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第4节　蛋白质工程的原理和应用
[学习目标]　1.说出蛋白质工程崛起的缘由。2.概述蛋白质工程的基本原理。3.举例说明依据人类需要对原有蛋白质结构进行基因改造、生产目标蛋白的过程。
一、蛋白质工程
1.蛋白质工程的概念
2.蛋白质工程崛起的缘由
(1)崛起缘由。
①基因工程的实质:将一种生物的基因转移到另一种生物体内,后者可以产生它本不能产生的蛋白质,进而表现出新的性状。
②基因工程的不足:基因工程原则上只能生产自然界中已存在的蛋白质。
③天然蛋白质的不足:天然蛋白质的结构和功能符合特定物种生存的需要,却不一定完全符合人类生产和生活的需要。
(2)实例:提高玉米赖氨酸含量。
改造后玉米叶片和种子中游离赖氨酸的含量分别提高5倍和2倍。
二、蛋白质工程的基本原理
三、蛋白质工程的应用
1.医药工业方面
(1)科学家通过对胰岛素基因的改造,研发出速效胰岛素类似物。
(2)
(3)人—鼠嵌合抗体:降低诱发免疫反应的强度。
2.其他工业方面
用于改进酶的性能或开发新的工业用酶,如利用蛋白质工程获得枯草杆菌蛋白酶的突变体,筛选出符合工业化生产需求的突变体,提高该酶的使用价值。
3.农业方面
(1)科学家尝试改造某些参与调控光合作用的酶,以提高植物光合作用的效率,增加粮食的产量。
(2)科学家利用蛋白质工程的思路来设计优良微生物农药,通过改造微生物蛋白质的结构,使它防治病虫害的效果增强。
判断正误
(1)蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作,定向改变分子的结构。(　　)
【答案】 ×
【提示】 蛋白质工程中直接改造的是基因,不是蛋白质。
(2)蛋白质工程能产生自然界中不存在的新型蛋白质分子。(　　)
【答案】 √
(3)基因工程遵循中心法则,而蛋白质工程不遵循。(　　)
【答案】 ×
【提示】 蛋白质工程也遵循中心法则。
(4)根据某多肽链的一段氨基酸序列,可以很容易地确定控制该肽链合成的基因的脱氧核苷酸序列。(　　)
【答案】 ×
【提示】 由于密码子具有简并性,根据某多肽链的一段氨基酸序列,不能确定基因的脱氧核苷酸序列。
(5)蛋白质工程是一项难度很大的工程,主要是因为人们对蛋白质复杂的高级结构没有完全认识。(　　)
【答案】 √
任务一　分析蛋白质工程的基本原理
　　基因工程原则上只能生产自然界已存在的蛋白质。蛋白质工程的目标是生产出符合人类生产和生活需要的蛋白质,甚至是自然界不存在的蛋白质。结合图示回答有关问题。
(1)写出流程图中字母代表的含义。
A.预期功能;B.氨基酸序列;C.改造或合成;D.转录;E翻译。
(2)如何由蛋白质氨基酸序列找到相对应的脱氧核苷酸序列
【提示】 先根据氨基酸与密码子的对应关系找到对应的mRNA,再根据mRNA与DNA的碱基互补配对关系找到相对应的脱氧核苷酸序列。
(3)如果已经推测出多肽中的氨基酸序列,那么据此推测出的基因中的碱基序列有多种,原因是什么
【提示】 决定一种氨基酸的密码子往往不止一种,因此获得的基因的碱基序列有多种。
(4)对天然蛋白质进行改造,你认为应该直接对蛋白质分子进行操作,还是通过对基因的操作来实现 原因是什么
【提示】 应该通过对基因的操作来实现对天然蛋白质的改造。主要原因:①蛋白质具有十分复杂的空间结构,基因的结构相对简单,容易改造;②改造后的基因可以遗传给下一代,被改造的蛋白质无法遗传。
核心归纳
蛋白质工程与基因工程的区别和联系
典型例题
1.天然胰岛素易形成二聚体,使得其疗效被延缓。科研人员通过蛋白质工程使胰岛素第28位的脯氨酸替换为天冬氨酸,从而抑制了胰岛素的聚合,由此研发出的速效胰岛素类似物产品已经在临床上广泛应用,以下叙述错误的是(　　)
[A]改造胰岛素的过程实际是改造胰岛素基因的过程
[B]若要改变蛋白质的功能,可通过改变蛋白质的氨基酸序列实现
[C]可将通过定点突变技术获得的新的胰岛素基因直接导入大肠杆菌用于发酵生产
[D]在通过蛋白质工程对胰岛素改造的过程中,对蛋白质分子结构的了解是非常关键的
【答案】 C
【解析】 基因指导蛋白质的合成,改造胰岛素的过程实际是改造胰岛素基因的过程;若要改变蛋白质的功能,可通过改变蛋白质的氨基酸序列实现;新的胰岛素基因不能直接导入大肠杆菌,需要先构建基因表达载体;蛋白质工程的基本途径是预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变对应的脱氧核苷酸序列(基因),因此在通过蛋白质工程对胰岛素改造的过程中,对蛋白质分子结构的了解是非常关键的。
2.(2025·来宾检测)通过蛋白质工程可以改造蛋白质,或制造一种新的蛋白质,以满足人类生产和生活的需要。下列叙述正确的是(　　)
[A]蛋白质工程只需要改造蛋白质,基因工程只需要改造基因
[B]天然蛋白质的合成过程与蛋白质工程的过程完全相同
[C]蛋白质工程要改造蛋白质所有的氨基酸序列
[D]蛋白质工程可以通过改造蛋白质,来改变酶的催化效率
【答案】 D
【解析】 蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出来的第二代基因工程,需要对基因进行改造;天然蛋白质的合成过程是按照中心法则进行的,蛋白质工程的过程与中心法则相反;蛋白质工程不需要改造蛋白质所有的氨基酸序列;蛋白质工程可以通过改造蛋白质,来改变酶的催化效率。
任务二　分析蛋白质工程的应用
　　小鼠单克隆抗体的制备比较简单,但这种鼠源性的单克隆抗体会被人的免疫系统排斥,不能直接用于人体。嵌合抗体就是保留鼠单克隆抗体的可变区,而用人抗体的恒定区替换鼠单克隆抗体的恒定区,这种嵌合抗体的抗原性显著下降,而抗体的特异识别功能没有丧失。目前,已有多种嵌合抗体用于临床治疗。
(1)生产人鼠嵌合抗体利用了哪种生物工程技术,该工程技术的目的是什么
【提示】 蛋白质工程。目的是改造现有蛋白质或制造一种新的蛋白质,满足人类生产和生活的需求。
(2)改造鼠单克隆抗体时,改造恒定区而不是可变区,原因是什么
【提示】 可变区是特异性识别抗原的区域,若进行改造就不能识别特定的抗原。
(3)经过改造的人鼠嵌合抗体,与鼠单克隆抗体相比较,突出的优点是什么 (从免疫角度考虑)
【提示】 降低诱发免疫反应的强度,人体的不良反应减少。
(4)人鼠嵌合抗体制造过程中对科学家最大的挑战是什么
【提示】 设计嵌合抗体的空间结构。
