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第二节　纯净的目标微生物可通过分离和纯化获得
素养测练
对点达标练
题组一　微生物的分离和纯化
1.稀释涂布平板法是微生物培养中一种常用的接种方法。下列说法错误的是(　C　)
A.操作中需要将菌液进行一系列的浓度梯度稀释
B.需将不同稀释浓度的菌液分别涂布到固体培养基表面
C.不同浓度的菌液均可在培养基表面形成单个菌落
D.操作过程中对培养基和涂布器等均需进行严格灭菌处理
解析:不同稀释浓度的菌液接种后,只有在一定的稀释浓度的菌液里聚集在一起的微生物才能分散成单个细胞,从而能够在固体培养基表面形成单个菌落;如果稀释度过低,将不会形成单个菌落;如果稀释度过高,可能没有菌落。
2.某兴趣小组从土壤中分离和计数能分解尿素的微生物,下图结果最能达到实验目的的是(　B　)
A B C D
解析:由题意可知,需对能分解尿素的微生物进行分离和计数,其中平板划线法只能分离,不能计数,而稀释涂布平板法既能分离又能计数,A、B为稀释涂布平板法,但A浓度过大,C、D为平板划线法。
3.(杭州期中)图①～④表示采用不同方法分离和纯化大肠杆菌的部分操作。下列相关叙述正确的是(　C　)
A.①属于倒平板操作,盖上培养皿的皿盖后立即将平板倒置
B.②是将在火焰上灼烧过的接种环直接伸入菌液中蘸取菌液
C.③属于涂布平板操作,涂布时可转动培养皿使菌液分布均匀
D.④属于平板划线操作,平板上形成的单菌落可用于微生物计数
解析:①属于倒平板操作,盖上培养皿的皿盖后需待培养基冷却凝固才能将平板倒置;②是将在火焰上灼烧过的接种环冷却后伸入菌液中蘸取菌液;③属于涂布平板操作,涂布时可转动培养皿使菌液分布均匀;④属于平板划线操作,平板上形成的单菌落不可用于微生物计数,因为划线所用的菌液体积未知,以及划线起始部分菌体连在一起生长,不能计数菌体数量。稀释涂布平板法可用于微生物计数。
题组二　测定微生物的数量
4.下列有关稀释涂布平板法计数和显微镜计数法的描述,错误的是(　C　)
A.利用血细胞计数板计数属于显微镜计数法,其缺点是不能区分死菌与活菌
B.两种计数方法,其统计值与实际值相比,均有差异,但差异原因不同
C.两种计数方法均能在计数的同时观察到所研究微生物的形态特征
D.待菌落数目稳定时,才能对平板上的菌落进行计数
解析:用显微镜计数法统计计数室内的微生物个体,无法区分死菌和活菌;用稀释涂布平板法计数时,当两个或多个细胞连在一起时,平板上观察到的往往是一个菌落,故而统计值比实际值小,用显微镜计数时死菌和活菌均被计数,导致统计值偏高;涂布平板观察到的是菌落的形态,而不是微生物的形态。
5.如图为某同学取1 mL培养液稀释100倍后,通过显微镜观察到的培养液中的酵母菌在血细胞计数板(1 mm×1 mm×0.1 mm)中的分布情况。下列相关叙述错误的是(　C　)
A.该培养液中酵母菌的数量约为6×108个/mL
B.选择图示乙规格的计数室,含25个中方格、400个小方格
C.一个血细胞计数板中央仅含有一个计数室
D.取样时滴管从静置的培养液底部吸取,会导致数据偏大
解析:乙中一个中方格含24个酵母菌,则一个大方格中含600个,因大方格体积为0.1 mm3,又稀释了100倍,所以酵母菌数量约为6×108个/mL;该血细胞计数板的规格为25个中方格×16个小方格,即一个大方格中含有400个小方格;一个血细胞计数板含有两个计数室;静置的培养液中酵母菌沉到底部,直接从底部吸取会导致细胞数目偏多,数据偏大。
6.如图为利用稀释涂布平板法对土壤中某些细菌计数的实验操作示意图。据图分析下列叙述正确的是(　B　)
A.3号试管的稀释倍数为103倍
B.5号试管的结果表明每克土壤中的菌株数为1.7×109个
C.若图中三个平板其中之一与另外两个平板中的菌落数差别较大,应舍去该平板以另两个平板的平均值进行计数
D.该实验方法统计得到的结果往往会比实际活菌数目要多
解析:3号试管中的菌液稀释倍数为104倍;5号试管的稀释倍数为106倍,每克土壤中的菌株数为(168+175+167)÷3÷0.1×106=1.7×109(个);当出现一个平板的菌落数与另两个平板的菌落数差别较大的情况时,应重新涂布平板,避免出现较大误差;稀释涂布平板法得到的菌落可能存在两个或多个细菌细胞长成一个菌落的情况,统计结果往往会偏低。
题组三　有目的地培养某种微生物
7.(S9联盟高二期中)下列关于“能分解尿素的微生物的分离与计数”实验的叙述,错误的是(　A　)
A.用无菌的G6玻璃砂漏斗在超净工作台中对尿素固体培养基进行过滤除菌
B.从有哺乳动物排泄物的地方取土样,分离到目的微生物的概率高
C.培养过程中,将培养皿倒置能防止杂菌的污染
D.在相同培养条件下,圆形红色区域愈大,表明这种菌利用尿素的能力愈强
解析:在“能分解尿素的微生物的分离与计数”的实验中,配制好的尿素固体培养基加上封口膜后用高压蒸汽灭菌方法灭菌,冷却后加入用G6玻璃砂漏斗过滤的尿素溶液;在含哺乳动物排泄物的土壤中有较多尿素且含脲酶的细菌数量更多,从有哺乳动物排泄物的地方取土样,获得目的菌种的概率高;在培养过程中,培养皿倒置可以防止培养皿边缘和盖子上的冷凝水流入培养基而造成杂菌污染;若培养基中存在能分解尿素的细菌,其菌落周围会出现红色环带,这是由于尿素被分解产生的氨使培养基的pH升高,指示剂产生颜色变化,从而证明这一菌株以尿素为氮源,圆形红色区域愈大,表明这种菌利用尿素的能力愈强。
8.某同学想分离出能分解纤维素的细菌,进行了如下实验:取土壤悬浮液,接种于表面铺有一张滤纸的培养基,经培养得到了单菌落。下列叙述正确的是(　A　)
A.培养基pH需中性偏碱
B.可取相对干净的土壤制作悬浮液
C.培养基中需加入酵母提取物
D.分离得到的细菌均能分解纤维素
解析:在培养细菌时,需要将培养基pH调至中性偏碱;纤维素分解菌大多分布在富含纤维素的环境中,采集土样时,可以选择纤维素丰富的环境,如树林中多年落叶形成的腐殖土等,所以想分离出能分解纤维素的细菌,可取纤维素丰富的土壤制作悬浮液;想分离出能分解纤维素的细菌,培养基中一般都含有水、碳源(滤纸中纤维素)、氮源(提供氮元素的物质)和无机盐等营养物质,不需要加入酵母提取物;周围滤纸被分解的菌落中才含有能分解纤维素的细菌。
9.科学史资料:弗莱明发现金黄色葡萄球菌的培养基中长出了青霉菌落,青霉周围出现透明圈(如图),最终发现青霉素。抗生素能够抑制细菌的生长与繁殖,因此在抗生素环境周围出现了透明的抑菌圈。下列叙述错误的是(　D　)
A.是否有抑菌圈可判断抗生素对细菌是否有抑制效果
B.抑菌圈直径与菌落直径比值的大小可判断抗生素对细菌抑制效果强弱
C.要选择能抗青霉素的细菌应从抑菌圈边缘获取目的菌
D.抑菌圈边缘存活的细菌一定产生了耐药性
解析:若抗生素对细菌有抑制效果,则存在抗生素的部位不会生长细菌菌落,故是否有抑菌圈可判断抗生素对细菌是否有抑制效果;抑菌圈直径与菌落直径比值的大小可判断抗生素对细菌抑制效果强弱,一般而言比值越大,抑菌效果越好;由于抑菌圈边缘的菌落直接与青霉素接触,耐药性强,所以应从抑菌圈边缘的菌落挑取细菌,从而获取目的菌;抗生素能够抑制细菌,抑菌圈边缘抗生素浓度较低,故抑菌圈边缘菌落中的细菌可能产生了耐药性,但有可能也存在能利用耐药菌产物的其他菌。
题组四　微生物的接种、培养、分离与计数的规范操作
10.做“接种、培养并分离酵母菌”实验时,下列叙述正确的是(　D　)
A.使用液体培养基
B.为了防止污染,接种环经火焰灼烧后应趁热快速挑取菌落
C.用记号笔标记培养皿中菌落时,应标记在皿盖上
D.在未接种的培养基表面若有菌落生长,则需要重新进行实验
解析:“接种、培养并分离酵母菌”实验用的是固体培养基;接种环经火焰灼烧后,待冷却才可以挑取菌落;用记号笔标记培养皿中菌落时,应标记在皿底上。
11.下列关于微生物的实验操作,正确的是(　A　)
A.用显微镜计数法测定酵母菌的数量时,对于压在方格边缘线上的酵母菌的处理方法是计数相邻两边及其顶角上的酵母菌数
B.倒平板时,应将打开的皿盖放到一边,以免培养基溅到皿盖上
C.接种后未长出菌落的培养基可以直接丢弃
D.为保证无菌操作,接种针、接种环使用前都必须高压蒸汽灭菌
解析:为了避免重复计数,应遵循“数上不数下,数左不数右”的原则,对于压在方格边缘线上的酵母菌,计数相邻两边及其顶角上的酵母菌数;倒平板时,用拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙,将培养基倒入培养皿后,立即盖上皿盖,而不能打开皿盖,这样可能导致培养基被杂菌污染;接种后未长出菌落的培养基不能直接丢弃,要经过灭菌处理后才能丢弃;接种针、接种环使用前可用酒精灯灼烧灭菌。
