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第52讲　
基因工程的基本工具和基本操作程序
核心考点 考情分析
1.重组DNA技 术的基本工具 1.命题特点：考查限制酶的选择、PCR中引物的使用、电泳鉴定等。
2.备考重点：掌握三种基本工具，熟悉基本操作程序的各个环节，结合具体的实例 归纳常考题型，构建解答模板
2.基因工程的 基本操作程序
3.DNA的粗提 取与鉴定、 DNA片段的扩 增与电泳鉴定
考点一　基因工程的基本工具
必备知识·夯基
1. 基因工程的概念
2. 基因工程的基本工具
（1）限制性内切核酸酶（简称限制酶）
特别提醒：大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，少数由4个、8个 或其他数量的核苷酸组成，多数为“回文序列”，即两条链的序列相同， 只是方向相反（如图）。
（2）DNA连接酶
特别提醒：与DNA有关的几种酶
（3）载体
1. 判断正误
提示：不同种类限制酶识别序列不同。
√
×
√
提示：限制性内切核酸酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工 具，前两者属于工具酶，质粒属于载体。
×
√
当外源DNA入侵时，它会利用限制酶来切
割外源DNA，使之失效，以保证自身的安全　
关键能力·提升
考向一　限制酶的作用及应用
1.★（2025·江苏高考19题改编）图示人体正常基因A突变为致病基因a及Hind Ⅲ切割位点。Alu Ⅰ限制酶识别序列及切割位点为　　 ，下列相关叙述错误的是（　　）
A.基因A突变为a是一种碱基增添
的突变
B.用两种限制酶分别酶切A基因
后，形成的末端类型不同
C.用两种限制酶分别酶切a基因后，产生的片段大小不一致
D.产前诊断时，该致病基因可选用Hind Ⅲ限制酶开展酶切鉴定
√
解析： 　由图可知，基因A突变为基因a，是由于T—A替换成了G—C，属于碱基对的替换，A错误；HindⅢ切割后形成的是黏性末端，AluⅠ切割后形成的是平末端，B正确；突变后的基因a中间片段不存在HindⅢ的切割位点，存在AluⅠ的切割位点，基因a分别用HindⅢ和AluⅠ酶切后产生的片段大小不一致，C正确；正常的基因A用HindⅢ酶切后产生4个片段，突变后的基因a用HindⅢ酶切后产生3个片段，D正确。
考向二　载体的作用及特点
2. 将外源基因导入受体细胞的过程中需要使用载体，下列有关载体的叙述 错误的是（　　）
A. 载体应对宿主细胞无伤害，以免影响宿主细胞的正常生命活动
B. 载体应具有一个至多个限制酶切割位点，以便于目的基因的插入
C. 基因工程中被用作载体的质粒都是在天然质粒的基础上改造的
D. 将外源基因送入受体细胞的载体可以是切割DNA分子的酶
√
解析： 　载体需和目的基因一起进入宿主细胞并与其共存，因此载体应 对宿主细胞无伤害，以免影响宿主细胞的正常生命活动，A正确；载体应 具有一个至多个限制酶切割位点，以便于目的基因拼接形成重组载体，B 正确；天然的质粒往往存在不足，基因工程中用到的质粒都是在天然质粒 的基础上进行过人工改造的，C正确；切割DNA分子的酶为限制酶，是基 因工程的工具之一，但不是运载体，D错误。
3. 大肠杆菌pUC118质粒是基因工程中常用的一种载体，具有氨苄青霉素 抗性基因，该质粒中某限制酶的唯一切点位于LacZ基因中。在特定的选择 培养基中，若LacZ基因没有被破坏，则大肠杆菌菌落呈蓝色；若LacZ基 因被破坏，则菌落呈白色。关于图中操作的叙述正确的是（　　）
A. 试管1中应加入限制酶和DNA连接酶
B. 试管2中将重组质粒导入大肠杆菌，需用Ca2＋处理大肠杆菌
C. 能在氨苄青霉素培养基中存在的菌落均呈现白色
D. 试管3应选择蓝色菌落内的大肠杆菌进行扩大培养
√
解析： 　分析题图可知，在加入试管1之前，质粒和目的基因已经被切 割，故试管1中应加入DNA连接酶，A错误；试管2中用Ca2＋处理大肠杆菌 使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，B正确；能在氨 苄青霉素培养基中存在的菌落呈现蓝色或白色，C错误；若大肠杆菌的菌 落为蓝色，则LacZ基因没有被破坏，即导入大肠杆菌的是普通质粒，试管 3应选择白色菌落内的大肠杆菌进行扩大培养，D错误。
考点二　基因工程的基本操作程序
必备知识·夯基
1. 目的基因的筛选与获取
（1）目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或 获得预期表达产物等的基因。主要是指 的基因。
编码蛋白质　
（2）利用PCR获取和扩增目的基因
特别提醒：①在PCR过程中实际加入的原料为dNTP（即dATP、dGTP、 dTTP、dCTP），既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供 能量。
②引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，作 为新子链的合成起点，只能结合在母链的3'端，使DNA聚合酶能够从引物 的3'端开始连接脱氧核苷酸。
③复性温度过高，则引物难以与模板链结合；温度过低则易使两条母链配 对结合，均难以获得足够的PCR产物。
④真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲液 中一般要添加Mg2＋。
⑤除利用PCR获取目的基因外，还可以用人工合成或者构建基因文库的方 法获取目的基因。
2. 基因表达载体的构建（核心）
项目 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子
本质 DNA DNA mRNA mRNA
位置 目的基因上游 目的基因下游 mRNA首端 mRNA尾端
功能 RNA聚合酶识别 和结合的部位， 驱动基因转录出 mRNA 使转录在所需 要的地方停下 来 翻译的起始信 号（编码氨基 酸） 翻译的结束信 号（正常情况 下，不编码氨 基酸）
特别提醒：启动子、终止子、起始密码子和终止密码子的对比
3. 将目的基因导入受体细胞
