅠ SmaⅠ
识别序 列及切 割位点
(1)一个图1所示的质粒分子经SmaⅠ切割前后,分别含有　　　　个游离的磷酸基团。
(2)若对图中质粒进行改造,插入的SmaⅠ识别序列越多,质粒的热稳定性越　　　　。
(3)用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒,不能使用SmaⅠ切割,原因是　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　 　　　　　。
(4)为了获取重组质粒,将切割后的质粒与目的基因片段混合,并加入　　　　酶。
(5)现使用BamHⅠ和Hind Ⅲ两种限制性内切核酸酶同时处理质粒、外源DNA,并对经拼接获得的重组质粒进行再次酶切,假设所用的酶均可将识别位点完全切开,请根据图1、图2中标示的切割位点及表中所列的识别序列,对以下酶切结果做出判断。
①采用BamHⅠ和Hind Ⅲ切割,得到　　　　种DNA片段。
②采用EcoRⅠ和Hind Ⅲ切割,得到　　　　种DNA片段。
【答案】 (每空2分)
(1)0、2　(2)高　(3)SmaⅠ会破坏质粒上的抗生素抗性基因和外源DNA中的目的基因　(4)DNA连接　(5)2　3
【解析】 (1)题图1中的质粒为环状,在没有经过SmaⅠ切割前,其不含游离的磷酸基团;当被SmaⅠ切割后,该质粒变成了一个链状DNA分子,在每条单链的5′端都含有1个游离的磷酸基团,故含有2个游离的磷酸基团。(2)SmaⅠ识别序列中含有多个C—G碱基对,含有的C—G碱基对越多,则所含的氢键越多,因此质粒的热稳定性越高。(3)当使用SmaⅠ切割时,会破坏质粒上的抗生素抗性基因和外源DNA中的目的基因。抗生素抗性基因被破坏会导致后期无法根据抗性基因筛选含重组质粒的受体细胞,目的基因被破坏则导致无法得到目的基因的表达产物。(4)要想将两个DNA片段连接在一起,需要使用DNA连接酶。(5)用BamHⅠ和Hind Ⅲ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA,并经拼接获得的重组质粒中,这两种酶的识别序列仍然完整存在,再用BamHⅠ和Hind Ⅲ两种限制酶进行切割时,可再度被切开,形成2种DNA片段;而EcoRⅠ的识别序列在原质粒中存在且没有被破坏,同时切下的含目的基因的外源DNA片段中还存在1个EcoRⅠ的识别序列,因此在重组质粒中存在2个EcoRⅠ的识别序列,用EcoRⅠ和Hind Ⅲ切割时,可得到3种DNA片段。(共66张PPT)
第1节　重组DNA技术的
基本工具
第3章　基因工程
1.阐明重组DNA技术所需的三种基本工具的作用。2.认同基因工程的诞生和发展离不开理论研究和技术创新。3.进行DNA的粗提取与鉴定。
[学习目标]
预习案·自主学习
一、基因工程的概念和诞生
1.基因工程的概念
DNA分子
遗传特性
生物类型
转基因
2.基因工程的诞生和发展
(1)基因工程的诞生。
遗传物质是DNA
DNA可以在同种生物的不同个体
DNA双螺旋
遗传物质自我复制
密码子
限制
DNA连接
逆转录
质粒
重组DNA
之间转移
(2)基因工程的发展。
重组人胰岛素
PCR
人类基因组
基因组编辑
原核生物
二、基因工程的操作工具
1.限制性内切核酸酶——
“分子手术刀”
数千
特定核苷酸序列
磷酸二
酯键
DNA片段
2.DNA连接酶——“分子缝合针”
(1)作用:将两个 连接起来,恢复被限制酶切开的 。
磷酸二酯键
(2)种类。
种类 来源 作用特点
大肠杆菌 这两类酶都能将双链DNA片段连接起来,但E.coli DNA连接酶连接具有 的DNA片段的效率要远远低于T4 DNA连接酶
T4噬菌体
E.coli DNA连接酶
T4 DNA连接酶
平末端
3.基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
(1)常用载体——质粒。
拟核
自我复制
环状双链DNA分子
自
限制酶切割位点
标记基因
我复制或整合到
受体DNA上
(2)其他载体: 、动植物病毒等。
(3)不同载体区别:不同载体的来源不同,在 、 、 以及可以插入外源DNA片段的 上也有很大差别。
噬菌体
大小
结构
复制方式
大小
三、DNA的粗提取与鉴定
1.实验原理
酒精
NaCl
2mol/L
蓝色
2.方法步骤