综合提升练
阅读下列材料,完成12、13小题:
　　金黄色葡萄球菌(SAU)是细菌性肺炎的病原体之一,感染时常用红霉素、庆大霉素、万古霉素、氯霉素等抗生素治疗,研究人员分别将含上述等量抗生素的四张相同的滤纸片a、b、c、d置于SAU均匀分布的平板培养基上,在适宜条件下培养48 h,药敏实验结果如图所示。
12.下列关于金黄色葡萄球菌药敏实验的叙述,错误的是(　D　)
A.需增加含等量无菌水的相同滤纸片作空白对照
B.结果显示金黄色葡萄球菌对红霉素的敏感性较强
C.测量抑菌圈直径时可直接在培养皿底上测量
D.可将菌液用接种环均匀涂布在LB培养基上制成试验菌平板
解析:为使实验结果更有说服力,可增加一组含等量无菌水的大小相等的滤纸片作空白对照;a处透明圈最大,说明红霉素对该菌的作用效果最佳,金黄色葡萄球菌对红霉素最敏感;测量抑菌圈直径时,为避免沾染到微生物,可在培养皿底上测量;可将菌液用涂布器均匀涂布在LB培养基上制成试验菌平板。
13.图中庆大霉素(b)的抑菌圈内出现了抗药性的金黄色葡萄球菌菌落,下列叙述正确的是(　C　)
A.抑菌圈内出现菌落是由于庆大霉素使SAU发生了抗药性变异
B.抗药性的变异来源于SAU的基因突变或染色体畸变
C.挑取抑菌圈内的菌落重复上述药敏实验,b的抑菌圈将变小
D.抑菌圈中离纸片越远的菌落对庆大霉素的抗药性越强
解析:抑菌圈内出现的菌落具有抗药性,但其抗药性的产生不是庆大霉素导致的;由于细菌属于原核生物,无染色体,因此抗药性的变异只可能来源于SAU的基因突变,不可能是染色体畸变;挑取抑菌圈内的菌落重复题述药敏实验,只有对庆大霉素有抗性的SAU才会生存下去,因此SAU对庆大霉素将不敏感,因此b的抑菌圈将变小;抑菌圈中离纸片越近的菌落附近庆大霉素浓度越高,因此对庆大霉素的抗药性越强。
14.(温州月考)聚羟基脂肪酸酯(PHA)是由嗜盐细菌合成的一种胞内聚酯,它具有类似于合成塑料的理化特性,且废弃后易被生物降解,可用于制造无污染的“绿色塑料”。如图为科学家从某咸水湖中寻找产生PHA菌种的流程图。下列相关叙述正确的是(　B　)
A.可用平板划线法接种到含合成塑料的选择培养基上进行筛选
B.挑取菌落时,应挑取多个菌落并分别测定嗜盐细菌的PHA含量
C.扩大培养时,需要将接种后的培养基进行倒置培养
D.用稀释涂布平板法接种,需用涂布器蘸取少量菌液并均匀地涂布在培养基的表面
解析:由题干信息可知,PHA是由嗜盐细菌合成的一种胞内聚酯,为寻找到产生PHA的菌种,可用平板划线法将菌种接种到含盐量较高的选择培养基上进行筛选;为获得高产PHA菌种,挑取菌落时,应挑取多个菌落并分别测定嗜盐细菌的PHA含量,以确定高产菌株;扩大培养采用的是液体培养基,不能进行倒置培养;如用稀释涂布平板法接种,需将菌液滴在培养基上,再用涂布器涂布均匀。
15.请回答下列与微生物培养相关问题:
(1)如表是某公司研发的一种培养大肠杆菌菌群的培养基配方。
成分 蛋白胨 乳糖 蔗糖 K2HPO4 显色剂 琼脂
含量 10.0 g 5.0 g 5.0 g 2.0 g 0.2 g 12.0 g
将上述物质溶解后,用蒸馏水定容到1 000 mL
配制培养基时要注意调节培养基的pH,因为大肠杆菌通常要求在　　　　　的环境中才能生长。
(2)用　　　　　　　法将0.1 mL稀释液接种于培养基上,其中104倍稀释度的菌悬液培养后平均长出了88个菌落,则每毫升菌悬液大肠杆菌的数量为　　　　个,此法与显微镜计数法相比,计数结果　　　　(填“偏小”或“偏大”)。
(3)若将此培养基用于能分解尿素的微生物的分离实验,应更改培养基中　　　成分,说明理由:　 。
解析:(1)细菌通常要求在中性偏碱的环境中生长,大肠杆菌是细菌,故大肠杆菌通常要求在中性偏碱的环境中才能生长。
(2)经梯度稀释后,用稀释涂布平板法将0.1 mL稀释液涂布在固体培养基上,其中104倍稀释度的菌悬液培养后平均长出了88个菌落,则每毫升菌悬液大肠杆菌的数量为88÷0.1×104=8.8×106(个)。用稀释涂布平板法统计时,由于两个或多个细胞连在一起可以形成一个菌落,而显微镜计数法计数的是活细胞与死细胞,故此法与显微镜计数法相比,计数结果偏小。
(3)因为蛋白胨含有氮元素,本实验是以尿素为唯一氮源,故若将此培养基用于能分解尿素的微生物的分离实验,应更改培养基中蛋白胨成分。
答案:(1)中性偏碱
(2)稀释涂布平板　8.8×106　偏小
(3)蛋白胨　蛋白胨含有氮元素,本实验是以尿素为唯一氮源
16.(舟山高二月考)经人工诱变后,部分细菌由于某种酶被破坏,其细胞中某些化学反应不能正常进行,就形成了营养缺陷型菌株,这在工业生产上有较广阔的应用前景。以下是实验人员利用影印法初检某种氨基酸缺陷型菌株的过程,请回答下列问题:
(1)制备如图所示的培养基除含有细菌必需的水、碳源、　　　　　　等营养物质外,还需要加入　　　　　　。
(2)倒平板的适宜温度是60 ℃左右,待平板冷凝后,要将平板倒置,这样做的目的是
　。
(3)根据用途分类,图中基本培养基属于　　　(填“选择”或“鉴别”)培养基。
(4)进行过程②培养时,应先将丝绒布转印至　　　　　　(填“基本”或“完全”)培养基上,原因是　 。
(5)利用影印法培养的优点是不同培养基中同种菌株的接种位置相同,为了完成对初检的营养缺陷型菌株的鉴定,实验人员应挑取　　　　　　(填“菌落A”或“菌落B”)进行接种培养,并进一步鉴定。
(6)科研人员用射线处理目的菌获得两个突变株C和D,然后对突变株C和D进行实验,结果如表所示。
接种的菌种 一般培养基 实验处理及结果
C 不生长 添加营养物质 甲,能生长
D 不生长 添加营养物质 乙,能生长
C+D 能生长 不添加营养物质 甲、乙,都能生长
①突变株C不能在一般培养基上生长的原因最可能是　 。
②将突变株C和D混合在一起,接种于一般培养基上,都能生长的最可能的原因是
　。
解析:(1)图示培养基上最后都长出了菌落,说明该培养基为固体培养基,因此制备该培养基时除加入细菌必需的水、碳源、氮源、无机盐等营养物质外,还需要加入凝固剂(或琼脂)。
(2)倒平板的适宜温度是60 ℃左右,待平板冷凝后,要将平板倒置,平板倒置的好处是一方面可以防止皿盖上的水珠落入培养基造成污染,另一方面也可避免培养基中的水分过快蒸发。
(3)根据用途分类,图中基本培养基属于选择培养基,在该培养基上不能生长的即为相应的营养缺陷型菌株。
(4)进行过程②培养时,为防止特定氨基酸混入基本培养基中,应先将丝绒布转印至基本培养基上,再转印至完全培养基上。
(5)利用影印法培养可以使不同培养基中同种菌株的接种位置相同,为了完成对初检的营养缺陷型菌株的鉴定,实验人员应挑取完全培养基中的菌落A进行接种培养,并进一步
鉴定。
(6)①由表格分析可知,突变株C的生长依赖于营养物质甲,突变株C不能在一般培养基上生长的原因最可能是突变株C缺乏合成营养物质甲所需要的酶;②突变株C的生长依赖于营养物质甲,而突变株D的生长依赖于营养物质乙,不添加营养物质甲和乙,二者混合培养时都能生长,最可能的原因是突变株C为突变株D提供了营养物质乙,突变株D为突变株C提供了营养物质甲。
答案:(1)氮源、无机盐　凝固剂(或琼脂)
(2)可防止皿盖上的水珠落入培养基造成污染,又可避免培养基中的水分过快蒸发
(3)选择
(4)基本　防止基本培养基中混入特定氨基酸
(5)菌落A
(6)①突变株C缺乏合成营养物质甲所需要的酶
②突变株D可以提供突变株C生长需要的营养物质甲,突变株C可以提供突变株D生长需要的营养物质乙第二节　纯净的目标微生物可通过分离和纯化获得
学习目标
1.举例说明采用划线或涂布的接种方法能够实现对目标微生物的分离和纯化。
2.说明稀释涂布平板法和显微镜计数法可测定微生物的数量。
3.举例说明调整培养基的配方和培养方式可有目的地培养某种微生物。
一、采用划线或涂布的接种方法能够实现对目标微生物的分离和纯化
1.接种的概念及类型
接种是指微生物进入培养基质的过程,包括自然接种和人为接种。
2.单菌落
在固体培养基上通过接种、培养获得的由一个细胞分裂形成的、肉眼可见的、有一定形态构造的子细胞集团。
3.平板划线法
通常用接种环蘸取液体培养物或挑取固体表面的微生物后,在固体培养基表面进行连续平行划线、扇形划线或其他形式的划线,以实现接种的目的。
划线名称 划线方法
连续平行划线 从培养基上的一点出发,向左右连续划平行线至覆盖整个培养基表面
扇形划线 从培养基上的一点出发,向多方向多次划线。每划一条线都要将接种环在酒精灯的火焰上灭菌,然后再次从同一起点变换方向划线
续　表
划线名称 划线方法
多次连续平行划线 划线可分3～4次进行。将培养皿旋转一定角度后,不需再次蘸取菌种,只需在上一次划线的末端区域直接开始划线即可
