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第2课时　将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定
课时作业
(时间:30分钟　分值:54分)
第1～6题每题3分,第7～8题每题6分,共计30分。
基础对点练
知识点1　将目的基因导入受体细胞
1.我国科学家独创的花粉管通道法,可以使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞,是一种十分简便经济的方法,对此认识正确的是(　　)
[A]不必构建表达载体就可以直接导入
[B]此方法可用于转基因动物
[C]受体细胞只能是植物的卵细胞
[D]有时可以取代农杆菌转化法
【答案】 D
【解析】 要让目的基因进入受体细胞后能稳定存在并得以表达,不管采用什么导入方法,都需要构建基因表达载体才能实现;花粉管通道法只适用于转基因植物的培育;采用花粉管通道法时,植物受体细胞一般是受精卵。
2.(2025·新余检测)下图表示转基因动、植物的培育过程。下列有关叙述不正确的是(　　)
[A]受体细胞A只能是绵羊的体细胞
[B]②过程中需要进行胚胎移植操作
[C]可采用花粉管通道法将目的基因导入受体细胞B
[D]③过程中一般需要生长素和细胞分裂素
【答案】 A
【解析】 培育转基因动物时,受体细胞A一般是该种动物的受精卵。
3.农杆菌能侵染双子叶植物而对大多数单子叶植物没有侵染能力,是因为受伤的双子叶植物能分泌某些酚类物质诱导Ti质粒中的Vir基因区段表达,该表达产物能诱导Ti质粒产生一条新的TDNA单链分子,此单链分子可进入植物细胞并整合到染色体上。下列相关叙述错误的是(　　)
[A]可以通过在伤口处施加相关酚类物质而使单子叶植物也成为农杆菌易感植物
[B]农杆菌侵染宿主细胞的原理与肺炎链球菌转化实验的原理类似
[C]使用农杆菌转化法时,目的基因应插入Ti质粒的TDNA中
[D]合成新的TDNA单链需要的DNA连接酶与限制酶,均在宿主细胞内合成
【答案】 D
【解析】 由题意可知,某些酚类物质能诱导农杆菌TDNA进入植物细胞,而多数单子叶植物细胞不能合成这些酚类化合物,可以通过在伤口处施加相关酚类物质而使单子叶植物也成为农杆菌易感植物;农杆菌侵染宿主细胞是把它的TDNA通过转化作用,整合到植物细胞染色体的DNA上,其原理与肺炎链球菌转化实验的原理类似,都是基因重组;农杆菌的转化作用可将插入Ti质粒的TDNA中的目的基因转移到植物细胞中,并能整合到其染色体DNA上;合成新的TDNA单链不需要限制酶,需要DNA聚合酶、DNA连接
酶等。
知识点2　目的基因的检测与鉴定
4.目的基因导入受体细胞后,需要检测目的基因是否可以维持稳定和表达其遗传特性。下列关于目的基因的检测和鉴定的叙述,正确的是(　　)
[A]目的基因能否在受体细胞中稳定遗传的关键是能否转录出mRNA
[B]可采用PCR检测目的基因是否转录和翻译
[C]可从转基因生物中提取蛋白质来检测目的基因是否翻译成相应蛋白质
[D]抗虫、抗病检验用于确定转基因生物是否具备相关性状属于分子水平的检测
【答案】 C
【解析】 目的基因导入受体细胞后,首先要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因,这是目的基因能否在受体细胞中稳定遗传的关键;PCR可用于检测目的基因是否转录,检测目的基因是否翻译用抗原—抗体杂交技术;抗虫、抗病检验用于确定转基因生物是否具备相关性状属于个体生物学水平的鉴定。
5.利用外源基因在受体细胞中表达,可生产人类所需要的产品。下列各项中能说明目的基因完成了在受体细胞中表达的是(　　)
[A]番茄细胞中检测到鱼的抗冻蛋白
[B]大肠杆菌中检测到人干扰素基因的mRNA
[C]山羊乳腺细胞中检测到人生长激素的DNA序列
[D]酵母菌细胞中提取到人胰岛素基因
【答案】 A
【解析】 番茄细胞中检测到鱼的抗冻蛋白,说明目的基因已经成功导入受体细胞,并且目的基因在受体细胞中已经完成表达;大肠杆菌中检测到人干扰素基因的mRNA,说明目的基因已经成功转录,但不能说明目的基因已经完成表达;山羊乳腺细胞中检测到人生长激素的DNA序列,说明目的基因已经导入受体细胞,但不能说明目的基因已经完成表达;酵母菌细胞中提取到人胰岛素基因,说明目的基因已经成功导入,但未必成功表达。
6.研究者将含有乳铁蛋白肽基因和人干扰素基因的DNA片段加上标记物后分别制成探针,与从转基因奶牛的乳腺细胞、口腔上皮细胞、蹄部细胞中提取的mRNA分别进行杂交,结果如下表所示。下列叙述正确的是(　　)
探针 乳腺细胞 口腔上皮 细胞 蹄部细胞
乳铁蛋白肽基因探针 出现 杂交带 未出现 杂交带 未出现 杂交带
人干扰素基因探针 出现 杂交带 出现 杂交带 出现 杂交带
[A]乳铁蛋白肽基因可在转基因奶牛的多种体细胞中表达
[B]人干扰素基因可在转基因奶牛的多种体细胞中表达
[C]表中两种基因探针所含的脱氧核苷酸的序列相同
[D]乳铁蛋白肽基因和人干扰素基因都是mRNA片段
【答案】 B
【解析】 由表可知,乳铁蛋白肽基因探针只在乳腺细胞出现了杂交带,不能在转基因奶牛多种体细胞中表达;据表格信息可知,人干扰素基因探针在三种细胞中都出现了杂交带,说明该基因可以在转基因奶牛的全身多种体细胞中表达;表中两种基因探针所含的脱氧核苷酸的序列不同,才会出现不同的杂交结果;乳铁蛋白肽基因和人干扰素基因都是特定的DNA片段。
综合提升练
7.科学家将人的生长激素基因与某种细菌(不含抗生素抗性基因)的DNA分子进行重组,并成功地在该细菌中得以表达(如图)。下列相关叙述错误的是(　　)
[A]过程①合成人生长激素基因的过程需要用到逆转录酶
[B]过程③是将重组质粒溶于缓冲液后与经Ca2+处理的细菌B混合
[C]成功导入了重组质粒的细菌B在含有氨苄青霉素的培养基上不能生长
[D]可采用抗原—抗体杂交技术检测工程菌中生长激素基因是否成功表达
【答案】 C
【解析】 重组质粒上四环素抗性基因被破坏,氨苄青霉素抗性基因未被破坏,因此成功导入了重组质粒的细菌B,在含有四环素的培养基上不能生长,在含氨苄青霉素的培养基上能生长。
8.除草剂的有效成分草甘膦能够专一性抑制EPSP合酶的作用,从而使植物多种代谢途径受影响而导致植物死亡。草甘膦没有选择性,除掉杂草的同时作物也会受损。培育抗草甘膦作物是解决办法之一。下列关于转入外源EPSP合酶基因使矮牵牛抗草甘膦流程的叙述,正确的是(　　)
[A]可以通过mRNA在逆转录酶的作用下形成cDNA,可获取EPSP合酶基因
[B]用限制酶和DNA连接酶处理目的基因和Ti质粒,仅涉及磷酸二酯键的断裂和形成
[C]基因表达载体组件中的起始密码子是RNA聚合酶识别和结合的部位,驱动基因转录
[D]目的基因插入Ti质粒的TDNA上,农杆菌的转化使植物细胞都能培育出转基因植株
【答案】 A
【解析】 mRNA在逆转录酶的作用下形成cDNA,从中可获取目的基因;用限制酶和DNA连接酶处理目的基因和Ti质粒,涉及碱基之间的氢键和DNA片段之间的磷酸二酯键的断裂和形成;起始密码子位于mRNA上,RNA聚合酶识别的位点是基因中的启动子;携带目的基因的TDNA可转移到受体细胞并整合到受体细胞染色体的DNA上,但不能保证目的基因导入率为100%,所以农杆菌的转化不能使植物细胞都培育出转基因植株。
9.(12分)(2025·宜春期末)我国科学家将蓝藻ictB蛋白(能高效转运和浓缩CO2)的基因
(ictB基因)与水稻叶绿体基因组中PSbA基因的启动子(叶片特异性表达)连接成重组DNA,然后将重组DNA与B质粒构建成表达载体,再导入水稻叶肉细胞的叶绿体中,最终成功获得了转ictB基因水稻,提高了水稻的产量。在ictB基因表达载体的构建中,含PSbA启动子和ictB基因的重组DNA分子和B质粒的酶切位点如图所示。回答下列问题。
(1)可以利用PCR技术从蓝藻DNA中扩增ictB基因,前提是　　　　　　　　　　。扩增过程需加入两种引物,经过5次循环后,形成的产物中同时含两种引物的DNA所占比例为　 　　　。
(2)为使重组DNA分子能定向插入B质粒的相应区段中,可在重组DNA分子两端添加限制酶识别序列,据图可知,M端应添加　　　　限制酶识别序列,N端应添加　　　　限制酶识别序列,经过酶切的重组DNA分子和Ti质粒进行连接时,可选用　　　　　　　　(填“E.coli DNA连接酶”或“T4 DNA连接酶”)。
(3)利用　　　　　　　技术,科研人员鉴定出4个成功表达了ictB蛋白的水稻株系,检测ictB蛋白时应选用水稻的叶片为材料,理由是　 　, 欲确定4个株系是否达到预期目标,还需要进行　　　　水平的鉴定。
【答案】 (除标注外,每空1分)
(1)已知目的基因两端部分脱氧核苷酸序列　(2分)
(2)BglⅡ(2分)　EcoRⅤ(2分)　T4 DNA连接酶
(3)抗原—抗体杂交　PSbA基因的启动子是叶片特异性启动子,它使ictB基因只能选择性地在叶片中表达(2分)　个体生物学
【解析】 (1)利用PCR技术从蓝藻DNA中扩增ictB基因的前提是已知目的基因两端部分脱氧核苷酸序列;经过5次循环后,总的DNA分子数目为25,即32个,同时含有两种引物的DNA分子所占的比例为(25-2)÷25=。
(2)据图可知,目的基因中有BamHⅠ的酶切位点,故不能选择BamHⅠ,又因为Sau3AⅠ也可识别BamHⅠ的酶切位点,故也不能选择该酶,由于SpeⅠ能切割PSbA启动子,不能选择,故只能选择BglⅡ和EcoRⅤ,再根据启动子的方向可知,M端应添加限制酶BglⅡ的识别序列,N端应添加限制酶EcoRⅤ的识别序列;EcoRⅤ酶切后是平末端,而T4 DNA连接酶既能连接黏性末端也能连接平末端,且连接平末端的效率大于E.coli DNA连接酶,故经过酶切的重组DNA分子和Ti质粒进行连接时,可选用T4 DNA连接酶。
(3)利用抗原—抗体杂交技术,科研人员鉴定出4个成功表达了ictB蛋白的水稻株系,检测ictB蛋白时应选用水稻的叶片为材料,理由是PSbA基因的启动子是叶片特异性启动子,它使ictB基因只能选择性地在叶片中表达;欲确定4个株系是否达到预期目标,还需要进行个体生物学水平的鉴定。
10.(12分)(2025·烟台检测)普通棉花中β甘露糖苷酶基因(GhManA2)表达出的β甘露糖苷酶能催化半纤维素降解,使棉纤维长度变短。为了培育长绒棉,科研人员构建了反义GhManA2基因表达载体,获得了转基因长绒棉新品种,具体过程如图所示,SmaⅠ、NotⅠ、HindⅢ和BamHⅠ表示酶切位点,LB为TDNA左边界,RB为TDNA右边界。回答下列问题。
(1)过程①中不用限制酶NotⅠ的原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。GhManA2的序列中包含内含子等序列,可增大重组质粒的相对分子质量,使导入效率降低,请提出一个解决此问题的方案:　 　。
(2)过程②中在培养基中添加　　　　可将含有重组质粒的农杆菌筛选出来。需将反义表达载体TDNA区段的　　　　　　　　片段整合到棉花细胞的染色体DNA上,并使之在翻译过程中起作用。
(3)过程③将目的基因导入棉花细胞后,可采用　　　　　　　　技术从分子水平上检测目的基因是否插入染色体DNA中;个体水平上的检测为　 。
(4)由图分析可知,转基因长绒棉棉纤维较普通棉棉纤维长的原因是 　。
【答案】 (除标注外,每空2分)
(1)限制酶NotⅠ会破坏目的基因,且质粒上没有NotⅠ的切割位点　从棉花细胞中提取GhManA2基因转录的mRNA,逆转录获得cDNA
(2)抗生素(1分)　E6启动子和GhManA2基因
(3)PCR(1分)　观察转基因棉花的棉纤维是否变长
(4)转基因长绒棉细胞内的反义GhManA2基因转录的mRNA能与细胞内的GhManA2基因转录的mRNA互补配对,从而抑制该基因的表达,使植物缺少β甘露糖苷酶,半纤维素不被降解,从而使转基因长绒棉的棉纤维长于普通棉花
【解析】 (1)由于限制酶NotⅠ会破坏目的基因,且质粒上没有NotⅠ的切割位点,因此过程①中不用限制酶NotⅠ;基因转录形成的mRNA不含内含子对应序列,故从棉花细胞中提取GhManA2基因转录的mRNA,再逆转录获得cDNA,以此为目的基因,可减小重组质粒的相对分子质量,解决导入效率低的问题。(2)过程②中在培养基中添加抗生素可将含有重组质粒的农杆菌筛选出来;需将反义表达载体TDNA区段的E6启动子和GhManA2基因片段整合到棉花细胞的染色体中,有利于目的基因的转录,以在翻译过程中起作用。(3)过程③中将目的基因导入棉花细胞后,可采用PCR技术从分子水平上检测目的基因是否插入染色体DNA中;个体水平上的检测为观察植株是否表现相应性状,即棉纤维是否变长。(4)分析题图,由启动子的方向可知,反义GhManA2基因转录的mRNA可与棉花细胞内的GhManA2基因转录的mRNA互补配对,从而抑制GhManA2基因转录的mRNA翻译成
β甘露糖苷酶,使半纤维素不被降解,因此转基因长绒棉的棉纤维长于普通棉花。(共39张PPT)
第3课时　DNA片段的扩增及电泳鉴定
尝试进行PCR的基本操作,并用电泳鉴定PCR的产物。
[学习目标]
预习案·自主学习
一、实验原理
1.DNA片段的扩增
PCR利用了 原理,通过调节 来控制DNA双链的
。
DNA的热变性
温度
解聚与结合
2.琼脂糖凝胶电泳
(1)DNA分子具有可解离的基团,在一定的pH下,这些基团可以带上
。在 的作用下,这些带电分子会向着
的电极移动,这个过程就是电泳。
(2)在凝胶中DNA分子的迁移速率与
等有关。
(3)凝胶中的DNA分子通过染色,可以在 下被检测出来。
正电荷或负电荷
电场
与它所带电荷相反
凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象
波长为300 nm的紫外灯
二、方法步骤
1.DNA片段的扩增
微量移液器
微量离心管
离心机
反应
液
2.PCR扩增产物的电泳鉴定
琼脂
核酸染料
加
糖
样孔
提醒　DNA的相对分子质量越小,迁移速率越快。
电泳缓冲液
加
指示分
指示剂
紫外灯
样孔
子大小的标准参照物
判断正误
(1)利用PCR扩增DNA片段时,在第一轮循环的变性之前,通常要用94 ℃的高温处理反应液5 min进行预变性。(　　)
√
(2)PCR中离心的目的是让反应组分在离心管中分层分布。(　　)
×
【提示】 PCR中离心的目的是使反应液集中在管的底部。
(3)电泳时加入指示剂的作用是显示电泳进度,指示剂到达凝胶边缘时,停止电泳。(　　)
×
【提示】 电泳时待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时,停止电泳。
(4)电泳时,DNA的相对分子质量越大,迁移速率相对越慢。(　　)
√
探究案·互动探究
任务一　分析实验的原理和操作过程
利用PCR可以在体外进行DNA片段的扩增,扩增获得的DNA片段需要进行分离、鉴定和纯化。自从琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶被引入核酸研究以来,按相对分子质量大小分离DNA的凝胶电泳技术已经发展成为一种分析鉴定DNA分子的重要实验手段。
(1)为什么PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压蒸汽灭菌处理
【提示】 避免外源DNA等因素的污染。
(2)PCR仪设置预变性的目的是什么
【提示】 增加大分子模板DNA彻底变性的概率。
(3)影响琼脂糖凝胶电泳过程中DNA迁移速率的因素有哪些
【提示】 DNA分子的大小和构象、凝胶的浓度等。
(4)核酸染料、指示剂分别加在哪里 它们的作用分别是什么
【提示】 核酸染料加在琼脂糖凝胶中,其可与DNA形成复合物,在波长为300 nm的紫外灯下发荧光,便于DNA的检测;指示剂加在凝胶载样缓冲液中,其作为电泳进度的指示分子,便于确定电泳停止时间。
「典型例题」
1.下列有关电泳的叙述,错误的是(　　)
[A]电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程
[B]待测样品中DNA分子的大小和构象、凝胶的浓度等都会影响DNA在电泳中的迁移速率
[C]进行电泳时,带电分子会向着与其所带电荷相同的电极移动
[D]PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定
C
【解析】 由于同性相斥、异性相吸,带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。
2.(2025·扬州检测)关于“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验,下列说法错误的是(　　)
[A]PCR体系中G—C碱基对含量多、少,将影响使DNA解链的所需温度
[B]实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压蒸汽灭菌处理
[C]扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液混匀后需缓慢注入加样孔以防样品飘散
[D]待指示剂前沿迁移到达凝胶加样孔边缘时需停止电泳以防DNA跑出
凝胶
D
【解析】 G—C碱基对含有3个氢键,DNA片段中G—C碱基对含量越多,使DNA解链的所需温度越高;PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压蒸汽灭菌处理,避免外源DNA等因素的污染;将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合,再用微量移液器将混合液缓慢注入加样孔,以防样品飘散;应待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时停止电泳,以防止样品流失到缓冲液中。
任务二　实验结果及原因分析
基因工程操作中,科研人员利用PCR技术扩增DNA,下图为不同循环次数获得的DNA的电泳结果,请思考并回答下列问题。
(1)若操作者进行电泳鉴定的结果不止一条条带,则产生这种结果的原因是什么
【提示】 ①模板DNA出现污染;②引物特异性不强或形成引物二聚体;③Mg2+浓度过高;④复性时的温度过低等。
(2)若PCR产物电泳时未出现扩增条带,其主要原因有哪些
【提示】 ①Taq DNA聚合酶失活;②引物出现质量问题;③Mg2+浓度过低;
④变性时的温度低,变性时间短。
「典型例题」
3.某实验利用PCR技术获取目的基因,实验结果显示除目的基因条带(引物与模板完全配对)外,还有 2条非特异条带(引物和模板不完全配对)。为了减少非特异条带的产生,以下措施中有效的是(　　)
[A]增加模板DNA的量
[B]延长热变性的时间
[C]延长延伸的时间
[D]提高复性的温度
D