典型例题
3.T4溶菌酶在温度较高时易失去活性。科学家对编码T4溶菌酶的基因进行改造,使其表达的溶菌酶第3位的异亮氨酸变为半胱氨酸,在该半胱氨酸与第97位的半胱氨酸之间可形成一个二硫键,进而提高了T4溶菌酶的耐热性。下列叙述正确的是(　　)
[A]高温时T4溶菌酶失活只与二硫键断裂有关
[B]改造的实质是改变基因中相关的碱基序列
[C]该过程依据的原理主要是DNA的复制
[D]该技术通过改造基因实现,属于基因工程
【答案】 B
【解析】 蛋白质的结构决定其功能,高温会使蛋白质的空间结构遭到破坏,从而导致蛋白质失去活性。T4溶菌酶在温度较高时易失去活性,是因为高温破坏了其空间结构,而不仅仅与二硫键断裂有关;基因指导蛋白质的合成,对T4溶菌酶的改造,实质是对编码T4溶菌酶的基因进行改造,即改变基因中相关的碱基序列;该过程属于蛋白质工程,依据的原理主要是中心法则的逆过程。
随堂检测反馈
1.(2025·开封检测)葡萄糖异构酶(GI)在工业上应用广泛,为提高其热稳定性,科学家对GI基因进行体外定点诱变,以脯氨酸(Pro138)替代甘氨酸(Gly138),含突变体的重组质粒在大肠杆菌中表达,结果最适反应温度提高10～12 ℃。这属于生物工程中的(　　)
[A]基因工程 [B]蛋白质工程
[C]发酵工程 [D]酶工程
【答案】 B
【解析】 题中是对基因进行修饰改造,以实现对现有蛋白质的改造,属于蛋白质工程。
2.水蛭素是一种蛋白质,可用于预防和治疗血栓。研究人员发现,用赖氨酸替换水蛭素第47位的天冬酰胺可以提高它的抗凝血活性。这项替换研究工作(　　)
[A]原理是中心法则
[B]可行的直接操作对象是水蛭素
[C]可通过改造或修饰基因来实现
[D]改变了蛋白质的活性而不改变蛋白质的结构
【答案】 C
【解析】 天然蛋白质合成的过程是按照中心法则进行的,而这项替换研究工作属于蛋白质工程,原理是中心法则的逆过程;可行的直接操作对象是水蛭素基因,可通过改造或修饰水蛭素基因来实现;结构决定功能,氨基酸序列的改变使蛋白质的结构和功能同时发生改变。
3.蛋白质工程是研究蛋白质结构和功能的重要手段,下列关于蛋白质工程的叙述正确的是(　　)
[A]蛋白质工程中可以不用构建基因表达载体
[B]通过蛋白质工程改造后获得的性状不能遗传给后代
[C]蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作
[D]蛋白质工程可以通过增加酶内部二硫键数目提高酶的热稳定性
【答案】 D
【解析】 蛋白质工程是基因工程的延伸,需要构建基因表达载体;蛋白质工程是直接对基因进行修饰或合成新基因,改造后的性状可以遗传给后代;蛋白质工程可以通过增加酶内部二硫键数目来提高酶的热稳定性。
4.(2025·安庆检测)中华鲟是地球上最古老的脊椎动物,被称为“活化石”。研究者试图通过蛋白质工程改造中华鲟体内的某些蛋白质,使其更加适应现在的水域环境。以下说法错误的是(　　)
[A]该工程可以定向改变蛋白质分子的结构
[B]改造蛋白质是通过改造基因而实现的
[C]改造后的中华鲟和现有中华鲟仍是同一物种
[D]改造后的中华鲟的后代不具有改造的蛋白质
【答案】 D
【解析】 蛋白质工程改造的是基因,可以遗传给后代。
5.Bt抗虫蛋白的第5号螺旋可在害虫肠上皮细胞膜上形成孔道结构,位于该螺旋疏水部分的第168位组氨酸是维持孔道结构稳定的关键。该孔道结构越稳定,Bt抗虫蛋白对害虫的毒性越大。研究人员拟对该蛋白进行改造以提高其抗虫效果,相关叙述正确的是(　　)
[A]蛋白质工程是对蛋白质中的氨基酸分子进行设计和改造
[B]改造Bt抗虫蛋白应首先从设计Bt抗虫蛋白基因中的脱氧核苷酸序列出发
[C]将第168位组氨酸替换成亲水性更强的氨基酸可增强Bt抗虫蛋白的抗虫效果
[D]蛋白质工程难度很大,主要是因为需要设计改造的蛋白质有复杂的高级结构
【答案】 D
【解析】 蛋白质工程是通过改造或合成基因,来改造现有蛋白质,或制造一种新的蛋白质;改造Bt抗虫蛋白应首先从预期的蛋白质功能出发;由题意可知,位于该螺旋疏水部分的第168位组氨酸是维持孔道结构稳定的关键,该孔道结构越稳定,Bt抗虫蛋白对害虫的毒性越大,因此将第168位组氨酸替换成亲水性更强的氨基酸会降低Bt抗虫蛋白的抗虫效果;多数蛋白质除了具有一级结构(即氨基酸顺序),还具有复杂的高级结构,即空间结构,而很多蛋白质的空间结构是人们目前还不清楚的,因此实施蛋白质工程的难度很大。
　　苏云金杆菌中的杀虫晶体蛋白Cry具有杀虫毒性,但Cry蛋白存在杀虫谱窄、毒力有限等问题,制约了其在农业生产中的进一步应用。科学家通过定点突变,将Cry蛋白第168位的组氨酸替换为精氨酸后,Cry蛋白对烟草天蛾的毒性提高了3倍。回答下列问题。
(1)科学家将Cry蛋白第168位的组氨酸替换为精氨酸,生产出性能优良的Cry突变蛋白的生物技术手段属于蛋白质工程。
(2)获得性能优良的Cry突变蛋白的正确顺序是②⑤①④③(选择正确编号并排序)。
①借助定点突变改造Cry基因序列
②Cry蛋白功能分析和结构设计
③检验Cry蛋白的结构和功能
④利用工程菌发酵合成Cry蛋白
⑤设计Cry蛋白氨基酸序列和基因序列
(3)重叠延伸PCR技术可以实现基因的定点诱变,科学家利用该技术实现对Cry基因的改造以获得Cry改良基因,其操作步骤如图所示。
Ⅰ.利用重叠延伸PCR技术扩增DNA片段时遵循的原理是DNA半保留复制。
Ⅱ.实现基因的定点诱变时,需要根据目的基因序列设计两个常规引物(a、d),突变碱基序列所处位置设计两个突变引物(b、c)。通过PCR1能得到大量产物AB,该过程需要加入引物a、b,通过PCR2能得到大量产物CD,PCR1和PCR2必须分两个系统进行,不能在同一个系统里面,这样做是为了防止两种突变引物在扩增时发生互补配对,从而失去作用。
(4)在获取性能优良的Cry突变蛋白的过程中,科学家是通过对基因的操作来实现的,而不是直接对天然的Cry蛋白进行操作,主要原因是Cry蛋白具有十分复杂的空间结构,而Cry基因的结构相对简单,更容易改造;Cry突变基因可以遗传给下一代,Cry突变蛋白不能遗传(答出1点)。
课时作业
(时间:30分钟　分值:45分)
第1～7题每题3分,共计21分。
基础对点练
知识点1　蛋白质工程的概念及基本原理
1.下列有关蛋白质工程的叙述,错误的是(　　)
[A]蛋白质工程可以改造蛋白酶的空间结构,提高酶的活性