4.稀释涂布平板法
二、接种、培养并分离酵母菌
1.原理
接种是使目标微生物在配制好的培养基上生长的操作。使用特定的接种技术可以在接种之后得到目标微生物的单菌落,实现对目标微生物的分离。
2.目的要求
(1)用平板划线法或稀释涂布平板法接种酵母菌。
(2)用液体培养基大量扩增酵母菌。
3.方法步骤
【易错判断】
(1)稀释涂布平板法使用的接种工具是涂布器,而平板划线法使用的是接种环。(　√　)
(2)稀释涂布平板法和平板划线法操作之前,都需要对菌液进行梯度稀释。(　×　)
提示:平板划线法操作是通过在固体培养基表面进行划线,降低菌种的密度,因此该操作方法不需要对菌液进行梯度稀释。
(3)接种环通过灼烧灭菌,在第二次及以后划线时,总是从上一次划线的末端开始划线,这样做的目的是将聚集的菌种逐步稀释,以便获得单菌落。(　√　)
(4)稀释涂布平板法能纯化微生物的原理是通过对菌液进行梯度稀释,当稀释度适当时,在固体培养基表面就能得到由单个细胞生长繁殖形成的单菌落。(　√　)
(5)获得单菌落后,挑取菌落接种至斜面培养基中的目的是短期保存菌种。(　√　)
三、稀释涂布平板法和显微镜计数法可测定微生物的数量
1.稀释涂布平板法
(1)操作要点。
①在保证能准确计数的前提下减小稀释度。
②将相同稀释度下的多组数值取平均值后再进行计算。
(2)计数公式。
每毫升菌液中微生物细胞的数量=某一稀释倍数下至少 3个培养皿的平均菌落数÷菌液稀释液体积×稀释倍数。
2.显微镜计数法
(1)血细胞计数板。
(2)步骤。
盖玻片盖在计数板上
　　↓
用吸管在中央平台盖玻片边缘滴加菌液
　　↓
选择适宜计数区进行计数
　　↓
计算菌液中细胞数
(3)计算公式。
菌液中细胞个数/mL=80个小方格细胞总数/80×400×10 000×稀释倍数
【易错判断】
(1)使用显微镜计数法对一个批次培养液中的酵母菌数量进行检测计数前,要将菌液反复振荡,这样做的目的是使培养液中的酵母菌均匀分布,减小误差。(　√　)
(2)使用血细胞计数板可以对冰淇淋中的大肠杆菌进行计数。(　√　)
(3)用稀释涂布平板法进行微生物计数时,结果往往比实际值偏大。(　×　)
提示:用稀释涂布平板法统计菌落数目时,若2个或2个以上的细菌连在一起,会形成一个菌落,这样统计的菌落数往往比活菌的实际数目要少。
(4)使用血细胞计数板进行计数时,应先在计数室上方加盖盖玻片,再滴加少量样液。(　√　)
四、调整培养基的配方和培养方式可有目的地培养某种微生物
1.微生物常见代谢类型
(1)按能否将CO2转变为有机物划分:自养型和异养型。
(2)按是否需要氧气划分:需氧型和厌氧型。
2.选择培养基
(1)定义:在培养基中添加(或减去)某种化学成分,使得只有某些特定的微生物能够生长,其他微生物均不能生长,这样的培养基称为选择培养基。
(2)应用价值。
①从混杂的微生物群体中快速筛选出所需种类的目标微生物。
②从已知种类的混杂的细胞群体中筛选出特定的细胞。
【易错判断】
(1)在牛肉膏蛋白胨培养基中加入高浓度NaCl可用于筛选耐盐细菌。(　√　)
(2)培养基中营养物质的浓度及比例都会影响微生物的生长。(　√　)
(3)能将分解尿素的细菌从土壤微生物中分离出来的原理是只有能分解尿素的细菌能在尿素培养基上生长,其他微生物不能利用尿素,无法生长。(　√　)
五、能分解尿素的微生物的分离与计数
1.实验原理
(1)当培养基中只有尿素作为氮源时,只有能分泌脲酶的微生物才能在该培养基中生长。
(2)微生物分解尿素产生的氨会使培养基的碱性增强,若在培养基中加入在酸性情况下呈黄色、碱性情况下呈红色的酚红指示剂,就可根据菌落周围是否出现红色区域,进一步鉴定尿素分解菌。
(3)在相同培养条件下,圆形红色区域愈大,表明这种菌利用尿素的能力愈强。
2.实验步骤
(1)制备培养基:配制100 mL LB固体培养基和100 mL 尿素固体培养基。
(2)灭菌:盛有蒸馏水的试管、三角瓶以及盛有未灭菌培养基的三角瓶:112 ℃下灭菌
30 min;尿素溶液:G6玻璃砂漏斗过滤除菌。
(3)倒平板:灭菌结束待培养基冷却至60 ℃时,在超净工作台内完成操作,冷却至凝固,备用。
(4)制备土壤细菌悬液:将已灭菌的5支试管依次标记→1 g土样+99 mL无菌水得10-2稀释液→取1 mL上清液+9 mL无菌水→得10-3稀释液,装入对应标记试管中→依次类推,得10-4、10-5、10-6、10-7稀释液。
(5)接种:①在培养皿底部做好标记。②用镊子夹取酒精棉,将手及超净工作台擦拭干净,待酒精挥发后再点燃酒精灯。③用移液器按照稀释度由大到小的顺序依次取0.1 mL土壤稀释液,在酒精灯火焰旁分别加入对应标记的培养皿中。④涂布。将稀释液均匀地涂布在培养基表面。
(6)培养:将培养皿倒置,置于37 ℃恒温培养箱中培养24～48 h。
【易错判断】
(1)分离尿素分解菌常采用稀释涂布平板法,用这种方法比显微镜计数法统计出的数值小的原因是显微镜计数法统计的是活菌和死菌,稀释涂布平板法统计的是活菌。(　√　)
(2)利用尿素固体培养基可杀死其他微生物,而保留能利用尿素的微生物。(　×　)
提示:尿素固体培养基是以尿素为唯一氮源,不能杀死其他微生物,其筛选出尿素分解菌的原因在于只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素,获得氮源,才能在此培养基中存活,其余微生物由于无法分解尿素,最终死亡。
(3)若从生活垃圾中分离能分解尿素的微生物,可在培养基中加入酚红指示剂,如果有尿素分解菌存在,则培养基中该菌落的周围会出现透明圈。(　×　)
提示:若从生活垃圾中分离能分解尿素的微生物,可在培养基中加入酚红指示剂,如果有尿素分解菌存在,则指示剂会变红。
(4)以尿素作为唯一氮源的培养基中分离出的微生物一定都是能分解尿素的微生物。(　×　)
提示:培养基上有些微生物可能是自生固氮微生物,不一定都是能分解尿素的微生物。
任务1　比较平板划线法与稀释涂布平板法的异同
阅读教材相关内容,列表比较平板划线法(以多次连续平行划线为例)与稀释涂布平板法的异同。
比较项目 平板划线法 稀释涂布平板法
纯化原理 通过连续划线的操作,将聚集的菌种逐步稀释分散 将菌液进行一系列梯度稀释,然后将不同稀释程度的菌液分别涂布到固体培养基的表面,进行培养,以形成单菌落
接种工具 接种环 涂布器
单菌 落的获得 单菌落从最后划线的区域挑取 只有合适的稀释度,才能得到数量适宜的单菌落
用途 分离纯化菌种 ①分离纯化菌种; ②用于活菌计数
操作难 易程度 操作较简单,细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少 操作比较复杂,需要将菌液进行一系列的梯度稀释和涂布培养,需要涂布多个平板
续　表
比较项目 平板划线法 稀释涂布平板法
菌落 示意图
共同点 ①都能分离纯化菌种; ②都是在固体培养基上进行的; ③都需要在酒精灯火焰旁进行接种
素养提升
平板划线和稀释涂布平板操作注意事项
(1)平板划线法(以多次连续平行划线为例)操作中应注意:
①在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环,在划线操作结束时,仍然需要灼烧接种环。
操作 第一次灼烧 每次划线之前灼烧 划线结束灼烧
目的 避免接种环上可能存在的微生物污染 杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种 杀死接种环上残留的菌种,避免污染环境或感染操作者
②在灼烧接种环之后,要等其冷却后再进行划线,以免接种环温度太高杀死菌种。
③在进行第二次及其后的划线操作时,要从上一次划线的末端开始划线。每次划线后,线条末端菌种的数目比线条起始处要少,每次从上一次划线的末端开始,能使菌种的数目随着划线次数的增加而逐步减少,最终经培养能得到单菌落。
(2)涂布器的灭菌:涂布器浸泡在75%的酒精中消毒,取出时,要让多余酒精在烧杯中滴尽,然后将蘸有少量酒精的涂布器在酒精灯火焰上灼烧。
迁移应用
1.(台州十校高二期中)图中甲是稀释涂布平板法中的部分操作,乙是平板划线法操作结果。下列叙述中,错误的是(　B　)
A.甲图中涂布前要将蘸有少量酒精的涂布器引燃,冷却后才能涂布菌液
B.稀释涂布平板法是将不同稀释度的菌液倒入液体培养基中进行培养
C.乙中培养皿中所得的菌落不都符合要求
D.乙中连续划线的起点是上一次划线的末端
解析:甲图中涂布前要将涂布器灼烧,冷却后才能涂布菌液;稀释涂布平板法使用固体培养基;乙培养皿中一般在5区域才能得到由单个细胞繁殖而形成的菌落;乙中连续划线的起点是上一次划线的末端,这样能使菌种的数目随着划线次数的增加而逐步减少,最终能得到由单个细胞繁殖而来的菌落。