特别提醒：①农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入：第一次拼接是将目 的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上，第二次拼接（非人工操作）是指插入目 的基因的T-DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上；两次导入：第一次导入 是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌，第二次导入（非人工操作）是指含 目的基因的T-DNA导入受体细胞。
②导入的目的基因，可能存在于细胞质中，也可能整合到染色体DNA上。 存在于染色体DNA上的目的基因有可能通过花粉传播进入杂草或其他作物 中，造成“基因污染”。
4. 目的基因的检测与鉴定
1. 判断正误
提示：DNA聚合酶不能从头开始合成DNA链，只能催化单个的脱氧核苷酸 添加到已有的核酸片段的3'端，故延伸过程需要引物参与。
提示：PCR扩增目的基因时，2种不同的引物不能互补配对。
×
×
提示：启动子和终止子决定着转录的开始与结束。
提示：目的基因需要构建成基因表达载体才能在受体细胞中表达。
×
×
√
2. 规范表达
为了避免目的基因和载体的自身环化和反向连
接　
农杆菌细胞侵染植物细胞后，能将Ti质粒
上的T-DNA转移到受体细胞且能整合到受体细胞的染色体DNA上，而目的
基因又插入T-DNA中，所以目的基因可以整合到受体细胞的染色体DNA
上　
关键能力·提升
考向　基因表达载体的构建与目的基因的筛选
1. （2025·江西高考11题）为了
获得抗白叶枯病的水稻品种，研
究人员构建了含有抗病基因D的
重组Ti质粒（如图），通过农杆菌转化法将D基因导入水稻种子诱导的愈伤组织，最终获得抗病植株。下列叙述正确的是（　　）
A. 水稻愈伤组织细胞中RNA聚合酶无法识别U6启动子
B. 在含重组Ti质粒的农杆菌中U6启动子不能驱动卡那霉素抗性基因表达
C. 农杆菌侵染愈伤组织后所用的筛选培养基中需加入卡那霉素
D. 愈伤组织再分化获得的含有D基因的幼苗属于抗病植株
√
解析： 　将T-DNA整合到水稻愈伤组织的染色体DNA后，若要使D基因 表达并使水稻植株表现出抗病性状，那么D基因上游的U6启动子需被水稻 愈伤组织细胞中RNA聚合酶识别， A错误。启动子是一段有特殊序列结构 的DNA片段，位于基因的上游，它是RNA聚合识别和结合的部位，并能够 驱动基因转录出mRNA，最终表达出蛋白质。由图得出，上述重组Ti质粒 中的U6启动子并非位于卡那霉素抗性基因的上游，因而不能驱动卡那霉素 抗性基因的表达， B正确。当农杆菌侵染愈伤组织后，T-DNA整合到水稻 细胞染色体的DNA中，通常情况下，若D基因能表达，那么T-DNA上的潮 霉素抗性基因也能表达，从而使得导入T-DNA的水稻愈伤组织具有潮霉素 抗性基因；卡那霉素抗性基因不位于T-DNA上，不会发生上述生理过程。
因此，在农杆菌侵染愈伤组织后所用的筛选培养基中需加入潮霉素， C错 误。检测是否成功获得转基因品种一般需要经历两个阶段，首先是分子水 平的检测，包括检测目的基因是否导入宿主细胞、检测在宿主细胞中目的 基因是否转录出mRNA或最终表达出蛋白质，其次，还需要进行个体生物 学水平的鉴定。因此愈伤组织再分化获得的含有D基因的幼苗不一定是抗 病植株， D错误。
2. （2025·广东广州一模）为使玉米
获得抗除草剂性状，科研人员进行了
相关操作（如图所示）。含有内含子
的报告基因不能在原核生物中正确表 达，其正确表达产物能催化无色物质K呈现蓝色。转化过程中愈伤组织表 面常残留农杆菌，会导致未转化的愈伤组织可能在含除草剂的培养基中生 长。下列叙述错误的是（　　）
A. T-DNA可将基因G转移并整合到愈伤组织细胞的染色体DNA上
B. 利用物质K和抗生素进行筛选1，可获得农杆菌的蓝色菌落
C. 利用物质K和除草剂进行筛选2，更易于获得抗除草剂的转基因植株
D. 愈伤组织重新分化为芽、根等器官的过程中，需要添加植物激素
√
解析： 　将目的基因（基因G）插入Ti质粒的T-DNA上，通过农杆菌的转 化作用，可以把目的基因（基因G）整合到愈伤组织细胞的染色体DNA 上，A正确；含有内含子的报告基因不能在原核生物中正确表达，农杆菌 属于原核生物，无法正确表达出产物，也就无法催化无色物质K呈现蓝 色，B错误；含有内含子的报告基因的产物在愈伤组织细胞中能催化无色 物质K呈现蓝色，而愈伤组织表面残留的农杆菌，会导致未转化的愈伤组 织可能在含除草剂的培养基中生长，因此利用物质K和除草剂进行筛选2， 更易于获得抗除草剂的转基因植株，C正确；植物组织培养过程需要添加 植物激素诱导愈伤组织重新分化为芽、根等器官，D正确。
3. （2023·湖北高考4题）用氨苄青霉素抗性基
因（AmpR）、四环素抗性基因（TetR）作为标记
基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA
片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达
载体（重组质粒），并转化到受体菌中。下列叙述错误的是（　　）
A. 若用Hind Ⅲ酶切，目的基因转录的产物可能不同
B. 若用Pvu Ⅰ酶切，在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的 基因
C. 若用Sph Ⅰ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D. 若用Sph Ⅰ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）和Tet 的培养基中能形成菌落
√
解析： 　若用Hind Ⅲ酶切割质粒和含有目的基因的DNA片段，用DNA 连接酶将两者连接成重组质粒时，目的基因和质粒有正向连接和反向连接 两种连接形式，因此，目的基因转录的产物可能不同，A正确；若用Pvu Ⅰ 酶切，只会破坏氨苄青霉素抗性基因，在含Tet（四环素）培养基中的菌落 可能是含有目的基因的重组质粒，也可能是普通质粒，因此，在含Tet（四 环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因，B正确；若用Sph Ⅰ酶切， 由于重组质粒和普通质粒的碱基对数不同，因此可通过DNA凝胶电泳技术 鉴定重组质粒构建成功与否，C正确；若用Sph Ⅰ酶切，会破坏四环素抗性 基因，氨苄青霉素抗性基因不受影响，因此携带目的基因的受体菌在含 Amp（氨苄青霉素）的培养基中能形成菌落，在含Tet（四环素）的培养基 中不能形成菌落，D错误。