[B]蛋白质工程的操作过程中,需先合成mRNA后合成基因
[C]蛋白质工程与天然合成蛋白质的遗传信息流向有所不同
[D]蛋白质工程进行中难度最大的操作是设计蛋白质的结构
【答案】 B
【解析】 蛋白质工程的基本思路:从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→获得所需要的蛋白质,过程中无须先合成mRNA后合成基因。
2.(2025·重庆检测)水蛭素是一种蛋白质,可用于预防和治疗血栓,但在治疗过程中发现其抗凝血活性低。研究人员欲提高水蛭素抗凝血活性,正确的操作步骤是(　　)
①确定影响活性的氨基酸序列　②分析水蛭素的空间结构,找到影响其活性的结构域　③推测需要替换的氨基酸序列　④构建表达载体,使其在受体细胞中表达　⑤PCR技术获得改造后的水蛭素基因　⑥确定基因中的碱基序列
[A]②①③⑤⑥④ [B]②③⑥①⑤④
[C]②①③⑥⑤④ [D]①②③④⑤⑥
【答案】 C
【解析】 运用蛋白质工程技术,先分析水蛭素的空间结构,找到影响其活性的结构域,然后确定影响活性的氨基酸序列,推测需要替换的氨基酸序列,最终确定基因中的碱基序列,据此通过PCR技术获得改造后的水蛭素基因,并构建表达载体,使其在受体细胞中表达。
3.蛋白质工程中,要对蛋白质结构进行设计改造,必须通过改造或合成基因来完成,而不直接改造蛋白质,最主要的原因是(　　)
[A]缺乏改造蛋白质所必需的工具酶
[B]改造基因易于操作且改造后能够遗传
[C]人类对大多数蛋白质高级结构知之甚少
[D]蛋白质中氨基酸的排列顺序千变万化,操作难度大
【答案】 B
【解析】 由于基因控制蛋白质的合成,所以对蛋白质设计改造可通过对基因进行改造或合成来完成,且改造后的基因能够遗传给子代。
4.有关基因工程和蛋白质工程的叙述,正确的是(　　)
[A]载体上的标记基因有利于筛选含重组DNA的细胞和促进目的基因表达
[B]限制酶可以识别一小段特殊的核苷酸序列,并在特定位点处切开
[C]以蛋白质的氨基酸序列为依据合成的目的基因与原基因相同
[D]蛋白质工程是指在分子水平上对蛋白质直接进行操作,定向改变分子的结构
【答案】 B
【解析】 载体上的标记基因有利于筛选含重组DNA的细胞,不能促进目的基因表达;限制酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列,并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开;基因表达过程中,可能会对mRNA进行剪切和修饰,且密码子具有简并性,所以以蛋白质的氨基酸序列为依据合成的目的基因与原基因不一定相同;蛋白质工程通常涉及对编码蛋白质的基因进行改造,而不是在分子水平上对蛋白质直接进行操作。
知识点2　蛋白质工程的应用
5.(2025·柳州检测)白细胞介素2(IL2)是一种细胞因子,含有3个半胱氨酸,分别位于58、105、125位,现用大肠杆菌生产IL2,为保证产物活性,将其基因中编码125位半胱氨酸的序列突变为丝氨酸序列。下列叙述错误的是(　　)
[A]突变的IL2基因的序列发生了碱基对的增添
[B]完成氨基酸的替换需要通过改造基因实现
[C]蛋白质工程的操作流程与中心法则的流动方向相反
[D]该技术可通过基因改造或合成构建出一种自然界中原先不存在的全新的基因
【答案】 A
【解析】 由题意可知,为保证产物活性,将IL2基因中编码125位半胱氨酸的序列突变为丝氨酸序列,只有一个氨基酸发生了改变,应是发生了碱基对的替换,而不是碱基对的增添。
6.科研人员以β甘露聚糖酶为核心研究材料,在其N端找到了两个关键的氨基酸位点,将这两个位点的组氨酸和脯氨酸分别替换为酪氨酸后,其热稳定性得到了显著提高。下列说法正确的是(　　)
[A]细胞内合成改造后的高热稳定性蛋白质的过程不遵循中心法则
[B]替换蛋白质中的氨基酸实际可通过改造基因中的碱基序列实现
[C]在分子水平上,可利用PCR等技术检测细胞内是否合成新的蛋白质
[D]制备过程中应先获得目标蛋白质的三维结构,再预期其生物学功能
【答案】 B
【解析】 细胞内蛋白质的合成过程都遵循中心法则;基因指导蛋白质的合成,所以替换蛋白质中的氨基酸实际可通过改造基因中的碱基序列实现;PCR等技术能检测目的基因是否导入细胞或是否转录,检测细胞内是否合成新的蛋白质可利用抗原—抗体杂交法;制备过程中要先预期目标蛋白质的生物学功能,再设计获得目标蛋白质的三维结构。
7.β防御素是由H基因编码的抗菌肽,可构建重组毕赤酵母并通过其发酵作用实现量产。但重组毕赤酵母合成的β防御素与人β防御素的结构存在差异,因此β防御素具有潜在的抗原性,如果用作防腐剂添加到食品中可能会引起人体发生过敏反应。蛋白质工程可改造β防御素,减轻其引起的过敏反应。下列有关叙述正确的是(　　)
[A]为减轻过敏反应,可改造H基因以去掉β防御素中抗原性较强的部分
[B]将改造后的H基因加上启动子再导入毕赤酵母,就可以使其完成表达
[C]通过蛋白质工程获得的新型β防御素与天然β防御素属于同一种蛋白质
[D]依据改造的β防御素氨基酸序列可推测新β防御素基因的核糖核苷酸序列
【答案】 A
【解析】 蛋白质工程通过改造基因来改造蛋白质,本题中为减轻过敏反应,通过改造H基因,使β防御素结构改变,去掉β防御素中抗原性较强的部分;将改造后的H基因,加上启动子、终止子等元件,并构建基因表达载体,再导入毕赤酵母,才能使其完成表达;通过蛋白质工程获得的新型β防御素在结构上与天然β防御素不同,不属于同一种蛋白质;依据改造的β防御素氨基酸序列可推测新β防御素基因的脱氧核苷酸序列。
综合提升练
8.(12分)(2022·湖南卷)水蛭是我国的传统中药材,主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一,具有良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构,提高其抗凝血活性。回答下列问题。
(1)蛋白质工程流程如图所示,物质a是　　　　,物质b是　　　　。在生产过程中,物质b可能不同,合成的蛋白质空间构象却相同,原因是　　　　　　　　　　　　。
(2)蛋白质工程是基因工程的延伸,基因工程中获取目的基因的常用方法有　　　　　　、
　　　　　和利用PCR技术扩增。PCR技术遵循的基本原理是　　　　　　　　　　。