【解析】 增加模板DNA的量可以提高反应速度,但不能有效减少非特异条带的产生;延长热变性的时间和延长延伸的时间会影响变性、延伸过程,但对于复性过程中引物与模板的配对影响不大,故不能有效减少非特异条带的产生;非特异条带增加的原因可能是复性温度过低,造成引物与模板的结合位点增加,故可通过提高复性的温度来减少非特异条带的产生。
4. (2025·广州检测)用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时,得到以下电泳图谱,其中1号为DNA标准样液(Marker),10号为无菌蒸馏水,PCR时加入的模板DNA如图所示。据此作出的分析,不合理的是(　　)
[A]PCR产物的分子大小在250～500 bp之间
[B]3号样品为不含目的基因的载体DNA
[C]9号样品对应植株不是所需的转基因植株
[D]10号确定反应体系等对结果没有干扰
B
【解析】 4～9号是转基因植株,理论上应包含目的基因,结合2号野生型植株和10号蒸馏水组的结果,推测包含目的基因的片段大小应为250～500 bp;
3号PCR结果包含250～500 bp片段,应包含目的基因;9号PCR结果不包含250～500 bp片段,所以不是所需转基因植株;10号放入蒸馏水,可排除反应体系等对结果的干扰。
思维导图
随堂检测反馈
1.下列关于PCR扩增DNA片段及电泳鉴定的叙述,正确的是(　　)
[A]PCR反应体系中需要加入解旋酶来解开双链DNA
[B]引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则,其长度越长越好
[C]在PCR循环过程中,延伸阶段需要的温度比变性阶段高
[D]琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA时,DNA分子的迁移速率与其大小有关
D
【解析】 PCR扩增中双链DNA在高温条件下可自动解开,不需要解旋酶;引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则,但其长度并非越长越好,引物过长容易形成二聚体,导致扩增失败;在PCR循环过程中,延伸阶段需要的温度比变性阶段低;琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA时,DNA分子的迁移速率与DNA分子的大小、凝胶的浓度等因素有关。
2.(2024·黑吉辽卷)关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验,下列叙述正确的是(　　)
[A]琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小
[B]凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置
[C]在同一电场作用下,DNA片段越长,向负极迁移速率越快
[D]琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来
A
【解析】 琼脂糖凝胶的浓度会影响DNA分子在凝胶中的迁移率和分辨率,琼脂糖凝胶的浓度通常是根据所需分离的DNA片段大小来选择的。对于较大的DNA片段,比如基因组DNA或质粒DNA,通常选择较低浓度的琼脂糖凝胶,因为它们需要更大的孔径来有效迁移。而对于较小的DNA片段,比如PCR产物或酶切片段,则需要选择较高浓度的琼脂糖凝胶,以提供更好的分辨率和分离效果; 凝胶载样缓冲液指示剂通常是一种颜色较深的染料,可以作为电泳进度的指示分子, 指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时,停止电泳;在琼脂糖凝胶电泳中,当电场作用时,DNA片段实际上是向正极迁移的,而不是向负极迁移。同时,DNA片段的迁移速率与其大小成反比,即DNA片段越长,迁移速率越慢;琼脂糖凝胶中的DNA分子需在波长为300 nm的紫外灯下检测。
3.关于“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验,下列相关叙述正确的是(　　)
[A]PCR仪实质上就是一台能自动调控温度的仪器,但在使用时需根据扩增的DNA片段以及引物的情况人工设定合适的温度
[B]PCR反应体系中需加入耐高温的DNA聚合酶,该酶主要在复性过程中起作用
[C]为避免外源DNA等因素的污染,PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水和移液器等在使用前都必须进行高压蒸汽灭菌处理
[D]电泳时,电泳缓冲液不能没过凝胶,以免凝胶加样孔中的电泳样液流出
A
【解析】 PCR反应体系中需加入耐高温的DNA聚合酶,该酶主要在延伸过程中起作用;为避免外源DNA等因素的污染,PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水等在使用前都必须进行高压蒸汽灭菌处理,移液器不需要高压蒸汽灭菌处理;电泳时,电泳缓冲液以没过凝胶1 mm 为宜。
4.下列关于PCR操作过程的叙述,错误的是(　　)
[A]在进行操作时,一定要戴好一次性手套
[B]PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份,在-20 ℃储存
[C]将PCR所用缓冲液和酶从冰箱拿出,需放在高温环境中迅速融化
[D]在向微量离心管中添加反应组分时,每吸取一种试剂后,移液器上的枪头都必须更换
C
【解析】 将PCR所用缓冲液和酶从冰箱拿出,需放在冰块上缓慢融化。
5.(2025·全国卷)琼脂糖凝胶电泳常用于核酸样品的分析,样品1～4的电泳结果如图所示(“+”“-”分别代表电泳槽的阳极和阴极)。已知样品1和2中的DNA分子分别是甲和乙,甲只有限制酶R的一个酶切位点,样品3和4中有一个样品是甲的酶切产物。下列叙述错误的是(　　)
[A]配制琼脂糖凝胶时需选用适当的缓冲溶液
[B]该实验条件下甲、乙两种DNA分子均带负电荷
[C]甲、乙两种DNA分子所含碱基对的数量可能不同
[D]据图推测样品3可能是甲被酶R完全酶切后的产物
D
【解析】 配制琼脂糖凝胶时选用适当缓冲溶液(电泳缓冲液),以维持电泳过程pH的稳定,保证核酸分子正常移动;电泳时,样品向“+”极移动,说明在该实验条件下甲、乙两种DNA分子均带负电荷;电泳中,DNA分子的迁移速率与分子大小、构象等多种因素有关。甲、乙电泳条带位置虽然相同,但碱基对的数量可能不同;甲只有限制酶R的一个酶切位点,若被酶R完全酶切,只会得到2种DNA片段(2个条带),这2个条带的碱基对数量比甲要少,电泳时移动速度更快,所以据图推测样品4可能是甲被酶R完全酶切后的产物。
联系实际 迁移应用
抗菌肽通常是由短氨基酸序列构成的小肽,具有广谱的杀菌活性,利用基因工程生产抗菌肽的难题之一是大肠杆菌能识别外源蛋白并将其水解。某科研小组将抗菌肽基因与大肠杆菌自身的半乳糖苷酶基因连接,组成融合基因,通过质粒构建基因表达载体并导入大肠杆菌中,以获得大量的抗菌肽。
图1、图2分别为融合基因和该实验所用质粒的结构示意图,请回答下列
问题。
注:EcoRⅠ、SmaⅠ、BamHⅠ、HindⅢ为能产生不同末端的限制酶, AmpR为氨苄青霉素抗性基因,TetR为四环素抗性基因。
(1)常用PCR技术获得大量的融合基因,PCR反应中的每次循环可分为变性、复性、 三步,扩增反应体系应添加引物、模板、含Mg2+的缓冲液、
、四种脱氧核苷酸等。引物的作用是
。
(2)分析图1可知,利用 PCR 技术扩增融合基因时,应选择的引物是
,循环 5次共需要消耗 个引物。
延伸
耐高温的DNA聚合酶
使DNA聚合
酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸
引物2和
引物4
62
(3)为构建重组质粒并保证基因能定向插入质粒中,需选择限制酶
切割质粒和含融合基因的DNA片段;为确定重组质粒是否构建成功,用上述选择的限制酶分别对融合基因PCR 产物、质粒和重组质粒进行完全酶切,再进行电泳,结果如图 3 所示。若重组质粒构建成功,请在图 3 中将酶切结果对应位置的条带涂黑。
BamHⅠ和
HindⅢ
【提示】(共46张PPT)
第2课时　将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定
1.阐明将目的基因导入受体细胞的方法。2.阐明目的基因的检测与鉴定的方法。
[学习目标]
预习案·自主学习
一、将目的基因导入受体细胞
1.将目的基因导入植物细胞
(1)花粉管通道法。
①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入 中。
②在植物受粉后的一定时间内,剪去柱头,将DNA溶液滴加在花柱切面上,使目的基因借助 进入 。
子房
花粉管通道
胚囊
(2)农杆菌转化法。
双子叶
裸子
T-DNA
染色体DNA
Ti质粒的T-DNA
2.将目的基因导入动物细胞
(1)方法: 技术。
(2)受体细胞: 。
3.将目的基因导入原核细胞
Ca2+处理法:用 处理细胞,使细胞处于一种
的生理状态,再将重组的基因表达载体导入其中。
显微注射
受精卵
Ca2+
能吸收周围环境中DNA
分子
二、目的基因的检测与鉴定
染色体DNA
目的基因
mRNA
抗原—抗体
判断正误
(1)将重组表达载体导入动物受精卵常用显微注射法。(　　)
√
(2)为培育抗除草剂的作物新品种,导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体细胞。(　　)
×
【提示】 为培育抗除草剂的作物新品种,受体细胞可以是受精卵,也可以是体细胞。
(3)Ti质粒上的T-DNA可转移到植物细胞内,并且与其染色体DNA整合在一起。(　　)
√
(4)转基因抗虫棉植株抗虫效果的鉴定必须通过分子检测才能达到目的。
(　　)
【提示】 抗虫效果的鉴定要在个体生物学水平上做抗虫接种实验来鉴定。
×
(5)检测目的基因是否成功表达可用抗原—抗体杂交技术。(　　)
√
(6)用PCR技术检测目的基因是否转录出mRNA,利用了碱基互补配对原则。
(　　)
√
探究案·互动探究
任务一　分析目的基因导入受体细胞的方法
转化是指目的基因进入受体细胞内,并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。受体细胞不同,采用的导入方法也不同。常见的方法有农杆菌转化法、花粉管通道法、显微注射法以及用Ca2+处理等。下面为利用农杆菌转化法制备转基因植物的过程图。
(1)在用农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞的过程中,将目的基因插入Ti质粒的T-DNA上的原因是什么
【提示】 Ti质粒上的T-DNA(可转移的DNA)可转移至被侵染的细胞,并且整合到该细胞的染色体DNA上。
(2)将基因表达载体导入农杆菌细胞时,应怎样处理农杆菌细胞
【提示】 用Ca2+处理农杆菌细胞,使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,利于重组质粒的导入。
(3)用花粉管通道法导入受体细胞的目的基因是否需要和载体结合,原因是什么
【提示】 需要,目的基因只有和载体结合成基因表达载体才能在受体细胞中稳定存在和表达。
「核心归纳」
1.目的基因导入不同受体细胞的方法
2.农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入
(1)第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上,第二次拼接(非人工直接操作)是指插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上。
(2)第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌(Ca2+处理法),第二次
导入(非人工直接操作)是指含目的基因的T-DNA导入受体细胞(农杆菌转化法)。
「典型例题」
1.我国科学家在进行抗虫棉的培育过程中独创了“花粉管通道法”,该方法有多种操作方式。如图表示花粉管通道法介导植物基因转移。下列相关说法错误的是(　　)
[A]除图示方法外,还可用微量注射器将含目的
基因的DNA溶液直接注入子房中
[B]通过该方法获得转基因植物可避免植物组织培养这一操作
[C]必须在雌蕊成熟时才能进行图中所示的处理方法
[D]外源DNA不需要构建基因表达载体,就能借助花粉管通道进入受体细胞并表达
D
【解析】 利用花粉管通道法时,也要先构建基因表达载体,然后基因表达载体借助花粉管通道进入受体细胞并表达。
2.(2025·广州检测)下图表示培育转基因抗植物病毒番茄的过程示意图。下列叙述正确的是(　　)
[A]过程A需要限制性内切核酸酶和DNA聚合酶的参与
[B]过程B通常需要用CaCl2溶液处理,以提高番茄细胞壁的通透性
[C]过程C需要采用植物组织培养技术
[D]抗植物病毒基因一旦整合到番茄细胞的染色体上,就能正常表达
C
【解析】 图中过程A为构建基因表达载体,需要用到限制酶和DNA连接酶,而不需要DNA聚合酶;过程B表示Ti质粒上的T-DNA转移到被侵染的植物细胞,并整合到该细胞染色体DNA上,利用的是农杆菌转化法;过程C表示由一个植物细胞得到一个完整植株的过程,一般要采用植物组织培养技术;抗植物病毒基因整合到番茄细胞的染色体上,不一定能正常表达。
任务二　分析目的基因的检测与鉴定的方法
抗虫棉中的“杀虫基因”就是培育转基因抗虫棉的目的基因——Bt抗虫蛋白基因。Bt基因进入受体细胞后,是否稳定维持和表达其遗传特性,只有通过检测与鉴定才能知道,这是检测转基因抗虫棉是否培育成功的重要一步。
(1)用什么方法检测棉花的染色体DNA上是否插入了Bt基因或检测Bt基因是否转录出了mRNA
【提示】 利用PCR等技术检测棉花的染色体DNA中是否插入了Bt基因或检测Bt基因是否转录出了mRNA。
(2)如果棉花中插入的Bt基因转录成功,是否一定能够翻译出相应的蛋白质呢 如何从分子水平进行检测
【提示】 不一定成功翻译。可从转基因棉花中提取蛋白质,用相应的抗体进行抗原—抗体杂交。
(3)如何在个体生物学水平鉴定转基因抗虫棉是否培育成功
【提示】 用导入Bt抗虫蛋白基因的棉花叶片饲喂棉铃虫,观察棉铃虫是否死亡。
「核心归纳」
1.目的基因的检测与鉴定
2.个体水平上鉴定转基因生物的方法举例
转基因生物 鉴定方法 观察目标
抗虫植物 害虫吞食 害虫是否死亡
抗病植物 病毒(菌)感染 是否出现病斑
抗盐植物 盐水浇灌 是否正常生长
抗除草剂植物 喷洒除草剂 是否正常生长
「典型例题」
3.(2025·白城检测)下列哪一种方法不能用于检测目的基因是否成功导入或表达(　　)
[A]在显微镜下直接观察受体细胞中是否含有目的基因
[B]通过PCR等技术检测受体细胞的DNA分子上是否含有目的基因
[C]提取受体细胞合成的相应蛋白质,利用抗原—抗体特异性反应进行检测
[D]抗虫基因导入植物细胞后,检测植物是否具有抗虫特性
A
【解析】 在显微镜下无法直接观察到基因,无法检测目的基因是否成功导入或表达;对受体细胞的DNA进行PCR技术检测,可以检测受体细胞DNA上是否插入了目的基因;利用抗原—抗体杂交技术可以检测目的基因是否翻译成相应蛋白质;检测植物是否具有抗虫特性,属于个体生物学水平的鉴定。
4.(2025·济宁检测)科学家将苏云金杆菌中的Bt抗虫蛋白基因导入棉花的愈伤组织细胞并进行组织培养获得棉花植株。经棉铃虫饲喂实验,发现棉花植株并无抗虫性状,科学家提取棉花叶片细胞中的有关成分进行了如下操作。下列有关分析错误的是(　　)
[A]提取细胞中的蛋白质,采用抗原—抗体杂交技术进行检测,若检测到细胞中无Bt抗虫蛋白,则说明抗虫基因不能表达
[B]若经A检测确定细胞中无Bt抗虫蛋白,可采用PCR等技术检测细胞中的RNA,若检测到Bt抗虫蛋白的mRNA,则说明抗虫基因能正常转录和翻译
[C]若经B检测确定细胞中无Bt抗虫蛋白的mRNA,可采用PCR等技术检测细胞中的DNA,若能检测到抗虫基因,则可能是抗虫基因反向插入载体中或抗虫基因不能正常转录
[D]若经C检测确定细胞中无抗虫基因,则可能是将没有目的基因的载体DNA分子导入了受体细胞
B
【解析】 若经A检测确定细胞中无Bt抗虫蛋白,可采用PCR等技术检测细胞中的RNA,若能检测到Bt抗虫蛋白的mRNA,则可能是Bt抗虫蛋白基因能转录,但不能正常翻译出蛋白质。
思维导图
随堂检测反馈
1.(2025·茂名检测)受体细胞不同,将目的基因导入受体细胞的方法也不相同,下列受体细胞与导入方法匹配错误的一项是(　　)
B
选项 受体细胞 导入方法
[A] 棉花细胞 花粉管通道法
[B] 大肠杆菌 农杆菌转化法
[C] 羊受精卵 显微注射法
[D] 番茄细胞 农杆菌转化法
【解析】 Ca2+能使大肠杆菌的生理状态发生改变,使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,所以将目的基因导入大肠杆菌细胞应采用Ca2+处理法。
2.下图表示利用农杆菌的Ti质粒构建基因表达载体的过程。下列相关叙述错误的是(　　)
[A]目的基因只有插入启动子和终止子之间才能进行复制
[B]采用同种限制酶切割目的基因和质粒可能会出现两种重组质粒
[C]构建基因表达载体是培育转基因生物的核心工作
[D]目的基因插入T-DNA的非必需区域是为了防止破坏T-DNA的转移特性
A
【解析】 目的基因随质粒(含复制原点)一同复制,或整合到受体DNA上,随受体DNA同步复制,目的基因插入启动子和终止子之间的目的是使其能正常转录。
3.(2025·常州检测)下列关于将目的基因导入受体细胞的叙述,错误的是
(　　)
[A]用一定浓度的CaCl2溶液处理大肠杆菌,以改变大肠杆菌细胞的生理状态
[B]将目的基因转入微生物细胞常用显微注射技术
[C]对于动物来说,受体细胞一般是受精卵
[D]通过基因工程大量获得胰岛素时,受体细胞选择酵母菌比大肠杆菌更有优势
B
【解析】 将目的基因转入微生物细胞常用Ca2+处理法。
4.下列用于判断目的基因是否转移成功的方法,不属于分子水平的检测的是
(　　)
[A]通过观察害虫吃棉叶是否死亡
[B]通过PCR检测棉花的染色体DNA上是否插入抗虫基因
[C]检测转基因生物细胞中是否转录出相应的mRNA
[D]从转基因生物中提取蛋白质,利用抗原—抗体杂交检测是否翻译成功
A
【解析】 通过观察害虫吃棉叶是否死亡,属于个体生物学水平的鉴定。
5.荔枝生产中常受病虫害的困扰。科研人员运用生物工程技术培育转基因抗虫荔枝的过程如图所示。回答下列问题。
(1)科研人员培育转基因抗虫荔枝的过程运用的生物工程主要是
　　　　　 　　。
基因工程和细胞工程
【解析】 (1)培育转基因抗虫荔枝的过程需要应用基因工程获取含有抗虫基因的荔枝细胞,再利用细胞工程将转基因荔枝细胞培育成转基因抗虫荔枝植株。