研磨液
上清液
酒精
2mol/L的NaCl
二苯胺
判断正误
(1)基因工程的原理是基因重组,利用基因工程可以实现定向变异。(　　)
(2)限制性内切核酸酶均能特异性地识别6个核苷酸序列。(　　)
√
【提示】 大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成,也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。
×
(3)DNA连接酶能将两碱基通过氢键连接起来。(　　)
【提示】 DNA连接酶能将两个DNA片段连接起来,恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
×
(4)作为载体的质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因。(　　)
×
【提示】 作为载体的质粒通常采用抗生素抗性基因作为筛选标记基因。
(5)载体的种类有质粒、噬菌体、动植物病毒等,其中动植物病毒必须是DNA病毒。(　　)
√
(6)DNA粗提取时,洋葱研磨液经纱布过滤后,应在-4 ℃冰箱中放置几分钟。
(　　)
【提示】 DNA粗提取时,洋葱研磨液经纱布过滤后,应在4 ℃冰箱中放置几分钟。
×
探究案·互动探究
任务一　分析基因工程的理论基础和工具酶
探究1　分析基因工程的理论基础,提高理解能力
生长激素释放抑制激素可用于治疗肢端肥大症,最初只能从动物下丘脑提取。科学家以质粒为载体,将相关基因转入大肠杆菌。利用改造后的工程菌生产的该激素价格降为原来的几百分之一。在构建工程菌的过程中,需要获取生长激素释放抑制激素基因,并将其与质粒DNA拼接为重组DNA分子,再导入大肠杆菌中表达合成生长激素释放抑制激素。请分析以上材料并回答有关问题。
(1)为什么不同生物的DNA分子能拼接起来
【提示】 ①DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸。
②DNA分子都遵循碱基互补配对原则。
③双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构。
(2)为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞中表达
【提示】 ①基因是控制生物性状的遗传物质的结构和功能单位。
②遗传信息的传递都遵循中心法则。
③生物界共用一套遗传密码。
(3)基因工程操作导致的基因重组与有性生殖中的基因重组的主要区别是什么
【提示】 ①有性生殖中的基因重组是随机的,并且只能在同一物种间进行。
②利用基因工程可以在不同物种间进行基因重组,并且方向性强,可以定向地改变生物的性状。
探究2　分析限制性内切核酸酶和DNA连接酶的作用
有2个不同来源的DNA片段A和B,A片段用限制酶SpeⅠ进行切割,B片段分别用限制酶Hind Ⅲ、XbaⅠ、EcoRⅤ和XhoⅠ进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如图。
(1)请写出限制酶SpeⅠ、Hind Ⅲ、XbaⅠ和XhoⅠ切割形成的黏性末端。
【提示】
(2)同种限制酶切割产生的黏性末端是否相同 不同限制酶切割产生的黏性末端是否一定不同
【提示】 同种限制酶切割产生的黏性末端相同;不同的限制酶切割可能会产生相同的黏性末端。
(3)哪种限制酶切割B片段产生的DNA片段能与限制酶SpeⅠ切割A片段产生的DNA片段相连接 为什么 连接完成后,该重组DNA分子的新连接处能否再被所用的限制酶识别 为什么
【提示】 限制酶XbaⅠ;因为XbaⅠ与SpeⅠ切割产生的黏性末端相同。重组DNA分子不能再被所用的限制酶识别;因为所用的两种限制酶均不能识别该重组DNA分子的新连接处的脱氧核苷酸序列。
(4)DNA连接酶与DNA聚合酶的作用不同,下图为两种酶的作用示意图:
两种酶作用的不同点是DNA聚合酶的作用是
,DNA连接酶的作用是 。
将单个的脱氧核苷酸连接到已
经形成的脱氧核苷酸链上
连接两个双链DNA片段
「核心归纳」
五种酶的比较
种类 作用底物 作用部位 形成产物
限制酶 双链 DNA分子 磷酸 二酯键 具有黏性末端
或平末端的双
链DNA片段
DNA 连接酶 双链 DNA片段 磷酸 二酯键 重组