(3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后,分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性,结果如图所示。推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的　　　　(填“种类”或“含量”)有关,导致其活性不同的原因是　　　　　　　　　　　　　　　　。
(4)若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异,简要写出实验设计思路 　。
【答案】 (除标注外,每空1分)
(1)多肽链　mRNA　密码子具有简并性
(2)从基因文库中获取目的基因　人工合成　DNA半保留复制
(3)种类　对水蛭蛋白进行酶解时酶的种类不同,导致水蛭蛋白水解产物的空间结构不同(2分)
(4)取3支试管,分别加入等量的蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素;取同一种动物(如家兔)血液,立即将等量的血液加入1、2、3号3支试管中,静置,统计3支试管中血液凝固时间(3分)
【解析】 (1)分析题图可知,物质a是多肽链,物质b是mRNA。在生产过程中,物质b可能不同,合成的蛋白质空间构象却相同,原因是密码子具有简并性,即一种氨基酸可能对应几个密码子。
(2)蛋白质工程是基因工程的延伸,基因工程中获取目的基因的常用方法有从基因文库中获取目的基因、通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成和利用PCR技术扩增。PCR技术遵循的基本原理是DNA半保留复制。
(3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后,据图可知,水解产物中的肽含量随着酶解时间的延长均上升,且差别不大;而水解产物的抗凝血活性有差异,经酶甲处理后,随着酶解时间的延长,抗凝血活性先上升后相对稳定,经酶乙处理后,随着酶解时间的延长,抗凝血活性先上升后下降,且酶甲处理后的酶解产物的抗凝血活性最终高于经酶乙处理后的酶解产物的抗凝血活性,差异明显,据此推测两种酶分别处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的种类有关,导致其活性不同的原因是对水蛭蛋白进行水解时酶的种类不同,导致水蛭蛋白水解产物的空间结构不同。
(4)若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异,实验设计思路为取3支试管,分别加入等量的蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素;取同一种动物(如家兔)血液,立即将等量的血液加入1、2、3号3支试管中,静置,统计3支试管中血液凝固时间。
9.(12分)人体内的tPA蛋白能高效降解血栓,是心梗和脑血栓的急救药。然而,为心梗患者注射大剂量的tPA蛋白会诱发颅内出血。研究证实,将tPA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸,能显著降低出血副作用。据此,先对天然的tPA基因进行序列改造,然后再采取传统的基因工程方法表达该改良基因,可制造出性能优异的tPA改良蛋白。下图是通过两次PCR操作,运用大引物进行定点突变获取tPA改良基因和利用质粒pCLYⅡ构建含
tPA改良基因的重组质粒示意图。(注:一次PCR操作可进行多次循环)
(1)科学家将tPA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸,生产出性能优良的tPA改良蛋白属于
　　　　　工程。tPA改良基因形成是tPA基因发生了碱基的　　　　　。
(2)已知tPA蛋白第84位是半胱氨酸,相应的基因模板链(图中tPA基因的上链)上的碱基序列是ACA,丝氨酸的密码子是UCU。获取tPA改良基因过程中需要以下三种引物:
引物Ⅰ:5'CGCGAAA AGACGGTTCA-3'(下划线 为突变基因位点)
引物Ⅱ:5'ACCCGGGCGAACATCGTA-3'(下划线字母为XmaⅠ酶切序列)
引物Ⅲ:5'GTAGATCTGGCCTCGAGTA-3'(下划线字母为BglⅡ酶切序列)
在上述引物中,引物Ⅰ中突变基因位点是碱基　　　　(填“A”“T”“C”或“G”),第一次PCR操作中使用的引物有　　 　、　　　　。下游大引物是　　　　(填“①”或“②”)链。
(3)PCR操作中复性的目的是　　　　　　　　。第二次PCR过程中至少需要　　　　次循环才能获得双链等长tPA改良基因。
(4)研究人员将重组质粒导入大肠杆菌常用的方法是　　 　　　,转化后的大肠杆菌需接种在含有　　　　的培养基上进行筛选。对于该基因的检测,通常需进一步通过　　　　　等技术进行检测。
【答案】 (除标注外,每空1分)
(1)蛋白质　替换
(2)G　Ⅰ　Ⅲ　②(2分)
(3)使引物与单链DNA结合　两
(4)Ca2+处理法　新霉素　PCR
【解析】 (1)科学家将tPA蛋白的第84位的半胱氨酸换成丝氨酸,生产出性能优良的tPA改良蛋白属于蛋白质工程,tPA改良基因形成是tPA基因发生了碱基的替换。
(2)由图可知,突变上游引物(引物Ⅰ)中引入突变碱基,结合题意可知,突变后,tPA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸,而相应的基因模板链(图中tPA基因的上链)上的碱基序列是ACA,丝氨酸的密码子是UCU,说明突变位点碱基为G,第一次PCR操作中使用的引物为突变上游引物(引物Ⅰ)和常规下游引物,为了保证目的基因能正向插入质粒,常规下游引物应选择含有BglⅡ识别序列的引物,即引物Ⅲ,结合图中第二次PCR所用引物的方向可知,下游大引物为②链。
(3)PCR操作中复性的目的是使引物与单链DNA结合。第二次PCR过程中至少需要两次循环才能获得双链等长tPA改良基因。
(4)研究人员将重组质粒导入大肠杆菌常用的方法是Ca2+处理法,质粒上的标记基因是新霉素抗性基因,因此转化后的大肠杆菌需接种在含新霉素的培养基上进行筛选。对于该基因的检测,通常需进一步通过PCR等技术进行检测。(共42张PPT)
第4节　蛋白质工程的原理和应用
