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第二节　基因工程及其延伸
技术应用广泛
[学习目标]
1.举例说明基因工程改善了人类的生活品质。
2.阐明蛋白质工程是基因工程的延伸。
3.阐明以测序为基础建立的基因数据库是人类共有的财富。
知识梳理
一、基因工程改善了人类的生活品质
应用方面 举例分析
运用核酸分子杂交、PCR等技术进行 ①核酸分子杂交和PCR技术常用来检测患者自身携带的缺陷基因;
②灵敏度极高的PCR技术常用于诊断患者是否感染某种
基因诊断
病原体
向患者体内导入正常基因进行基因治疗 主要针对一些严重威胁人类健康的 ,如血友病、恶性肿瘤等
利用转基因生物生产基因工程药物 ①利用转基因植物生产 蛋白;
②转基因哺乳动物的乳腺作为 生产蛋白质类药物;
③微生物遗传物质简单、操作方便、生长迅速,可作为理想的 的分子工厂
遗传病
药物
生物反应器
合成蛋白质
转基因动物可为研究疾病机理提供 借助转基因技术,“敲除”某些基因,通过观察转基因生物 变化,推测该基因的功能
应用基因工程技术进行 鉴定,能保护受害者权益 ①进行个体识别、亲子鉴定等;
②借助限制酶剪切、电泳、与标记的探针进行
,制作特异的 (DNA指纹),进行相关鉴定
模型
性状
法医
核酸分子杂交
图谱
应用基因工程可培育具有优良性状的农牧业品种C 通过基因工程,很多农作物在抗虫、抗病、抗逆、产品的品质等方面不断被改良
获得生长快、体型大、性状优良的转基因动物 如转基因羊、转基因奶牛的培育
保护生态环境 利用转基因 菌进行采矿或分解有毒污染物
工程
【易错判断】
(1)用含H1N1碱基序列的核酸探针,可检测发热病人体内是否含流感病毒。
(　 )
×
提示:含H1N1碱基序列的核酸探针,只能检测是否被H1N1感染。
(2)利用乳腺生物反应器能够获得一些重要的医药产品,如人的血清白蛋白,这是因为将人的血清白蛋白基因导入了动物的乳腺细胞中。(　 　)
×
提示:乳腺生物反应器通常是将目的基因导入受精卵获得的,即血清白蛋白基因是导入到受精卵细胞中。
(3)基因工程育种比传统育种所需的时间短,并且可以解决远缘亲本难以杂交的问题。(　 　)
√
二、蛋白质工程是基因工程的延伸
1.蛋白质工程的定义
指通过设计和改造编码蛋白质的基因,从而改变氨基酸序列,最终获得特定功能的蛋白质。
2.蛋白质工程的设计流程
(1)建立蛋白质功能与 的联系。
结构
(2)依据所需蛋白质的功能,设计改造天然蛋白质的 结构,推测出其
的序列。
(3)根据“中心法则”逆推出 序列。
(4)利用 技术改变DNA上特定位点的核苷酸序列。
(5)将改造了的基因导入受体细胞后进行表达,获得特定功能的 。
空间
氨基酸
基因的核苷酸
基因工程
蛋白质
【易错判断】
(1)蛋白质工程和基因工程的根本区别是操作对象的差异。(　 　)
提示:蛋白质工程和基因工程的操作对象都是基因。
×
(2)蛋白质工程能产生自然界中不存在的新型蛋白质分子。(　 　)
(3)当前限制蛋白质工程发展的关键因素是基因工程技术还不成熟。(　　)
√
×
提示:当前限制蛋白质工程发展的关键因素是人们对蛋白质的高级结构了解太少。
三、以测序为基础建立的基因数据库是人类共有的财富
1.2003年 测序完成,我国也参与其中并做出很大的贡献。
2.基因测序技术不断发展,不仅 越来越快,而且 也越来越低。
人类基因组计划
速度
成本
3.多个国家和机构建立了庞大的 。
(1)数据库信息不仅通过互联网共享,还定期交换数据进行更新。