DNA分子
DNA 聚合酶 脱氧核苷酸 和DNA片段 磷酸二 酯键 子代DNA
分子
解旋酶 双链 DNA分子 碱基对中 的氢键 单链
DNA分子
DNA (水解)酶 DNA分子 磷酸二 酯键 游离的脱
氧核苷酸
「典型例题」
1.(2025·广州检测)下图是几种不同限制酶切割DNA分子后形成的部分片段。下列叙述正确的是(　　)
D
[A]以上DNA片段是由4种限制酶切割后产生的
[C]①和④两个片段在DNA聚合酶的作用下可形成重组DNA分子
[D]限制酶和DNA连接酶作用的部位都是磷酸二酯键
2.(2025·泰安期末)某线性DNA分子含有3 000个碱基对(bp),先用限制酶a切割,再把得到的产物用限制酶b切割,得到的DNA片段大小如下表。限制酶a和b的识别序列和切割位点如图所示。下列有关说法错误的是(　　)
A
a酶切割产物(bp) b酶再次切割产物(bp)
1 600;1 100;300 800;300
[A]在该DNA分子中,a酶与b酶的识别序列分别有3个和2个
[B]a酶与b酶切出的黏性末端可相互连接
[C]a酶与b酶切断的化学键均为磷酸二酯键
[D]a酶与b酶识别切割的序列不同体现了酶的专一性
【解析】 分析题表可知,a酶可以把某线性DNA分子切成3段,说明该DNA分子中a酶的识别序列有2个,b酶把大小是1 600 bp的DNA切成大小分别为800 bp和800 bp 的两个片段,把大小是1 100 bp的DNA片段切成大小分别为800 bp和300 bp的两个片段,说明该DNA分子中b酶的识别序列有2个;
a酶与b酶切出的黏性末端相同,用DNA连接酶可以将它们连接起来;a酶和b酶属于限制酶,限制酶切割的化学键都是磷酸二酯键;a酶与b酶识别切割的脱氧核苷酸序列不同,体现了酶的专一性。
任务二　分析载体需具备的条件和载体的选择
下图为大肠杆菌及质粒载体的结构模式图,据图思考下列问题。
(1)所有载体都是质粒吗
【提示】 不是;除了质粒外,载体还有动植物病毒和噬菌体等。
(2)将外源基因直接导入受体细胞可行吗 为什么
【提示】 不可行;因为目的基因直接导入受体细胞后,无法进行自我复制和稳定存在以及表达。
(3)根据标记基因的作用,有同学认为在含有某种抗生素的培养基中筛选出的存活的受体细胞不一定是导入目的基因的受体细胞,这种说法是否合理 并说明理由。
【提示】 合理;因为导入不含目的基因的载体的受体细胞也能在该培养基中存活。
「核心归纳」
标记基因的筛选原理
载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因,而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞,抗性基因在受体细胞内表达,受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上,能够生存的是被导入了载体的受体细胞。如图所示:
「典型例题」
3.(2025·广州检测)质粒是基因工程中最常用的目的基因运载工具。下列有关叙述正确的是(　　)
[A]质粒是只存在于细菌细胞质中能自我复制的小型环状双链DNA分子
[B]在所有的质粒上总能找到一个或多个限制酶切割位点
[C]携带目的基因的重组质粒只有整合到受体DNA上才会随后者的复制而复制
[D]质粒上的抗性基因常作为标记基因供重组DNA的筛选
D
【解析】 质粒不只分布于原核生物中,在真核生物如酵母菌细胞内也有分布;并不是所有的质粒上都能找到限制酶的切割位点而成为适合运载目的基因的工具;重组质粒进入受体细胞后,可以在细胞内自我复制或整合到受体DNA上随后者的复制而复制。
4.(2025·茂名检测)某细菌质粒上有标记基因如图所示,通过标记基因可以推知外源基因
(目的基因)是否转入成功。外源基因插入的位置不同,细菌在培养基上的生长情况也不
同,如图是外源基因插入位置(插入点有a、b、c)示意图。请根据表中提供的细菌生长情况,推测①②③三种重组后细菌的外源基因插入点,正确的一组是(　　)
A
插入点 细菌在含氨苄青霉 素的培养基上的生长状况 细菌在含四环素
的培养基上的生长状况
① 能生长 能生长
② 能生长 不能生长
③ 不能生长 能生长
[A]①是c;②是b;③是a [B]①是a和b;②是a;③是b
[C]①是a和b;②是b;③是a [D]①是c;②是a;③是b