(2)根据图中抗虫基因和质粒的限制酶的切割位点分析,在基因表达载体构建过程中,使用　　　　和　　　　对含抗虫基因的DNA片段和质粒进行切割。将重组质粒转入农杆菌操作过程中,操作液中含有的　　　　(填物质)便于农杆菌吸收质粒DNA,然后将该农杆菌置于含　　　　　　　　培养基中培养,从而筛选出含重组质粒的农杆菌。
SalⅠ
HindⅢ
Ca2+
氨苄青霉素
【解析】 (2)在基因表达载体构建过程中,BamHⅠ会破坏目的基因,所以可以用SalⅠ、HindⅢ两种限制酶对含抗虫基因的DNA片段和质粒进行切割;将重组质粒转入农杆菌操作过程中,操作液中含有的Ca2+可以使农杆菌处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,便于农杆菌吸收质粒DNA,由于重组质粒中含有氨苄青霉素抗性基因,因此可以将该农杆菌置于含氨苄青霉素培养基中培养,从而筛选出含重组质粒的农杆菌。
(3)目的基因进入荔枝细胞后,是否稳定维持和表达需要进行检测和鉴定。请写出分子水平的检测过程或方法:①
　。 ②
　　　　　　　　　　　　　　　　。
通过PCR等技术检测荔枝细胞的染色体DNA上是否含有抗虫基因或检测抗虫基因是否转录出相应的mRNA
从转基因抗虫荔枝中提取蛋白质,用抗原—抗体杂交法检测抗虫基因是否翻译成抗虫蛋白
【解析】 (3)目的基因进入荔枝细胞后,是否稳定维持和表达需要进行检测与鉴定,分子水平的检测有:①通过PCR等技术检测荔枝细胞的染色体DNA上是否含有抗虫基因或检测抗虫基因是否转录出相应的mRNA;②从转基因抗虫荔枝中提取蛋白质,用抗原—抗体杂交法检测抗虫基因是否翻译成抗虫蛋白。
联系实际 迁移应用
研究发现,StP5CS基因能促进脯氨酸的大量合成,进而提高植物耐盐碱能力。某研究小组利用基因工程等技术将茄子的StP5CS基因导入结球甘蓝细胞中,培育出了耐盐碱的结球甘蓝转基因新品种,实验流程如图所示。回答下列问题。
(1)在PCR体系中应加入 才能特异性扩增出StP5CS基因。StP5CS基因转录时,以 (填“a链”或“b链”)作为模板链。
(2)Ⅰ～Ⅴ是5种限制酶切割的位点。将StP5CS基因和Ti质粒构建重组质粒时,宜选用的限制酶组合是 。步骤②中常使用 处理农杆菌,促进重组质粒的转化。
StP5CS基因的引物
b链
Ⅰ和Ⅲ
Ca2+
(3)双丙氨膦是一种除草剂,Bar是其抗性基因。步骤⑤的目的是
。经抗原—抗体杂交阳性的转基因植株,通过 及 评价转基因结球甘蓝的抗性。
初步筛选
含重组质粒的结球甘蓝植株
检测植株的脯氨酸含量
将植株种植在盐碱地,观察其生长情况第2课时　将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定
[学习目标]　1.阐明将目的基因导入受体细胞的方法。2.阐明目的基因的检测与鉴定的
方法。
一、将目的基因导入受体细胞
1.将目的基因导入植物细胞
(1)花粉管通道法。
①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中。
②在植物受粉后的一定时间内,剪去柱头,将DNA溶液滴加在花柱切面上,使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。
(2)农杆菌转化法。
2.将目的基因导入动物细胞
(1)方法:显微注射技术。
(2)受体细胞:受精卵。
3.将目的基因导入原核细胞
Ca2+处理法:用Ca2+处理细胞,使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,再将重组的基因表达载体导入其中。
二、目的基因的检测与鉴定
判断正误
(1)将重组表达载体导入动物受精卵常用显微注射法。(　　)
【答案】 √
(2)为培育抗除草剂的作物新品种,导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体细胞。(　　)
【答案】 ×
【提示】 为培育抗除草剂的作物新品种,受体细胞可以是受精卵,也可以是体细胞。
(3)Ti质粒上的TDNA可转移到植物细胞内,并且与其染色体DNA整合在一起。(　　)
【答案】 √
(4)转基因抗虫棉植株抗虫效果的鉴定必须通过分子检测才能达到目的。(　　)
【答案】 ×
【提示】 抗虫效果的鉴定要在个体生物学水平上做抗虫接种实验来鉴定。
(5)检测目的基因是否成功表达可用抗原—抗体杂交技术。(　　)
【答案】 √
(6)用PCR技术检测目的基因是否转录出mRNA,利用了碱基互补配对原则。(　　)
【答案】 √
任务一　分析目的基因导入受体细胞的方法
　　转化是指目的基因进入受体细胞内,并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。受体细胞不同,采用的导入方法也不同。常见的方法有农杆菌转化法、花粉管通道法、显微注射法以及用Ca2+处理等。下面为利用农杆菌转化法制备转基因植物的过程图。
(1)在用农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞的过程中,将目的基因插入Ti质粒的TDNA上的原因是什么
【提示】 Ti质粒上的TDNA(可转移的DNA)可转移至被侵染的细胞,并且整合到该细胞的染色体DNA上。
(2)将基因表达载体导入农杆菌细胞时,应怎样处理农杆菌细胞
【提示】 用Ca2+处理农杆菌细胞,使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,利于重组质粒的导入。
(3)用花粉管通道法导入受体细胞的目的基因是否需要和载体结合,原因是什么
【提示】 需要,目的基因只有和载体结合成基因表达载体才能在受体细胞中稳定存在和表达。
核心归纳
1.目的基因导入不同受体细胞的方法
2.农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入
(1)第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的TDNA上,第二次拼接(非人工直接操作)是指插入目的基因的TDNA拼接到受体细胞的染色体DNA上。
(2)第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌(Ca2+处理法),第二次导入(非人工直接操作)是指含目的基因的TDNA导入受体细胞(农杆菌转化法)。
典型例题
1.我国科学家在进行抗虫棉的培育过程中独创了“花粉管通道法”,该方法有多种操作方式。如图表示花粉管通道法介导植物基因转移。下列相关说法错误的是(　　)
[A]除图示方法外,还可用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中
[B]通过该方法获得转基因植物可避免植物组织培养这一操作
[C]必须在雌蕊成熟时才能进行图中所示的处理方法
[D]外源DNA不需要构建基因表达载体,就能借助花粉管通道进入受体细胞并表达
【答案】 D
【解析】 利用花粉管通道法时,也要先构建基因表达载体,然后基因表达载体借助花粉管通道进入受体细胞并表达。
2.(2025·广州检测)下图表示培育转基因抗植物病毒番茄的过程示意图。下列叙述正确的是(　　)
[A]过程A需要限制性内切核酸酶和DNA聚合酶的参与
[B]过程B通常需要用CaCl2溶液处理,以提高番茄细胞壁的通透性
[C]过程C需要采用植物组织培养技术
[D]抗植物病毒基因一旦整合到番茄细胞的染色体上,就能正常表达
【答案】 C
【解析】 图中过程A为构建基因表达载体,需要用到限制酶和DNA连接酶,而不需要DNA聚合酶;过程B表示Ti质粒上的TDNA转移到被侵染的植物细胞,并整合到该细胞染色体DNA上,利用的是农杆菌转化法;过程C表示由一个植物细胞得到一个完整植株的过程,一般要采用植物组织培养技术;抗植物病毒基因整合到番茄细胞的染色体上,不一定能正常表达。
任务二　分析目的基因的检测与鉴定的方法
　　抗虫棉中的“杀虫基因”就是培育转基因抗虫棉的目的基因——Bt抗虫蛋白基因。Bt基因进入受体细胞后,是否稳定维持和表达其遗传特性,只有通过检测与鉴定才能知道,这是检测转基因抗虫棉是否培育成功的重要一步。
(1)用什么方法检测棉花的染色体DNA上是否插入了Bt基因或检测Bt基因是否转录出了mRNA
【提示】 利用PCR等技术检测棉花的染色体DNA中是否插入了Bt基因或检测Bt基因是否转录出了mRNA。
(2)如果棉花中插入的Bt基因转录成功,是否一定能够翻译出相应的蛋白质呢 如何从分子水平进行检测
【提示】 不一定成功翻译。可从转基因棉花中提取蛋白质,用相应的抗体进行抗原—抗体杂交。
(3)如何在个体生物学水平鉴定转基因抗虫棉是否培育成功
【提示】 用导入Bt抗虫蛋白基因的棉花叶片饲喂棉铃虫,观察棉铃虫是否死亡。
核心归纳
1.目的基因的检测与鉴定
2.个体水平上鉴定转基因生物的方法举例
转基因生物 鉴定方法 观察目标
抗虫植物 害虫吞食 害虫是否死亡
抗病植物 病毒(菌)感染 是否出现病斑
抗盐植物 盐水浇灌 是否正常生长
抗除草剂植物 喷洒除草剂 是否正常生长
典型例题
3.(2025·白城检测)下列哪一种方法不能用于检测目的基因是否成功导入或表达(　　)
[A]在显微镜下直接观察受体细胞中是否含有目的基因
[B]通过PCR等技术检测受体细胞的DNA分子上是否含有目的基因
[C]提取受体细胞合成的相应蛋白质,利用抗原—抗体特异性反应进行检测
[D]抗虫基因导入植物细胞后,检测植物是否具有抗虫特性
【答案】 A
【解析】 在显微镜下无法直接观察到基因,无法检测目的基因是否成功导入或表达;对受体细胞的DNA进行PCR技术检测,可以检测受体细胞DNA上是否插入了目的基因;利用抗原—抗体杂交技术可以检测目的基因是否翻译成相应蛋白质;检测植物是否具有抗虫特性,属于个体生物学水平的鉴定。
4.(2025·济宁检测)科学家将苏云金杆菌中的Bt抗虫蛋白基因导入棉花的愈伤组织细胞并进行组织培养获得棉花植株。经棉铃虫饲喂实验,发现棉花植株并无抗虫性状,科学家提取棉花叶片细胞中的有关成分进行了如下操作。下列有关分析错误的是(　　)
[A]提取细胞中的蛋白质,采用抗原—抗体杂交技术进行检测,若检测到细胞中无Bt抗虫蛋白,则说明抗虫基因不能表达
[B]若经A检测确定细胞中无Bt抗虫蛋白,可采用PCR等技术检测细胞中的RNA,若检测到Bt抗虫蛋白的mRNA,则说明抗虫基因能正常转录和翻译
[C]若经B检测确定细胞中无Bt抗虫蛋白的mRNA,可采用PCR等技术检测细胞中的DNA,若能检测到抗虫基因,则可能是抗虫基因反向插入载体中或抗虫基因不能正常转录
[D]若经C检测确定细胞中无抗虫基因,则可能是将没有目的基因的载体DNA分子导入了受体细胞
【答案】 B
【解析】 若经A检测确定细胞中无Bt抗虫蛋白,可采用PCR等技术检测细胞中的RNA,若能检测到Bt抗虫蛋白的mRNA,则可能是Bt抗虫蛋白基因能转录,但不能正常翻译出蛋白质。
随堂检测反馈
1.(2025·茂名检测)受体细胞不同,将目的基因导入受体细胞的方法也不相同,下列受体细胞与导入方法匹配错误的一项是(　　)
选项 受体细胞 导入方法
[A] 棉花细胞 花粉管通道法
[B] 大肠杆菌 农杆菌转化法
[C] 羊受精卵 显微注射法
[D] 番茄细胞 农杆菌转化法
【答案】 B
【解析】 Ca2+能使大肠杆菌的生理状态发生改变,使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,所以将目的基因导入大肠杆菌细胞应采用Ca2+处理法。
2.下图表示利用农杆菌的Ti质粒构建基因表达载体的过程。下列相关叙述错误的是(　　)
[A]目的基因只有插入启动子和终止子之间才能进行复制
[B]采用同种限制酶切割目的基因和质粒可能会出现两种重组质粒
[C]构建基因表达载体是培育转基因生物的核心工作
[D]目的基因插入TDNA的非必需区域是为了防止破坏TDNA的转移特性
【答案】 A
【解析】 目的基因随质粒(含复制原点)一同复制,或整合到受体DNA上,随受体DNA同步复制,目的基因插入启动子和终止子之间的目的是使其能正常转录。
3.(2025·常州检测)下列关于将目的基因导入受体细胞的叙述,错误的是(　　)
[A]用一定浓度的CaCl2溶液处理大肠杆菌,以改变大肠杆菌细胞的生理状态
[B]将目的基因转入微生物细胞常用显微注射技术
[C]对于动物来说,受体细胞一般是受精卵
[D]通过基因工程大量获得胰岛素时,受体细胞选择酵母菌比大肠杆菌更有优势
【答案】 B
【解析】 将目的基因转入微生物细胞常用Ca2+处理法。
4.下列用于判断目的基因是否转移成功的方法,不属于分子水平的检测的是(　　)
[A]通过观察害虫吃棉叶是否死亡
[B]通过PCR检测棉花的染色体DNA上是否插入抗虫基因
[C]检测转基因生物细胞中是否转录出相应的mRNA
[D]从转基因生物中提取蛋白质,利用抗原—抗体杂交检测是否翻译成功
【答案】 A
【解析】 通过观察害虫吃棉叶是否死亡,属于个体生物学水平的鉴定。
5.荔枝生产中常受病虫害的困扰。科研人员运用生物工程技术培育转基因抗虫荔枝的过程如图所示。回答下列问题。
(1)科研人员培育转基因抗虫荔枝的过程运用的生物工程主要是　　　　　　　。
(2)根据图中抗虫基因和质粒的限制酶的切割位点分析,在基因表达载体构建过程中,使用　　　　和　　　　对含抗虫基因的DNA片段和质粒进行切割。将重组质粒转入农杆菌操作过程中,操作液中含有的　　　　　(填物质)便于农杆菌吸收质粒DNA,然后将该农杆菌置于含　　　　　　　　培养基中培养,从而筛选出含重组质粒的农杆菌。
(3)目的基因进入荔枝细胞后,是否稳定维持和表达需要进行检测和鉴定。请写出分子水平的检测过程或方法:① 　。
② 　　　　　　　　　　　　　　　　。
【答案】 (1)基因工程和细胞工程
(2)SalⅠ　HindⅢ　Ca2+　氨苄青霉素
(3)①通过PCR等技术检测荔枝细胞的染色体DNA上是否含有抗虫基因或检测抗虫基因是否转录出相应的mRNA　②从转基因抗虫荔枝中提取蛋白质,用抗原—抗体杂交法检测抗虫基因是否翻译成抗虫蛋白
【解析】 (1)培育转基因抗虫荔枝的过程需要应用基因工程获取含有抗虫基因的荔枝细胞,再利用细胞工程将转基因荔枝细胞培育成转基因抗虫荔枝植株。
(2)在基因表达载体构建过程中,BamHⅠ会破坏目的基因,所以可以用SalⅠ、HindⅢ两种限制酶对含抗虫基因的DNA片段和质粒进行切割;将重组质粒转入农杆菌操作过程中,操作液中含有的Ca2+可以使农杆菌处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,便于农杆菌吸收质粒DNA,由于重组质粒中含有氨苄青霉素抗性基因,因此可以将该农杆菌置于含氨苄青霉素培养基中培养,从而筛选出含重组质粒的农杆菌。
(3)目的基因进入荔枝细胞后,是否稳定维持和表达需要进行检测与鉴定,分子水平的检测有:①通过PCR等技术检测荔枝细胞的染色体DNA上是否含有抗虫基因或检测抗虫基因是否转录出相应的mRNA;②从转基因抗虫荔枝中提取蛋白质,用抗原—抗体杂交法检测抗虫基因是否翻译成抗虫蛋白。
　　研究发现,StP5CS基因能促进脯氨酸的大量合成,进而提高植物耐盐碱能力。某研究小组利用基因工程等技术将茄子的StP5CS基因导入结球甘蓝细胞中,培育出了耐盐碱的结球甘蓝转基因新品种,实验流程如图所示。回答下列问题。
(1)在PCR体系中应加入StP5CS基因的引物才能特异性扩增出StP5CS基因。StP5CS基因转录时,以b链(填“a链”或“b链”)作为模板链。
(2)Ⅰ～Ⅴ是5种限制酶切割的位点。将StP5CS基因和Ti质粒构建重组质粒时,宜选用的限制酶组合是Ⅰ和Ⅲ。步骤②中常使用Ca2+处理农杆菌,促进重组质粒的转化。
(3)双丙氨膦是一种除草剂,Bar是其抗性基因。步骤⑤的目的是初步筛选含重组质粒的结球甘蓝植株。经抗原—抗体杂交阳性的转基因植株,通过检测植株的脯氨酸含量及将植株种植在盐碱地,观察其生长情况评价转基因结球甘蓝的抗性。
课时作业
(时间:30分钟　分值:54分)
第1～6题每题3分,第7～8题每题6分,共计30分。
基础对点练
知识点1　将目的基因导入受体细胞
1.我国科学家独创的花粉管通道法,可以使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞,是一种十分简便经济的方法,对此认识正确的是(　　)
[A]不必构建表达载体就可以直接导入
[B]此方法可用于转基因动物
[C]受体细胞只能是植物的卵细胞
[D]有时可以取代农杆菌转化法
【答案】 D
【解析】 要让目的基因进入受体细胞后能稳定存在并得以表达,不管采用什么导入方法,都需要构建基因表达载体才能实现;花粉管通道法只适用于转基因植物的培育;采用花粉管通道法时,植物受体细胞一般是受精卵。
2.(2025·新余检测)下图表示转基因动、植物的培育过程。下列有关叙述不正确的是(　　)
[A]受体细胞A只能是绵羊的体细胞
[B]②过程中需要进行胚胎移植操作
[C]可采用花粉管通道法将目的基因导入受体细胞B
[D]③过程中一般需要生长素和细胞分裂素
【答案】 A
【解析】 培育转基因动物时,受体细胞A一般是该种动物的受精卵。
3.农杆菌能侵染双子叶植物而对大多数单子叶植物没有侵染能力,是因为受伤的双子叶植物能分泌某些酚类物质诱导Ti质粒中的Vir基因区段表达,该表达产物能诱导Ti质粒产生一条新的TDNA单链分子,此单链分子可进入植物细胞并整合到染色体上。下列相关叙述错误的是(　　)
[A]可以通过在伤口处施加相关酚类物质而使单子叶植物也成为农杆菌易感植物
[B]农杆菌侵染宿主细胞的原理与肺炎链球菌转化实验的原理类似
[C]使用农杆菌转化法时,目的基因应插入Ti质粒的TDNA中
[D]合成新的TDNA单链需要的DNA连接酶与限制酶,均在宿主细胞内合成
【答案】 D
【解析】 由题意可知,某些酚类物质能诱导农杆菌TDNA进入植物细胞,而多数单子叶植物细胞不能合成这些酚类化合物,可以通过在伤口处施加相关酚类物质而使单子叶植物也成为农杆菌易感植物;农杆菌侵染宿主细胞是把它的TDNA通过转化作用,整合到植物细胞染色体的DNA上,其原理与肺炎链球菌转化实验的原理类似,都是基因重组;农杆菌的转化作用可将插入Ti质粒的TDNA中的目的基因转移到植物细胞中,并能整合到其染色体DNA上;合成新的TDNA单链不需要限制酶,需要DNA聚合酶、DNA连接
酶等。
知识点2　目的基因的检测与鉴定
4.目的基因导入受体细胞后,需要检测目的基因是否可以维持稳定和表达其遗传特性。下列关于目的基因的检测和鉴定的叙述,正确的是(　　)
[A]目的基因能否在受体细胞中稳定遗传的关键是能否转录出mRNA
[B]可采用PCR检测目的基因是否转录和翻译
[C]可从转基因生物中提取蛋白质来检测目的基因是否翻译成相应蛋白质
[D]抗虫、抗病检验用于确定转基因生物是否具备相关性状属于分子水平的检测
【答案】 C