1.说出蛋白质工程崛起的缘由。2.概述蛋白质工程的基本原理。3.举例说明依据人类需要对原有蛋白质结构进行基因改造、生产目标蛋白的过程。
[学习目标]
预习案·自主学习
一、蛋白质工程
1.蛋白质工程的概念
蛋白质
生物功能
改造或合成
蛋白质
蛋白质
基因工程
2.蛋白质工程崛起的缘由
(1)崛起缘由。
①基因工程的实质:将一种生物的 转移到另一种生物体内,后者可以产生它本不能产生的 ,进而表现出 。
②基因工程的不足:基因工程原则上只能生产自然界中 的蛋白质。
③天然蛋白质的不足:天然蛋白质的结构和功能符合 生存的需要,却不一定完全符合 的需要。
基因
新的性状
蛋白质
已存在
特定物种
人类生产和生活
(2)实例:提高玉米赖氨酸含量。
改造后玉米叶片和种子中游离赖氨酸的含量分别提高5倍和2倍。
苏氨酸
异亮氨酸
天冬酰胺
异亮氨酸
二、蛋白质工程的基本原理
功能
结构
改造
合成
蛋白质结构
氨基
脱氧
基因
酸
核苷酸
三、蛋白质工程的应用
1.医药工业方面
(1)科学家通过对 基因的改造,研发出速效胰岛素类似物。
胰岛素
(2)
(3)人—鼠嵌合抗体:降低诱发免疫反应的强度。
2.其他工业方面
用于改进酶的性能或开发新的工业用酶,如利用蛋白质工程获得枯草杆菌蛋白酶的 ,筛选出符合工业化生产需求的突变体,提高该酶的使用价值。
3.农业方面
(1)科学家尝试改造某些 的酶,以提高植物光合作用的效率,增加粮食的产量。
(2)科学家利用蛋白质工程的思路来设计优良 ,通过改造微生物蛋白质的结构,使它防治病虫害的效果增强。
突变体
参与调控光合作用
微生物农药
判断正误
(1)蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作,定向改变分子的结构。(　　)
×
(2)蛋白质工程能产生自然界中不存在的新型蛋白质分子。(　　)
√
(3)基因工程遵循中心法则,而蛋白质工程不遵循。(　　)
×
【提示】 蛋白质工程也遵循中心法则。
【提示】 蛋白质工程中直接改造的是基因,不是蛋白质。
(4)根据某多肽链的一段氨基酸序列,可以很容易地确定控制该肽链合成的基因的脱氧核苷酸序列。(　　)
×
【提示】 由于密码子具有简并性,根据某多肽链的一段氨基酸序列,不能确定基因的脱氧核苷酸序列。
(5)蛋白质工程是一项难度很大的工程,主要是因为人们对蛋白质复杂的高级结构没有完全认识。(　　)
√
探究案·互动探究
任务一　分析蛋白质工程的基本原理
基因工程原则上只能生产自然界已存在的蛋白质。蛋白质工程的目标是生产出符合人类生产和生活需要的蛋白质,甚至是自然界不存在的蛋白质。结合图示回答有关问题。
(1)写出流程图中字母代表的含义。
A. ;B. ;C. ;D. ;E 。
预期功能
氨基酸序列
改造或合成
转录
翻译
(2)如何由蛋白质氨基酸序列找到相对应的脱氧核苷酸序列
【提示】 先根据氨基酸与密码子的对应关系找到对应的mRNA,再根据mRNA与DNA的碱基互补配对关系找到相对应的脱氧核苷酸序列。
(3)如果已经推测出多肽中的氨基酸序列,那么据此推测出的基因中的碱基序列有多种,原因是什么
【提示】 决定一种氨基酸的密码子往往不止一种,因此获得的基因的碱基序列有多种。
(4)对天然蛋白质进行改造,你认为应该直接对蛋白质分子进行操作,还是通过对基因的操作来实现 原因是什么
【提示】 应该通过对基因的操作来实现对天然蛋白质的改造。主要原因:①蛋白质具有十分复杂的空间结构,基因的结构相对简单,容易改造;②改造后的基因可以遗传给下一代,被改造的蛋白质无法遗传。
「核心归纳」
蛋白质工程与基因工程的区别和联系
「典型例题」
1.天然胰岛素易形成二聚体,使得其疗效被延缓。科研人员通过蛋白质工程使胰岛素第28位的脯氨酸替换为天冬氨酸,从而抑制了胰岛素的聚合,由此研发出的速效胰岛素类似物产品已经在临床上广泛应用,以下叙述错误的是(　　)
[A]改造胰岛素的过程实际是改造胰岛素基因的过程
[B]若要改变蛋白质的功能,可通过改变蛋白质的氨基酸序列实现
[C]可将通过定点突变技术获得的新的胰岛素基因直接导入大肠杆菌用于发酵生产
[D]在通过蛋白质工程对胰岛素改造的过程中,对蛋白质分子结构的了解是非常关键的
C
【解析】 基因指导蛋白质的合成,改造胰岛素的过程实际是改造胰岛素基因的过程;若要改变蛋白质的功能,可通过改变蛋白质的氨基酸序列实现;新的胰岛素基因不能直接导入大肠杆菌,需要先构建基因表达载体;蛋白质工程的基本途径是预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变对应的脱氧核苷酸序列(基因),因此在通过蛋白质工程对胰岛素改造的过程中,对蛋白质分子结构的了解是非常关键的。
2.(2025·来宾检测)通过蛋白质工程可以改造蛋白质,或制造一种新的蛋白
质,以满足人类生产和生活的需要。下列叙述正确的是(　　)
[A]蛋白质工程只需要改造蛋白质,基因工程只需要改造基因
[B]天然蛋白质的合成过程与蛋白质工程的过程完全相同
[C]蛋白质工程要改造蛋白质所有的氨基酸序列
[D]蛋白质工程可以通过改造蛋白质,来改变酶的催化效率
D
【解析】 蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出来的第二代基因工程,需要对基因进行改造;天然蛋白质的合成过程是按照中心法则进行的,蛋白质工程的过程与中心法则相反;蛋白质工程不需要改造蛋白质所有的氨基酸序列;蛋白质工程可以通过改造蛋白质,来改变酶的催化效率。
任务二　分析蛋白质工程的应用
小鼠单克隆抗体的制备比较简单,但这种鼠源性的单克隆抗体会被人的免疫系统排斥,不能直接用于人体。嵌合抗体就是保留鼠单克隆抗体的可变区,而用人抗体的恒定区替换鼠单克隆抗体的恒定区,这种嵌合抗体的抗原性显著下降,而抗体的特异识别功能没有丧失。目前,已有多种嵌合抗体用于临床治疗。
(1)生产人鼠嵌合抗体利用了哪种生物工程技术,该工程技术的目的是什么
【提示】 蛋白质工程。目的是改造现有蛋白质或制造一种新的蛋白质,满足人类生产和生活的需求。
(2)改造鼠单克隆抗体时,改造恒定区而不是可变区,原因是什么
【提示】 可变区是特异性识别抗原的区域,若进行改造就不能识别特定的抗原。
(3)经过改造的人鼠嵌合抗体,与鼠单克隆抗体相比较,突出的优点是什么
(从免疫角度考虑)
【提示】 降低诱发免疫反应的强度,人体的不良反应减少。
(4)人鼠嵌合抗体制造过程中对科学家最大的挑战是什么
【提示】 设计嵌合抗体的空间结构。