【解析】 第①组细菌能在含氨苄青霉素的培养基上生长,说明氨苄青霉素抗性基因没有被破坏,细菌能在含四环素的培养基上生长,说明四环素抗性基因没有被破坏,由此可知,外源基因插入的位置是c;第②组细菌能在含氨苄青霉素的培养基上生长,说明氨苄青霉素抗性基因没有被破坏,细菌不能在含四环素的培养基上生长,说明四环素抗性基因被破坏,由此可知,外源基因插入位置是b;第③组细菌不能在含氨苄青霉素的培养基上生长,说明氨苄青霉素抗性基因被破坏,细菌能在含四环素的培养基上生长,说明四环素抗性基因没有被破坏,由此可知,外源基因插入的位置是a。
任务三　DNA的粗提取与鉴定
下图为DNA的粗提取与鉴定实验的部分操作流程。据图回答下列有关
问题。
(1)选取洋葱作为实验材料时要充分地研磨,若研磨不充分,则对实验结果造成的影响是
。兔血和鸡血提取DNA效果更好的是鸡血,理由是
。
研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全,提取的DNA量变
少,导致白色丝状物较少,用二苯胺试剂鉴定时蓝色不明显
鸡血细胞的核DNA含量丰富,材料易得,
而兔为哺乳动物,其成熟的红细胞无细胞核和线粒体,几乎不含DNA
(2)上清液中为何要加入酒精 加入的酒精为什么要预冷
【提示】 DNA不溶于酒精,但某些蛋白质溶于酒精,利用该原理可初步分离DNA与蛋白质。酒精预冷的目的:一是抑制核酸水解酶活性,防止DNA降解;二是降低分子运动,易于形成沉淀析出;三是低温有利于增加DNA分子柔韧性,减少断裂。
(3)该实验进行了几次静置或离心,目的是什么 DNA是在上清液中还是在沉淀物中
【提示】 2次静置或离心,目的是将DNA和杂质分子分开。第1次操作后,
DNA存在于上清液中;第2次操作后DNA存在于析出的白色丝状物或离心管管底的沉淀物中。
「典型例题」
5.下表关于“DNA的粗提取与鉴定”实验的表述,错误的是(　　)
选项 试剂 操作 作用
[A] 研磨液 与生物材料混合 提取溶解DNA
[B] 2 mol·L-1 NaCl溶液 与提取出的DNA混合 溶解DNA
[C] 预冷的酒精 加入离心后的上清液中 溶解DNA
[D] 二苯胺试剂 加入溶解有DNA的 NaCl溶液中 鉴定DNA
C
【解析】 DNA不溶于酒精,加入预冷的酒精的目的是析出DNA。
6.某实验小组进行了“DNA的粗提取与鉴定”实验,实验流程如图所示。下列说法正确的是(　　)
[A]溶液甲是NaCl溶液,加入它的目的是溶解DNA
[B]溶液乙在使用时需用50~60 ℃水浴加热5 min
[C]实验也可用鸡血、猪血等动物组织作为材料
[D]粗提取的DNA中含有RNA、蛋白质等杂质
D
【解析】 DNA不溶于酒精,加入溶液甲后获得的白色丝状物主要为DNA,故溶液甲为体积分数为95%的预冷的酒精;溶液乙为二苯胺试剂,使用时需要进行沸水浴加热;猪为哺乳动物,其成熟的红细胞无细胞核和线粒体,几乎不含DNA,故猪血不适合用作此实验的材料;粗提取的DNA中含有蛋白质、多糖和RNA等杂质。
思维导图
随堂检测反馈
1.下列关于基因工程的叙述,错误的是(　　)
[A]基因工程的原理是基因重组,能按照人们的意愿定向改造生物的性状
[B]基因工程是在细胞水平上设计施工的,需要限制酶、DNA连接酶和
载体
[C]基因工程的操作环境在生物体外,且能在不同物种间进行
[D]基因工程可以将外源基因导入不同种的生物体内,赋予生物新的遗传特性
B
【解析】 基因工程是在DNA分子水平上设计施工的,需要限制酶、DNA连接酶和载体。
2.下列有关基因工程的工具的叙述,正确的是(　　)
[A]基因工程的载体都是质粒
[B]限制酶和其他酶一样具有专一性,只能识别特定的核苷酸序列
[C]噬菌体可以作为动物基因工程的载体
[D]天然质粒均可以直接用作载体将目的基因送入受体细胞
B
【解析】 目前常用的载体有质粒、噬菌体和动植物病毒等;限制酶和其他酶一样具有专一性,只能识别特定的核苷酸序列,并在特定位点进行切割;噬菌体具有严格的宿主特异性,不会侵染动物细胞,因此不可作为动物基因工程的载体;天然质粒往往不能直接作为载体,要根据不同的目的和需求进行人工改造。
3.下表列举了几种限制酶的识别序列及其切割位点(箭头表示相关酶的切割位点)。下图是酶切后产生的几种末端。下列有关叙述错误的是(　　)
C