题后归纳：双标记基因与影印接种法筛选含重组质粒的菌落
（1）原理：将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时，如果目 的基因插入某种抗生素抗性基因内部，则会导致该抗生素抗性基因失活。 如图，目的基因插入了四环素抗性基因内部，则四环素抗性基因失活。
（2）被转化的细菌有三种：含目的基因的细菌、含重组质粒的细菌、含 质粒的细菌。
（3）筛选方法：将细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养，能生长的 是含重组质粒的细菌和含质粒的细菌，如图中1、2、3、4、5菌落，再利 用灭菌的绒布影印到含有四环素的培养基上，如图能生长的菌落为2、3、 4，则在含四环素培养基上不生长的即含有目的基因的菌落，如图中1、5 菌落。最后，可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。
4. （2024·重庆高考19题节选）大豆是重要的粮油作物，提高大豆产量是 我国农业领域的重要任务。我国研究人员发现，基因S在大豆品种DN（种 子较大）中的表达量高于品种TL（种子较小），然后克隆了该基因（两品 种中基因S序列无差异）及其上游的启动子序列，并开展相关研究。
（2）为验证“启动子D＋基因S”是否连接在表达载体上，可用限制酶对 重组表达载体酶切后进行电泳。电泳时，对照样品除指示分子大小的标准 参照物外，还应有 。经验 证的重组表达载体需转入农杆菌，检测转入是否成功的技术是 。
EcoRⅠ
酶切后形
成的片段黏性末端相同，易自我环化；不能保证目标片段与载体定向链接
（反向链接）
酶切后的空载体片段，启动子D＋基因S片段
PCR
思维路径：
解析：（1）①根据图示信息可知，“启动子D＋基因S”的DNA序列上存 在EcoR Ⅰ的识别序列，若使用限制酶EcoR Ⅰ，会使目的基因序列被破坏； ②根据图中限制酶的识别序列可知，酶Spe Ⅰ和Xba Ⅰ切割产生的黏性末端相 同，若用这两种限制酶切割，形成的DNA片段在构建基因表达载体时，容 易出现自我环化，以及无法保证目的基因片段与载体片段单向连接，影响 目的基因在受体细胞中的表达。
（2）①DNA电泳可以分离不同大小的DNA片段，用限制酶对重组表达载 体酶切后的产物不仅有“启动子D＋基因S”片段，还有酶切后的空载体片 段，因此电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有酶切 后的空载体片段和“启动子D＋基因S”片段；②在分子水平上检测目的基 因是否转入成功可通过PCR等技术检测受体细胞的DNA上是否插入目的基 因或目的基因是否转录出mRNA。
5. （2025·广东湛江高三一模）甜蛋白是一种高甜度的特殊蛋白质，将甜 蛋白基因导入番茄可提高番茄甜味，改善果实品质，获得超甜植株。如图 是甜蛋白基因和Ti质粒上限制酶切割位点示意图。回答下列相关问题：
解析： 基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建；切割目的基因 时，不能选择限制酶BamHⅠ，因为其会破坏目的基因，故目的基因左侧应 选择限制酶Xba Ⅰ切割，目的基因应插入质粒的启动子和终止子之间，故不 能选择限制酶SalⅠ，综合考虑，目的基因右侧应选择限制酶Hind Ⅲ切割 （Hind Ⅲ靠近终止子，而EcoR Ⅰ靠近启动子）。
基因表达载体的构
建　
Xba Ⅰ和Hind Ⅲ
解析： Ti质粒上的启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，启动子 具有组织特异性，为了保证甜蛋白基因能够在番茄细胞中表达，应将Ti质 粒上的启动子替换为番茄细胞中能表达的基因的启动子。
RNA聚合酶
番茄
细胞中能表达的基因的启动子
解析： 农杆菌转化番茄细胞时，T-DNA的作用是携带目的基因进入 受体细胞并将其整合到受体细胞的染色体DNA上，该过程使受体细胞发生 了基因重组。由于重组质粒中含有卡那霉素抗性基因，因此在添加卡那霉 素的培养基中培养番茄细胞，筛选出导入甜蛋白基因的细胞，进而可获得 转化成功的愈伤组织。
携带目的基因进入受体
细胞并将其整合到受体细胞的染色体DNA上
基因重组
卡那霉素
（4）若得到的超甜番茄体细胞中导入的是2个甜蛋白基因，则让其自交， 若子代表型及比例为 ，则说明2个甜蛋白 基因插入两对同源染色体上（含有1个和2个甜蛋白基因的番茄甜味相 同）。
解析： 若2个甜蛋白基因插入两对同源染色体上，即相当于双杂合类 型，遗传上遵循基因的自由组合定律，则让其自交，后代中只要含有甜蛋 白基因，其性状就表现为超甜，则其自交产生的后代的表型及比例为超甜 番茄∶普通番茄＝15∶1。
超甜番茄∶普通番茄＝15∶1
考点三　
DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定
必备知识·夯基
1. DNA的粗提取与鉴定
（1）实验原理
（2）实验步骤
特别提醒：①哺乳动物成熟的红细胞无细胞核（无DNA），不能作为提取 DNA的实验材料。可选用鸡血细胞作为实验材料，不用研磨，加蒸馏水使 其涨破后过滤即可。
②过滤时不能用滤纸，因为DNA会被吸附到滤纸上而大量损失，影响 提取量。
③加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂， 导致DNA分子不能形成丝状沉淀。
④二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。
2. DNA片段的扩增与电泳鉴定
（1）实验基础
（2）PCR实验过程
（3）DNA的电泳鉴定过程
特别提醒：①缓冲液中的指示剂是可见的，当指示剂前沿迁移接近凝胶边 缘时，就要停止电泳，防止电泳时间过长导致所有DNA片段都集中到边缘 而无法分开。
②核酸染料要加到琼脂糖凝胶中，在DNA分子迁移过程中与之结合，电泳 结束后在紫外灯下才能显色。
1. 判断正误
提示：DNA的鉴定需在沸水浴条件下与二苯胺试剂反应呈蓝色。
提示：猪是哺乳动物，猪成熟红细胞没有细胞核和众多细胞器，也就不含 DNA。
×
√
×
提示：应加入4种脱氧核苷酸作为PCR扩增原料。
提示：DNA片段的迁移速率与其大小成反比，即DNA片段越长，迁移速率 越慢。
提示：缓冲液和酶应在－20 ℃条件下储存。
×
×
×