「典型例题」
3.T4溶菌酶在温度较高时易失去活性。科学家对编码T4溶菌酶的基因进行改造,使其表达的溶菌酶第3位的异亮氨酸变为半胱氨酸,在该半胱氨酸与第97位的半胱氨酸之间可形成一个二硫键,进而提高了T4溶菌酶的耐热性。下列叙述正确的是(　　)
[A]高温时T4溶菌酶失活只与二硫键断裂有关
[B]改造的实质是改变基因中相关的碱基序列
[C]该过程依据的原理主要是DNA的复制
[D]该技术通过改造基因实现,属于基因工程
B
【解析】 蛋白质的结构决定其功能,高温会使蛋白质的空间结构遭到破坏,从而导致蛋白质失去活性。T4溶菌酶在温度较高时易失去活性,是因为高温破坏了其空间结构,而不仅仅与二硫键断裂有关;基因指导蛋白质的合成,对T4溶菌酶的改造,实质是对编码T4溶菌酶的基因进行改造,即改变基因中相关的碱基序列;该过程属于蛋白质工程,依据的原理主要是中心法则的逆过程。
思维导图
随堂检测反馈
1.(2025·开封检测)葡萄糖异构酶(GI)在工业上应用广泛,为提高其热稳定性,科学家对GI基因进行体外定点诱变,以脯氨酸(Pro138)替代甘氨酸(Gly138),含突变体的重组质粒在大肠杆菌中表达,结果最适反应温度提高10～12 ℃。这属于生物工程中的(　　)
[A]基因工程 [B]蛋白质工程
[C]发酵工程 [D]酶工程
B
【解析】 题中是对基因进行修饰改造,以实现对现有蛋白质的改造,属于蛋白质工程。
2.水蛭素是一种蛋白质,可用于预防和治疗血栓。研究人员发现,用赖氨酸替换水蛭素第47位的天冬酰胺可以提高它的抗凝血活性。这项替换研究工作(　　)
[A]原理是中心法则
[B]可行的直接操作对象是水蛭素
[C]可通过改造或修饰基因来实现
[D]改变了蛋白质的活性而不改变蛋白质的结构
C
【解析】 天然蛋白质合成的过程是按照中心法则进行的,而这项替换研究工作属于蛋白质工程,原理是中心法则的逆过程;可行的直接操作对象是水蛭素基因,可通过改造或修饰水蛭素基因来实现;结构决定功能,氨基酸序列的改变使蛋白质的结构和功能同时发生改变。
3.蛋白质工程是研究蛋白质结构和功能的重要手段,下列关于蛋白质工程的叙述正确的是(　　)
[A]蛋白质工程中可以不用构建基因表达载体
[B]通过蛋白质工程改造后获得的性状不能遗传给后代
[C]蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作
[D]蛋白质工程可以通过增加酶内部二硫键数目提高酶的热稳定性
D
【解析】 蛋白质工程是基因工程的延伸,需要构建基因表达载体;蛋白质工程是直接对基因进行修饰或合成新基因,改造后的性状可以遗传给后代;蛋白质工程可以通过增加酶内部二硫键数目来提高酶的热稳定性。
4.(2025·安庆检测)中华鲟是地球上最古老的脊椎动物,被称为“活化石”。研究者试图通过蛋白质工程改造中华鲟体内的某些蛋白质,使其更加适应现在的水域环境。以下说法错误的是(　　)
[A]该工程可以定向改变蛋白质分子的结构
[B]改造蛋白质是通过改造基因而实现的
[C]改造后的中华鲟和现有中华鲟仍是同一物种
[D]改造后的中华鲟的后代不具有改造的蛋白质
D
【解析】 蛋白质工程改造的是基因,可以遗传给后代。
5.Bt抗虫蛋白的第5号螺旋可在害虫肠上皮细胞膜上形成孔道结构,位于该螺旋疏水部分的第168位组氨酸是维持孔道结构稳定的关键。该孔道结构越稳定,Bt抗虫蛋白对害虫的毒性越大。研究人员拟对该蛋白进行改造以提高其抗虫效果,相关叙述正确的是(　　)
[A]蛋白质工程是对蛋白质中的氨基酸分子进行设计和改造
[B]改造Bt抗虫蛋白应首先从设计Bt抗虫蛋白基因中的脱氧核苷酸序列出发
[C]将第168位组氨酸替换成亲水性更强的氨基酸可增强Bt抗虫蛋白的抗虫效果
[D]蛋白质工程难度很大,主要是因为需要设计改造的蛋白质有复杂的高级结构
D
【解析】 蛋白质工程是通过改造或合成基因,来改造现有蛋白质,或制造一种新的蛋白质;改造Bt抗虫蛋白应首先从预期的蛋白质功能出发;由题意可知,位于该螺旋疏水部分的第168位组氨酸是维持孔道结构稳定的关键,该孔道结构越稳定,Bt抗虫蛋白对害虫的毒性越大,因此将第168位组氨酸替换成亲水性更强的氨基酸会降低Bt抗虫蛋白的抗虫效果;多数蛋白质除了具有一级结构(即氨基酸顺序),还具有复杂的高级结构,即空间结构,而很多蛋白质的空间结构是人们目前还不清楚的,因此实施蛋白质工程的难度很大。
联系实际 迁移应用
苏云金杆菌中的杀虫晶体蛋白Cry具有杀虫毒性,但Cry蛋白存在杀虫谱窄、毒力有限等问题,制约了其在农业生产中的进一步应用。科学家通过定点突变,将Cry蛋白第168位的组氨酸替换为精氨酸后,Cry蛋白对烟草天蛾的毒性提高了3倍。回答下列问题。
(1)科学家将Cry蛋白第168位的组氨酸替换为精氨酸,生产出性能优良的Cry突变蛋白的生物技术手段属于 工程。
蛋白质
(2)获得性能优良的Cry突变蛋白的正确顺序是 (选择正确编号并排序)。
①借助定点突变改造Cry基因序列
②Cry蛋白功能分析和结构设计
③检验Cry蛋白的结构和功能
④利用工程菌发酵合成Cry蛋白
⑤设计Cry蛋白氨基酸序列和基因序列
②⑤①④③
(3)重叠延伸PCR技术可以实现基因的定点诱变,科学家利用该技术实现对Cry基因的改造以获得Cry改良基因,其操作步骤如图所示。
Ⅰ.利用重叠延伸PCR技术扩增DNA片段时遵循的原理是 。
Ⅱ.实现基因的定点诱变时,需要根据目的基因序列设计两个常规引物(a、d),突变碱基序列所处位置设计两个突变引物(b、c)。通过PCR1能得到大量产物AB,该过程需要加入引物 ,通过PCR2能得到大量产物CD,PCR1和PCR2必须分两个系统进行,不能在同一个系统里面,这样做是为了防止两种突变引物在扩增时发生 ,从而失去作用。
DNA半保留复制
a、b
互补配对
(4)在获取性能优良的Cry突变蛋白的过程中,科学家是通过对基因的操作来实现的,而不是直接对天然的Cry蛋白进行操作,主要原因是
(答出1点)。
Cry蛋白具有
十分复杂的空间结构,而Cry基因的结构相对简单,更容易改造;Cry突变基
因可以遗传给下一代,Cry突变蛋白不能遗传第4节　蛋白质工程的原理和应用
课时作业
(时间:30分钟　分值:45分)
第1～7题每题3分,共计21分。
基础对点练
知识点1　蛋白质工程的概念及基本原理
1.下列有关蛋白质工程的叙述,错误的是(　　)
[A]蛋白质工程可以改造蛋白酶的空间结构,提高酶的活性