限制酶 AluⅠ BamHⅠ SmaⅠ Sau3AⅠ
识别序列 及其切 割位点
[A]表中4种限制酶均可破坏DNA分子中特定位置的磷酸二酯键
[B]表中4种限制酶中AluⅠ 、SmaⅠ切割目的基因后形成平末端
[C]②④⑤对应的识别序列均能被 BamHⅠ 识别并切割
[D]T4 DNA连接酶既能连接①和③,也能连接②和⑤
【解析】 据图可知,②④⑤对应的识别序列均能被Sau3AⅠ识别并切割,②⑤对应的识别序列不能被BamHⅠ识别并切割,④对应的识别序列可被BamHⅠ识别并切割。
4.下列关于“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述,错误的是(　　)
[A]可选用新鲜的鸡血、猪肝等作为实验材料
[B]研磨液中2 mol/L的NaCl溶液有利于溶解DNA和去除杂质
[C]过滤液放入4 ℃冰箱或加入预冷的酒精都可抑制DNA酶的活性
[D]将析出的丝状物加入4 mL二苯胺试剂后沸水浴加热可出现蓝色
D
【解析】 DNA粗提取实验需要选取DNA含量相对较高的材料,新鲜的鸡血、猪肝中DNA含量较高,这些材料都能用于该实验;DNA在2 mol/L的NaCl溶液中溶解度较高,研磨过滤后,DNA存在于滤液中,有利于去除杂质;将过滤液放入4 ℃冰箱或加入预冷的酒精的目的是抑制DNA酶的活性,避免DNA被水解;将析出的丝状物先溶于5 mL 2 mol/L NaCl溶液中,然后加入4 mL二苯胺试剂,混匀后沸水浴中加热可出现蓝色。
(1)常用的DNA连接酶有E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶。上图中
　　　　 　　酶切割后的DNA片段可以用E.coli DNA连接酶连接。上图中　　　　　 　　　　酶切割后的DNA片段可以用T4 DNA连接酶连接。
5.用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性,创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶,其中4种限制性内切核酸酶的切割位点如图所示。回答下列问题。
EcoRⅠ、PstⅠ
EcoRⅠ、PstⅠ、SmaⅠ和EcoRⅤ
【解析】 (1)限制酶EcoRⅠ和PstⅠ切割形成的是黏性末端,限制酶SmaⅠ和EcoRⅤ切割形成的是平末端,E.coli DNA连接酶与T4 DNA连接酶都能将双链DNA片段“缝合”起来,恢复被限制酶切开的磷酸二酯键,但E.coli DNA连接酶连接具有平末端的DNA片段的效率要远远低于T4 DNA连接酶。因此图中EcoR Ⅰ、PstⅠ切割后的DNA片段(黏性末端)可以用E.coli DNA连接酶连接,
EcoRⅠ、PstⅠ、SmaⅠ和EcoRⅤ切割后的DNA片段均可以用T4 DNA连接酶连接。
(2)DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是
　　　　　　。
磷酸二酯键
【解析】 (2)DNA连接酶将两个DNA片段连接,形成磷酸二酯键。
(3)DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征。如质粒DNA分子上有复制原点,可以保证质粒在受体细胞中能　　　 　　　;质粒DNA分子上有　　　　　　 　　　　　,便于外源DNA插入;质粒DNA分子上有标记基因(如某种抗生素抗性基因),利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞,方法是
　 。
自我复制
一个至多个限制酶的切割位点
用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞,能够存活的
即为含有质粒载体的宿主细胞
【解析】 (3)质粒是小型环状的DNA分子,常作为基因工程中的载体,首先质粒上含有复制原点,能保证质粒在受体细胞中自我复制。质粒DNA分子上有一个至多个限制酶的切割位点,便于外源DNA的插入。利用抗生素可筛选出含质粒载体(含抗生素抗性基因)的宿主细胞,具体做法是用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞,能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞。