(2)现在通过访问 ,任何人都可以方便地检索出需要的信息。
(3)科学家也能通过比对 或 的序列重新审视生命进化的历程,深度解码个人的遗传信息。
生物信息数据库
互联网
核酸
蛋白质
任务突破
任务1　对比分析基因工程的应用
1.阅读教材内容,概括PCR技术检测是否感染RNA病毒的过程。
逆转录酶
PCR扩增
2.阅读教材内容,列表比较乳腺生物反应器与工程菌。
比较项目 乳腺生物反应器 工程菌
基因结构 动物基因的结构与人类基因的结构基本相同 细菌等微生物基因的结构与人类基因的结构有较大差异
基因表达 合成的药物蛋白与天然蛋白质相同 细菌细胞内没有 等具膜结构的细胞器,产生的药物蛋白可能没有活性,需要进一步加工获得活性
内质网、高尔基体
受体细胞 动物的受精卵 微生物细胞
导入目的基因的方式 法 处理,制备感受态细胞
生产条件 不需要严格灭菌,温度等外界条件对其影响不大 需严格灭菌,严格控制工程菌所需的温度、pH、营养物质等外界条件
药物提取 从动物的乳汁中提取 从微生物细胞或代谢物中提取
显微注射
CaCl2
[迁移应用]
1.(台州十校高二期中)镰刀形细胞贫血症是一种单基因遗传病,由正常血红蛋白基因(HbA)突变为异常血红蛋白基因(Hbs)引起,它们的某片段如图甲。现对一胎儿进行基因检测,主要原理:限制酶Mst Ⅱ处理扩增后的DNA,加热使酶切片段解旋后用荧光标记的CTGACTCCT序列与其杂交,最后电泳分离。图乙为电泳后荧光出现的三种可能性。
下列叙述错误的是(　 　)
A.正常血红蛋白基因与异常血红蛋白基因的根本区别在于碱基的排列顺序不同
B.若该胎儿检测结果为图乙-b,则其为镰刀形细胞贫血症患者
C.荧光标记序列越长,图乙-c中两个DNA条带间的距离越大
D.用限制酶MstⅡ处理DNA不充分,可能把正常人误判为携带者
C
解析:镰刀形细胞贫血症是由基因中碱基对发生替换导致的,即正常血红蛋白基因与异常血红蛋白基因的根本区别在于碱基的排列顺序不同;图乙-b中的DNA条带距离加样孔较近,说明DNA相对分子质量较大,并且只有一种类型,因此可以确定为镰刀形细胞贫血症基因的一条链与荧光标记的序列进行了杂交,即只含有致病基因,因此若该胎儿检测结果为图乙-b,则其为镰刀形细胞贫血症患者;凝胶电泳中,DNA相对分子质量越大跑得越慢,即距离加样孔越近,因此图乙-c中两个DNA条带间的距离与切割后DNA相对分子质量的大小有关,与荧光标记序列长短无关;正常血红蛋白基因(HbA)的中间也含有MstⅡ限制酶的酶切位点,而异常血红蛋白基因(Hbs)中没有,如果用MstⅡ限制酶处理DNA不充分,则正常血红蛋白基因(HbA)中的中间位置可能没有被切割,结果可能与异常血红蛋白基因(Hbs)酶切后电泳结果一样,因此可能把正常人误判为携带者。
2.如图表示抗凝血酶乳腺生物反应器的制备过程,下列说法正确的是(　 　)
A.该转基因牛中的抗凝血酶基因只存在于乳腺细胞中
B.②表示性别为雄性的胚胎
C.常用农杆菌转化法将基因导入受体细胞
D.①表示受精卵
D
解析:该转基因牛中的抗凝血酶基因存在于所有体细胞中,只是在乳腺细胞中表达;由于只有母牛能产奶,因此②表示性别为雌性的胚胎;常用显微注射法将基因导入动物受体细胞;培育转基因动物时应该以受精卵为受体细胞,因此①表示受精卵。
任务2　概述蛋白质工程的原理,并能与基因
工程的原理、操作等进行对比分析
阅读教材内容,比较蛋白质工程和基因工程。
项目 蛋白质工程 基因工程
区 别 原理
对基因 的操作 对目的基因进行实质性的 或根据预期蛋白质功能设计合成 对基因进行DNA片段的