[B]蛋白质工程的操作过程中,需先合成mRNA后合成基因
[C]蛋白质工程与天然合成蛋白质的遗传信息流向有所不同
[D]蛋白质工程进行中难度最大的操作是设计蛋白质的结构
【答案】 B
【解析】 蛋白质工程的基本思路:从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→获得所需要的蛋白质,过程中无须先合成mRNA后合成基因。
2.(2025·重庆检测)水蛭素是一种蛋白质,可用于预防和治疗血栓,但在治疗过程中发现其抗凝血活性低。研究人员欲提高水蛭素抗凝血活性,正确的操作步骤是(　　)
①确定影响活性的氨基酸序列　②分析水蛭素的空间结构,找到影响其活性的结构域　③推测需要替换的氨基酸序列　④构建表达载体,使其在受体细胞中表达　⑤PCR技术获得改造后的水蛭素基因　⑥确定基因中的碱基序列
[A]②①③⑤⑥④ [B]②③⑥①⑤④
[C]②①③⑥⑤④ [D]①②③④⑤⑥
【答案】 C
【解析】 运用蛋白质工程技术,先分析水蛭素的空间结构,找到影响其活性的结构域,然后确定影响活性的氨基酸序列,推测需要替换的氨基酸序列,最终确定基因中的碱基序列,据此通过PCR技术获得改造后的水蛭素基因,并构建表达载体,使其在受体细胞中表达。
3.蛋白质工程中,要对蛋白质结构进行设计改造,必须通过改造或合成基因来完成,而不直接改造蛋白质,最主要的原因是(　　)
[A]缺乏改造蛋白质所必需的工具酶
[B]改造基因易于操作且改造后能够遗传
[C]人类对大多数蛋白质高级结构知之甚少
[D]蛋白质中氨基酸的排列顺序千变万化,操作难度大
【答案】 B
【解析】 由于基因控制蛋白质的合成,所以对蛋白质设计改造可通过对基因进行改造或合成来完成,且改造后的基因能够遗传给子代。
4.有关基因工程和蛋白质工程的叙述,正确的是(　　)
[A]载体上的标记基因有利于筛选含重组DNA的细胞和促进目的基因表达
[B]限制酶可以识别一小段特殊的核苷酸序列,并在特定位点处切开
[C]以蛋白质的氨基酸序列为依据合成的目的基因与原基因相同
[D]蛋白质工程是指在分子水平上对蛋白质直接进行操作,定向改变分子的结构
【答案】 B
【解析】 载体上的标记基因有利于筛选含重组DNA的细胞,不能促进目的基因表达;限制酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列,并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开;基因表达过程中,可能会对mRNA进行剪切和修饰,且密码子具有简并性,所以以蛋白质的氨基酸序列为依据合成的目的基因与原基因不一定相同;蛋白质工程通常涉及对编码蛋白质的基因进行改造,而不是在分子水平上对蛋白质直接进行操作。
知识点2　蛋白质工程的应用
5.(2025·柳州检测)白细胞介素2(IL2)是一种细胞因子,含有3个半胱氨酸,分别位于58、105、125位,现用大肠杆菌生产IL2,为保证产物活性,将其基因中编码125位半胱氨酸的序列突变为丝氨酸序列。下列叙述错误的是(　　)
[A]突变的IL2基因的序列发生了碱基对的增添
[B]完成氨基酸的替换需要通过改造基因实现
[C]蛋白质工程的操作流程与中心法则的流动方向相反
[D]该技术可通过基因改造或合成构建出一种自然界中原先不存在的全新的基因
【答案】 A
【解析】 由题意可知,为保证产物活性,将IL2基因中编码125位半胱氨酸的序列突变为丝氨酸序列,只有一个氨基酸发生了改变,应是发生了碱基对的替换,而不是碱基对的增添。
6.科研人员以β甘露聚糖酶为核心研究材料,在其N端找到了两个关键的氨基酸位点,将这两个位点的组氨酸和脯氨酸分别替换为酪氨酸后,其热稳定性得到了显著提高。下列说法正确的是(　　)
[A]细胞内合成改造后的高热稳定性蛋白质的过程不遵循中心法则
[B]替换蛋白质中的氨基酸实际可通过改造基因中的碱基序列实现
[C]在分子水平上,可利用PCR等技术检测细胞内是否合成新的蛋白质
[D]制备过程中应先获得目标蛋白质的三维结构,再预期其生物学功能
【答案】 B
【解析】 细胞内蛋白质的合成过程都遵循中心法则;基因指导蛋白质的合成,所以替换蛋白质中的氨基酸实际可通过改造基因中的碱基序列实现;PCR等技术能检测目的基因是否导入细胞或是否转录,检测细胞内是否合成新的蛋白质可利用抗原—抗体杂交法;制备过程中要先预期目标蛋白质的生物学功能,再设计获得目标蛋白质的三维结构。
7.β防御素是由H基因编码的抗菌肽,可构建重组毕赤酵母并通过其发酵作用实现量产。但重组毕赤酵母合成的β防御素与人β防御素的结构存在差异,因此β防御素具有潜在的抗原性,如果用作防腐剂添加到食品中可能会引起人体发生过敏反应。蛋白质工程可改造β防御素,减轻其引起的过敏反应。下列有关叙述正确的是(　　)
[A]为减轻过敏反应,可改造H基因以去掉β防御素中抗原性较强的部分
[B]将改造后的H基因加上启动子再导入毕赤酵母,就可以使其完成表达
[C]通过蛋白质工程获得的新型β防御素与天然β防御素属于同一种蛋白质
[D]依据改造的β防御素氨基酸序列可推测新β防御素基因的核糖核苷酸序列
【答案】 A
【解析】 蛋白质工程通过改造基因来改造蛋白质,本题中为减轻过敏反应,通过改造H基因,使β防御素结构改变,去掉β防御素中抗原性较强的部分;将改造后的H基因,加上启动子、终止子等元件,并构建基因表达载体,再导入毕赤酵母,才能使其完成表达;通过蛋白质工程获得的新型β防御素在结构上与天然β防御素不同,不属于同一种蛋白质;依据改造的β防御素氨基酸序列可推测新β防御素基因的脱氧核苷酸序列。
综合提升练
8.(12分)(2022·湖南卷)水蛭是我国的传统中药材,主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一,具有良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构,提高其抗凝血活性。回答下列问题。
(1)蛋白质工程流程如图所示,物质a是　　　　,物质b是　　　　。在生产过程中,物质b可能不同,合成的蛋白质空间构象却相同,原因是　　　　　　　　　　　　。
(2)蛋白质工程是基因工程的延伸,基因工程中获取目的基因的常用方法有　　　　　　、
　　　　　和利用PCR技术扩增。PCR技术遵循的基本原理是　　　　　　　　　　。