联系实际 迁移应用
图1
图2
(1)限制性内切核酸酶切断的化学键所处的具体部位是
。
(2)若用限制酶SmaⅠ完全切割图1所示DNA片段,其产物长度分别为537 bp、
bp和 bp。
DNA一条链上两个相
邻的核苷酸之间
790
661
图1
(3)若图1中虚线方框内的碱基对被T—A碱基对替换,那么基因D就突变为基因d。从杂合子中分离出图1所对应的DNA片段,用限制酶SmaⅠ完全切割,产物中共有 种不同长度的DNA片段。
4
图1
(4)若将图2中质粒和目的基因D通过同一种限制酶处理后进行连接,形成重组质粒,那么应选用的限制酶是 ,理由是
。
BamHⅠ
图2
MspⅠ会破坏目的基因,
MboⅠ会将质粒上的两个标记基因全破坏,BamHⅠ在目的基因两端和质粒
的抗生素A抗性基因上有识别序列,用它处理后既能形成重组质粒,又利于筛选第1节　重组DNA技术的基本工具
课时作业
(时间:30分钟　分值:53分)
第1~7题每题3分,第8~9题每题6分,共计33分。
基础对点练
知识点1　基因工程及其工具酶
1.(2025·宣城检测)下列关于转基因技术的叙述,错误的是(　　)
[A]能将不同物种优良性状集中到一起,定向地改造生物的遗传性状
[B]所有生物共用一套遗传密码是基因工程能够最终成功的重要前提
[C]艾弗里等人通过实验证明遗传物质是DNA可以说是基因工程的先导
[D]沃森、克里克解开了DNA复制、转录和翻译过程之谜,阐明了遗传信息流动的方向
【答案】 D
【解析】 梅塞尔森和斯塔尔用实验证明了DNA的半保留复制,克里克提出中心法则。
2.(2025·郑州检测)下列关于DNA重组技术基本工具的说法,正确的是(　　)
[A]DNA连接酶可催化脱氧核苷酸链间形成氢键
[B]限制酶切割DNA后一定能产生黏性末端
[C]病毒不能作为能将目的基因送入受体细胞的载体
[D]微生物中的限制性内切核酸酶通常对自身DNA无损害作用
【答案】 D
【解析】 DNA连接酶可催化脱氧核苷酸间形成磷酸二酯键;限制酶切割DNA后能产生黏性末端或平末端;质粒是基因工程中常用的载体,噬菌体、动植物病毒也可以作为基因工程的载体;微生物中的限制酶通常对自身DNA无损害作用,主要用于切割外源DNA。
3.如图所示的三个DNA片段依次表示EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三种限制酶的识别序列与切割位点。下列有关叙述错误的是(　　)
[A]三种限制酶切割产生的末端的长度大小相同
[B]这三种限制酶切割后形成的都是黏性末端
[C]BamHⅠ和Sau3AⅠ切割DNA片段形成的末端不能彼此连接
[D]图中的DNA片段被EcoRⅠ切割后,会增加两个游离的磷酸基团
【答案】 C
【解析】 用BamHⅠ和Sau3AⅠ切割DNA片段会形成相同的黏性末端,故BamHⅠ和Sau3AⅠ切割DNA片段形成的末端在DNA连接酶的作用下能按照碱基互补配对彼此
连接。
知识点2　基因进入受体细胞的载体
4.基因工程中常以质粒为载体,某质粒的结构如图所示,其中SmaⅠ、EcoRⅠ表示限制酶切割位点。下列相关叙述错误的是(　　)
[A]质粒是具有自我复制能力的环状双链DNA分子
[B]质粒上的限制酶切割位点可以供外源基因插入其中
[C]所有的天然质粒均可直接作为基因工程的载体
[D]除了质粒,噬菌体、动植物病毒也可作为基因工程的载体
【答案】 C
【解析】 基因工程中被用作载体的质粒,都是在天然质粒的基础上经过人工改造的。
5.质粒是基因工程中常用的分子载体。下列有关质粒的说法,错误的是(　　)
[A]在所有的质粒上都能找到一个或多个限制酶切割位点
[B]质粒的复制和表达都遵循中心法则和碱基互补配对原则
[C]质粒上的抗性基因常作为标记基因供重组DNA的鉴定和选择
[D]大多数天然质粒都需要人工改造,才可以作为载体使用
【答案】 A
【解析】 并不是在所有的质粒上都能找到一个或多个限制酶切割位点,因此有时需要人工添加;质粒的本质是DNA,质粒的复制和表达都遵循中心法则,也遵循碱基互补配对
原则。
知识点3　DNA的粗提取与鉴定
6.(2025·陕西检测)某兴趣小组利用鸡血细胞进行“DNA的粗提取与鉴定”实验,实验流程如下所示:
鸡血细胞→破碎细胞→获得滤液→去除杂质→进一步提纯→DNA鉴定