提示：移液器上的枪头在实验过程中必须更换，避免试剂的污染。
×
2. 规范表达
（2）〔选择性必修3 P84“探究·实践”〕影响凝胶中DNA分子的迁移速 率的因素有 。
DNA不溶于酒精，某些蛋白质溶于酒精，加入酒精可使DNA析
出，与蛋白质分开　
凝胶浓度、DNA分子的大小和构象等　
关键能力·提升
考向一　DNA的粗提取
1. （2024·山东高考13题）关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法 正确的是（　　）
A. 整个提取过程中可以不使用离心机
B. 研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中
C. 鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变
D. 仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰
√
解析： 　研磨后，可以将研磨液过滤到烧杯中，在4 ℃冰箱中放置几分 钟后，再取上清液，可以不使用离心机，A正确，B错误。鉴定过程中的沸 水浴加热可使DNA双螺旋结构发生改变，C错误。该实验中，为排除二苯 胺加热后可能变蓝对实验结果造成干扰，可设置加二苯胺不加DNA的对照 组，D错误。
考向二　PCR与电泳鉴定
2. （2025·全国卷6题）琼脂糖凝胶电泳常用于核酸样品的分析，样品1～ 4的电泳结果如图所示（“＋”“－”分别代表电泳槽的阳极和阴极）。 已知样品1和2中的DNA分子分别是甲和乙，甲只有限制酶R的一个酶切位 点，样品3和4中有一个样品是甲的酶切产物。下列叙述错误的是（　　）
A. 配制琼脂糖凝胶时需选用适当的缓冲溶液
B. 该实验条件下甲、乙两种DNA分子均带负电荷
C. 甲、乙两种DNA分子所含碱基对的数量可能不同
D. 据图推测样品3可能是甲被酶R完全酶切后的产物
√
解析： 　配制琼脂糖凝胶时选用适当缓冲溶液，可维持电泳过程中体 系的pH稳定，保证核酸分子正常泳动，A正确；电泳时，样品向 “＋”极移动，说明在该实验条件下甲、乙两种DNA分子均带负电 荷，符合核酸分子在电泳中的带电特性，B正确；电泳中，DNA分子 的迁移速率与分子大小、构象、电荷的多少等多种因素有关。甲、乙 电泳条带位置虽然相同，但影响DNA分子的迁移速率的因素很多，所 以碱基对的数量可能不同，C正确；甲只有限制酶R的一个酶切位点， 若被酶R完全酶切，只会得到2种DNA片段（2个条带），这两个条带 的碱基数量比甲要少，电泳跑的距离要比甲更远，所以据图推测样品4 才是甲被酶R完全酶切后的产物，D错误。
3. （2023·福建高考4题）关于“DNA片段的扩增及电泳鉴定”（实验Ⅰ） 和“DNA的粗提取与鉴定”（实验Ⅱ）的实验操作，下列相关叙述正确的 是（　　）
A. 实验Ⅰ中，PCR实验所需的移液器、枪头、蒸馏水等必须进行高压灭菌 处理
B. 实验Ⅰ中，将扩增得到的PCR产物进行凝胶电泳，加样前应先接通电源
C. 实验Ⅱ中，取洋葱研磨液的上清液，加入等体积冷酒精后析出粗提取的 DNA
D. 实验Ⅱ中，将白色丝状物直接加入到二苯胺试剂中并进行沸水浴，用于 鉴定DNA
√
解析： 　为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心 管、枪头、蒸馏水等在使用前都必须进行高压蒸汽灭菌处理，移液器不需 要进行高压蒸汽灭菌处理，A错误；PCR产物进行凝胶电泳，应先加样后 接通电源，B错误；DNA不溶于酒精，细胞中的某些蛋白质可溶于酒精， 因此可取洋葱研磨液的上清液加入等体积冷酒精进行DNA的粗提取，C正 确；鉴定DNA时，应先将白色丝状物溶解在2 mol/L的NaCl溶液中，再加 入二苯胺试剂并进行沸水浴，D错误。
考教衔接　限制酶的选择和使用
（2025·河南高考21题节选）卡拉胶是一类源于海洋
红藻的大分子多糖，可被某些细菌降解为具有多种应
用前景的卡拉胶寡糖。某研究小组拟筛选具有高活性
卡拉胶酶（CG）的菌种用于生产卡拉胶寡糖。
BamHⅠ
重组质粒连接处的序列不再是原
来的限制酶识别序列
限制酶的识别序列和切割位点如下：
解析：E. coli DNA连接酶通常无法有效连接平末端，而对黏性末端的连接 效率较高，即不能选择EcoRⅤ酶和SmaⅠ酶，而SpeⅠ酶与XbaⅠ酶切割后的 黏性末端相同，若选择SpeⅠ酶与XbaⅠ酶切割，会出现质粒和目的基因的自 连，甚至目的基因倒接，因此切割质粒时SpeⅠ酶与XbaⅠ酶中只能选择一 个，而另一个限制酶需要选择BamHⅠ酶，又由于转录的方向是由启动子→ 终止子，且mRNA形成的方向是5'→3'，且mRNA与DNA的模板链方向相 反，因此基因模板链的3'应靠近启动子，故为保证连接准确性和效率，cg 转录模板链的5'端最好含有BamHⅠ酶切位点。T4 DNA连接酶既可以连接平 末端，也可连接黏性末端，不同的平末端均可由T4 DNA连接酶连接，由
于限制酶的识别序列具有专一性，若连接后的序列不存在最初限制酶的识 别序列，则可能导致重组质粒无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进 行切割。故另有两组同学选用了各不相同的双酶切组合和T4 DNA连接酶 重复上述实验，获得的部分重组质粒分子大小符合预期，但均无法使用各 自构建表达载体的双酶切组合进行切割，其原因是重组质粒连接处的序列 不再是原来的限制酶识别序列。
〔选择性必修3 P74“拓展应用”〕
　　有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeⅠ进行切割，B 片段分别用限制酶Hind Ⅲ、XbaⅠ、EcoRⅤ和XhoⅠ进行切割。各限制酶的 识别序列和切制位点如下。
　　据图可知，XbaⅠ切割B片段产生的DNA片段能与限制酶SpeⅠ切制A片 段产生的DNA片段相连接，因为XbaⅠ与SpeⅠ切割产生了相同的黏性末端， 这种能识别DNA分子中不同核苷酸序列，但切割产生相同黏性末端的限制 酶被称为同尾酶。同尾酶在基因工程操作中有重要的意义：例如，我们选 择了用某种限制酶切割载体，如果目的基因的核苷酸序列中恰好含有该限 制酶的识别序列，那么用该限制酶切割含有目的基因的DNA片段时，目的 基因就很可能被切断；这时可以考虑用合适的同尾酶（目的基因的核苷酸 序列中不能有它的识别序列）来获取目的基因。
考法1：根据限制酶识别序列判定末端形态