【解析】 目的基因导入受体细胞后,首先要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因,这是目的基因能否在受体细胞中稳定遗传的关键;PCR可用于检测目的基因是否转录,检测目的基因是否翻译用抗原—抗体杂交技术;抗虫、抗病检验用于确定转基因生物是否具备相关性状属于个体生物学水平的鉴定。
5.利用外源基因在受体细胞中表达,可生产人类所需要的产品。下列各项中能说明目的基因完成了在受体细胞中表达的是(　　)
[A]番茄细胞中检测到鱼的抗冻蛋白
[B]大肠杆菌中检测到人干扰素基因的mRNA
[C]山羊乳腺细胞中检测到人生长激素的DNA序列
[D]酵母菌细胞中提取到人胰岛素基因
【答案】 A
【解析】 番茄细胞中检测到鱼的抗冻蛋白,说明目的基因已经成功导入受体细胞,并且目的基因在受体细胞中已经完成表达;大肠杆菌中检测到人干扰素基因的mRNA,说明目的基因已经成功转录,但不能说明目的基因已经完成表达;山羊乳腺细胞中检测到人生长激素的DNA序列,说明目的基因已经导入受体细胞,但不能说明目的基因已经完成表达;酵母菌细胞中提取到人胰岛素基因,说明目的基因已经成功导入,但未必成功表达。
6.研究者将含有乳铁蛋白肽基因和人干扰素基因的DNA片段加上标记物后分别制成探针,与从转基因奶牛的乳腺细胞、口腔上皮细胞、蹄部细胞中提取的mRNA分别进行杂交,结果如下表所示。下列叙述正确的是(　　)
探针 乳腺细胞 口腔上皮 细胞 蹄部细胞
乳铁蛋白肽基因探针 出现 杂交带 未出现 杂交带 未出现 杂交带
人干扰素基因探针 出现 杂交带 出现 杂交带 出现 杂交带
[A]乳铁蛋白肽基因可在转基因奶牛的多种体细胞中表达
[B]人干扰素基因可在转基因奶牛的多种体细胞中表达
[C]表中两种基因探针所含的脱氧核苷酸的序列相同
[D]乳铁蛋白肽基因和人干扰素基因都是mRNA片段
【答案】 B
【解析】 由表可知,乳铁蛋白肽基因探针只在乳腺细胞出现了杂交带,不能在转基因奶牛多种体细胞中表达;据表格信息可知,人干扰素基因探针在三种细胞中都出现了杂交带,说明该基因可以在转基因奶牛的全身多种体细胞中表达;表中两种基因探针所含的脱氧核苷酸的序列不同,才会出现不同的杂交结果;乳铁蛋白肽基因和人干扰素基因都是特定的DNA片段。
综合提升练
7.科学家将人的生长激素基因与某种细菌(不含抗生素抗性基因)的DNA分子进行重组,并成功地在该细菌中得以表达(如图)。下列相关叙述错误的是(　　)
[A]过程①合成人生长激素基因的过程需要用到逆转录酶
[B]过程③是将重组质粒溶于缓冲液后与经Ca2+处理的细菌B混合
[C]成功导入了重组质粒的细菌B在含有氨苄青霉素的培养基上不能生长
[D]可采用抗原—抗体杂交技术检测工程菌中生长激素基因是否成功表达
【答案】 C
【解析】 重组质粒上四环素抗性基因被破坏,氨苄青霉素抗性基因未被破坏,因此成功导入了重组质粒的细菌B,在含有四环素的培养基上不能生长,在含氨苄青霉素的培养基上能生长。
8.除草剂的有效成分草甘膦能够专一性抑制EPSP合酶的作用,从而使植物多种代谢途径受影响而导致植物死亡。草甘膦没有选择性,除掉杂草的同时作物也会受损。培育抗草甘膦作物是解决办法之一。下列关于转入外源EPSP合酶基因使矮牵牛抗草甘膦流程的叙述,正确的是(　　)
[A]可以通过mRNA在逆转录酶的作用下形成cDNA,可获取EPSP合酶基因
[B]用限制酶和DNA连接酶处理目的基因和Ti质粒,仅涉及磷酸二酯键的断裂和形成
[C]基因表达载体组件中的起始密码子是RNA聚合酶识别和结合的部位,驱动基因转录
[D]目的基因插入Ti质粒的TDNA上,农杆菌的转化使植物细胞都能培育出转基因植株
【答案】 A
【解析】 mRNA在逆转录酶的作用下形成cDNA,从中可获取目的基因;用限制酶和DNA连接酶处理目的基因和Ti质粒,涉及碱基之间的氢键和DNA片段之间的磷酸二酯键的断裂和形成;起始密码子位于mRNA上,RNA聚合酶识别的位点是基因中的启动子;携带目的基因的TDNA可转移到受体细胞并整合到受体细胞染色体的DNA上,但不能保证目的基因导入率为100%,所以农杆菌的转化不能使植物细胞都培育出转基因植株。
9.(12分)(2025·宜春期末)我国科学家将蓝藻ictB蛋白(能高效转运和浓缩CO2)的基因
(ictB基因)与水稻叶绿体基因组中PSbA基因的启动子(叶片特异性表达)连接成重组DNA,然后将重组DNA与B质粒构建成表达载体,再导入水稻叶肉细胞的叶绿体中,最终成功获得了转ictB基因水稻,提高了水稻的产量。在ictB基因表达载体的构建中,含PSbA启动子和ictB基因的重组DNA分子和B质粒的酶切位点如图所示。回答下列问题。
(1)可以利用PCR技术从蓝藻DNA中扩增ictB基因,前提是　　　　　　　　　　。扩增过程需加入两种引物,经过5次循环后,形成的产物中同时含两种引物的DNA所占比例为　 　　　。
(2)为使重组DNA分子能定向插入B质粒的相应区段中,可在重组DNA分子两端添加限制酶识别序列,据图可知,M端应添加　　　　限制酶识别序列,N端应添加　　　　限制酶识别序列,经过酶切的重组DNA分子和Ti质粒进行连接时,可选用　　　　　　　　(填“E.coli DNA连接酶”或“T4 DNA连接酶”)。
(3)利用　　　　　　　技术,科研人员鉴定出4个成功表达了ictB蛋白的水稻株系,检测ictB蛋白时应选用水稻的叶片为材料,理由是　 　, 欲确定4个株系是否达到预期目标,还需要进行　　　　水平的鉴定。
【答案】 (除标注外,每空1分)
(1)已知目的基因两端部分脱氧核苷酸序列　(2分)
(2)BglⅡ(2分)　EcoRⅤ(2分)　T4 DNA连接酶
(3)抗原—抗体杂交　PSbA基因的启动子是叶片特异性启动子,它使ictB基因只能选择性地在叶片中表达(2分)　个体生物学
【解析】 (1)利用PCR技术从蓝藻DNA中扩增ictB基因的前提是已知目的基因两端部分脱氧核苷酸序列;经过5次循环后,总的DNA分子数目为25,即32个,同时含有两种引物的DNA分子所占的比例为(25-2)÷25=。
(2)据图可知,目的基因中有BamHⅠ的酶切位点,故不能选择BamHⅠ,又因为Sau3AⅠ也可识别BamHⅠ的酶切位点,故也不能选择该酶,由于SpeⅠ能切割PSbA启动子,不能选择,故只能选择BglⅡ和EcoRⅤ,再根据启动子的方向可知,M端应添加限制酶BglⅡ的识别序列,N端应添加限制酶EcoRⅤ的识别序列;EcoRⅤ酶切后是平末端,而T4 DNA连接酶既能连接黏性末端也能连接平末端,且连接平末端的效率大于E.coli DNA连接酶,故经过酶切的重组DNA分子和Ti质粒进行连接时,可选用T4 DNA连接酶。
(3)利用抗原—抗体杂交技术,科研人员鉴定出4个成功表达了ictB蛋白的水稻株系,检测ictB蛋白时应选用水稻的叶片为材料,理由是PSbA基因的启动子是叶片特异性启动子,它使ictB基因只能选择性地在叶片中表达;欲确定4个株系是否达到预期目标,还需要进行个体生物学水平的鉴定。
10.(12分)(2025·烟台检测)普通棉花中β甘露糖苷酶基因(GhManA2)表达出的β甘露糖苷酶能催化半纤维素降解,使棉纤维长度变短。为了培育长绒棉,科研人员构建了反义GhManA2基因表达载体,获得了转基因长绒棉新品种,具体过程如图所示,SmaⅠ、NotⅠ、HindⅢ和BamHⅠ表示酶切位点,LB为TDNA左边界,RB为TDNA右边界。回答下列问题。
(1)过程①中不用限制酶NotⅠ的原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。GhManA2的序列中包含内含子等序列,可增大重组质粒的相对分子质量,使导入效率降低,请提出一个解决此问题的方案:　 　。
(2)过程②中在培养基中添加　　　　可将含有重组质粒的农杆菌筛选出来。需将反义表达载体TDNA区段的　　　　　　　　片段整合到棉花细胞的染色体DNA上,并使之在翻译过程中起作用。
(3)过程③将目的基因导入棉花细胞后,可采用　　　　　　　　技术从分子水平上检测目的基因是否插入染色体DNA中;个体水平上的检测为　 。
(4)由图分析可知,转基因长绒棉棉纤维较普通棉棉纤维长的原因是 　。
【答案】 (除标注外,每空2分)
(1)限制酶NotⅠ会破坏目的基因,且质粒上没有NotⅠ的切割位点　从棉花细胞中提取GhManA2基因转录的mRNA,逆转录获得cDNA
(2)抗生素(1分)　E6启动子和GhManA2基因
(3)PCR(1分)　观察转基因棉花的棉纤维是否变长
(4)转基因长绒棉细胞内的反义GhManA2基因转录的mRNA能与细胞内的GhManA2基因转录的mRNA互补配对,从而抑制该基因的表达,使植物缺少β甘露糖苷酶,半纤维素不被降解,从而使转基因长绒棉的棉纤维长于普通棉花
【解析】 (1)由于限制酶NotⅠ会破坏目的基因,且质粒上没有NotⅠ的切割位点,因此过程①中不用限制酶NotⅠ;基因转录形成的mRNA不含内含子对应序列,故从棉花细胞中提取GhManA2基因转录的mRNA,再逆转录获得cDNA,以此为目的基因,可减小重组质粒的相对分子质量,解决导入效率低的问题。(2)过程②中在培养基中添加抗生素可将含有重组质粒的农杆菌筛选出来;需将反义表达载体TDNA区段的E6启动子和GhManA2基因片段整合到棉花细胞的染色体中,有利于目的基因的转录,以在翻译过程中起作用。(3)过程③中将目的基因导入棉花细胞后,可采用PCR技术从分子水平上检测目的基因是否插入染色体DNA中;个体水平上的检测为观察植株是否表现相应性状,即棉纤维是否变长。(4)分析题图,由启动子的方向可知,反义GhManA2基因转录的mRNA可与棉花细胞内的GhManA2基因转录的mRNA互补配对,从而抑制GhManA2基因转录的mRNA翻译成
β甘露糖苷酶,使半纤维素不被降解,因此转基因长绒棉的棉纤维长于普通棉花。第3课时　DNA片段的扩增及电泳鉴定
[学习目标]　尝试进行PCR的基本操作,并用电泳鉴定PCR的产物。
一、实验原理
1.DNA片段的扩增
PCR利用了DNA的热变性原理,通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。
2.琼脂糖凝胶电泳
(1)DNA分子具有可解离的基团,在一定的pH下,这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下,这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动,这个过程就是电泳。
(2)在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。
(3)凝胶中的DNA分子通过染色,可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。
二、方法步骤
1.DNA片段的扩增
2.PCR扩增产物的电泳鉴定
提醒　DNA的相对分子质量越小,迁移速率越快。
判断正误
(1)利用PCR扩增DNA片段时,在第一轮循环的变性之前,通常要用94 ℃的高温处理反应液5 min进行预变性。(　　)
【答案】 √
(2)PCR中离心的目的是让反应组分在离心管中分层分布。(　　)
【答案】 ×
【提示】 PCR中离心的目的是使反应液集中在管的底部。
(3)电泳时加入指示剂的作用是显示电泳进度,指示剂到达凝胶边缘时,停止电泳。(　　)
【答案】 ×
【提示】 电泳时待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时,停止电泳。
(4)电泳时,DNA的相对分子质量越大,迁移速率相对越慢。(　　)
【答案】 √
任务一　分析实验的原理和操作过程
　　利用PCR可以在体外进行DNA片段的扩增,扩增获得的DNA片段需要进行分离、鉴定和纯化。自从琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶被引入核酸研究以来,按相对分子质量大小分离DNA的凝胶电泳技术已经发展成为一种分析鉴定DNA分子的重要实验手段。
(1)为什么PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压蒸汽灭菌处理
【提示】 避免外源DNA等因素的污染。
(2)PCR仪设置预变性的目的是什么
【提示】 增加大分子模板DNA彻底变性的概率。
(3)影响琼脂糖凝胶电泳过程中DNA迁移速率的因素有哪些
【提示】 DNA分子的大小和构象、凝胶的浓度等。
(4)核酸染料、指示剂分别加在哪里 它们的作用分别是什么
【提示】 核酸染料加在琼脂糖凝胶中,其可与DNA形成复合物,在波长为300 nm的紫外灯下发荧光,便于DNA的检测;指示剂加在凝胶载样缓冲液中,其作为电泳进度的指示分子,便于确定电泳停止时间。
典型例题
1.下列有关电泳的叙述,错误的是(　　)
[A]电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程
[B]待测样品中DNA分子的大小和构象、凝胶的浓度等都会影响DNA在电泳中的迁移速率
[C]进行电泳时,带电分子会向着与其所带电荷相同的电极移动
[D]PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定
【答案】 C
【解析】 由于同性相斥、异性相吸,带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。
2.(2025·扬州检测)关于“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验,下列说法错误的是(　　)
[A]PCR体系中G—C碱基对含量多、少,将影响使DNA解链的所需温度
[B]实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压蒸汽灭菌处理
[C]扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液混匀后需缓慢注入加样孔以防样品飘散
[D]待指示剂前沿迁移到达凝胶加样孔边缘时需停止电泳以防DNA跑出凝胶
【答案】 D
【解析】 G—C碱基对含有3个氢键,DNA片段中G—C碱基对含量越多,使DNA解链的所需温度越高;PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压蒸汽灭菌处理,避免外源DNA等因素的污染;将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合,再用微量移液器将混合液缓慢注入加样孔,以防样品飘散;应待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时停止电泳,以防止样品流失到缓冲液中。
任务二　实验结果及原因分析
　　基因工程操作中,科研人员利用PCR技术扩增DNA,下图为不同循环次数获得的DNA的电泳结果,请思考并回答下列问题。
(1)若操作者进行电泳鉴定的结果不止一条条带,则产生这种结果的原因是什么
【提示】 ①模板DNA出现污染;②引物特异性不强或形成引物二聚体;③Mg2+浓度过高;④复性时的温度过低等。
(2)若PCR产物电泳时未出现扩增条带,其主要原因有哪些
【提示】 ①Taq DNA聚合酶失活;②引物出现质量问题;③Mg2+浓度过低;④变性时的温度低,变性时间短。
典型例题
3.某实验利用PCR技术获取目的基因,实验结果显示除目的基因条带(引物与模板完全配对)外,还有 2条非特异条带(引物和模板不完全配对)。为了减少非特异条带的产生,以下措施中有效的是(　　)
[A]增加模板DNA的量
[B]延长热变性的时间
[C]延长延伸的时间
[D]提高复性的温度
【答案】 D
【解析】 增加模板DNA的量可以提高反应速度,但不能有效减少非特异条带的产生;延长热变性的时间和延长延伸的时间会影响变性、延伸过程,但对于复性过程中引物与模板的配对影响不大,故不能有效减少非特异条带的产生;非特异条带增加的原因可能是复性温度过低,造成引物与模板的结合位点增加,故可通过提高复性的温度来减少非特异条带的产生。
4. (2025·广州检测)用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时,得到以下电泳图谱,其中1号为DNA标准样液(Marker),10号为无菌蒸馏水,PCR时加入的模板DNA如图所示。据此作出的分析,不合理的是(　　)
[A]PCR产物的分子大小在250～500 bp之间
[B]3号样品为不含目的基因的载体DNA
[C]9号样品对应植株不是所需的转基因植株
[D]10号确定反应体系等对结果没有干扰
【答案】 B
【解析】 4～9号是转基因植株,理论上应包含目的基因,结合2号野生型植株和10号蒸馏水组的结果,推测包含目的基因的片段大小应为250～500 bp;3号PCR结果包含250～500 bp片段,应包含目的基因;9号PCR结果不包含250～500 bp片段,所以不是所需转基因植株;10号放入蒸馏水,可排除反应体系等对结果的干扰。
随堂检测反馈
1.下列关于PCR扩增DNA片段及电泳鉴定的叙述,正确的是(　　)
[A]PCR反应体系中需要加入解旋酶来解开双链DNA
[B]引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则,其长度越长越好
[C]在PCR循环过程中,延伸阶段需要的温度比变性阶段高
[D]琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA时,DNA分子的迁移速率与其大小有关
【答案】 D
【解析】 PCR扩增中双链DNA在高温条件下可自动解开,不需要解旋酶;引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则,但其长度并非越长越好,引物过长容易形成二聚体,导致扩增失败;在PCR循环过程中,延伸阶段需要的温度比变性阶段低;琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA时,DNA分子的迁移速率与DNA分子的大小、凝胶的浓度等因素有关。
2.(2024·黑吉辽卷)关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验,下列叙述正确的是(　　)
[A]琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小
[B]凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置
[C]在同一电场作用下,DNA片段越长,向负极迁移速率越快
[D]琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来
【答案】 A