下列相关叙述正确的是(　　)
[A]若将鸡血细胞换成猪血细胞,实验效果可能会更佳
[B]将鸡血细胞置于生理盐水比置于蒸馏水中更易破碎并释放出内容物
[C]用2 mol/L的NaCl溶液提纯DNA,是因为有些蛋白质不溶于该溶液,而DNA可溶于该溶液
[D]将提取的DNA置于预冷酒精中并加入二苯胺反应,蓝色越深,说明DNA含量越高
【答案】 C
【解析】 猪血细胞中无细胞核及细胞器,不含有DNA,不能作为该实验的材料;与生理盐水相比,将鸡血细胞置于蒸馏水中,更容易吸水涨破,释放内容物;用2 mol/L的NaCl溶液提纯DNA,是因为有些蛋白质不溶于该溶液,而DNA可被该溶液溶解;DNA不溶于预冷的酒精,鉴定DNA时,应将DNA溶于2 mol/L的NaCl溶液中,且需沸水加热。
7.某同学选用新鲜洋葱为实验材料进行DNA的粗提取与鉴定实验,下列叙述错误的是(　　)
[A]研磨切碎的洋葱时加入适量的纤维素酶有利于DNA释放
[B]用预冷的体积分数为75%的酒精粗提取DNA
[C]丝状DNA能够溶解于2 mol·L-1的NaCl溶液
[D]沸水浴条件下DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色
【答案】 B
【解析】 植物细胞壁的成分主要是纤维素和果胶,研磨切碎的洋葱时加入适量的纤维素酶有利于破坏细胞壁,有利于DNA释放;DNA在95%的冷酒精中溶解度小,故向含DNA的滤液中加入预冷的体积分数为95%的酒精溶液,更有利于DNA析出;DNA在2 mol·L-1的NaCl溶液中溶解度大,故可用2 mol·L-1的NaCl溶液溶解白色丝状物DNA;二苯胺试剂可作为鉴定DNA的试剂,DNA和二苯胺试剂在沸水浴的条件下反应呈蓝色。
综合提升练
8.某细菌DNA分子上有4个Sau3AⅠ的酶切位点,经Sau3AⅠ处理后会形成4个大小不同的DNA片段。若是用BamHⅠ处理,则只会形成2个大小不同的DNA片段。Sau3AⅠ和BamHⅠ的识别序列及切割位点如下表所示。下列叙述不正确的是(　　)
限制酶名称 识别序列及切割位点
BamHⅠ G↓GATCC
Sau3AⅠ ↓GATC
[A]上述两种限制酶切割后可形成互补的黏性末端
[B]该DNA分子上有两个BamHⅠ的酶切位点
[C]黏性末端能通过T4 DNA连接酶连接
[D]若用两种酶共同处理,会形成6个大小不同的DNA片段
【答案】 D
【解析】 该DNA分子上有4个Sau3AⅠ的酶切位点,有2个BamHⅠ的酶切位点,但是BamHⅠ识别序列中包含Sau3AⅠ的识别序列,所以同时用两种酶共同处理,不会形成6个大小不同的DNA片段。
9.限制酶是重组DNA技术中重要的工具酶,下表为几种限制酶的识别序列及其切割位点,由此推断,下列说法错误的是(　　)
限制酶 名称 识别序列和 切割位点 限制酶 名称 识别序列和 切割位点
BamHⅠ 5′G↓GATCC3′ KpnⅠ 5′CGTAC↓C3′
EcoRⅠ 5′G↓AATTC3′ Sau3AⅠ 5′↓GATC3′
HindⅡ 5′GTN↓RAC3′ SmaⅠ 5′CCC↓GGG3′
BglⅡ 5′A↓GATCT3′ Acc65Ⅰ 5′G↓GTACC3′
注:N为C或T,R为A或G。
[A]表中只有HindⅡ、SmaⅠ两种限制酶可形成平末端
[B]BamHⅠ和Sau3AⅠ切割产生的DNA片段,经DNA连接酶连接后可以重新被Sau3AⅠ切割
[C]Acc65Ⅰ和KpnⅠ切割产生的黏性末端序列无法配对
[D]分别用Sau3AⅠ和BglⅡ切割同一种随机序列DNA,前者得到的片段数往往少于后者
【答案】 D
【解析】 表中只有HindⅡ、SmaⅠ两种限制酶的切割位点在识别序列的中间,所以只有HindⅡ、SmaⅠ两种限制酶可形成平末端;BamHⅠ和Sau3AⅠ切割形成的末端,可以相互连接,连接形成的DNA序列中还存在Sau3AⅠ的识别序列和切割位点,故能再被Sau3AⅠ切割;Acc65Ⅰ和KpnⅠ切割形成的黏性末端序列无法配对;Sau3AⅠ识别序列为4个碱基,而BglⅡ识别序列为6个碱基,而且Sau3AⅠ也能识别BglⅡ识别的序列,因此分别用Sau3AⅠ和BglⅡ切割同一种随机序列DNA,前者得到的片段数往往多于后者。
10.(8分)下图为DNA的粗提取与鉴定实验的相关操作。回答下列问题。
(1)图中实验材料A可以是　　　　等。