1.如表为几种限制酶的识别序列及其切割位点，由此推断，下列说法错误的是（　　）
限制酶名称 识别序列和切割位点
BamHⅠ
EcoRⅠ
限制酶名称 识别序列和切割位点
Hind Ⅱ
KpnⅠ
Sau3AⅠ
SmaⅠ
注：Y为C或T，R为A或G。
A.HindⅡ能识别GTCAAC序列，也能识别GTTAAC序列
B.Sau3A Ⅰ和EcoR Ⅰ破坏的都是识别序列中心轴线两侧的磷酸二酯键
C.BamH Ⅰ和Kpn Ⅰ两种限制酶可识别相同的序列但切割后形成不同的黏性末端
D.Hind Ⅱ、Sma Ⅰ两种限制酶的切割位点在识别序列中心轴线上，因而形成平末端
√
解析： 　当Y为C、R为A时，Hind Ⅱ的识别序列为GTCAAC，当Y为T、R为A时，Hind Ⅱ的识别序列为GTTAAC，A正确；Sau3A Ⅰ识别序列和切割位点为5'-↓GATC-3'，切割后形成的黏性末端是GATC-3'，破坏的是识别序列中心轴线两侧的磷酸二酯键，EcoR Ⅰ的识别序列和切割位点为5'-G↓AATTC-3'，切割后形成的黏性末端为AATTC-3'，破坏的也是中心轴线两侧的磷酸二酯键，B正确；BamH Ⅰ和Kpn Ⅰ两种限制酶的识别序列不同，切割后形成的黏性末端也不同，C错误；由表格可知，Hind Ⅱ、Sma Ⅰ两种限制酶的切割位点在识别序列中心轴线上，因而形成平末端，D正确。
考法2：从保证目的基因和质粒连接后正确表达的角度选择限制酶
2. 研究人员拟利用如图所示的目的基因片段和质粒构建基因表达载体。下 列相关叙述错误的是（　　）
名称 识别序列及切割 位点 名称 识别序列及
切割位点
SmaⅠ CCC↓GGG
GGG↑CCC EcoRⅠ G↓AATTC
CTTAA↑G
AvrⅡ C↓CTAGG
GGATC↑C XbalⅠ T↓CTAGA
AGATC↑T
A. 应选用SmaⅠ和XbalⅠ切割目的基因，SmaⅠ和AvrⅡ切割质粒
B. 最好选用T4 DNA连接酶连接目的基因与质粒
C. 重组表达载体能被XbalⅠ识别并切割
D. 目的基因以β链为模板链进行转录
√
解析： 　据表可知，Avr Ⅱ和Xbal Ⅰ切割后可产生相同的黏性末端，由图可 知，为了保证目的基因能正向接入载体，应选用Sma Ⅰ和Xbal Ⅰ切割目的基 因，Sma Ⅰ和Avr Ⅱ切割质粒，A正确；T4 DNA连接酶连接平末端的DNA效 率高，所以最好用T4 DNA连接酶目的基因与质粒，B正确；重组表达载体 序列不能被Avr Ⅱ 、Xbal Ⅰ识别，不能被二者切割，C错误；转录的方向为 5'→3'端，据图可知，目的基因以β链为模板链进行转录，D正确。
高考真题感悟
一、命题角度练
角度一 结合基因工程的操作程序，考查科学思维
1. （2025·黑吉辽蒙高考1题）下列关于耐高温的DNA聚合酶的叙述正确 的是（　　）
A. 基本单位是脱氧核苷酸
B. 在细胞内或细胞外均可发挥作用
C. 当模板DNA和脱氧核苷酸存在时即可催化反应
D. 为维持较高活性， 适宜在70 ℃～75 ℃下保存
√
解析： 　耐高温的DNA聚合酶的化学本质为蛋白质，基本单位是氨基 酸，A错误；只要有活性，酶可以在细胞内或细胞外发挥作用，B正确；耐 高温的DNA聚合酶通常应用于PCR过程，发挥作用时还需要引物等，C错 误；酶应该在较低温度下保存，而不是在适宜活性温度下保存，D错误。
2. （2025·安徽高考15题）质粒K中含有β-半乳糖苷酶基因，将该质粒导 入大肠杆菌细胞后，其编码的酶可分解X-gal，产生蓝色物质，进而形成蓝 色菌落，如图所示。科研小组以该质粒作为载体，采用基因工程技术实现 人源干扰素基因在大肠杆菌中的高效表达。下列叙述错误的是（　　）
A. 使用氯化钙处理大肠杆菌以提高转化效率，可增加筛选平板上白色和 蓝色菌落数
B. 如果筛选平板中仅含卡那霉素，生长出的白色菌落不可判定为含目的基 因的菌株
C. 因质粒K中含两个标记基因，筛选平板中长出的白色菌落即为表达目标 蛋白的菌株
D. 若筛选平板中蓝色菌落偏多，原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导 入了大肠杆菌
思维路径：基因工程图像分析
解析：C　氯化钙处理大肠杆菌能增强其对质粒的摄取能力，使更多大肠 杆菌获得质粒，提高其转化效率。若获得空载质粒（β-半乳糖苷酶基因未 被破坏），则会在筛选平板上形成蓝色菌落；若获得重组质粒（人源干扰 素基因的插入会破坏β-半乳糖苷酶基因），则会在筛选平板上形成白色菌 落。因此，使用氯化钙处理可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数，A正 确；若筛选平板中仅含卡那霉素，能在上面形成白色菌落的菌可能是导入 目的基因的大肠杆菌，也可能是对卡那霉素有抗性的杂菌，B正确；筛选 平板中长出白色菌落，只能说明菌株中导入了β-半乳糖苷酶基因被破坏的 质粒，但该质粒中是否正确连接目的基因，且目的基因是否转录、翻译， 是否表达出目标蛋白未知，还需要进一步鉴定，C错误；质粒K经过BamH Ⅰ酶切后，若未与目的基因连接，其可能是自身环化重新形成完整质粒，导入大肠杆菌后，β-半乳糖苷酶基因正常表达，分解X-gal产生蓝色物质，形成蓝色菌落，D正确。
3. （2024·江西高考12题）γ-氨基丁酸在医药等领域有重要的应用价值。 利用L-谷氨酸脱羧酶（GadB）催化L-谷氨酸脱羧是高效生产γ-氨基丁酸的 重要途径之一。研究人员采用如图方法将酿酒酵母S的L-谷氨酸脱羧酶基 因（gadB）导入生产菌株E. coli A，构建了以L-谷氨酸钠为底物高效生产 γ-氨基丁酸的菌株E. coli B。下列叙述正确的是（　　）
A. 如图表明，可以从酿酒酵母S中分离
得到目的基因gadB
B. E. coli B发酵生产γ-氨基丁酸时，L-谷氨
酸钠的作用是供能
C. E. coli A和E. coli B都能高效降解γ-氨基丁酸
D. 可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ构建重组质粒
√