2.(舟山高二月考)金黄色葡萄球菌是一种耐高盐的食源性致病微生物。哥伦比亚血平板是含无菌脱纤维羊血等成分的固体培养基,生长在该培养基上的金黄色葡萄球菌菌落能破坏其周围的红细胞,产生透明的溶血圈。如图为检测鲜牛奶是否被金黄色葡萄球菌污染的操作流程,据此分析不正确的是(　D　)
A.7.5%NaCl肉汤培养基从功能角度划分属于选择培养基
B.振荡培养后培养基变浑浊是耐高盐的微生物数量增多所致
C.若最终长出的菌落周围出现透明的溶血圈,则说明鲜牛奶被金黄色葡萄球菌污染
D.取菌种后的接种方法为稀释涂布平板法
解析:金黄色葡萄球菌是一种耐高盐的食源性致病微生物,因此7.5%NaCl肉汤培养基从功能角度划分属于选择培养基;7.5%NaCl肉汤培养基振荡培养后培养基变浑浊是耐高盐的微生物数量增多所致;金黄色葡萄球菌可破坏菌落周围的红细胞,产生透明的溶血圈,若最终长出的菌落周围出现透明的溶血圈,则说明鲜牛奶被金黄色葡萄球菌污染;由图可知,平板上出现前后相连的菌落群,故取菌种后的接种方法为平板划线法。
任务2　比较测定微生物数量的稀释涂布平板法与显微镜计数法
阅读教材相关内容,列表比较测定微生物数量的稀释涂布平板法与显微镜计数法。
项目 显微镜计数法 (直接计数法) 稀释涂布平板法 (间接计数法)
原理 利用特定的血细胞计数板,在显微镜下计算一定体积的样品中微生物的数量 当样品的稀释度足够高时,培养基表面生长的一个菌落来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数,就能推测出样品中大约有多少活菌
主要 工具 显微镜、血细胞计数板 培养基等
计数 依据 菌体本身 培养基上的菌落
续　表
项目 显微镜计数法 (直接计数法) 稀释涂布平板法 (间接计数法)
优点 计数方便,操作简单 计数的是活菌
缺点 死菌、活菌均计算在内 操作复杂,统计的菌落数往往比活菌的实际数低
计算 公式 每毫升菌液所含微生物细胞数=400×10 000×80个小方格细胞总数/80×稀释倍数 每毫升菌液所含微生物细胞数=某一稀释倍数下至少3个培养皿的平均菌落数÷菌液稀释液体积×稀释倍数
素养提升
1.稀释涂布平板法计数微生物的原理及误差分析
(1)原理:平板上的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌。
(2)误差分析:菌落数太少说明稀释倍数太大,各平板之间菌落数差异会很大,造成误差。平板上菌落数量太多,则菌落的生长受到抑制,菌落之间营养竞争较大,可导致某些菌落营养不良影响计数,并且难以区分各个菌落,无法准确计数,易造成误差。
(3)结果分析:统计的菌落数往往比实际数目少,这是因为当两个或多个细胞连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落,此外涂布器上还残留少量细菌。
2.血细胞计数板及其使用
(1)血细胞计数板:通常有两种规格,一种是一个大方格分成16个中方格,每个中方格又分成 25个小方格;另一种是一个大方格分成25个中方格,每个中方格又分成16个小方格。但无论哪种规格的计数板,每个大方格都有16×25=400(个)小方格。一个大方格长和宽各为1 mm,深度为0.1 mm,体积为0.1 mm3。
(2)计数方法:对于16×25的血细胞计数板而言,计四角的4个中方格,共计100个小方格中的个体数量;对于25×16的计数板而言,计四角和正中间的中方格(共5个),共计 80个小方格中的个体数量(如图所示)。
(3)计算方法。
①16×25型的计数板:微生物细胞个数/mL=100个小方格细胞总数/100×400×10 000×稀释倍数。
②25×16型的计数板:微生物细胞个数/mL=80个小方格细胞总数/80×400×10 000×稀释
倍数。
迁移应用
3.(9+1联盟高三联考)科研人员将培养到第4天的一定量酵母菌培养液稀释100倍后,与台盼蓝染液(台盼蓝染液能将死细胞染色)等体积混合均匀,一段时间后用血细胞计数板进行计数(血细胞计数板上面标注为1/400 mm2,0.1 mm,XB.K.25.)结果如下:计数室中a～e五个区域的细胞总数为54,着色细胞比例为20%,则10 mL酵母菌培养液中活菌数约为(　C　)
A.2.16×109个 B.2.16×108个
C.4.32×109个 D.4.32×108个
解析:据图可知,计数室中a～e五个区域都是16个小方格,细胞总数为54,说明一个小方格酵母菌数目为54÷5÷16=0.675(个),一个大方格体积为0.1 mm3,一个大方格含有400个小方格,那么0.1 mm3 培养液中含有的酵母菌数为400×0.675=270(个),由于酵母菌培养液与台盼蓝染液等体积混合均匀,据此可知,10 mL酵母菌培养液中酵母菌数目为2×270×105×102=5.4×109(个),死细胞失去选择透过性,台盼蓝染液能将死细胞染色,着色细胞比例为20%,说明活菌数比例为80%,因此10 mL酵母菌培养液中活菌数约为5.4×109×80%=4.32×109(个)。
4.益生菌是一类食用后能在肠道内发挥调节功能的活菌。市售的益生菌产品质量参差不齐,某益生菌品牌宣传其产品中活菌数不少于107个/g。研究小组尝试检测该品牌益生菌中的活菌含量是否与宣传一致,实验步骤为:制备培养基→调节pH→灭菌→倒平板→梯度稀释样品→接种→培养→计数。下列叙述错误的是(　C　)
A.培养箱中氧含量的变化会影响所培养的益生菌的繁殖和代谢
B.经高压蒸汽灭菌的空白平板和接种后的平板培养时均需要倒置
C.对该品牌益生菌进行计数时,稀释涂布平板法统计的数目会比实际值略大
D.若要检测培养基是否被污染,可将未接种的培养基在相同条件下进行培养
解析:益生菌主要在肠道内发挥调节功能,所以其代谢类型是厌氧型,因此培养箱中氧含量的变化会影响所培养的益生菌的繁殖和代谢;经高压蒸汽灭菌的空白平板和接种后的平板均需要倒置,防止冷凝水对培养基造成污染;由于两个或多个细胞可能会形成一个菌落,所以稀释涂布平板法统计的数目会比实际值略小;若要检测培养基是否被污染,可将未接种的培养基在相同条件下进行培养,如果出现了菌落,则说明培养基制作不合格,被污染。
任务3　举例分析不同类型培养基在微生物培养中的应用
阅读教材相关内容,列表比较特定培养基的设计原理与应用实例。
特定培养基的 设计原理 应用实例
具体处理 分离菌种
依据营养需求 不添加碳源 自养型微生物(蓝细菌、硝化细菌等)
不添加氮源 固氮微生物(圆褐固氮菌等)
以尿素为唯一氮源 能分解尿素的微生物
以石油为唯一碳源 能分解石油的微生物
加入某种化学物质,抑 制或杀死其他微生物 加入青霉素、 四环素或链霉素 抑制细菌生长→分离酵母菌、霉菌等
利用特殊环境 置于无氧条件下 厌氧型和兼性厌氧型微生物能生存→分离乳酸菌、酵母菌等
置于高盐环境中 其他菌在高盐环境中易失水而不能生存→分离金黄色葡萄球菌等
置于高温环境中 其他微生物因酶失活而无法生存→分离耐高温微生物
迁移应用
5.根据各类微生物的形态结构特点和新陈代谢类型,利用选择培养基和鉴别培养基,结合显微镜镜检以及菌落特征,可以把混杂在一起的硝化细菌、乳酸菌、酵母菌、圆褐固氮菌、能分解尿素的细菌等分离开来(真菌具有抗青霉素的特性)。下面是分离筛选的方法,请根据条件填写相应内容。首先配制一系列不同性质的固体培养基,然后进行高压蒸汽灭菌,再将上述微生物的混合液分别接种到各种培养基上培养。
(1)利用无氮源培养基可筛选出　 。
(2)用不含有机碳源的选择培养基可筛选出　　　　　　　　。
(3)酵母菌的筛选需要在常规培养基中另加入　　　　。
(4)在无氧环境下培养混合菌,　　　　　　　　可以生长,加入一定浓度的乳酸,使培养基pH充分降低,可抑制　　　　　的生长,利用菌落特征,结合显微镜镜检,选取具有生长优势的菌落,即可分离出　　　　　　　。
(5)若筛选能分解尿素的细菌,则配制的培养基特点是　　　　　　　　　。
解析:(1)无氮源培养基可筛选出能固氮的微生物(圆褐固氮菌)。
(2)不含有机碳源的选择培养基可筛选出自养型微生物(硝化细菌)。
(3)酵母菌是真菌,筛选时常在培养基中加入抗生素,防止其他细菌的生长。
(4)无氧条件下乳酸菌和酵母菌可以生长,加入一定浓度的乳酸可以抑制酵母菌的生长,可筛选出乳酸菌。
(5)在以尿素为唯一氮源的培养基上筛选能分解尿素的细菌。
答案:(1)圆褐固氮菌　
(2)硝化细菌　
(3)青霉素(或抗生素)　
(4)乳酸菌和酵母菌　酵母菌　乳酸菌　
(5)以尿素为唯一氮源
课堂小结
素养测练
对点达标练
题组一　微生物的分离和纯化
1.稀释涂布平板法是微生物培养中一种常用的接种方法。下列说法错误的是(　C　)