【解析】 琼脂糖凝胶的浓度会影响DNA分子在凝胶中的迁移率和分辨率,琼脂糖凝胶的浓度通常是根据所需分离的DNA片段大小来选择的。对于较大的DNA片段,比如基因组DNA或质粒DNA,通常选择较低浓度的琼脂糖凝胶,因为它们需要更大的孔径来有效迁移。而对于较小的DNA片段,比如PCR产物或酶切片段,则需要选择较高浓度的琼脂糖凝胶,以提供更好的分辨率和分离效果; 凝胶载样缓冲液指示剂通常是一种颜色较深的染料,可以作为电泳进度的指示分子, 指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时,停止电泳;在琼脂糖凝胶电泳中,当电场作用时,DNA片段实际上是向正极迁移的,而不是向负极迁移。同时,DNA片段的迁移速率与其大小成反比,即DNA片段越长,迁移速率越慢;琼脂糖凝胶中的DNA分子需在波长为300 nm的紫外灯下检测。
3.关于“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验,下列相关叙述正确的是(　　)
[A]PCR仪实质上就是一台能自动调控温度的仪器,但在使用时需根据扩增的DNA片段以及引物的情况人工设定合适的温度
[B]PCR反应体系中需加入耐高温的DNA聚合酶,该酶主要在复性过程中起作用
[C]为避免外源DNA等因素的污染,PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水和移液器等在使用前都必须进行高压蒸汽灭菌处理
[D]电泳时,电泳缓冲液不能没过凝胶,以免凝胶加样孔中的电泳样液流出
【答案】 A
【解析】 PCR反应体系中需加入耐高温的DNA聚合酶,该酶主要在延伸过程中起作用;为避免外源DNA等因素的污染,PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水等在使用前都必须进行高压蒸汽灭菌处理,移液器不需要高压蒸汽灭菌处理;电泳时,电泳缓冲液以没过凝胶1 mm 为宜。
4.下列关于PCR操作过程的叙述,错误的是(　　)
[A]在进行操作时,一定要戴好一次性手套
[B]PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份,在-20 ℃储存
[C]将PCR所用缓冲液和酶从冰箱拿出,需放在高温环境中迅速融化
[D]在向微量离心管中添加反应组分时,每吸取一种试剂后,移液器上的枪头都必须更换
【答案】 C
【解析】 将PCR所用缓冲液和酶从冰箱拿出,需放在冰块上缓慢融化。
5.(2025·全国卷)琼脂糖凝胶电泳常用于核酸样品的分析,样品1～4的电泳结果如图所示(“+”“-”分别代表电泳槽的阳极和阴极)。已知样品1和2中的DNA分子分别是甲和乙,甲只有限制酶R的一个酶切位点,样品3和4中有一个样品是甲的酶切产物。下列叙述错误的是(　　)
[A]配制琼脂糖凝胶时需选用适当的缓冲溶液
[B]该实验条件下甲、乙两种DNA分子均带负电荷
[C]甲、乙两种DNA分子所含碱基对的数量可能不同
[D]据图推测样品3可能是甲被酶R完全酶切后的产物
【答案】 D
【解析】 配制琼脂糖凝胶时选用适当缓冲溶液(电泳缓冲液),以维持电泳过程pH的稳定,保证核酸分子正常移动;电泳时,样品向“+”极移动,说明在该实验条件下甲、乙两种DNA分子均带负电荷;电泳中,DNA分子的迁移速率与分子大小、构象等多种因素有关。甲、乙电泳条带位置虽然相同,但碱基对的数量可能不同;甲只有限制酶R的一个酶切位点,若被酶R完全酶切,只会得到2种DNA片段(2个条带),这2个条带的碱基对数量比甲要少,电泳时移动速度更快,所以据图推测样品4可能是甲被酶R完全酶切后的产物。
　　抗菌肽通常是由短氨基酸序列构成的小肽,具有广谱的杀菌活性,利用基因工程生产抗菌肽的难题之一是大肠杆菌能识别外源蛋白并将其水解。某科研小组将抗菌肽基因与大肠杆菌自身的半乳糖苷酶基因连接,组成融合基因,通过质粒构建基因表达载体并导入大肠杆菌中,以获得大量的抗菌肽。图1、图2分别为融合基因和该实验所用质粒的结构示意图,请回答下列问题。
注:EcoRⅠ、SmaⅠ、BamHⅠ、HindⅢ为能产生不同末端的限制酶, AmpR为氨苄青霉素抗性基因,TetR为四环素抗性基因。
(1)常用PCR技术获得大量的融合基因,PCR反应中的每次循环可分为变性、复性、延伸三步,扩增反应体系应添加引物、模板、含Mg2+的缓冲液、耐高温的DNA聚合酶、四种脱氧核苷酸等。引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。
(2)分析图1可知,利用 PCR 技术扩增融合基因时,应选择的引物是引物2和引物4,循环 5次共需要消耗62个引物。
(3)为构建重组质粒并保证基因能定向插入质粒中,需选择限制酶BamHⅠ和HindⅢ切割质粒和含融合基因的DNA片段;为确定重组质粒是否构建成功,用上述选择的限制酶分别对融合基因PCR 产物、质粒和重组质粒进行完全酶切,再进行电泳,结果如图 3 所示。若重组质粒构建成功,请在图 3 中将酶切结果对应位置的条带涂黑。
【提示】
课时作业
(时间:25分钟　分值:42分)
第1～6题每题3分,第7～8题每题6分,共计30分。
基础对点练
知识点1　DNA片段的扩增
1.下列相关实验操作正确的是(　　)
[A]配制PCR反应体系时,加入等量的4种核糖核苷酸溶液作为扩增原料
[B]利用添加核酸染料的凝胶对PCR产物进行电泳后,在紫外灯下观察结果
[C]检测目的基因是否表达,分子水平的检测是PCR
[D]基因工程四个步骤中只有构建基因表达载体遵循碱基互补配对
【答案】 B
【解析】 配制PCR反应体系时,加入4种脱氧核糖核苷酸等量混合的溶液作为扩增原料;琼脂糖凝胶制备中加入的核酸染料能与DNA分子结合,可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来;检测目的基因是否表达,分子水平的检测是抗原—抗体杂交技术;除构建基因表达载体外,利用PCR扩增目的基因,以及通过PCR检测目的基因是否插入、是否转录时,均遵循碱基互补配对。
2.(2025·昭通检测)PCR仪实际上是一个温控设备,能在每次循环的3个步骤间进行温度切换,主要过程如图所示,图中a、b、c表示过程。下列叙述正确的是(　　)
[A]若设计的引物与模板不完全配对,可适当提高PCR复性的温度
[B]耐高温的DNA聚合酶能与引物结合,并从引物的5'端连接脱氧核苷酸
[C]每次循环需要的引物Ⅰ的数量与引物Ⅱ的相同
[D]PCR循环过程控制的温度高低关系为a>b>c
【答案】 C
【解析】 若设计的引物与模板不完全配对,可适当降低PCR复性的温度,以便引物与模板链结合;耐高温的DNA聚合酶能与引物结合,并从引物的3'端连接脱氧核苷酸;每次循环解旋后的两条单链分别与两种引物结合,故每次循环需要的引物Ⅰ的数量与引物Ⅱ的数量相同;PCR循环过程,a为解旋,温度需90 ℃以上,b为复性,温度需下降至50 ℃左右,c为延伸,温度需上升到72 ℃左右,因此PCR循环过程控制的温度高低关系为a>c>b。
3.采用PCR技术可获取并扩增目的基因。下列说法正确的是(　　)
[A]若PCR的模板是mRNA,完成扩增只需要逆转录酶
[B]预变性有利于模板DNA充分解聚为单链
[C]复性温度太高会导致引物和模板的非特异性结合增加
[D]一个DNA模板完成20轮循环需要(220-2)个引物
【答案】 B
【解析】 若PCR的模板是mRNA,完成扩增需要逆转录酶和耐高温的DNA聚合酶;预变性温度较高,双链DNA在热作用下,氢键断裂,形成单链DNA;复性温度太低会导致引物和模板的非特异性结合增加,温度太高会使引物与模板结合减少;一个DNA模板完成20轮循环需要的引物为(221-2)个。
知识点2　DNA片段的电泳鉴定
4.番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)为DNA病毒,能引发番茄黄化曲叶病毒病,为检测某番茄植株是否感染该病毒,对PCR扩增得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳。下列叙述错误的是(　　)
[A]DNA分子在凝胶中的迁移速率与其碱基对数成正比
[B]PCR反应中每次循环可分为变性、复性、延伸三步
[C]琼脂糖凝胶中被染色的DNA可在紫外灯下被检测出来
[D]样品受到污染或混杂,凝胶中可能会出现异常的DNA条带
【答案】 A
【解析】 一般来说,DNA分子越小,其在凝胶中的迁移速率越快,即DNA分子在凝胶中的迁移速率与其碱基对数成反比,而不是正比。
5.下列有关DNA片段的扩增及电泳鉴定实验的叙述,正确的是(　　)
[A]PCR缓冲液中一般要加Mg2+,用于激活RNA聚合酶
[B]琼脂糖熔化后即加入适量的核酸染料混匀,用来指示DNA迁移的位置
[C]在凝胶中的DNA分子的迁移速率只与DNA分子大小有关
[D]电泳缓冲液加入电泳槽时,需要没过凝胶1 mm
【答案】 D
【解析】 DNA聚合酶需要Mg2+激活,PCR缓冲液中一般要加Mg2+,用于激活DNA聚合酶;琼脂糖熔化,要稍冷却后加入适量的核酸染料混匀,用来指示DNA迁移的位置;在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关;电泳缓冲液加入电泳槽时,需要没过凝胶1 mm。
6.(2025·龙岩一模)科研人员利用两种识别不同序列的限制酶(E1和E2)处理某一基因表达载体后进行琼脂糖凝胶电泳,结果如图所示。下列叙述正确的是(　　)
[A]该载体的长度约为800 bp
[B]电泳加样时,将待检测样液与电泳缓冲液(内含指示剂)混合,注入加样孔内
[C]待观察到DNA片段前沿迁移接近凝胶边缘时,停止电泳
[D]E1和E2在该载体上的酶切位点最短相距约200 bp
【答案】 D
【解析】 仅从图中信息无法直接得出载体的长度约为800 bp;电泳加样时,是将待检测样液与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合,注入加样孔内;接通电源后,待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时,停止电泳;用E1和E2双酶切后,最短DNA片段为200 bp,因此E1和E2在该载体上的酶切位点最短相距约200 bp。
综合提升练
7.不对称PCR是利用不等量的一对引物来产生大量单链DNA(ssDNA)的方法。加入的一对引物中含量较少的被称为限制性引物,含量较多的被称为非限制性引物。PCR 反应最初的若干次循环中,其扩增产物主要是双链DNA(dsDNA),但当限制性引物消耗完后,就会产生大量的 ssDNA。不对称PCR的过程如下图所示。假设模板 DNA 分子初始数量为a个,6次循环后开始扩增产生ssDNA。下列叙述正确的是(　　)
[A]该不对称PCR 过程中需要 26个限制性引物
[B]两种引物与模板链结合时,需将温度控制在72 ℃左右
[C]据图可知,最后大量获得的 ssDNA 与图中甲链的碱基序列相同
[D]上述过程中子链分别沿限制性引物的5'端、非限制性引物的3'端延伸
【答案】 C
【解析】 PCR扩增时引物是新子链的一部分,模板DNA分子初始数量为a个,6次循环后产生a·26个DNA分子,则不对称PCR过程中需要(26-1)a个限制性引物;当温度降至50 ℃左右时,两种引物通过碱基互补配对原则与模板链结合;非限制性引物是与乙链结合,所以最后大量获得的ssDNA与图中甲链的碱基序列一致;扩增时耐高温的DNA聚合酶将4种脱氧核苷酸连接至引物的3'端,即子链沿引物的3'端延伸。
8.我国科研人员在ASFV(非洲猪瘟病毒)的K基因(大小为790 bp)中间插入荧光素酶(Gluc)基因和绿色荧光蛋白(EGFP)基因,构建了ASFVGlucEGFP重组病毒体系(如图1),通过PCR扩增和电泳鉴定重组病毒是否构建成功(结果如图2)。下列说法正确的是(　　)
[A]在PCR体系中加入图1中的引物1和引物2能特异性扩增出重组基因
[B]构建图1所示结构时发生了磷酸二酯键的断裂和形成
[C]可根据电泳结果中的条带数量判断重组病毒是否构建成功
[D]图2中出现790 bp、1 758 bp的条带说明样液中重组病毒构建成功
【答案】 B
【解析】 引物1和引物2是根据K基因两端的序列设计的,在PCR体系中加入图1中的引物1和引物2不一定能特异性扩增出重组基因,也可能只扩增出K基因; 构建图1所示的重组病毒体系时,需要将Gluc基因和EGFP基因插入K基因中间,这一过程中发生了磷酸二酯键的断裂和形成;无论重组病毒是否构建成功,PCR扩增并电泳鉴定都会得到一条条带,因此不能通过条带数量判断重组病毒是否构建成功,需根据条带的大小进行判断;由于不知道插入的Gluc基因和EGFP基因的总长度,所以根据这两个条带不能说明样液中重组病毒构建成功。
9.(12分)科研人员将除草剂草甘膦抗性基因转入甘蓝植株,获得抗草甘膦转基因甘蓝植株。培育过程如图1所示。
(1)为便于PCR扩增后的草甘膦抗性基因与质粒连接,需在两个引物的　　　　(填“3'”或“5'”)端添加限制酶的识别序列。
(2)若目的基因用BamHⅠ和BglⅡ剪切,形成的黏性末端(单链突出末端)序列为
5'-　　　　-3'和5'-　　　　-3'。质粒用BamHⅠ剪切,酶切后的目的基因与质粒存在正向与反向两种连接方式。用BamHⅠ和　　　　对重组质粒进行剪切,通过琼脂糖凝胶电泳技术对酶切后产物进行分析,结果如图2所示,样品1和样品2中小片段的长度分别为　　　　　　　,图中　　　　(填“样品1”或“样品2”)为所需的基因表达载体。
(3)在过程④的培养基中添加的抗生素为　　　　　　,以便筛选出含目的基因的甘蓝植株。鉴定时发现,该过程获得的转基因甘蓝植株有一部分具有草甘膦抗性基因,但没有表现出抗草甘膦性状,原因可能是　　　　　　　　　　　　(答出1点即可)。
【答案】 (除标注外,每空1分)
(1) 5'
(2)GATC　GATC　EcoRⅠ　20 kb、45 kb(2分)　样品2(2分)
(3)潮霉素(2分)　草甘膦抗性基因没有表达(2分)
【解析】 (1)PCR扩增后的草甘膦抗性基因包含引物,切割的时候也要包含引物,PCR扩增目的基因时,两种引物分别结合到模板链的两端,耐高温的DNA聚合酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸,因此需要把限制酶识别序列加在引物的5' 端。
(2)用BamHⅠ、BglⅡ切割产生的黏性末端相同,即5'GATC3'。用EcoRⅠ和BamHⅠ进行酶切,正向连接的重组质粒会被切出20+25=45 kb长度的片段,反向连接的重组质粒会被切出20 kb长度的片段,电泳凝胶中,DNA分子越大,在凝胶中迁移速率越小,迁移距离越短,结合图2分析,样品2是所需的基因表达载体。
(3)由图可知,卡那霉素抗性基因不在TDNA片段中,潮霉素抗性基因在TDNA片段中,可随TDNA转移并整合到被侵染的细胞的染色体DNA上,从而使含目的基因的甘蓝植株有抗潮霉素的抗性,所以应在含潮霉素的培养基上筛选含目的基因的甘蓝植株。转基因甘蓝植株有一部分具有草甘膦抗性基因,但没有表现出抗草甘膦性状,原因可能是草甘膦抗性基因没有表达,从而使得相应性状没有表现出来。第2节　基因工程的基本操作程序
第1课时　目的基因的筛选与获取和基因表达载体的构建
[学习目标]　1.阐明PCR技术的过程、原理、条件等内容。2.简述基因表达载体的组成及构建过程。
一、基因工程的基本操作程序
1.目的基因的筛选与获取。
2.基因表达载体的构建。
3.将目的基因导入受体细胞。
4.目的基因的检测与鉴定。
二、目的基因的筛选与获取
1. 筛选合适的目的基因
(1)目的基因。
(2)获取目的基因的方法。
2.利用PCR获取和扩增目的基因
(1)原理:DNA半保留复制。
(2)DNA复制所需的基本条件。
参与的组分 在DNA复制中的作用
解旋酶(体外用高温代替) 打开DNA双链
DNA母链 提供DNA复制的模板
4种脱氧核苷酸 合成DNA子链的原料
DNA聚合酶 催化合成DNA子链
引物 使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸
(3)PCR反应条件:一定的缓冲液、DNA模板、分别与两条模板链结合的2种引物、4种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶;同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。
(4)PCR扩增的过程。
过程Ⅰ为变性,该阶段的温度为90 ℃以上,目的是使双链DNA解聚为单链。
过程Ⅱ为复性,该阶段的温度为50 ℃左右,两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
过程Ⅲ为延伸,该阶段的温度为72 ℃左右,该过程需要在耐高温的DNA聚合酶的催化下,利用4种脱氧核苷酸为原料,根据碱基互补配对原则从子链的3′端延伸合成新的子链DNA。
(5)PCR产物的鉴定:常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定。
三、基因表达载体的构建
1.构建基因表达载体的目的
(1)使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且遗传给下一代。
(2)使目的基因能够表达和发挥作用。
2.基因表达载体的组成
提醒　目的基因插入位点不是随意的。基因表达载体需要启动子与终止子的调控,所以目的基因应插入启动子和终止子之间的部位。
3.基因表达载体的构建过程
判断正误
(1)PCR扩增技术中,需用解旋酶使双链DNA解聚。(　　)
【答案】 ×
【提示】 PCR扩增技术中,利用高温使双链DNA解聚。
(2)DNA聚合酶能够从引物的5′端开始连接脱氧核苷酸。(　　)
【答案】 ×
【提示】 DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。
(3)PCR反应中温度的周期性改变是为了DNA聚合酶催化不同的反应。(　　)
【答案】 ×
【提示】 PCR反应中温度的周期性改变是为了变性、复性、延伸,DNA聚合酶只催化子链的延伸。
(4)基因工程操作程序的核心步骤是目的基因的获取。(　　)
【答案】 ×
【提示】 基因工程操作程序的核心步骤是基因表达载体的构建。
(5)基因表达载体中含有启动子和终止密码子。(　　)
【答案】 ×
【提示】 基因表达载体中含有启动子和终止子,终止密码子位于mRNA上。
(6)基因表达载体中启动子是DNA聚合酶识别和结合的部位。(　　)
【答案】 ×
【提示】 启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位。
任务一　分析PCR技术的原理和过程
　　聚合酶链式反应(PCR)是一种用于扩增特定的DNA片段的分子生物学技术,下图为PCR扩增中第一轮的变化,结合所学知识回答下列问题。
(1)PCR过程中为什么需要引物 DNA链复制的方向是怎样的