解析： 　不能直接从酿酒酵母S中分离得到目的基因gadB，只能分离得 到含有目的基因gadB序列的染色体DNA，如题图所示，若要获取目的基 因，需要进行PCR，A错误；由题意知L-谷氨酸钠是合成γ-氨基丁酸的底 物，用L-谷氨酸脱羧酶（GadB）催化L-谷氨酸（或L-谷氨酸盐）脱羧（谷 氨酸→氨基丁酸＋CO2）生产γ-氨基丁酸，该过程L-谷氨酸钠的作用是底物 而不是供能，B错误；菌株E. coli A中没有L-谷氨酸脱羧酶基因 （gadB），不能表达产生L-谷氨酸脱羧酶（GadB），因而不能降解L-谷 氨酸，而E. coli B中导入L-谷氨酸脱羧酶基因（gadB），L-谷氨酸脱羧酶基因（gadB）表达产生L-谷氨酸脱羧酶（gadB），能高效降解L-谷氨酸钠生成γ-氨基丁酸，而不是高效降解γ-氨基丁酸，C错误；图中质粒下方括号内备注含多克隆位点，表明质粒上含有多种限制酶的识别序列，除了Nco Ⅰ和Kpn Ⅰ外还有其他的限制酶可选，D正确。
角度二 结合基因工程的相关实验，考查科学探究
4. （2024·安徽高考14题）下列关于“DNA粗提取与鉴定”实验的叙述， 错误的是（　　）
A. 实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低
B. 利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNA
C. DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA粗提物
D. 将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应，可检测溶液中是否含有蛋白 质杂质
√
解析： 　研磨液有利于DNA的溶解，换为蒸馏水，DNA提取的效率会降 低，A正确；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精，可 初步分离DNA，B正确；DNA在NaCl溶液中的溶解度随着NaCl浓度的变化 而改变，因此可用不同浓度的NaCl溶液对DNA进行粗提取，C正确；在沸 水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，二苯胺试剂用于鉴定DNA， D错误。
5. （2024·黑吉辽高考7题）关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实 验，下列叙述正确的是（　　）
A. 琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小
B. 凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置
C. 在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快
D. 琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来
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解析： 　应根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶 液，一般配制质量体积比为0.8％～1.2％的琼脂糖溶液，A正确；凝胶载 样缓冲液中指示剂的作用是指示电泳的进度，而不是指示DNA分子的具体 位置，B错误；在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的 大小和构象等有关，在同一电场作用下，DNA片段（带负电）越长，DNA 向正极迁移的速率越慢，C错误；凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波 长为300 nm的紫外灯下被检测出来，D错误。
二、长句表达练
6. （2025·全国卷34题节选）为在大肠杆菌中表达酶X，某同学将编码酶 X的基因（目的基因）插入质粒P0，构建重组质粒Px，并转入大肠杆菌。 该同学设计引物用PCR方法验证重组质粒构建成功（引物1～4结合位置如 图所示，→表示引物5'→3'方向）。
（1）该同学进行PCR实验时，所用模板与引物见下表。实验中①和④的作 用是： 。
管号 ① ② ③ ④ ⑤ ⑥
模板 无 P0 Px 无 P0 Px
引物对 引物1和引物2 引物3和引物4
作为对照（或答：鉴定反应体系是否有模板污染）　
P0不含与引物1和引物2互补的碱基序列　
目的基因、质粒片段、含
目的基因和部分质粒序列的片段　
（2）设计实验验证大肠杆菌表达的酶X有活性，简要写出实验思路和预期 结果。
提示：提取酶X，催化相应底物（反应物）的反应，检测是否有产物生 成。有产物生成，则证明酶X有活性。
课时跟踪检测
1. （2025·湖北荆州期末）下列有关基因工程的理论基础和技术发展的叙 述，错误的是（　　）
A. 遗传密码的破译为基因的分离和合成提供了理论依据
B. 基因载体的发现为基因跨物种转移找到了运载工具
C. 限制酶和DNA连接酶的发现为DNA的切割和连接创造了条件
D. PCR技术扩增目的基因的前提是已知目的基因的碱基序列
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解析： 　细菌的质粒有自我复制能力，并可以在细胞间转移，质粒作为 基因工程的常用载体，为基因跨物种转移找到了运载工具，B正确；基因 工程诞生的过程中，限制酶和DNA连接酶的发现为DNA的切割和连接创造 了条件，C正确；在基因工程中，利用PCR技术扩增目的基因的前提需要 有一段目的基因的已知碱基序列，便于合成引物，并不是已知目的基因的 全部碱基序列，D错误。
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2. （2025·陕西名校联考）基因工程操作过程中需要特殊工具和合适的受 体细胞。下列有关叙述错误的是（　　）
A. DNA连接酶与DNA聚合酶催化合成的化学键相同，但催化反应的底物 不同
B. 质粒作为载体必须具有特殊的标记基因，以便于重组DNA分子的筛选
C. 原核生物中限制酶不切割自身的DNA一定与其DNA中不存在该酶识别 序列有关
D. 培育转基因高产抗病植物时的受体细胞可以为受精卵或体细胞
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解析： 　DNA连接酶使DNA片段间形成磷酸二酯键，DNA聚合酶在DNA 复制时发挥作用，使单个的脱氧核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷 酸二酯键，两种酶催化合成的化学键相同，但催化反应的底物不同，A正 确；作为载体必须具备的条件之一是具有某些特殊的标记基因，以便重组 DNA分子的筛选，B正确；限制酶不切割自身DNA的原因可能是自身的识 别序列已经被修饰，C错误；可以用受精卵作为受体细胞，也可以用体细 胞作为受体细胞，再采用植物组织培养技术将受体细胞培育成转基因植 株，D正确。