A.操作中需要将菌液进行一系列的浓度梯度稀释
B.需将不同稀释浓度的菌液分别涂布到固体培养基表面
C.不同浓度的菌液均可在培养基表面形成单个菌落
D.操作过程中对培养基和涂布器等均需进行严格灭菌处理
解析:不同稀释浓度的菌液接种后,只有在一定的稀释浓度的菌液里聚集在一起的微生物才能分散成单个细胞,从而能够在固体培养基表面形成单个菌落;如果稀释度过低,将不会形成单个菌落;如果稀释度过高,可能没有菌落。
2.某兴趣小组从土壤中分离和计数能分解尿素的微生物,下图结果最能达到实验目的的是(　B　)
A B C D
解析:由题意可知,需对能分解尿素的微生物进行分离和计数,其中平板划线法只能分离,不能计数,而稀释涂布平板法既能分离又能计数,A、B为稀释涂布平板法,但A浓度过大,C、D为平板划线法。
3.(杭州期中)图①～④表示采用不同方法分离和纯化大肠杆菌的部分操作。下列相关叙述正确的是(　C　)
A.①属于倒平板操作,盖上培养皿的皿盖后立即将平板倒置
B.②是将在火焰上灼烧过的接种环直接伸入菌液中蘸取菌液
C.③属于涂布平板操作,涂布时可转动培养皿使菌液分布均匀
D.④属于平板划线操作,平板上形成的单菌落可用于微生物计数
解析:①属于倒平板操作,盖上培养皿的皿盖后需待培养基冷却凝固才能将平板倒置;②是将在火焰上灼烧过的接种环冷却后伸入菌液中蘸取菌液;③属于涂布平板操作,涂布时可转动培养皿使菌液分布均匀;④属于平板划线操作,平板上形成的单菌落不可用于微生物计数,因为划线所用的菌液体积未知,以及划线起始部分菌体连在一起生长,不能计数菌体数量。稀释涂布平板法可用于微生物计数。
题组二　测定微生物的数量
4.下列有关稀释涂布平板法计数和显微镜计数法的描述,错误的是(　C　)
A.利用血细胞计数板计数属于显微镜计数法,其缺点是不能区分死菌与活菌
B.两种计数方法,其统计值与实际值相比,均有差异,但差异原因不同
C.两种计数方法均能在计数的同时观察到所研究微生物的形态特征
D.待菌落数目稳定时,才能对平板上的菌落进行计数
解析:用显微镜计数法统计计数室内的微生物个体,无法区分死菌和活菌;用稀释涂布平板法计数时,当两个或多个细胞连在一起时,平板上观察到的往往是一个菌落,故而统计值比实际值小,用显微镜计数时死菌和活菌均被计数,导致统计值偏高;涂布平板观察到的是菌落的形态,而不是微生物的形态。
5.如图为某同学取1 mL培养液稀释100倍后,通过显微镜观察到的培养液中的酵母菌在血细胞计数板(1 mm×1 mm×0.1 mm)中的分布情况。下列相关叙述错误的是(　C　)
A.该培养液中酵母菌的数量约为6×108个/mL
B.选择图示乙规格的计数室,含25个中方格、400个小方格
C.一个血细胞计数板中央仅含有一个计数室
D.取样时滴管从静置的培养液底部吸取,会导致数据偏大
解析:乙中一个中方格含24个酵母菌,则一个大方格中含600个,因大方格体积为0.1 mm3,又稀释了100倍,所以酵母菌数量约为6×108个/mL;该血细胞计数板的规格为25个中方格×16个小方格,即一个大方格中含有400个小方格;一个血细胞计数板含有两个计数室;静置的培养液中酵母菌沉到底部,直接从底部吸取会导致细胞数目偏多,数据偏大。
6.如图为利用稀释涂布平板法对土壤中某些细菌计数的实验操作示意图。据图分析下列叙述正确的是(　B　)
A.3号试管的稀释倍数为103倍
B.5号试管的结果表明每克土壤中的菌株数为1.7×109个
C.若图中三个平板其中之一与另外两个平板中的菌落数差别较大,应舍去该平板以另两个平板的平均值进行计数
D.该实验方法统计得到的结果往往会比实际活菌数目要多
解析:3号试管中的菌液稀释倍数为104倍;5号试管的稀释倍数为106倍,每克土壤中的菌株数为(168+175+167)÷3÷0.1×106=1.7×109(个);当出现一个平板的菌落数与另两个平板的菌落数差别较大的情况时,应重新涂布平板,避免出现较大误差;稀释涂布平板法得到的菌落可能存在两个或多个细菌细胞长成一个菌落的情况,统计结果往往会偏低。
题组三　有目的地培养某种微生物
7.(S9联盟高二期中)下列关于“能分解尿素的微生物的分离与计数”实验的叙述,错误的是(　A　)
A.用无菌的G6玻璃砂漏斗在超净工作台中对尿素固体培养基进行过滤除菌
B.从有哺乳动物排泄物的地方取土样,分离到目的微生物的概率高
C.培养过程中,将培养皿倒置能防止杂菌的污染
D.在相同培养条件下,圆形红色区域愈大,表明这种菌利用尿素的能力愈强
解析:在“能分解尿素的微生物的分离与计数”的实验中,配制好的尿素固体培养基加上封口膜后用高压蒸汽灭菌方法灭菌,冷却后加入用G6玻璃砂漏斗过滤的尿素溶液;在含哺乳动物排泄物的土壤中有较多尿素且含脲酶的细菌数量更多,从有哺乳动物排泄物的地方取土样,获得目的菌种的概率高;在培养过程中,培养皿倒置可以防止培养皿边缘和盖子上的冷凝水流入培养基而造成杂菌污染;若培养基中存在能分解尿素的细菌,其菌落周围会出现红色环带,这是由于尿素被分解产生的氨使培养基的pH升高,指示剂产生颜色变化,从而证明这一菌株以尿素为氮源,圆形红色区域愈大,表明这种菌利用尿素的能力愈强。
8.某同学想分离出能分解纤维素的细菌,进行了如下实验:取土壤悬浮液,接种于表面铺有一张滤纸的培养基,经培养得到了单菌落。下列叙述正确的是(　A　)
A.培养基pH需中性偏碱
B.可取相对干净的土壤制作悬浮液
C.培养基中需加入酵母提取物
D.分离得到的细菌均能分解纤维素
解析:在培养细菌时,需要将培养基pH调至中性偏碱;纤维素分解菌大多分布在富含纤维素的环境中,采集土样时,可以选择纤维素丰富的环境,如树林中多年落叶形成的腐殖土等,所以想分离出能分解纤维素的细菌,可取纤维素丰富的土壤制作悬浮液;想分离出能分解纤维素的细菌,培养基中一般都含有水、碳源(滤纸中纤维素)、氮源(提供氮元素的物质)和无机盐等营养物质,不需要加入酵母提取物;周围滤纸被分解的菌落中才含有能分解纤维素的细菌。
9.科学史资料:弗莱明发现金黄色葡萄球菌的培养基中长出了青霉菌落,青霉周围出现透明圈(如图),最终发现青霉素。抗生素能够抑制细菌的生长与繁殖,因此在抗生素环境周围出现了透明的抑菌圈。下列叙述错误的是(　D　)
A.是否有抑菌圈可判断抗生素对细菌是否有抑制效果
B.抑菌圈直径与菌落直径比值的大小可判断抗生素对细菌抑制效果强弱
C.要选择能抗青霉素的细菌应从抑菌圈边缘获取目的菌
D.抑菌圈边缘存活的细菌一定产生了耐药性
解析:若抗生素对细菌有抑制效果,则存在抗生素的部位不会生长细菌菌落,故是否有抑菌圈可判断抗生素对细菌是否有抑制效果;抑菌圈直径与菌落直径比值的大小可判断抗生素对细菌抑制效果强弱,一般而言比值越大,抑菌效果越好;由于抑菌圈边缘的菌落直接与青霉素接触,耐药性强,所以应从抑菌圈边缘的菌落挑取细菌,从而获取目的菌;抗生素能够抑制细菌,抑菌圈边缘抗生素浓度较低,故抑菌圈边缘菌落中的细菌可能产生了耐药性,但有可能也存在能利用耐药菌产物的其他菌。
题组四　微生物的接种、培养、分离与计数的规范操作
10.做“接种、培养并分离酵母菌”实验时,下列叙述正确的是(　D　)
A.使用液体培养基
B.为了防止污染,接种环经火焰灼烧后应趁热快速挑取菌落
C.用记号笔标记培养皿中菌落时,应标记在皿盖上
D.在未接种的培养基表面若有菌落生长,则需要重新进行实验
解析:“接种、培养并分离酵母菌”实验用的是固体培养基;接种环经火焰灼烧后,待冷却才可以挑取菌落;用记号笔标记培养皿中菌落时,应标记在皿底上。
11.下列关于微生物的实验操作,正确的是(　A　)
A.用显微镜计数法测定酵母菌的数量时,对于压在方格边缘线上的酵母菌的处理方法是计数相邻两边及其顶角上的酵母菌数
B.倒平板时,应将打开的皿盖放到一边,以免培养基溅到皿盖上
C.接种后未长出菌落的培养基可以直接丢弃
D.为保证无菌操作,接种针、接种环使用前都必须高压蒸汽灭菌
解析:为了避免重复计数,应遵循“数上不数下,数左不数右”的原则,对于压在方格边缘线上的酵母菌,计数相邻两边及其顶角上的酵母菌数;倒平板时,用拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙,将培养基倒入培养皿后,立即盖上皿盖,而不能打开皿盖,这样可能导致培养基被杂菌污染;接种后未长出菌落的培养基不能直接丢弃,要经过灭菌处理后才能丢弃;接种针、接种环使用前可用酒精灯灼烧灭菌。
综合提升练
阅读下列材料,完成12、13小题:
　　金黄色葡萄球菌(SAU)是细菌性肺炎的病原体之一,感染时常用红霉素、庆大霉素、万古霉素、氯霉素等抗生素治疗,研究人员分别将含上述等量抗生素的四张相同的滤纸片a、b、c、d置于SAU均匀分布的平板培养基上,在适宜条件下培养48 h,药敏实验结果如图所示。