(3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后,分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性,结果如图所示。推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的　　　　(填“种类”或“含量”)有关,导致其活性不同的原因是　　　　　　　　　　　　　　　　。
(4)若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异,简要写出实验设计思路 　。
【答案】 (除标注外,每空1分)
(1)多肽链　mRNA　密码子具有简并性
(2)从基因文库中获取目的基因　人工合成　DNA半保留复制
(3)种类　对水蛭蛋白进行酶解时酶的种类不同,导致水蛭蛋白水解产物的空间结构不同(2分)
(4)取3支试管,分别加入等量的蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素;取同一种动物(如家兔)血液,立即将等量的血液加入1、2、3号3支试管中,静置,统计3支试管中血液凝固时间(3分)
【解析】 (1)分析题图可知,物质a是多肽链,物质b是mRNA。在生产过程中,物质b可能不同,合成的蛋白质空间构象却相同,原因是密码子具有简并性,即一种氨基酸可能对应几个密码子。
(2)蛋白质工程是基因工程的延伸,基因工程中获取目的基因的常用方法有从基因文库中获取目的基因、通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成和利用PCR技术扩增。PCR技术遵循的基本原理是DNA半保留复制。
(3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后,据图可知,水解产物中的肽含量随着酶解时间的延长均上升,且差别不大;而水解产物的抗凝血活性有差异,经酶甲处理后,随着酶解时间的延长,抗凝血活性先上升后相对稳定,经酶乙处理后,随着酶解时间的延长,抗凝血活性先上升后下降,且酶甲处理后的酶解产物的抗凝血活性最终高于经酶乙处理后的酶解产物的抗凝血活性,差异明显,据此推测两种酶分别处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的种类有关,导致其活性不同的原因是对水蛭蛋白进行水解时酶的种类不同,导致水蛭蛋白水解产物的空间结构不同。
(4)若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异,实验设计思路为取3支试管,分别加入等量的蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素;取同一种动物(如家兔)血液,立即将等量的血液加入1、2、3号3支试管中,静置,统计3支试管中血液凝固时间。
9.(12分)人体内的tPA蛋白能高效降解血栓,是心梗和脑血栓的急救药。然而,为心梗患者注射大剂量的tPA蛋白会诱发颅内出血。研究证实,将tPA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸,能显著降低出血副作用。据此,先对天然的tPA基因进行序列改造,然后再采取传统的基因工程方法表达该改良基因,可制造出性能优异的tPA改良蛋白。下图是通过两次PCR操作,运用大引物进行定点突变获取tPA改良基因和利用质粒pCLYⅡ构建含
tPA改良基因的重组质粒示意图。(注:一次PCR操作可进行多次循环)
(1)科学家将tPA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸,生产出性能优良的tPA改良蛋白属于
　　　　　工程。tPA改良基因形成是tPA基因发生了碱基的　　　　　。
(2)已知tPA蛋白第84位是半胱氨酸,相应的基因模板链(图中tPA基因的上链)上的碱基序列是ACA,丝氨酸的密码子是UCU。获取tPA改良基因过程中需要以下三种引物:
引物Ⅰ:5'CGCGAAA AGACGGTTCA-3'(下划线 为突变基因位点)
引物Ⅱ:5'ACCCGGGCGAACATCGTA-3'(下划线字母为XmaⅠ酶切序列)
引物Ⅲ:5'GTAGATCTGGCCTCGAGTA-3'(下划线字母为BglⅡ酶切序列)
在上述引物中,引物Ⅰ中突变基因位点是碱基　　　　(填“A”“T”“C”或“G”),第一次PCR操作中使用的引物有　　 　、　　　　。下游大引物是　　　　(填“①”或“②”)链。
(3)PCR操作中复性的目的是　　　　　　　　。第二次PCR过程中至少需要　　　　次循环才能获得双链等长tPA改良基因。
(4)研究人员将重组质粒导入大肠杆菌常用的方法是　　 　　　,转化后的大肠杆菌需接种在含有　　　　的培养基上进行筛选。对于该基因的检测,通常需进一步通过　　　　　等技术进行检测。
【答案】 (除标注外,每空1分)
(1)蛋白质　替换
(2)G　Ⅰ　Ⅲ　②(2分)
(3)使引物与单链DNA结合　两
(4)Ca2+处理法　新霉素　PCR
【解析】 (1)科学家将tPA蛋白的第84位的半胱氨酸换成丝氨酸,生产出性能优良的tPA改良蛋白属于蛋白质工程,tPA改良基因形成是tPA基因发生了碱基的替换。
(2)由图可知,突变上游引物(引物Ⅰ)中引入突变碱基,结合题意可知,突变后,tPA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸,而相应的基因模板链(图中tPA基因的上链)上的碱基序列是ACA,丝氨酸的密码子是UCU,说明突变位点碱基为G,第一次PCR操作中使用的引物为突变上游引物(引物Ⅰ)和常规下游引物,为了保证目的基因能正向插入质粒,常规下游引物应选择含有BglⅡ识别序列的引物,即引物Ⅲ,结合图中第二次PCR所用引物的方向可知,下游大引物为②链。
(3)PCR操作中复性的目的是使引物与单链DNA结合。第二次PCR过程中至少需要两次循环才能获得双链等长tPA改良基因。
(4)研究人员将重组质粒导入大肠杆菌常用的方法是Ca2+处理法,质粒上的标记基因是新霉素抗性基因,因此转化后的大肠杆菌需接种在含新霉素的培养基上进行筛选。对于该基因的检测,通常需进一步通过PCR等技术进行检测。

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