(2)将含有一定量杂质的DNA丝状物分别放入体积为2 mL的3种溶液中,经搅拌后过滤,获得下表所示的3种滤液,则含DNA最少的是滤液　　　　,原因是　　　　　　　 　
　　 　。
序号 溶液 操作 滤液
1 图中的B溶液 研磨搅拌 后过滤 E
2 物质的量浓度为 2 mol/L的NaCl溶液 搅拌后过滤 F
3 冷却的体积分数为 95%的酒精溶液 搅拌后过滤 G
(3)DNA鉴定的原理是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
【答案】 (每空2分)
(1)洋葱(合理即可)
(2)G　DNA不溶于酒精
(3)在沸水浴条件下,DNA与二苯胺试剂反应呈现蓝色
【解析】 (1)DNA的粗提取与鉴定实验中,原则上只要含有较多DNA的生物都可以作为实验材料,洋葱、菜花、香蕉、猪肝等都含有较多DNA,都可以作为该实验的材料。(2)图中B溶液为研磨液,DNA溶于研磨液中;DNA在物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液中溶解度较高,搅拌过滤后,DNA存在于得到的滤液中;DNA不溶于酒精,因此将DNA丝状物放入冷却的体积分数为95%的酒精溶液中,搅拌过滤后,DNA存在于丝状物中,滤液中几乎不含DNA,因此含DNA最少的是滤液G。(3)DNA鉴定的原理:在沸水浴的条件下,DNA与二苯胺试剂反应呈现蓝色。
11.(12分)下表中列出了几种限制性内切核酸酶的识别序列及其切割位点,图1、图2中箭头表示相关限制性内切核酸酶的切割位点。请回答下列问题。
限制性 内切核 酸酶 BamHⅠ Hind Ⅲ EcoRⅠ SmaⅠ
识别序 列及切 割位点
(1)一个图1所示的质粒分子经SmaⅠ切割前后,分别含有　　　　个游离的磷酸基团。
(2)若对图中质粒进行改造,插入的SmaⅠ识别序列越多,质粒的热稳定性越　　　　。
(3)用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒,不能使用SmaⅠ切割,原因是　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　 　　　　　。
(4)为了获取重组质粒,将切割后的质粒与目的基因片段混合,并加入　　　　酶。
(5)现使用BamHⅠ和Hind Ⅲ两种限制性内切核酸酶同时处理质粒、外源DNA,并对经拼接获得的重组质粒进行再次酶切,假设所用的酶均可将识别位点完全切开,请根据图1、图2中标示的切割位点及表中所列的识别序列,对以下酶切结果做出判断。
①采用BamHⅠ和Hind Ⅲ切割,得到　　　　种DNA片段。
②采用EcoRⅠ和Hind Ⅲ切割,得到　　　　种DNA片段。
【答案】 (每空2分)
(1)0、2　(2)高　(3)SmaⅠ会破坏质粒上的抗生素抗性基因和外源DNA中的目的基因　(4)DNA连接　(5)2　3
【解析】 (1)题图1中的质粒为环状,在没有经过SmaⅠ切割前,其不含游离的磷酸基团;当被SmaⅠ切割后,该质粒变成了一个链状DNA分子,在每条单链的5′端都含有1个游离的磷酸基团,故含有2个游离的磷酸基团。(2)SmaⅠ识别序列中含有多个C—G碱基对,含有的C—G碱基对越多,则所含的氢键越多,因此质粒的热稳定性越高。(3)当使用SmaⅠ切割时,会破坏质粒上的抗生素抗性基因和外源DNA中的目的基因。抗生素抗性基因被破坏会导致后期无法根据抗性基因筛选含重组质粒的受体细胞,目的基因被破坏则导致无法得到目的基因的表达产物。(4)要想将两个DNA片段连接在一起,需要使用DNA连接酶。(5)用BamHⅠ和Hind Ⅲ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA,并经拼接获得的重组质粒中,这两种酶的识别序列仍然完整存在,再用BamHⅠ和Hind Ⅲ两种限制酶进行切割时,可再度被切开,形成2种DNA片段;而EcoRⅠ的识别序列在原质粒中存在且没有被破坏,同时切下的含目的基因的外源DNA片段中还存在1个EcoRⅠ的识别序列,因此在重组质粒中存在2个EcoRⅠ的识别序列,用EcoRⅠ和Hind Ⅲ切割时,可得到3种DNA片段。

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