【提示】 加入引物,能够使DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。DNA链复制的方向总是从子链的5′端向3′端延伸。
(2)PCR扩增目的基因需要知道目的基因的全部核苷酸序列吗
【提示】 不需要,只要知道目的基因两端的部分核苷酸序列即可(以便根据这部分序列合成两种引物)。
(3)复性温度的设定与引物长度、碱基组成有关,假设引物的长度相同,当G、C含量高时,对复性温度的设定有什么要求 说明理由。
【提示】 当引物的G、C含量高时,设定的复性温度要高一些。因为DNA分子中G—C之间有三个氢键,A—T之间有两个氢键,当引物的G、C含量高时,引物与模板结合的作用力大,适当提高复性温度,可提高结合的特异性。
(4)PCR扩增的不一定(填“一定”或“不一定”)是完整的模板DNA分子,理由是PCR扩增的仅仅是两种引物之间的特定DNA片段。
(5)在利用PCR获取和扩增目的基因(位于某段DNA分子中间)时,至少第几轮循环结束才会产生完整的目的基因
【提示】 第3轮。
核心归纳
PCR与体内DNA复制的比较
类型 体内DNA复制 PCR
解旋 在解旋酶作用下,细胞提供能量,部分DNA双链解开 90 ℃以上高温解旋,DNA双链全部解开,不需要解旋酶
酶 解旋酶、DNA聚合酶、DNA连接酶等 耐高温的DNA聚合酶
合成 子链 一条链连续合成;另一条链不连续合成,再由DNA连接酶连接 分别从两条引物的3′端开始延伸,都是连续合成
过程
产物 完整DNA 两种引物之间的DNA片段
相同 点 (1)都需要提供DNA模板、4种脱氧核苷酸和引物;(2)都是半保留复制,严格遵循碱基互补配对原则
典型例题
1.(2025·广州检测)下列关于PCR技术的叙述,错误的是(　　)
注:A、B、C、D是引物,箭头是延伸方向。
[A]PCR技术的原理是DNA的半保留复制
[B]该反应体系缓冲液中一般要添加Mg2+,以激活DNA聚合酶
[C]引物应选用图中的A、D
[D]引物是一小段DNA或RNA,用于PCR的引物长度通常为30~40个核苷酸
【答案】 D
【解析】 引物是一小段DNA或RNA,用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸。
2.下列有关体内DNA复制与PCR技术比较的叙述,错误的是(　　)
[A]二者子链的延伸方向相同,均为5′端→3′端
[B]二者均需要解旋酶破坏氢键来实现解旋
[C]体内DNA复制需要能量,PCR反应也需要能量
[D]二者遵循的碱基互补配对原则相同
【答案】 B
【解析】 PCR扩增DNA时,解旋不需要解旋酶,而是在高温条件下使氢键断裂。
任务二　分析基因表达载体构建的目的和方法
　　目的基因导入受体细胞之前,需构建基因表达载体,图1、图2表示质粒及目的基因所在DNA片段,图中箭头表示相关限制酶的切割位点。
(1)构建基因表达载体时目的基因插入的位置应该在哪里 为什么
【提示】 启动子下游和终止子上游;因为只有插入在启动子和终止子之间,目的基因才可以正常表达。
(2)构建基因表达载体时,能否用限制酶SmaⅠ切割质粒 为什么
【提示】 不能;因为SmaⅠ会破坏质粒的抗生素抗性基因,该基因是标记基因,用于重组DNA分子的筛选。
(3)与只使用EcoRⅠ相比较,使用BamHⅠ和Hind Ⅲ 两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点是什么
【提示】 可以防止切割后的质粒和目的基因发生自身环化或目的基因与质粒发生反向连接。
核心归纳
1.启动子、终止子与起始密码子、终止密码子的区别
项目 位置 作用
启动子 位于DNA 分子上 RNA聚合酶识别和 结合的部位, 启动转录过程
终止子 位于DNA 分子上 决定转录的结束
起始密码子 位于mRNA 分子上 决定翻译的开始
终止密码子 位于mRNA 分子上 决定翻译的结束
2.构建基因表达载体中限制酶的选择技巧
(1)根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类。
①应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶,如图甲可选择PstⅠ。
②不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶,如图甲不能选择SmaⅠ。
③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接,也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒,如图甲也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点,如图乙)。
(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类。
典型例题
3.如图为科研人员运用基因工程技术进行研究时构建的一个基因表达载体。下列相关叙述错误的是(　　)
[A]若a是RNA聚合酶识别和结合的部位,则a为启动子
[B]若b表示终止子,则其上的终止密码子能使翻译停止
[C]若c中含有一个限制酶切割位点,则载体中可能含有多个
[D]若d表示复制原点,则载体能在受体细胞中进行自我复制
【答案】 B
【解析】 启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位,能启动转录过程,a为启动子;b表示终止子,其具有终止转录过程的作用,而终止密码子位于mRNA上,作用是使翻译停止;载体中可能含有多个限制酶切割位点。
4.下面是利用基因工程技术培育转基因植物,进而生产可食用疫苗的部分过程示意图,其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ为四种限制性内切核酸酶。下列说法错误的是(　　)
[A]图示过程是基因工程的核心步骤
[B]表达载体构建时需要用到限制酶SmaⅠ
[C]卡那霉素抗性基因的存在有利于将含有抗原基因的细胞筛选出来
[D]除图示组成外,表达载体中还应该含有启动子和终止子等结构
【答案】 B
【解析】 构建表达载体过程中需要将目的基因完整切割下来,此时要用到限制酶PstⅠ、EcoRⅠ,若使用SmaⅠ会破坏抗原基因。
随堂检测反馈
1.(2025·深圳检测)实验室常利用PCR对目的基因进行体外扩增,下列相关叙述错误的是(　　)
[A]PCR反应中目的基因呈指数形式扩增
[B]反应过程的每个循环一般可以分为变性、复性、延伸三步
[C]90 ℃以上时双链DNA的氢键断开
[D]反应体系中需加入ATP来为DNA复制提供能量
【答案】 D
【解析】 利用PCR对目的基因进行体外扩增时,不需要加入ATP提供能量。
2.(2025·汕头检测)下图是基因工程中基因表达载体的模式图,若结构X是表达载体所必需的,则X最可能是(　　)
[A]目的基因插入位点
[B]启动子
[C]标记基因
[D]DNA聚合酶识别位点
【答案】 B
【解析】 题图中有终止子、标记基因(抗生素抗性基因)、目的基因、复制原点,还缺少启动子。启动子位于目的基因的上游,是RNA聚合酶识别和结合的部位,所以X最可能是启动子。
3.(2025·海南检测)PCR是聚合酶链式反应的缩写,下图表示PCR的过程,下列叙述错误的是(　　)
[A]反应体系中需加入耐高温的DNA聚合酶,该酶在B过程起作用
[B]引物a和引物b的长度应适宜,且相互之间不能发生碱基互补配对
[C]PCR是体外进行的DNA扩增,PCR扩增遵循DNA半保留复制原则
[D]A过程通过高温破坏DNA分子中的氢键,使双链DNA解聚为单链
【答案】 A
【解析】 反应体系中需加入耐高温的DNA聚合酶,该酶的作用是催化合成DNA子链,在C过程中起作用。
4.(2023·新课标卷)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具,将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接,以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是(　　)
[A]质粒和目的基因都用酶3切割,用E.coli DNA连接酶连接
[B]质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割,用T4 DNA连接酶连接
[C]质粒和目的基因都用酶1和酶2切割,用T4 DNA连接酶连接
[D]质粒和目的基因都用酶2和酶4切割,用E.coli DNA连接酶连接
【答案】 C
【解析】 酶3切割后得到的是平末端,应该用T4 DNA连接酶连接,且只用一种限制酶切割质粒和目的基因,会使质粒和目的基因发生自身环化或者使目的基因在质粒中反向连接;质粒用酶3切割后得到平末端,目的基因用酶1切割后得到的是黏性末端,二者不能连接;质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端,用T4 DNA连接酶连接后,还能保证目的基因在质粒上的连接方向,此重组表达载体的构建方案最合理且高效;若用酶2和酶4切割质粒和目的基因,产生的黏性末端相同,会使质粒和目的基因自身环化或者使目的基因在质粒中反向连接,并且用酶4切割会破坏质粒上的抗生素抗性基因,连接形成的基因表达载体缺少标记基因,无法进行后续的筛选。
5.若要利用某目的基因(图甲)和P1噬菌体载体(图乙)构建重组DNA(图丙),限制酶的识别序列和切割位点分别是BglⅡ(A↓GATCT)、EcoRⅠ(G↓AATTC)和Sau3AⅠ(↓GATC)。下列方案最合理的是(　　)
[A]用EcoRⅠ切割含目的基因的DNA片段和P1噬菌体载体
[B]用BglⅡ和EcoRⅠ切割含目的基因的DNA片段和P1噬菌体载体
[C]用BglⅡ和Sau3AⅠ切割含目的基因的DNA片段和P1噬菌体载体
[D]用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割含目的基因的DNA片段和P1噬菌体载体
【答案】 D
【解析】 用EcoRⅠ切割含目的基因的DNA片段和P1噬菌体载体,产生相同的黏性末端,用DNA连接酶连接时可能会发生反向连接;用BglⅡ和EcoRⅠ切割含目的基因的DNA片段会产生两种DNA片段,一种含有目的基因,一种不含目的基因,且有目的基因的片段(两端黏性末端均为AATT)无法与酶切后的载体(黏性末端分别为AATT和GATC)结合;用Bgl Ⅱ和Sau 3AⅠ切割含目的基因的DNA片段和P1噬菌体载体,也能产生相同的黏性末端,可能会发生反向连接;用EcoRⅠ和Sau 3AⅠ切割含目的基因的DNA片段和P1噬菌体载体,产生不同的黏性末端,目的基因插入载体后,RNA聚合酶的移动方向与图丙相同。
　　大刍草具有较强的耐盐碱能力,该性状与M蛋白有关。科学家通过PCR技术获取和扩增M蛋白基因,如图1所示。将获得的大量M蛋白基因与质粒构建基因表达载体,各部分结构如图2所示。
(1)据图1分析,PCR过程应选择的引物是引物Ⅱ、引物Ⅲ。
(2)在M蛋白基因两端设计不同黏性末端的目的是防止M蛋白基因自身环化,保证M蛋白基因在质粒上正向连接。质粒中氨苄青霉素抗性基因的作用是便于重组DNA分子的筛选。
(3)为实现质粒和M蛋白基因的连接,切割质粒时选用限制酶XmaⅠ而不选用限制酶SmaⅠ的原因是XmaⅠ切出的黏性末端与M蛋白基因一端的黏性末端相同,SmaⅠ的酶切末端为平末端,无法与M蛋白基因的黏性末端连接。 为将M蛋白基因连接到质粒上,还需要BglⅡ、DNA连接酶等酶。
课时作业
(时间:30分钟　分值:52分)
第1~6题每题3分,第7~8题每题6分,共计30分。
基础对点练
知识点1　目的基因的筛选与获取
1.下列有关获取目的基因的叙述错误的是(　　)
[A]目的基因就是编码蛋白质的基因
[B]筛选和获取目的基因是基因工程的第一步
[C]来自苏云金杆菌的Bt基因可作为转基因抗虫棉的目的基因
[D]序列比对工具的应用为科学家找到合适的目的基因提供了更多的机会
【答案】 A
【解析】 目的基因主要是指编码蛋白质的基因,少数是具有调控作用的因子,如启动子、终止子等。
2.下列关于PCR的叙述,正确的是(　　)
[A]PCR是体外DNA复制技术,关键酶是解旋酶和DNA聚合酶
[B]DNA聚合酶从引物的5′端开始连接脱氧核苷酸
[C]第三轮循环产物中出现位于两种引物之间的DNA片段
[D]延伸过程需要酶、ATP和4种核糖核苷酸
【答案】 C
【解析】 PCR过程中不需要解旋酶,需要耐高温的DNA聚合酶;DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸;第三轮循环产物中出现位于两种引物之间的DNA片段;延伸过程中所需原料是4种游离的脱氧核苷酸,不是核糖核苷酸,也不需要ATP。
3.下列关于PCR的叙述,错误的是(　　)
[A]PCR只能扩增引物之间的DNA片段而非整个完整的模板DNA分子
[B]PCR过程中变性的目的是让引物与模板DNA单链结合
[C]PCR的原理是DNA半保留复制
[D]PCR的过程需要耐高温的DNA聚合酶,但不需要解旋酶
【答案】 B
【解析】 变性的目的是通过升高温度,破坏氢键,使双链DNA解聚为单链,为子链的延伸提供模板。
4.(2025·咸阳期末)PCR引物的3′端为结合模板DNA的关键,5′端无严格限制,可用于添加限制酶切点等序列,dNTP是DNA合成的原料,还可供能。下列相关说法错误的是(　　)
[A]图示环节所需的温度比上一个环节的低
[B]引物的设计要有一段已知目的基因的核苷酸序列
[C]耐高温的DNA聚合酶只能从引物的3′端开始延伸DNA链
[D]一个循环后,子代DNA双链的脱氧核苷酸数量相同
【答案】 D
【解析】 由图可知,一个循环后,子代DNA双链的脱氧核苷酸数量不相同。
知识点2　基因表达载体的构建
5.下列关于基因表达载体的说法,不正确的是(　　)
[A]基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤
[B]基因表达载体包含启动子、目的基因、终止子、标记基因等
[C]终止子位于目的基因的下游,能够终止翻译过程
[D]不同的目的基因所需的启动子不一定相同
【答案】 C
【解析】 终止子位于目的基因的下游,能够终止转录过程。
6.科学家利用质粒(如图)成功构建了蛛丝蛋白基因的重组质粒,并在家蚕丝腺细胞中获得大量蛛丝蛋白。下列有关说法错误的是(　　)
[A]为防止目的基因自身环化,可以用限制酶XbaⅠ和SacⅠ来切割目的基因
[B]构建基因表达载体时选用蚕丝蛋白基因的启动子利于基因在家蚕丝腺细胞中表达
[C]启动子是DNA聚合酶的识别和结合部位,可以驱动遗传信息的转录
[D]基因表达载体中的标记基因可以用来鉴别与选择含有蛛丝蛋白基因的受体细胞
【答案】 C
【解析】 启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位。
综合提升练
7.如图表示pBR322质粒和人生长激素基因所在片段的结构信息,将二者构建的重组质粒导入受体菌并进行筛选。下列有关叙述正确的是(　　)
注:AmpR为氨苄青霉素抗性基因,TetR为四环素抗性基因。
[A]可选择的限制酶组合是酶E和酶G
[B]所选用的受体菌不能含有AmpR和TetR
[C]用含氨苄青霉素的培养基就能筛选出含重组质粒的受体菌
[D]同时用三种限制酶处理图中质粒,电泳后可得到3个条带
【答案】 B
【解析】 酶E会破坏质粒上的两种标记基因,为使切割后的目的基因与质粒正向连接,又保留质粒上的标记基因,切割时应选择的限制酶组合是酶F和酶G;重组质粒上的TetR被破坏,AmpR能表达,用含氨苄青霉素的培养基筛选出的受体菌有导入重组质粒的受体菌和导入普通质粒的受体菌;据题图可知,同时用三种限制酶处理图中质粒,能将质粒切割成
4个大小不同的DNA片段,电泳后可得到4个条带。
8.PCR扩增仪的温度、时间和循环次数等参数设定不当会影响基因的扩增结果。下图是PCR扩增目的基因时的参数设定,图中线上、线下分别为温度和时间设定。下列叙述错误的是(　　)
[A]步骤2的温度及时间设定受目的基因的G、C含量的影响
[B]步骤3的温度及时间设定受引物的长度及G、C含量的影响
[C]步骤4延伸时间的设定主要依据目的基因的碱基数目
[D]步骤5除设定循环次数(25次)外,还应将“GOTO”设定为步骤3
【答案】 D
【解析】 步骤2是变性过程,是在高温条件下使DNA分子解聚为单链的过程,由于G和C之间有3个氢键,热稳定性高,故步骤2的温度及时间设定要根据目的基因的G、C含量调整;步骤3是复性过程,一般情况下,引物的长度越长,G和C比例越高,则复性步骤中的复性温度设定就越高;步骤4是延伸过程,时长的设置依据目的基因的长度,即主要依据目的基因的碱基数目;“GOTO”是设置返回的步骤序号,参数应设置为步骤2,以进行“变性—复性—延伸”的循环。
9.(8分)图a中的三个DNA片段上依次表示出了EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3A Ⅰ三种限制性内切核酸酶的识别序列与切割位点,图b为某种表达载体的示意图(载体上的EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切割位点是唯一的)。根据基因工程的有关知识,回答下列问题。
(1)经BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被　　　　酶切后的产物连接,理由是　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(2)若某人利用图b所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组表达载体,如图c所示,这三种重组表达载体中,不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有　　　　,不能表达的原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　　　　
　　　 　　　。
【答案】 (除标注外,每空2分)
(1)Sau3AⅠ　两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端　(2)甲、丙　甲中目的基因插入在启动子的上游,丙中目的基因插入在终止子的下游,二者的目的基因均不能被转录
【解析】 (2)在基因表达载体中,启动子应位于目的基因的上游,终止子应位于目的基因的下游,这样目的基因才能转录。题图c中甲、丙均不符合,所以不能在宿主细胞中表达目的基因产物。
10.(14分)苯丙酮尿症是单基因遗传病,科学家将正常基因D导入该病患者的细胞,以治疗该病。图甲为A、B、C三种质粒,图乙为含有目的基因D的DNA片段,图丙为重组载体的示意图。AmpR为氨苄青霉素抗性基因,Tet r为四环素抗性基因。LacZ基因编码产生的酶可以分解物质X-gal,从而使菌落呈现蓝色;若无该基因或该基因被破坏,则菌落呈白色。EcoRⅠ(0.6 kb)、PvuⅠ(0.8 kb)为限制酶及其切割位点与复制原点之间的距离。回答下列问题。