12.下列关于金黄色葡萄球菌药敏实验的叙述,错误的是(　D　)
A.需增加含等量无菌水的相同滤纸片作空白对照
B.结果显示金黄色葡萄球菌对红霉素的敏感性较强
C.测量抑菌圈直径时可直接在培养皿底上测量
D.可将菌液用接种环均匀涂布在LB培养基上制成试验菌平板
解析:为使实验结果更有说服力,可增加一组含等量无菌水的大小相等的滤纸片作空白对照;a处透明圈最大,说明红霉素对该菌的作用效果最佳,金黄色葡萄球菌对红霉素最敏感;测量抑菌圈直径时,为避免沾染到微生物,可在培养皿底上测量;可将菌液用涂布器均匀涂布在LB培养基上制成试验菌平板。
13.图中庆大霉素(b)的抑菌圈内出现了抗药性的金黄色葡萄球菌菌落,下列叙述正确的是(　C　)
A.抑菌圈内出现菌落是由于庆大霉素使SAU发生了抗药性变异
B.抗药性的变异来源于SAU的基因突变或染色体畸变
C.挑取抑菌圈内的菌落重复上述药敏实验,b的抑菌圈将变小
D.抑菌圈中离纸片越远的菌落对庆大霉素的抗药性越强
解析:抑菌圈内出现的菌落具有抗药性,但其抗药性的产生不是庆大霉素导致的;由于细菌属于原核生物,无染色体,因此抗药性的变异只可能来源于SAU的基因突变,不可能是染色体畸变;挑取抑菌圈内的菌落重复题述药敏实验,只有对庆大霉素有抗性的SAU才会生存下去,因此SAU对庆大霉素将不敏感,因此b的抑菌圈将变小;抑菌圈中离纸片越近的菌落附近庆大霉素浓度越高,因此对庆大霉素的抗药性越强。
14.(温州月考)聚羟基脂肪酸酯(PHA)是由嗜盐细菌合成的一种胞内聚酯,它具有类似于合成塑料的理化特性,且废弃后易被生物降解,可用于制造无污染的“绿色塑料”。如图为科学家从某咸水湖中寻找产生PHA菌种的流程图。下列相关叙述正确的是(　B　)
A.可用平板划线法接种到含合成塑料的选择培养基上进行筛选
B.挑取菌落时,应挑取多个菌落并分别测定嗜盐细菌的PHA含量
C.扩大培养时,需要将接种后的培养基进行倒置培养
D.用稀释涂布平板法接种,需用涂布器蘸取少量菌液并均匀地涂布在培养基的表面
解析:由题干信息可知,PHA是由嗜盐细菌合成的一种胞内聚酯,为寻找到产生PHA的菌种,可用平板划线法将菌种接种到含盐量较高的选择培养基上进行筛选;为获得高产PHA菌种,挑取菌落时,应挑取多个菌落并分别测定嗜盐细菌的PHA含量,以确定高产菌株;扩大培养采用的是液体培养基,不能进行倒置培养;如用稀释涂布平板法接种,需将菌液滴在培养基上,再用涂布器涂布均匀。
15.请回答下列与微生物培养相关问题:
(1)如表是某公司研发的一种培养大肠杆菌菌群的培养基配方。
成分 蛋白胨 乳糖 蔗糖 K2HPO4 显色剂 琼脂
含量 10.0 g 5.0 g 5.0 g 2.0 g 0.2 g 12.0 g
将上述物质溶解后,用蒸馏水定容到1 000 mL
配制培养基时要注意调节培养基的pH,因为大肠杆菌通常要求在　　　　　的环境中才能生长。
(2)用　　　　　　　法将0.1 mL稀释液接种于培养基上,其中104倍稀释度的菌悬液培养后平均长出了88个菌落,则每毫升菌悬液大肠杆菌的数量为　　　　个,此法与显微镜计数法相比,计数结果　　　　(填“偏小”或“偏大”)。
(3)若将此培养基用于能分解尿素的微生物的分离实验,应更改培养基中　　　成分,说明理由:　 。
解析:(1)细菌通常要求在中性偏碱的环境中生长,大肠杆菌是细菌,故大肠杆菌通常要求在中性偏碱的环境中才能生长。
(2)经梯度稀释后,用稀释涂布平板法将0.1 mL稀释液涂布在固体培养基上,其中104倍稀释度的菌悬液培养后平均长出了88个菌落,则每毫升菌悬液大肠杆菌的数量为88÷0.1×104=8.8×106(个)。用稀释涂布平板法统计时,由于两个或多个细胞连在一起可以形成一个菌落,而显微镜计数法计数的是活细胞与死细胞,故此法与显微镜计数法相比,计数结果偏小。
(3)因为蛋白胨含有氮元素,本实验是以尿素为唯一氮源,故若将此培养基用于能分解尿素的微生物的分离实验,应更改培养基中蛋白胨成分。
答案:(1)中性偏碱
(2)稀释涂布平板　8.8×106　偏小
(3)蛋白胨　蛋白胨含有氮元素,本实验是以尿素为唯一氮源
16.(舟山高二月考)经人工诱变后,部分细菌由于某种酶被破坏,其细胞中某些化学反应不能正常进行,就形成了营养缺陷型菌株,这在工业生产上有较广阔的应用前景。以下是实验人员利用影印法初检某种氨基酸缺陷型菌株的过程,请回答下列问题:
(1)制备如图所示的培养基除含有细菌必需的水、碳源、　　　　　　等营养物质外,还需要加入　　　　　　。
(2)倒平板的适宜温度是60 ℃左右,待平板冷凝后,要将平板倒置,这样做的目的是
　。
(3)根据用途分类,图中基本培养基属于　　　(填“选择”或“鉴别”)培养基。
(4)进行过程②培养时,应先将丝绒布转印至　　　　　　(填“基本”或“完全”)培养基上,原因是　 。
(5)利用影印法培养的优点是不同培养基中同种菌株的接种位置相同,为了完成对初检的营养缺陷型菌株的鉴定,实验人员应挑取　　　　　　(填“菌落A”或“菌落B”)进行接种培养,并进一步鉴定。
(6)科研人员用射线处理目的菌获得两个突变株C和D,然后对突变株C和D进行实验,结果如表所示。
接种的菌种 一般培养基 实验处理及结果
C 不生长 添加营养物质 甲,能生长
D 不生长 添加营养物质 乙,能生长
C+D 能生长 不添加营养物质 甲、乙,都能生长
①突变株C不能在一般培养基上生长的原因最可能是　 。
②将突变株C和D混合在一起,接种于一般培养基上,都能生长的最可能的原因是
　。
解析:(1)图示培养基上最后都长出了菌落,说明该培养基为固体培养基,因此制备该培养基时除加入细菌必需的水、碳源、氮源、无机盐等营养物质外,还需要加入凝固剂(或琼脂)。
(2)倒平板的适宜温度是60 ℃左右,待平板冷凝后,要将平板倒置,平板倒置的好处是一方面可以防止皿盖上的水珠落入培养基造成污染,另一方面也可避免培养基中的水分过快蒸发。
(3)根据用途分类,图中基本培养基属于选择培养基,在该培养基上不能生长的即为相应的营养缺陷型菌株。
(4)进行过程②培养时,为防止特定氨基酸混入基本培养基中,应先将丝绒布转印至基本培养基上,再转印至完全培养基上。
(5)利用影印法培养可以使不同培养基中同种菌株的接种位置相同,为了完成对初检的营养缺陷型菌株的鉴定,实验人员应挑取完全培养基中的菌落A进行接种培养,并进一步
鉴定。
(6)①由表格分析可知,突变株C的生长依赖于营养物质甲,突变株C不能在一般培养基上生长的原因最可能是突变株C缺乏合成营养物质甲所需要的酶;②突变株C的生长依赖于营养物质甲,而突变株D的生长依赖于营养物质乙,不添加营养物质甲和乙,二者混合培养时都能生长,最可能的原因是突变株C为突变株D提供了营养物质乙,突变株D为突变株C提供了营养物质甲。
答案:(1)氮源、无机盐　凝固剂(或琼脂)
(2)可防止皿盖上的水珠落入培养基造成污染,又可避免培养基中的水分过快蒸发
(3)选择
(4)基本　防止基本培养基中混入特定氨基酸
(5)菌落A
(6)①突变株C缺乏合成营养物质甲所需要的酶
②突变株D可以提供突变株C生长需要的营养物质甲,突变株C可以提供突变株D生长需要的营养物质乙(共53张PPT)
第二节　纯净的目标微生物
可通过分离和纯化获得
[学习目标]
1.举例说明采用划线或涂布的接种方法能够实现对目标微生物的分离和
纯化。
2.说明稀释涂布平板法和显微镜计数法可测定微生物的数量。
3.举例说明调整培养基的配方和培养方式可有目的地培养某种微生物。
知识梳理
一、采用划线或涂布的接种方法能够实现对目标微生物的分离和纯化
1.接种的概念及类型
接种是指微生物进入培养基质的过程,包括 和 。
2.单菌落
在固体培养基上通过接种、培养获得的由一个细胞分裂形成的、肉眼可见的、有一定形态构造的子细胞集团。
自然接种
人为接种
3.平板划线法
通常用 蘸取液体培养物或挑取固体表面的微生物后,在固体培养基表面进行连续平行划线、 或其他形式的划线,以实现接种的目的。
接种环
扇形划线
划线名称 划线方法
连续平行划线 从培养基上的一点出发,向左右连续划平行线至覆盖整个培养基表面
扇形划线 从培养基上的一点出发,向多方向多次划线。每划一条线都要将接种环在 ,然后再次从 起点变换方向划线
酒精灯的火焰上灭菌
同一
划线可分 次进行。将培养皿旋转一定角度后,不需再次蘸取菌种,只需在
直接开始划线即可
多次连续平行划线
3～4
上一次划线的末端区域
4.稀释涂布平板法
梯度稀释
稀释度
0.1
固体培养基
涂布器
单菌落
二、接种、培养并分离酵母菌
1.原理
接种是使 在配制好的培养基上生长的操作。使用特定的接种技术可以在接种之后得到目标微生物的 ,实现对目标微生物的分离。