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3. （2025·山东青岛一模）采用PCR技术可获取并扩增目的基因。下列说 法正确的是（　　）
A. 若PCR的模板是mRNA，完成扩增只需要逆转录酶
B. 预变性有利于模板DNA充分解聚为单链
C. 复性温度太高会导致引物和模板的非特异性结合增加
D. 一个DNA模板完成第20轮循环需要（220－2）个引物
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解析： 　若PCR的模板是mRNA，完成扩增需要逆转录酶和耐高温的 DNA聚合酶，A错误；预变性温度较高，双链DNA在热作用下，氢键断 裂，形成单链DNA，B正确；复性温度太低会导致引物和模板的非特异性 结合增加，温度太高会使引物与模板结合减少，C错误；合成1个DNA分子 需要2个引物，一个模板完成第20轮循环会合成220－219个DNA，因此需要 的引物为（220－219）×2＝220个，D错误。
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4. （2025·辽宁沈阳模拟）农杆菌转化法是植物转基因技术中常用的转化 方法之一。下列与该方法相关的叙述，错误的是（　　）
A. 土壤农杆菌是重组质粒的受体细胞
B. T-DNA是拟核DNA上的一段序列
C. 农杆菌能侵染双子叶植物和裸子植物
D. 新鲜叶圆片与农杆菌在适宜条件下共培养，部分细胞会被转化
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解析： 　将目的基因与载体相连形成重组质粒后，要导入土壤农杆菌 内，再让农杆菌去侵染植物细胞，A正确；T-DNA是位于Ti质粒中的一段 序列，不位于拟核，B错误；农杆菌能在自然条件下侵染双子叶植物和裸 子植物，对大多数单子叶植物没有侵染能力，C正确；农杆菌转化法的转 化效率不是100％，因此适宜条件下，新鲜叶圆片与农杆菌共培养后，部 分细胞会被转化，D正确。
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5. （2025·山东青岛一模）野生大豆的SAMS基因具有提高抗逆性的作 用。水稻是一种盐敏感型作物，为提高水稻的抗盐碱胁迫能力，研究者将 野生大豆的SAMS基因转入水稻细胞内，从而培养出转基因水稻株系，具 体过程如图。下列说法错误的是（　　）
A. 图示过程中发生了两次转化
B. Ⅰ和Ⅲ都需使用固体培养基
C. Ⅰ中的筛选可使用PCR技术
D. 获得的转基因水稻苗都具备
抗盐碱能力
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解析： 　转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳 定和表达的过程，图示过程需要两次转化，一是将目的基因（SAMS基 因）转化到质粒的T-DNA分子上，二是被插入目的基因的T-DNA转化到受 体细胞的染色体DNA分子上，A正确；Ⅰ和Ⅲ分别用于培养农杆菌和植物组 织培养的再分化过程，均需要使用固体培养基，B正确；PCR技术可用于 目的基因和基因表达载体的筛选，C正确；SAMS基因具有提高抗逆性的作 用，获得的转基因水稻幼苗不一定都具有抗盐碱的能力，所以需要将转基 因水稻置于盐碱的环境中，进行筛选与鉴定，D错误。
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6. （2026·江西九江开学考试）下列关于“DNA的粗提取与鉴定”实验的 叙述，正确的是（　　）
A. 以洋葱为材料研磨时需要切碎后加入蒸馏水进行充分研磨
B. 预冷的酒精溶液容易使DNA析出
C. 利用二苯胺试剂对提取的DNA进行鉴定时，不需要进行沸水浴
D. 粗提取的 DNA中不含有蛋白质
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解析： 　洋葱研磨时需加入洗涤剂（瓦解细胞膜）和食盐（溶解 DNA），仅用蒸馏水无法有效破碎细胞并释放DNA，A错误；DNA不溶于 酒精，而细胞中的某些蛋白质溶于酒精，预冷的酒精容易使DNA析出，B 正确；二苯胺试剂鉴定DNA需在沸水浴（约100 ℃）条件下显蓝色，否则 无法观察到明显的颜色变化，C错误；粗提取的DNA中可能残留少量蛋白 质（如未完全分解的组蛋白），需通过进一步纯化去除，D错误。
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7. （2025·山东烟台三模）下列关于“DNA片段的扩增及电泳”实验的叙 述，错误的是（　　）
A. 进行PCR时设计的引物长度和GC含量对PCR均有影响
B. PCR组分添加完成后用移液器轻吸混匀立即置于仪器使反应充分进行
C. 新的Taq DNA聚合酶可分装成小份并低温保存以防频繁取用导致酶失活
D. 琼脂糖凝胶电泳时，电泳缓冲液可维持pH，使溶液具有导电性，利于 核酸迁移
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解析： 　引物长度影响与模板结合的特异性，GC含量高则复性温度高， 两者均影响PCR效率，A正确。PCR组分添加后需充分混匀并短暂离心， 确保反应液集中管底。仅轻吸混匀可能混合不均，且未离心直接运行易导 致反应不充分，B错误。Taq DNA聚合酶需分装低温保存以避免反复冻融 失活，C正确。电泳缓冲液维持pH稳定并提供离子导电性，确保DNA迁 移，D正确。
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8. 当苹果削好皮或切开后放置一会儿，切口面的颜色就会由浅变深，最后 变成深褐色。发生色变反应主要是因为这些植物体内存在着酚类化合物。 酚类化合物易被氧化成醌类化合物，即发生变色反应变成黄色，随着反应 的量的增加颜色就逐渐加深，最后变成深褐色。氧化反应的发生是由于与 空气中的氧接触和细胞中酚氧化酶的释放。如图是培育抗褐变的转基因苹 果的过程，下列叙述不正确的是（　　）