(1)图甲中三种质粒适宜作为载体的是质粒　　 　　。
(2)获取目的基因D时应选择图乙中的　 　　对其所在的DNA进行切割。
(3)将目的基因D和图甲中相应质粒连接后,得到图丙中三种方式。为选出正向连接的重组质粒,使用　　　　对质粒完全酶切。若是正向连接载体,能得到长度为　　 　　kb和　　 　　kb两条DNA片段。
(4)利用自身不含LacZ基因且对抗生素敏感的大肠杆菌作为受体细胞,要在已转化的含重组质粒的受体细胞、已转化的含空质粒的受体细胞和未转化成功的细胞中筛选出已转化的含重组质粒的受体细胞的方法是在含有　　 　　和　 　　　的培养基上培养,形成　　 　　(填“蓝色”或“白色”)菌落的为导入重组质粒的受体细胞。
【答案】 (除标注外,每空2分)
(1)B(1分)
(2)PvuⅠ(1分)
(3)EcoRⅠ　1.2　5.5
(4)氨苄青霉素　X-gal　白色
【解析】 (1)图甲中三种质粒适宜作为载体的是质粒B,因为质粒B含有与目的基因相同的酶切位点,而且相应的限制酶切割后,可以保留氨苄青霉素抗性基因的完整性。质粒A无标记基因,质粒C被限制酶切割后会破坏复制原点。
(2)获取目的基因D时应选择图乙中的PvuⅠ对其所在的DNA进行切割,因为目的基因两端存在PvuⅠ酶切位点。
(3)为选出正向连接的重组质粒,应使用EcoRⅠ对质粒完全酶切,并进行电泳分析。质粒B中EcoRⅠ酶切位点与PvuⅠ酶切位点之间的距离为0.2 kb,若是正向连接载体,重组质粒中2个EcoRⅠ酶切位点之间的距离是0.2+1.0=1.2(kb),重组质粒长度为2.7+4.0=6.7(kb),故EcoRⅠ酶切后,若是正向连接载体,能得到长度为1.2 kb和5.5 kb两条DNA片段。
(4)重组质粒中含有氨苄青霉素抗性基因,那么含有重组质粒的受体细胞可以在含有氨苄青霉素的培养基中生存,由于目的基因插入到了LacZ基因中,LacZ基因被破坏,因此含有重组质粒的受体细胞无法产生可以分解物质Xgal的酶,从而使菌落显现出白色。因此要筛选出已转化的含重组质粒的受体细胞的方法是在含有氨苄青霉素和Xgal的培养基上培养,形成白色菌落的为导入重组质粒的受体细胞。第3课时　DNA片段的扩增及电泳鉴定
课时作业
(时间:25分钟　分值:42分)
第1～6题每题3分,第7～8题每题6分,共计30分。
基础对点练
知识点1　DNA片段的扩增
1.下列相关实验操作正确的是(　　)
[A]配制PCR反应体系时,加入等量的4种核糖核苷酸溶液作为扩增原料
[B]利用添加核酸染料的凝胶对PCR产物进行电泳后,在紫外灯下观察结果
[C]检测目的基因是否表达,分子水平的检测是PCR
[D]基因工程四个步骤中只有构建基因表达载体遵循碱基互补配对
【答案】 B
【解析】 配制PCR反应体系时,加入4种脱氧核糖核苷酸等量混合的溶液作为扩增原料;琼脂糖凝胶制备中加入的核酸染料能与DNA分子结合,可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来;检测目的基因是否表达,分子水平的检测是抗原—抗体杂交技术;除构建基因表达载体外,利用PCR扩增目的基因,以及通过PCR检测目的基因是否插入、是否转录时,均遵循碱基互补配对。
2.(2025·昭通检测)PCR仪实际上是一个温控设备,能在每次循环的3个步骤间进行温度切换,主要过程如图所示,图中a、b、c表示过程。下列叙述正确的是(　　)
[A]若设计的引物与模板不完全配对,可适当提高PCR复性的温度
[B]耐高温的DNA聚合酶能与引物结合,并从引物的5'端连接脱氧核苷酸
[C]每次循环需要的引物Ⅰ的数量与引物Ⅱ的相同
[D]PCR循环过程控制的温度高低关系为a>b>c
【答案】 C
【解析】 若设计的引物与模板不完全配对,可适当降低PCR复性的温度,以便引物与模板链结合;耐高温的DNA聚合酶能与引物结合,并从引物的3'端连接脱氧核苷酸;每次循环解旋后的两条单链分别与两种引物结合,故每次循环需要的引物Ⅰ的数量与引物Ⅱ的数量相同;PCR循环过程,a为解旋,温度需90 ℃以上,b为复性,温度需下降至50 ℃左右,c为延伸,温度需上升到72 ℃左右,因此PCR循环过程控制的温度高低关系为a>c>b。
3.采用PCR技术可获取并扩增目的基因。下列说法正确的是(　　)
[A]若PCR的模板是mRNA,完成扩增只需要逆转录酶
[B]预变性有利于模板DNA充分解聚为单链
[C]复性温度太高会导致引物和模板的非特异性结合增加
[D]一个DNA模板完成20轮循环需要(220-2)个引物
【答案】 B
【解析】 若PCR的模板是mRNA,完成扩增需要逆转录酶和耐高温的DNA聚合酶;预变性温度较高,双链DNA在热作用下,氢键断裂,形成单链DNA;复性温度太低会导致引物和模板的非特异性结合增加,温度太高会使引物与模板结合减少;一个DNA模板完成20轮循环需要的引物为(221-2)个。
知识点2　DNA片段的电泳鉴定
4.番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)为DNA病毒,能引发番茄黄化曲叶病毒病,为检测某番茄植株是否感染该病毒,对PCR扩增得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳。下列叙述错误的是(　　)
[A]DNA分子在凝胶中的迁移速率与其碱基对数成正比
[B]PCR反应中每次循环可分为变性、复性、延伸三步
[C]琼脂糖凝胶中被染色的DNA可在紫外灯下被检测出来
[D]样品受到污染或混杂,凝胶中可能会出现异常的DNA条带
【答案】 A
【解析】 一般来说,DNA分子越小,其在凝胶中的迁移速率越快,即DNA分子在凝胶中的迁移速率与其碱基对数成反比,而不是正比。
5.下列有关DNA片段的扩增及电泳鉴定实验的叙述,正确的是(　　)
[A]PCR缓冲液中一般要加Mg2+,用于激活RNA聚合酶
[B]琼脂糖熔化后即加入适量的核酸染料混匀,用来指示DNA迁移的位置
[C]在凝胶中的DNA分子的迁移速率只与DNA分子大小有关
[D]电泳缓冲液加入电泳槽时,需要没过凝胶1 mm
【答案】 D
【解析】 DNA聚合酶需要Mg2+激活,PCR缓冲液中一般要加Mg2+,用于激活DNA聚合酶;琼脂糖熔化,要稍冷却后加入适量的核酸染料混匀,用来指示DNA迁移的位置;在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关;电泳缓冲液加入电泳槽时,需要没过凝胶1 mm。
6.(2025·龙岩一模)科研人员利用两种识别不同序列的限制酶(E1和E2)处理某一基因表达载体后进行琼脂糖凝胶电泳,结果如图所示。下列叙述正确的是(　　)
[A]该载体的长度约为800 bp
[B]电泳加样时,将待检测样液与电泳缓冲液(内含指示剂)混合,注入加样孔内
[C]待观察到DNA片段前沿迁移接近凝胶边缘时,停止电泳
[D]E1和E2在该载体上的酶切位点最短相距约200 bp
【答案】 D
【解析】 仅从图中信息无法直接得出载体的长度约为800 bp;电泳加样时,是将待检测样液与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合,注入加样孔内;接通电源后,待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时,停止电泳;用E1和E2双酶切后,最短DNA片段为200 bp,因此E1和E2在该载体上的酶切位点最短相距约200 bp。
综合提升练
7.不对称PCR是利用不等量的一对引物来产生大量单链DNA(ssDNA)的方法。加入的一对引物中含量较少的被称为限制性引物,含量较多的被称为非限制性引物。PCR 反应最初的若干次循环中,其扩增产物主要是双链DNA(dsDNA),但当限制性引物消耗完后,就会产生大量的 ssDNA。不对称PCR的过程如下图所示。假设模板 DNA 分子初始数量为a个,6次循环后开始扩增产生ssDNA。下列叙述正确的是(　　)
[A]该不对称PCR 过程中需要 26个限制性引物
[B]两种引物与模板链结合时,需将温度控制在72 ℃左右
[C]据图可知,最后大量获得的 ssDNA 与图中甲链的碱基序列相同
[D]上述过程中子链分别沿限制性引物的5'端、非限制性引物的3'端延伸
【答案】 C
【解析】 PCR扩增时引物是新子链的一部分,模板DNA分子初始数量为a个,6次循环后产生a·26个DNA分子,则不对称PCR过程中需要(26-1)a个限制性引物;当温度降至50 ℃左右时,两种引物通过碱基互补配对原则与模板链结合;非限制性引物是与乙链结合,所以最后大量获得的ssDNA与图中甲链的碱基序列一致;扩增时耐高温的DNA聚合酶将4种脱氧核苷酸连接至引物的3'端,即子链沿引物的3'端延伸。
8.我国科研人员在ASFV(非洲猪瘟病毒)的K基因(大小为790 bp)中间插入荧光素酶(Gluc)基因和绿色荧光蛋白(EGFP)基因,构建了ASFVGlucEGFP重组病毒体系(如图1),通过PCR扩增和电泳鉴定重组病毒是否构建成功(结果如图2)。下列说法正确的是(　　)
[A]在PCR体系中加入图1中的引物1和引物2能特异性扩增出重组基因
[B]构建图1所示结构时发生了磷酸二酯键的断裂和形成
[C]可根据电泳结果中的条带数量判断重组病毒是否构建成功
[D]图2中出现790 bp、1 758 bp的条带说明样液中重组病毒构建成功
【答案】 B
【解析】 引物1和引物2是根据K基因两端的序列设计的,在PCR体系中加入图1中的引物1和引物2不一定能特异性扩增出重组基因,也可能只扩增出K基因; 构建图1所示的重组病毒体系时,需要将Gluc基因和EGFP基因插入K基因中间,这一过程中发生了磷酸二酯键的断裂和形成;无论重组病毒是否构建成功,PCR扩增并电泳鉴定都会得到一条条带,因此不能通过条带数量判断重组病毒是否构建成功,需根据条带的大小进行判断;由于不知道插入的Gluc基因和EGFP基因的总长度,所以根据这两个条带不能说明样液中重组病毒构建成功。
9.(12分)科研人员将除草剂草甘膦抗性基因转入甘蓝植株,获得抗草甘膦转基因甘蓝植株。培育过程如图1所示。
(1)为便于PCR扩增后的草甘膦抗性基因与质粒连接,需在两个引物的　　　　(填“3'”或“5'”)端添加限制酶的识别序列。
(2)若目的基因用BamHⅠ和BglⅡ剪切,形成的黏性末端(单链突出末端)序列为
5'-　　　　-3'和5'-　　　　-3'。质粒用BamHⅠ剪切,酶切后的目的基因与质粒存在正向与反向两种连接方式。用BamHⅠ和　　　　对重组质粒进行剪切,通过琼脂糖凝胶电泳技术对酶切后产物进行分析,结果如图2所示,样品1和样品2中小片段的长度分别为　　　　　　　,图中　　　　(填“样品1”或“样品2”)为所需的基因表达载体。
(3)在过程④的培养基中添加的抗生素为　　　　　　,以便筛选出含目的基因的甘蓝植株。鉴定时发现,该过程获得的转基因甘蓝植株有一部分具有草甘膦抗性基因,但没有表现出抗草甘膦性状,原因可能是　　　　　　　　　　　　(答出1点即可)。
【答案】 (除标注外,每空1分)
(1) 5'
(2)GATC　GATC　EcoRⅠ　20 kb、45 kb(2分)　样品2(2分)
(3)潮霉素(2分)　草甘膦抗性基因没有表达(2分)
【解析】 (1)PCR扩增后的草甘膦抗性基因包含引物,切割的时候也要包含引物,PCR扩增目的基因时,两种引物分别结合到模板链的两端,耐高温的DNA聚合酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸,因此需要把限制酶识别序列加在引物的5' 端。
(2)用BamHⅠ、BglⅡ切割产生的黏性末端相同,即5'GATC3'。用EcoRⅠ和BamHⅠ进行酶切,正向连接的重组质粒会被切出20+25=45 kb长度的片段,反向连接的重组质粒会被切出20 kb长度的片段,电泳凝胶中,DNA分子越大,在凝胶中迁移速率越小,迁移距离越短,结合图2分析,样品2是所需的基因表达载体。
(3)由图可知,卡那霉素抗性基因不在TDNA片段中,潮霉素抗性基因在TDNA片段中,可随TDNA转移并整合到被侵染的细胞的染色体DNA上,从而使含目的基因的甘蓝植株有抗潮霉素的抗性,所以应在含潮霉素的培养基上筛选含目的基因的甘蓝植株。转基因甘蓝植株有一部分具有草甘膦抗性基因,但没有表现出抗草甘膦性状,原因可能是草甘膦抗性基因没有表达,从而使得相应性状没有表现出来。(共49张PPT)
第2节　基因工程的
基本操作程序
第1课时　目的基因的筛选与
获取和基因表达载体的构建
1.阐明PCR技术的过程、原理、条件等内容。2.简述基因表达载体的组成及构建过程。
[学习目标]
预习案·自主学习
一、基因工程的基本操作程序
1. 的筛选与获取。
2. 的构建。
3.将目的基因导入 。
4.目的基因的 。
目的基因
基因表达载体
受体细胞
检测与鉴定
二、目的基因的筛选与获取
1. 筛选合适的目的基因
(1)目的基因。
性状
表达产物
编码蛋白质
已知结构和功能清晰
(2)获取目的基因的方法。
PCR
基因文库
2.利用PCR获取和扩增目的基因
(1)原理: 。
DNA半保留复制
(2)DNA复制所需的基本条件。
参与的组分 在DNA复制中的作用
解旋酶(体外用 代替)
提供DNA复制的模板
合成DNA子链的原料
DNA聚合酶 催化合成
引物 使 能够从引物的 开始连接脱氧核苷酸
高温
打开DNA双链
DNA母链
4种脱氧核苷酸
DNA子链
DNA聚合酶
3′端
(3)PCR反应条件:一定的缓冲液、 、分别与两条模板链结合的 、4种脱氧核苷酸和 的DNA聚合酶;同时通过控制 使DNA复制在体外反复进行。
DNA模板
2种引物
耐高温
温度
(4)PCR扩增的过程。
过程Ⅰ为 ,该阶段的温度为 以上,目的是使双链DNA解聚为 。
过程Ⅱ为 ,该阶段的温度为 左右,两种引物通过 与两条单链DNA结合。
过程Ⅲ为 ,该阶段的温度为 左右,该过程需要在
的催化下,利用 为原料,根据碱基互补配对原则从子链的 端延伸合成新的子链DNA。
(5)PCR产物的鉴定:常采用 来鉴定。
变性
90 ℃
单链
复性
50 ℃
碱基互补配对
延伸
72 ℃
耐高温的DNA
聚合酶
4种脱氧核苷酸
3′
琼脂糖凝胶电泳
三、基因表达载体的构建
1.构建基因表达载体的目的
(1)使目的基因在受体细胞中 ,并且 给下一代。
(2)使目的基因能够 和发挥作用。
稳定存在
遗传
表达
2.基因表达载体的组成
上游
RNA聚合酶
转录
下游
标记基因
提醒　目的基因插入位点不是随意的。基因表达载体需要启动子与终止子的调控,所以目的基因应插入启动子和终止子之间的部位。
3.基因表达载体的构建过程
限制酶
产生相同
末端
DNA连接
判断正误
(1)PCR扩增技术中,需用解旋酶使双链DNA解聚。(　　)
×
【提示】 PCR扩增技术中,利用高温使双链DNA解聚。
(2)DNA聚合酶能够从引物的5′端开始连接脱氧核苷酸。(　　)
×
【提示】 DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。
(3)PCR反应中温度的周期性改变是为了DNA聚合酶催化不同的反应。(　　)
×
【提示】 PCR反应中温度的周期性改变是为了变性、复性、延伸,DNA聚合酶只催化子链的延伸。
(4)基因工程操作程序的核心步骤是目的基因的获取。(　　)
【提示】 基因工程操作程序的核心步骤是基因表达载体的构建。
×
(5)基因表达载体中含有启动子和终止密码子。(　　)
×
【提示】 基因表达载体中含有启动子和终止子,终止密码子位于mRNA上。
(6)基因表达载体中启动子是DNA聚合酶识别和结合的部位。(　　)
×
【提示】 启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位。
探究案·互动探究
任务一　分析PCR技术的原理和过程
聚合酶链式反应(PCR)是一种用于扩增特定的DNA片段的分子生物学技术,下图为PCR扩增中第一轮的变化,结合所学知识回答下列问题。
(1)PCR过程中为什么需要引物 DNA链复制的方向是怎样的
【提示】 加入引物,能够使DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。DNA链复制的方向总是从子链的5′端向3′端延伸。
(2)PCR扩增目的基因需要知道目的基因的全部核苷酸序列吗
【提示】 不需要,只要知道目的基因两端的部分核苷酸序列即可(以便根据这部分序列合成两种引物)。
(3)复性温度的设定与引物长度、碱基组成有关,假设引物的长度相同,当G、C含量高时,对复性温度的设定有什么要求 说明理由。
【提示】 当引物的G、C含量高时,设定的复性温度要高一些。因为DNA分子中G—C之间有三个氢键,A—T之间有两个氢键,当引物的G、C含量高时,引物与模板结合的作用力大,适当提高复性温度,可提高结合的特异性。
(4)PCR扩增的 (填“一定”或“不一定”)是完整的模板DNA分子,理由是 。
(5)在利用PCR获取和扩增目的基因(位于某段DNA分子中间)时,至少第几轮循环结束才会产生完整的目的基因
不一定
PCR扩增的仅仅是两种引物之间的特定DNA片段
【提示】 第3轮。
「核心归纳」
PCR与体内DNA复制的比较
类型 体内DNA复制 PCR
解旋 在解旋酶作用下,细胞提供能量,部分DNA双链解开 90 ℃以上高温解旋,DNA双链全部解开,不需要解旋酶
酶 解旋酶、DNA聚合酶、DNA连接酶等 耐高温的DNA聚合酶
合成子链 一条链连续合成;另一条链不连续合成,再由DNA连接酶连接 分别从两条引物的3′端开始延伸,都是连续合成
过程
产物 完整DNA 两种引物之间的DNA片段
相同点 (1)都需要提供DNA模板、4种脱氧核苷酸和引物;(2)都是半保留复制,严格遵循碱基互补配对原则
「典型例题」
1.(2025·广州检测)下列关于PCR技术的叙述,错误的是(　　)
注:A、B、C、D是引物,箭头是延伸方向。
[A]PCR技术的原理是DNA的半保留复制
[B]该反应体系缓冲液中一般要添加Mg2+,以激活DNA聚合酶
[C]引物应选用图中的A、D
[D]引物是一小段DNA或RNA,用于PCR的引物长度通常为30~40个核苷酸
D
【解析】 引物是一小段DNA或RNA,用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸。
2.下列有关体内DNA复制与PCR技术比较的叙述,错误的是(　　)
[A]二者子链的延伸方向相同,均为5′端→3′端
[B]二者均需要解旋酶破坏氢键来实现解旋
[C]体内DNA复制需要能量,PCR反应也需要能量
[D]二者遵循的碱基互补配对原则相同
B
【解析】 PCR扩增DNA时,解旋不需要解旋酶,而是在高温条件下使氢键
断裂。
任务二　分析基因表达载体构建的目的和方法