2.目的要求
(1)用平板划线法或稀释涂布平板法接种酵母菌。
(2)用液体培养基大量扩增酵母菌。
目标微生物
单菌落
3.方法步骤
未凝固
酵母菌菌液
0.1
涂布器
接种环
25
划线
【易错判断】
(1)稀释涂布平板法使用的接种工具是涂布器,而平板划线法使用的是接种环。
(　 　)
(2)稀释涂布平板法和平板划线法操作之前,都需要对菌液进行梯度稀释。
(　 　)
√
×
提示:平板划线法操作是通过在固体培养基表面进行划线,降低菌种的密度,因此该操作方法不需要对菌液进行梯度稀释。
(3)接种环通过灼烧灭菌,在第二次及以后划线时,总是从上一次划线的末端开始划线,这样做的目的是将聚集的菌种逐步稀释,以便获得单菌落。(　　)
(4)稀释涂布平板法能纯化微生物的原理是通过对菌液进行梯度稀释,当稀释度适当时,在固体培养基表面就能得到由单个细胞生长繁殖形成的单菌落。
(　 　)
(5)获得单菌落后,挑取菌落接种至斜面培养基中的目的是短期保存菌种。
(　 　)
√
√
√
三、稀释涂布平板法和显微镜计数法可测定微生物的数量
1.稀释涂布平板法
(1)操作要点。
①在保证能准确计数的前提下减小稀释度。
②将相同稀释度下的多组数值取 后再进行计算。
(2)计数公式。
每毫升菌液中微生物细胞的数量=某一稀释倍数下至少 个培养皿的平均菌落数÷菌液稀释液体积× 。
平均值
3
稀释倍数
2.显微镜计数法
(1)血细胞计数板。
(2)步骤。
盖玻片盖在计数板上
　　↓
　　↓
选择适宜计数区进行计数
　　↓
计算菌液中细胞数
(3)计算公式。
菌液中细胞个数/mL=80个小方格细胞总数/80×400×10 000×
中央平台盖玻片
盖玻片
气泡
稀释倍数
【易错判断】
(1)使用显微镜计数法对一个批次培养液中的酵母菌数量进行检测计数前,要将菌液反复振荡,这样做的目的是使培养液中的酵母菌均匀分布,减小误差。
(　 　)
(2)使用血细胞计数板可以对冰淇淋中的大肠杆菌进行计数。(　 　)
√
√
(3)用稀释涂布平板法进行微生物计数时,结果往往比实际值偏大。(　 　)
×
提示:用稀释涂布平板法统计菌落数目时,若2个或2个以上的细菌连在一起,会形成一个菌落,这样统计的菌落数往往比活菌的实际数目要少。
(4)使用血细胞计数板进行计数时,应先在计数室上方加盖盖玻片,再滴加少量样液。(　 　)
√
四、调整培养基的配方和培养方式可有目的地培养某种微生物
1.微生物常见代谢类型
(1)按能否将CO2转变为有机物划分: 和异养型。
(2)按是否需要氧气划分:需氧型和 。
2.选择培养基
(1)定义:在培养基中 某种化学成分,使得只有 的微生物能够生长,其他微生物均不能生长,这样的培养基称为选择培养基。
自养型
厌氧型
添加(或减去)
某些特定
(2)应用价值。
①从混杂的微生物群体中快速筛选出所需种类的 。
②从已知种类的混杂的细胞群体中筛选出 。
目标微生物
特定的细胞
【易错判断】
(1)在牛肉膏蛋白胨培养基中加入高浓度NaCl可用于筛选耐盐细菌。(　 　)
(2)培养基中营养物质的浓度及比例都会影响微生物的生长。(　 　)
(3)能将分解尿素的细菌从土壤微生物中分离出来的原理是只有能分解尿素的细菌能在尿素培养基上生长,其他微生物不能利用尿素,无法生长。(　 　)
√
√
√
五、能分解尿素的微生物的分离与计数
1.实验原理
(1)当培养基中只有尿素作为氮源时,只有能分泌 的微生物才能在该培养基中生长。
(2)微生物分解尿素产生的氨会使培养基的碱性增强,若在培养基中加入在酸性情况下呈 、碱性情况下呈 的酚红指示剂,就可根据菌落周围是否出现 区域,进一步鉴定尿素分解菌。
(3)在相同培养条件下,圆形红色区域愈大,表明这种菌利用尿素的能力 。
脲酶
黄色
红色
红色
愈强
2.实验步骤
(1)制备培养基:配制100 mL 培养基和100 mL 培养基。
(2)灭菌:盛有蒸馏水的试管、三角瓶以及盛有未灭菌培养基的三角瓶:112 ℃下灭菌30 min;尿素溶液: 除菌。
(3)倒平板:灭菌结束待培养基冷却至60 ℃时,在 内完成操作,冷却至凝固,备用。
(4)制备土壤细菌悬液:将已灭菌的5支试管依次标记→1 g土样+99 mL无菌水
得10-2稀释液→取1 mL上清液+9 mL无菌水→得10-3稀释液,装入对应标记试管中→依次类推,得10-4、10-5、10-6、10-7稀释液。
LB固体
尿素固体
G6玻璃砂漏斗过滤
超净工作台
(5)接种:①在培养皿底部做好标记。②用镊子夹取酒精棉,将
擦拭干净,待酒精挥发后再点燃酒精灯。③用移液器按照稀释度
的顺序依次取0.1 mL土壤稀释液,在酒精灯火焰旁分别加入对应标记的培养皿中。④涂布。将稀释液均匀地涂布在培养基表面。
(6)培养:将培养皿 ,置于37 ℃恒温培养箱中培养24～48 h。
手及超净
工作台
由大到小
倒置
【易错判断】
(1)分离尿素分解菌常采用稀释涂布平板法,用这种方法比显微镜计数法统计出的数值小的原因是显微镜计数法统计的是活菌和死菌,稀释涂布平板法统计的是活菌。(　 　)
(2)利用尿素固体培养基可杀死其他微生物,而保留能利用尿素的微生物。
(　 　)
√
×
提示:尿素固体培养基是以尿素为唯一氮源,不能杀死其他微生物,其筛选出尿素分解菌的原因在于只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素,获得氮源,才能在此培养基中存活,其余微生物由于无法分解尿素,最终死亡。
(3)若从生活垃圾中分离能分解尿素的微生物,可在培养基中加入酚红指示 剂,如果有尿素分解菌存在,则培养基中该菌落的周围会出现透明圈。(　 　)
×
提示:若从生活垃圾中分离能分解尿素的微生物,可在培养基中加入酚红指示剂,如果有尿素分解菌存在,则指示剂会变红。
(4)以尿素作为唯一氮源的培养基中分离出的微生物一定都是能分解尿素的微生物。(　 　)
×
提示:培养基上有些微生物可能是自生固氮微生物,不一定都是能分解尿素的微生物。
任务突破
任务1　比较平板划线法与稀释涂布平板法的异同
阅读教材相关内容,列表比较平板划线法(以多次连续平行划线为例)与稀释涂布平板法的异同。
比较项目 平板划线法 稀释涂布平板法
纯化原理 通过连续划线的操作,将聚集的菌种逐步稀释分散 将菌液进行一系列 ,然后将不同稀释程度的菌液分别涂布到固体培养基的表面,进行培养,以形成
梯度稀释
单菌落
接种工具
单菌 落的获得 单菌落从最后划线的区域挑取 只有合适的稀释度,才能得到数量适宜的单菌落
用途 分离纯化菌种 ①分离纯化菌种;
②用于活菌计数
操作难 易程度 操作较简单,细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少 操作比较复杂,需要将菌液进行一系列的梯度稀释和涂布培养,需要涂布多个平板
接种环
涂布器
菌落 示意图
共同点 ①都能分离纯化菌种; ②都是在固体培养基上进行的; ③都需要在酒精灯火焰旁进行接种
[素养提升]
平板划线和稀释涂布平板操作注意事项
(1)平板划线法(以多次连续平行划线为例)操作中应注意:
①在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环,在划线操作结束时,仍然需要灼烧接种环。
操作 第一次灼烧 每次划线之前灼烧 划线结束灼烧
目的 避免接种环上可能存在的微生物污染 杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种 杀死接种环上残留的菌种,避免污染环境或感染操作者
②在灼烧接种环之后,要等其冷却后再进行划线,以免接种环温度太高杀死菌种。
③在进行第二次及其后的划线操作时,要从上一次划线的末端开始划线。每次划线后,线条末端菌种的数目比线条起始处要少,每次从上一次划线的末端开始,能使菌种的数目随着划线次数的增加而逐步减少,最终经培养能得到单菌落。
(2)涂布器的灭菌:涂布器浸泡在75%的酒精中消毒,取出时,要让多余酒精在烧杯中滴尽,然后将蘸有少量酒精的涂布器在酒精灯火焰上灼烧。
[迁移应用]
1.(台州十校高二期中)图中甲是稀释涂布平板法中的部分操作,乙是平板划线法操作结果。下列叙述中,错误的是(　 　)
A.甲图中涂布前要将蘸有少量酒精的涂布器引燃,冷却后才能涂布菌液
B.稀释涂布平板法是将不同稀释度的菌液倒入液体培养基中进行培养
C.乙中培养皿中所得的菌落不都符合要求
D.乙中连续划线的起点是上一次划线的末端
B
解析:甲图中涂布前要将涂布器灼烧,冷却后才能涂布菌液;稀释涂布平板法使用固体培养基;乙培养皿中一般在5区域才能得到由单个细胞繁殖而形成的菌落;乙中连续划线的起点是上一次划线的末端,这样能使菌种的数目随着划线次数的增加而逐步减少,最终能得到由单个细胞繁殖而来的菌落。