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A. 要想获得抗褐变的转基因苹果，目的基因可选择抑制酚氧化酶表达的 基因
B. 实施步骤①是需要限制性内切核酸酶和DNA聚合酶的参与
C. 步骤④阶段使用的MS培养基中要加入植物激素和卡那霉素等物质
D. 为了评估目的基因抑制苹果褐变的效果，可与导入含pBI 121质粒的植 株作对照
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解析： 　褐变是细胞中的酚氧化酶催化酚类化合物变成黄色所致，故要 想获得抗褐变的转基因苹果，可选择抑制酚氧化酶表达的基因作为目的基 因，A正确；步骤①是目的基因表达载体的构建，该过程中需要限制性内 切核酸酶和DNA连接酶的参与，B错误；步骤④是脱分化阶段，该阶段使 用的MS培养基中要加入植物激素（影响细胞的发育方向）和卡那霉素（将 含有目的基因的细胞筛选出来），C正确；为了评估目的基因抑制苹果褐 变的效果，可与导入不含目的基因质粒的植株作对照，本实验设计的目的 是排除质粒本身对实验结果的影响，同时也能检测导入目的基因的效果， D正确。
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9. （2025·湖南衡阳月考）戊型肝炎病毒是一种RNA病毒，ORF2基因编 码的结构蛋白（pORF2）位于病毒表面，构成病毒的衣壳。我国科研人员 利用基因工程技术，在大肠杆菌中表达pORF2，制备戊型肝炎疫苗，过程 如图。下列关于该疫苗的叙述错误的是（　　）
A. 过程①需要的酶是RNA聚合酶，
原料是A、U、G、C
B. 重组基因表达载体上的启动子需
来源于大肠杆菌
C. 过程⑤需要用Ca2＋处理大肠杆菌使其处于一种能吸收周围环境中DNA 分子的生理状态
D. 过程⑥大量制备pORF2蛋白前应做相应的检测与鉴定
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解析： 　戊型肝炎病毒是一种RNA病毒，过程①是以病毒RNA为模板合 成DNA，获取目的基因的过程，需要的酶是逆转录酶，原料是四种脱氧核 苷酸，A错误；启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，其作用是供 RNA聚合酶的识别结合以驱动目的基因的转录，启动子具有物种或组织特 异性，构建在大肠杆菌细胞内特异表达pORF2的载体时，需要选择大肠杆 菌细胞的启动子，而不能选择其他物种的启动子，B正确；将目的基因导 入微生物细胞的方法是Ca2＋处理法，需要用Ca2＋处理大肠杆菌，使其处于 一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，C正确。
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10.（2025·河北沧州一模）基因工程可将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性，获得新品种，生产新产品。引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。下列相关叙述不正确的是（　　）
A.基因工程需引物是因为DNA聚合酶不能从头开始合成DNA
B.引物设计时既要考虑目的基因的碱基序列，还要考虑载体的碱基序列
C.为便于目的基因与载体连接，需在引物的3'端加上限制酶的酶切位点
D.用同一种限制酶切割获得的目的基因和质粒，在DNA连接酶作用下可能会反向连接
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解析： 　 DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸连续结合到双链DNA片段的引物链上，不能从头开始合成DNA，所以基因工程中进行PCR扩增等操作时需要引物，A正确；在基因工程中，引物要与模板DNA链（可能是目的基因或载体的一部分）结合，以便进行DNA的合成，因此，引物设计时既要考虑目的基因的碱基序列，还要考虑载体的碱基序列，B正确；为便于目的基因与载体连接，需在引物的5'端加上限制酶的酶切位点，而不是3'端，因为DNA聚合酶只能从引物的3'端开始延伸DNA链，若在3'端加酶切位点会影响DNA的合成，C错误；用同一种限制酶切割获得的目的基因和质粒，两端的黏性末端相同，在DNA连接酶作用下可能会出现正向连接，也可能会反向连接，D正确。
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终止
子、复制原点
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重组菌没有裂解或没有将蛋白A释放到细胞外、转速过高使蛋
白A发生沉淀、蛋白A亲水性较差发生沉淀、蛋白A被大肠杆菌的蛋白酶降
解
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解析： ①重组质粒的必备元件包括目的基因、限制酶切割位点、标 记基因、启动子和终止子，复制原点等，终止子能终止转录过程。要确定 基因A已连接到质粒中且插入方向正确，应选用引物P1和P3。因为P1与基 因下游的非编码区互补配对，P3与基因A上游且靠近启动子的区域互补配 对，这样扩增的片段大小为200＋582＝782 bp。②将DNA测序正确的重组 质粒转入大肠杆菌构建重组菌，培养后上清液中无蛋白A，可能的原因 有：重组菌没有裂解或没有将蛋白A释放到细胞外，转速过高使蛋白A发生 沉淀，蛋白A亲水性较差发生沉淀，蛋白A被大肠杆菌的蛋白酶降解。
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解析： 诱导动物细胞融合的常用方法有聚乙二醇（PEG）融合法、灭 活病毒诱导法、电融合法等。选择培养时，对杂交瘤细胞进行克隆化培养 和抗体检测，多次筛选获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。
聚乙二醇（PEG）融合法（或灭活病毒诱导法、电
融合法）
抗体检测
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