目的基因导入受体细胞之前,需构建基因表达载体,图1、图2表示质粒及目的基因所在DNA片段,图中箭头表示相关限制酶的切割位点。
(1)构建基因表达载体时目的基因插入的位置应该在哪里 为什么
【提示】 启动子下游和终止子上游;因为只有插入在启动子和终止子之间,目的基因才可以正常表达。
(2)构建基因表达载体时,能否用限制酶SmaⅠ切割质粒 为什么
【提示】 不能;因为SmaⅠ会破坏质粒的抗生素抗性基因,该基因是标记基因,用于重组DNA分子的筛选。
(3)与只使用EcoRⅠ相比较,使用BamHⅠ和Hind Ⅲ 两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点是什么
【提示】 可以防止切割后的质粒和目的基因发生自身环化或目的基因与质粒发生反向连接。
「核心归纳」
1.启动子、终止子与起始密码子、终止密码子的区别
项目 位置 作用
启动子 位于DNA分子上 RNA聚合酶识别和
结合的部位,启动转录过程
终止子 位于DNA分子上 决定转录的结束
起始密码子 位于mRNA分子上 决定翻译的开始
终止密码子 位于mRNA分子上 决定翻译的结束
2.构建基因表达载体中限制酶的选择技巧
(1)根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类。
①应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶,如图甲可选择PstⅠ。
②不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶,如图甲不能选择SmaⅠ。
③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接,也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒,如图甲也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点,如图乙)。
(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类。
「典型例题」
3.如图为科研人员运用基因工程技术进行研究时构建的一个基因表达载体。下列相关叙述错误的是(　　)
[A]若a是RNA聚合酶识别和结合的部位,则a为启动子
[B]若b表示终止子,则其上的终止密码子能使翻译停止
[C]若c中含有一个限制酶切割位点,则载体中可能含有多个
[D]若d表示复制原点,则载体能在受体细胞中进行自我复制
B
【解析】 启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位,能启动转录过程,a为启动子;b表示终止子,其具有终止转录过程的作用,而终止密码子位于mRNA上,作用是使翻译停止;载体中可能含有多个限制酶切割位点。
4.下面是利用基因工程技术培育转基因植物,进而生产可食用疫苗的部分过程示意图,其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ为四种限制性内切核酸酶。下列说法错误的是(　　)
[A]图示过程是基因工程的核心步骤
[B]表达载体构建时需要用到限制酶SmaⅠ
[C]卡那霉素抗性基因的存在有利于将含有抗原基因的细胞筛选出来
[D]除图示组成外,表达载体中还应该含有启动子和终止子等结构
B
【解析】 构建表达载体过程中需要将目的基因完整切割下来,此时要用到限制酶PstⅠ、EcoRⅠ,若使用SmaⅠ会破坏抗原基因。
思维导图
随堂检测反馈
1.(2025·深圳检测)实验室常利用PCR对目的基因进行体外扩增,下列相关叙述错误的是(　　)
[A]PCR反应中目的基因呈指数形式扩增
[B]反应过程的每个循环一般可以分为变性、复性、延伸三步
[C]90 ℃以上时双链DNA的氢键断开
[D]反应体系中需加入ATP来为DNA复制提供能量
D
【解析】 利用PCR对目的基因进行体外扩增时,不需要加入ATP提供能量。
2.(2025·汕头检测)下图是基因工程中基因表达载体的模式图,若结构X是表达载体所必需的,则X最可能是(　　)
[A]目的基因插入位点
[B]启动子
[C]标记基因
[D]DNA聚合酶识别位点
B
【解析】 题图中有终止子、标记基因(抗生素抗性基因)、目的基因、复制原点,还缺少启动子。启动子位于目的基因的上游,是RNA聚合酶识别和结合的部位,所以X最可能是启动子。
3.(2025·海南检测)PCR是聚合酶链式反应的缩写,下图表示PCR的过程,下列叙述错误的是(　　)
[A]反应体系中需加入耐高温的DNA聚合酶,该酶在B过程起作用
[B]引物a和引物b的长度应适宜,且相互之间不能发生碱基互补配对
[C]PCR是体外进行的DNA扩增,PCR扩增遵循DNA半保留复制原则
[D]A过程通过高温破坏DNA分子中的氢键,使双链DNA解聚为单链
A
【解析】 反应体系中需加入耐高温的DNA聚合酶,该酶的作用是催化合成DNA子链,在C过程中起作用。
4.(2023·新课标卷)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具,将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接,以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是(　　)
[A]质粒和目的基因都用酶3切割,用E.coli DNA连接酶连接
[B]质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割,用T4 DNA连接酶连接
[C]质粒和目的基因都用酶1和酶2切割,用T4 DNA连接酶连接
[D]质粒和目的基因都用酶2和酶4切割,用E.coli DNA连接酶连接
C
【解析】 酶3切割后得到的是平末端,应该用T4 DNA连接酶连接,且只用一种限制酶切割质粒和目的基因,会使质粒和目的基因发生自身环化或者使目的基因在质粒中反向连接;质粒用酶3切割后得到平末端,目的基因用酶1切割后得到的是黏性末端,二者不能连接;质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端,用T4 DNA连接酶连接后,还能保证目的基因在质粒上的连接方向,此重组表达载体的构建方案最合理且高效;若用酶2和酶4切割质粒和目的基因,产生的黏性末端相同,会使质粒和目的基因自身环化或者使目的基因在质粒中反向连接,并且用酶4切割会破坏质粒上的抗生素抗性基因,连接形成的基因表达载体缺少标记基因,无法进行后续的筛选。
5.若要利用某目的基因(图甲)和P1噬菌体载体(图乙)构建重组DNA(图丙),限制酶的识别序列和切割位点分别是BglⅡ(A↓GATCT)、EcoRⅠ(G↓AATTC)和Sau3AⅠ
(↓GATC)。下列方案最合理的是(　　)
[A]用EcoRⅠ切割含目的基因的DNA片段和P1噬菌体载体
[B]用BglⅡ和EcoRⅠ切割含目的基因的DNA片段和P1噬菌体载体
[C]用BglⅡ和Sau3AⅠ切割含目的基因的DNA片段和P1噬菌体载体
[D]用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割含目的基因的DNA片段和P1噬菌体载体
D
【解析】 用EcoRⅠ切割含目的基因的DNA片段和P1噬菌体载体,产生相同的黏性末端,用DNA连接酶连接时可能会发生反向连接;用BglⅡ和EcoRⅠ切割含目的基因的DNA片段会产生两种DNA片段,一种含有目的基因,一种不含目的基因,且有目的基因的片段(两端黏性末端均为AATT)无法与酶切后的载体(黏性末端分别为AATT和GATC)结合;用Bgl Ⅱ和Sau 3AⅠ切割含目的基因的DNA片段和P1噬菌体载体,也能产生相同的黏性末端,可能会发生反向连接;
用EcoRⅠ和Sau 3AⅠ切割含目的基因的DNA片段和
P1噬菌体载体,产生不同的黏性末端,目的基因插入载
体后,RNA聚合酶的移动方向与图丙相同。
联系实际 迁移应用
大刍草具有较强的耐盐碱能力,该性状与M蛋白有关。科学家通过PCR技术获取和扩增M蛋白基因,如图1所示。将获得的大量M蛋白基因与质粒构建基因表达载体,各部分结构如图2所示。
(1)据图1分析,PCR过程应选择的引物是 。
引物Ⅱ、引物Ⅲ
(2)在M蛋白基因两端设计不同黏性末端的目的是
。质粒中氨苄青霉素抗性基因的作用是 。
(3)为实现质粒和M蛋白基因的连接,切割质粒时选用限制酶XmaⅠ而不选用限制酶SmaⅠ的原因是
。 为将M蛋白基因连接到质粒上,还需要 等酶。
防止M蛋白基因自身环化,
保证M蛋白基因在质粒上正向连接
便于重组DNA分子的筛选
XmaⅠ切出的黏性末端与M蛋白基因一端的黏性末
端相同,SmaⅠ的酶切末端为平末端,无法与M蛋白基因的黏性末端连接
BglⅡ、DNA连接酶第2节　基因工程的基本操作程序
第1课时　目的基因的筛选与获取和基因表达载体的构建
课时作业
(时间:30分钟　分值:52分)
第1~6题每题3分,第7~8题每题6分,共计30分。
基础对点练
知识点1　目的基因的筛选与获取
1.下列有关获取目的基因的叙述错误的是(　　)
[A]目的基因就是编码蛋白质的基因
[B]筛选和获取目的基因是基因工程的第一步
[C]来自苏云金杆菌的Bt基因可作为转基因抗虫棉的目的基因
[D]序列比对工具的应用为科学家找到合适的目的基因提供了更多的机会
【答案】 A
【解析】 目的基因主要是指编码蛋白质的基因,少数是具有调控作用的因子,如启动子、终止子等。
2.下列关于PCR的叙述,正确的是(　　)
[A]PCR是体外DNA复制技术,关键酶是解旋酶和DNA聚合酶
[B]DNA聚合酶从引物的5′端开始连接脱氧核苷酸
[C]第三轮循环产物中出现位于两种引物之间的DNA片段
[D]延伸过程需要酶、ATP和4种核糖核苷酸
【答案】 C
【解析】 PCR过程中不需要解旋酶,需要耐高温的DNA聚合酶;DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸;第三轮循环产物中出现位于两种引物之间的DNA片段;延伸过程中所需原料是4种游离的脱氧核苷酸,不是核糖核苷酸,也不需要ATP。
3.下列关于PCR的叙述,错误的是(　　)
[A]PCR只能扩增引物之间的DNA片段而非整个完整的模板DNA分子
[B]PCR过程中变性的目的是让引物与模板DNA单链结合
[C]PCR的原理是DNA半保留复制
[D]PCR的过程需要耐高温的DNA聚合酶,但不需要解旋酶
【答案】 B
【解析】 变性的目的是通过升高温度,破坏氢键,使双链DNA解聚为单链,为子链的延伸提供模板。
4.(2025·咸阳期末)PCR引物的3′端为结合模板DNA的关键,5′端无严格限制,可用于添加限制酶切点等序列,dNTP是DNA合成的原料,还可供能。下列相关说法错误的是(　　)
[A]图示环节所需的温度比上一个环节的低
[B]引物的设计要有一段已知目的基因的核苷酸序列
[C]耐高温的DNA聚合酶只能从引物的3′端开始延伸DNA链
[D]一个循环后,子代DNA双链的脱氧核苷酸数量相同
【答案】 D
【解析】 由图可知,一个循环后,子代DNA双链的脱氧核苷酸数量不相同。
知识点2　基因表达载体的构建
5.下列关于基因表达载体的说法,不正确的是(　　)
[A]基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤
[B]基因表达载体包含启动子、目的基因、终止子、标记基因等
[C]终止子位于目的基因的下游,能够终止翻译过程
[D]不同的目的基因所需的启动子不一定相同
【答案】 C
【解析】 终止子位于目的基因的下游,能够终止转录过程。
6.科学家利用质粒(如图)成功构建了蛛丝蛋白基因的重组质粒,并在家蚕丝腺细胞中获得大量蛛丝蛋白。下列有关说法错误的是(　　)
[A]为防止目的基因自身环化,可以用限制酶XbaⅠ和SacⅠ来切割目的基因
[B]构建基因表达载体时选用蚕丝蛋白基因的启动子利于基因在家蚕丝腺细胞中表达
[C]启动子是DNA聚合酶的识别和结合部位,可以驱动遗传信息的转录
[D]基因表达载体中的标记基因可以用来鉴别与选择含有蛛丝蛋白基因的受体细胞
【答案】 C
【解析】 启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位。
综合提升练
7.如图表示pBR322质粒和人生长激素基因所在片段的结构信息,将二者构建的重组质粒导入受体菌并进行筛选。下列有关叙述正确的是(　　)
注:AmpR为氨苄青霉素抗性基因,TetR为四环素抗性基因。
[A]可选择的限制酶组合是酶E和酶G
[B]所选用的受体菌不能含有AmpR和TetR
[C]用含氨苄青霉素的培养基就能筛选出含重组质粒的受体菌
[D]同时用三种限制酶处理图中质粒,电泳后可得到3个条带
【答案】 B
【解析】 酶E会破坏质粒上的两种标记基因,为使切割后的目的基因与质粒正向连接,又保留质粒上的标记基因,切割时应选择的限制酶组合是酶F和酶G;重组质粒上的TetR被破坏,AmpR能表达,用含氨苄青霉素的培养基筛选出的受体菌有导入重组质粒的受体菌和导入普通质粒的受体菌;据题图可知,同时用三种限制酶处理图中质粒,能将质粒切割成
4个大小不同的DNA片段,电泳后可得到4个条带。
8.PCR扩增仪的温度、时间和循环次数等参数设定不当会影响基因的扩增结果。下图是PCR扩增目的基因时的参数设定,图中线上、线下分别为温度和时间设定。下列叙述错误的是(　　)
[A]步骤2的温度及时间设定受目的基因的G、C含量的影响
[B]步骤3的温度及时间设定受引物的长度及G、C含量的影响
[C]步骤4延伸时间的设定主要依据目的基因的碱基数目
[D]步骤5除设定循环次数(25次)外,还应将“GOTO”设定为步骤3
【答案】 D
【解析】 步骤2是变性过程,是在高温条件下使DNA分子解聚为单链的过程,由于G和C之间有3个氢键,热稳定性高,故步骤2的温度及时间设定要根据目的基因的G、C含量调整;步骤3是复性过程,一般情况下,引物的长度越长,G和C比例越高,则复性步骤中的复性温度设定就越高;步骤4是延伸过程,时长的设置依据目的基因的长度,即主要依据目的基因的碱基数目;“GOTO”是设置返回的步骤序号,参数应设置为步骤2,以进行“变性—复性—延伸”的循环。
9.(8分)图a中的三个DNA片段上依次表示出了EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3A Ⅰ三种限制性内切核酸酶的识别序列与切割位点,图b为某种表达载体的示意图(载体上的EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切割位点是唯一的)。根据基因工程的有关知识,回答下列问题。
(1)经BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被　　　　酶切后的产物连接,理由是　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(2)若某人利用图b所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组表达载体,如图c所示,这三种重组表达载体中,不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有　　　　,不能表达的原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　　　　
　　　 　　　。
【答案】 (除标注外,每空2分)
(1)Sau3AⅠ　两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端　(2)甲、丙　甲中目的基因插入在启动子的上游,丙中目的基因插入在终止子的下游,二者的目的基因均不能被转录
【解析】 (2)在基因表达载体中,启动子应位于目的基因的上游,终止子应位于目的基因的下游,这样目的基因才能转录。题图c中甲、丙均不符合,所以不能在宿主细胞中表达目的基因产物。
10.(14分)苯丙酮尿症是单基因遗传病,科学家将正常基因D导入该病患者的细胞,以治疗该病。图甲为A、B、C三种质粒,图乙为含有目的基因D的DNA片段,图丙为重组载体的示意图。AmpR为氨苄青霉素抗性基因,Tet r为四环素抗性基因。LacZ基因编码产生的酶可以分解物质X-gal,从而使菌落呈现蓝色;若无该基因或该基因被破坏,则菌落呈白色。EcoRⅠ(0.6 kb)、PvuⅠ(0.8 kb)为限制酶及其切割位点与复制原点之间的距离。回答下列问题。
(1)图甲中三种质粒适宜作为载体的是质粒　　 　　。
(2)获取目的基因D时应选择图乙中的　 　　对其所在的DNA进行切割。
(3)将目的基因D和图甲中相应质粒连接后,得到图丙中三种方式。为选出正向连接的重组质粒,使用　　　　对质粒完全酶切。若是正向连接载体,能得到长度为　　 　　kb和　　 　　kb两条DNA片段。
(4)利用自身不含LacZ基因且对抗生素敏感的大肠杆菌作为受体细胞,要在已转化的含重组质粒的受体细胞、已转化的含空质粒的受体细胞和未转化成功的细胞中筛选出已转化的含重组质粒的受体细胞的方法是在含有　　 　　和　 　　　的培养基上培养,形成　　 　　(填“蓝色”或“白色”)菌落的为导入重组质粒的受体细胞。
【答案】 (除标注外,每空2分)
(1)B(1分)
(2)PvuⅠ(1分)
(3)EcoRⅠ　1.2　5.5
(4)氨苄青霉素　X-gal　白色
【解析】 (1)图甲中三种质粒适宜作为载体的是质粒B,因为质粒B含有与目的基因相同的酶切位点,而且相应的限制酶切割后,可以保留氨苄青霉素抗性基因的完整性。质粒A无标记基因,质粒C被限制酶切割后会破坏复制原点。
(2)获取目的基因D时应选择图乙中的PvuⅠ对其所在的DNA进行切割,因为目的基因两端存在PvuⅠ酶切位点。
(3)为选出正向连接的重组质粒,应使用EcoRⅠ对质粒完全酶切,并进行电泳分析。质粒B中EcoRⅠ酶切位点与PvuⅠ酶切位点之间的距离为0.2 kb,若是正向连接载体,重组质粒中2个EcoRⅠ酶切位点之间的距离是0.2+1.0=1.2(kb),重组质粒长度为2.7+4.0=6.7(kb),故EcoRⅠ酶切后,若是正向连接载体,能得到长度为1.2 kb和5.5 kb两条DNA片段。
(4)重组质粒中含有氨苄青霉素抗性基因,那么含有重组质粒的受体细胞可以在含有氨苄青霉素的培养基中生存,由于目的基因插入到了LacZ基因中,LacZ基因被破坏,因此含有重组质粒的受体细胞无法产生可以分解物质Xgal的酶,从而使菌落显现出白色。因此要筛选出已转化的含重组质粒的受体细胞的方法是在含有氨苄青霉素和Xgal的培养基上培养,形成白色菌落的为导入重组质粒的受体细胞。

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