2.(舟山高二月考)金黄色葡萄球菌是一种耐高盐的食源性致病微生物。哥伦比亚血平板是含无菌脱纤维羊血等成分的固体培养基,生长在该培养基上的金黄色葡萄球菌菌落能破坏其周围的红细胞,产生透明的溶血圈。如图为检测鲜牛奶是否被金黄色葡萄球菌污染的操作流程,
据此分析不正确的是(　 　)
A.7.5%NaCl肉汤培养基从功能角度划分属于选择培养基
B.振荡培养后培养基变浑浊是耐高盐的微生物数量增多所致
C.若最终长出的菌落周围出现透明的溶血圈,则说明鲜牛奶被金黄色葡萄球菌污染
D.取菌种后的接种方法为稀释涂布平板法
D
解析:金黄色葡萄球菌是一种耐高盐的食源性致病微生物,因此7.5%NaCl肉汤培养基从功能角度划分属于选择培养基;7.5%NaCl肉汤培养基振荡培养后培养基变浑浊是耐高盐的微生物数量增多所致;金黄色葡萄球菌可破坏菌落周围的红细胞,产生透明的溶血圈,若最终长出的菌落周围出现透明的溶血圈,则说明鲜牛奶被金黄色葡萄球菌污染;由图可知,平板上出现前后相连的菌落群,故取菌种后的接种方法为平板划线法。
任务2　比较测定微生物数量的稀释涂布平板法与显微镜计数法
阅读教材相关内容,列表比较测定微生物数量的稀释涂布平板法与显微镜计数法。
项目 显微镜计数法 (直接计数法) 稀释涂布平板法
(间接计数法)
原理 利用特定的 ,在显微镜下计算一定体积的样品中微生物的数量 当样品的稀释度足够高时,培养基表面生长的一个菌落来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数,就能推测出样品中大约有多少活菌
血细胞计
数板
主要工具 显微镜、血细胞计数板 培养基等
计数依据 菌体本身 培养基上的
优点 计数方便,操作简单 计数的是活菌
缺点 死菌、活菌均计算在内 操作复杂,统计的菌落数往往比活菌的实际数
计算 公式 每毫升菌液所含微生物细胞数=400×10 000×80个小方格细胞总数/80×稀释倍数 每毫升菌液所含微生物细胞数=某一稀释倍数下至少3个培养皿的平均菌落数÷菌液稀释液体积×稀释倍数
菌落
低
[素养提升]
1.稀释涂布平板法计数微生物的原理及误差分析
(1)原理:平板上的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌。
(2)误差分析:菌落数太少说明稀释倍数太大,各平板之间菌落数差异会很大,造成误差。平板上菌落数量太多,则菌落的生长受到抑制,菌落之间营养竞争较大,可导致某些菌落营养不良影响计数,并且难以区分各个菌落,无法准确计数,易造成误差。
(3)结果分析:统计的菌落数往往比实际数目少,这是因为当两个或多个细胞连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落,此外涂布器上还残留少量细菌。
2.血细胞计数板及其使用
(1)血细胞计数板:通常有两种规格,一种是一个大方格分成16个中方格,每个中方格又分成 25个小方格;另一种是一个大方格分成25个中方格,每个中方格又分成16个小方格。但无论哪种规格的计数板,每个大方格都有16×25=400(个)小方格。一个大方格长和宽各为1 mm,深度为0.1 mm,体积为0.1 mm3。
(2)计数方法:对于16×25的血细胞计数板而言,计四角的4个中方格,共计
100个小方格中的个体数量;对于25×16的计数板而言,计四角和正中间的中方格(共5个),共计 80个小方格中的个体数量(如图所示)。
(3)计算方法。
①16×25型的计数板:微生物细胞个数/mL=100个小方格细胞总数/100× 400×10 000×稀释倍数。
②25×16型的计数板:微生物细胞个数/mL=80个小方格细胞总数/80× 400×10 000×稀释倍数。
[迁移应用]
3.(9+1联盟高三联考)科研人员将培养到第4天的一定量酵母菌培养液稀释100倍后,与台盼蓝染液(台盼蓝染液能将死细胞染色)等体积混合均匀,一段时间后用血细胞计数板进行计数(血细胞计数板上面标注为1/400 mm2,
0.1 mm,XB.K.25.)结果如下:计数室中a～e五个区域的细胞总数为54,着色细胞比例为20%,则10 mL酵母菌培养液中活菌数约为(　 　)
A.2.16×109个 B.2.16×108个
C.4.32×109个 D.4.32×108个
C
解析:据图可知,计数室中a～e五个区域都是16个小方格,细胞总数为54,说明一个小方格酵母菌数目为54÷5÷16=0.675(个),一个大方格体积为
0.1 mm3,一个大方格含有400个小方格,那么0.1 mm3 培养液中含有的酵母菌数为400×0.675=270(个),由于酵母菌培养液与台盼蓝染液等体积混合均匀,据此可知,10 mL酵母菌培养液中酵母菌数目为2×270×105×102=5.4× 109(个),死细胞失去选择透过性,台盼蓝染液能将死细胞染色,着色细胞比例为20%,说明活菌数比例为80%,因此10 mL酵母菌培养液中活菌数约为5.4×109×80%=4.32×109(个)。
4.益生菌是一类食用后能在肠道内发挥调节功能的活菌。市售的益生菌产品质量参差不齐,某益生菌品牌宣传其产品中活菌数不少于107个/g。研究小组尝试检测该品牌益生菌中的活菌含量是否与宣传一致,实验步骤为:制备培养基→调节pH→灭菌→倒平板→梯度稀释样品→接种→培养→计数。下列叙述错误的是(　 　)
A.培养箱中氧含量的变化会影响所培养的益生菌的繁殖和代谢
B.经高压蒸汽灭菌的空白平板和接种后的平板培养时均需要倒置
C.对该品牌益生菌进行计数时,稀释涂布平板法统计的数目会比实际值略大
D.若要检测培养基是否被污染,可将未接种的培养基在相同条件下进行培养
C
解析:益生菌主要在肠道内发挥调节功能,所以其代谢类型是厌氧型,因此培养箱中氧含量的变化会影响所培养的益生菌的繁殖和代谢;经高压蒸汽灭菌的空白平板和接种后的平板均需要倒置,防止冷凝水对培养基造成污染;由于两个或多个细胞可能会形成一个菌落,所以稀释涂布平板法统计的数目会比实际值略小;若要检测培养基是否被污染,可将未接种的培养基在相同条件下进行培养,如果出现了菌落,则说明培养基制作不合格,被污染。
任务3　举例分析不同类型培养基在微生物培养中的应用
阅读教材相关内容,列表比较特定培养基的设计原理与应用实例。
特定培养基的 设计原理 应用实例
具体处理 分离菌种
依据营养需求 不添加碳源 微生物(蓝细菌、硝化细菌等)
不添加氮源 微生物(圆褐固氮菌等)
以尿素为唯一氮源 的微生物
以石油为唯一碳源 的微生物
自养型
固氮
能分解尿素
能分解石油
加入某种化学物质,抑 制或杀死其他微生物 加入青霉素、 四环素或链霉素 抑制细菌生长→分离酵母菌、
霉菌等
利用特殊环境 置于无氧条件下 厌氧型和兼性厌氧型微生物能生存→分离乳酸菌、酵母菌等
置于高盐环境中 其他菌在高盐环境中易失水而不能生存→分离金黄色葡萄球菌等
置于高温环境中 其他微生物因酶失活而无法生存→分离耐高温微生物
[迁移应用]
5.根据各类微生物的形态结构特点和新陈代谢类型,利用选择培养基和鉴别培养基,结合显微镜镜检以及菌落特征,可以把混杂在一起的硝化细菌、乳酸菌、酵母菌、圆褐固氮菌、能分解尿素的细菌等分离开来(真菌具有抗青霉素的特性)。下面是分离筛选的方法,请根据条件填写相应内容。首先配制一系列不同性质的固体培养基,然后进行高压蒸汽灭菌,再将上述微生物的混合液分别接种到各种培养基上培养。
(1)利用无氮源培养基可筛选出　 。
圆褐固氮菌
解析:(1)无氮源培养基可筛选出能固氮的微生物(圆褐固氮菌)。
(2)用不含有机碳源的选择培养基可筛选出　　　　　　　　。
硝化细菌
解析: (2)不含有机碳源的选择培养基可筛选出自养型微生物(硝化细菌)。
(3)酵母菌的筛选需要在常规培养基中另加入　　 　　。
青霉素(或抗生素)
解析: (3)酵母菌是真菌,筛选时常在培养基中加入抗生素,防止其他细菌的生长。
(4)在无氧环境下培养混合菌,　　　　　　 　　可以生长,加入一定浓度的乳酸,使培养基pH充分降低,可抑制　　　　　的生长,利用菌落特征,结合显微镜镜检,选取具有生长优势的菌落,即可分离出　　　　。
乳酸菌和酵母菌
酵母菌
乳酸菌
解析: (4)无氧条件下乳酸菌和酵母菌可以生长,加入一定浓度的乳酸可以抑制酵母菌的生长,可筛选出乳酸菌。
(5)若筛选能分解尿素的细菌,则配制的培养基特点是　　　 　　　　　。
以尿素为唯一氮源
解析: (5)在以尿素为唯一氮源的培养基上筛选能分解尿素的细菌。
课堂小结

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