,不改变基因的遗传信息
中心法则的逆推
基因重组
改造
全新基因
切割和连接
实质 定向改造或生产人类所需蛋白质 定向改造生物的遗传特性,以获得人类所需的生物类型或生物产品(基因的异体表达)
结果 生产自然界没有的蛋白质 原则上只能生产
联系 蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出的第二代基因工程,因为是对现有蛋白质的改造或制造新的蛋白质,所以必须通过基因修饰或基因合成来实现
自然界已有的蛋白质
[迁移应用]
3.(A9协作体高二期中)蛋白质工程是新崛起的一项生物工程,又称第二代基因工程。下列叙述正确的是(　 　)
A.蛋白质工程就是根据人们需要,直接对蛋白质进行加工改造
B.蛋白质工程首先要建立蛋白质功能与结构的联系
C.经蛋白质工程改造后的性状不可以遗传
D.蛋白质工程最终要达到的目的是获取编码蛋白质的基因序列信息
B
解析:由蛋白质工程的概念可知,蛋白质工程改造的是DNA上特定位点的核苷酸序列,不是蛋白质;蛋白质工程首先要建立蛋白质功能与结构的联系,然后依据所需蛋白质的功能,设计改造天然蛋白质的空间结构;蛋白质工程是通过对基因进行修饰改造或重新合成,从而改造蛋白质进而改造性状,其本质是通过基因控制性状,故可遗传;蛋白质工程最终要获得特定功能的蛋白质。
4.(舟山高二月考)研究发现,胰岛素进入血液循环后容易被降解,糖尿病患者需要反复注射胰岛素才能达到治疗效果。科研人员借助蛋白质工程改变了胰岛素中的某些氨基酸,提高了胰岛素在患者体内的稳定性,延长了其作用时间。下列有关叙述错误的是(　 　)
A.蛋白质工程的实质是在DNA分子水平上进行设计和改造
B.氨基酸序列的差异是影响胰岛素在患者体内稳定性的原因之一
C.改造胰岛素应首先从设计胰岛素基因中的脱氧核苷酸序列出发
D.蛋白质工程难度很大与蛋白质发挥功能必须依赖于正确的高级结构有关
C
解析:蛋白质工程最终要利用基因工程来解决蛋白质的合成,因此蛋白质工程的实质是在 DNA 分子水平上进行设计和改造蛋白质;氨基酸序列差异,导致胰岛素的空间结构有所改变,影响了它的功能;胰岛素属于蛋白质,改造胰岛素应首先建立蛋白质功能与结构的联系;多数蛋白质除具有一级结构
(即氨基酸顺序)外,还具有复杂的高级结构,即空间结构,而很多蛋白质的空间结构是人们目前还不清楚的,因此实施蛋白质工程的难度很大。
课堂小结第二节　基因工程及其延伸技术应用广泛
学习目标
1.举例说明基因工程改善了人类的生活品质。
2.阐明蛋白质工程是基因工程的延伸。
3.阐明以测序为基础建立的基因数据库是人类共有的财富。
一、基因工程改善了人类的生活品质
应用方面 举例分析
运用核酸分子杂交、PCR等技术进行基因诊断 ①核酸分子杂交和PCR技术常用来检测患者自身携带的缺陷基因; ②灵敏度极高的PCR技术常用于诊断患者是否感染某种病原体
向患者体内导入正常基因进行基因治疗 主要针对一些严重威胁人类健康的遗传病,如血友病、恶性肿瘤等
利用转基因生物生产基因工程药物 ①利用转基因植物生产药物蛋白; ②转基因哺乳动物的乳腺作为生物反应器生产蛋白质类药物; ③微生物遗传物质简单、操作方便、生长迅速,可作为理想的合成蛋白质的分子工厂
转基因动物可为研究疾病机理提供模型 借助转基因技术,“敲除”某些基因,通过观察转基因生物性状变化,推测该基因的功能
应用基因工程技术进行法医鉴定,能保护受害者权益 ①进行个体识别、亲子鉴定等; ②借助限制酶剪切、电泳、与标记的探针进行核酸分子杂交,制作特异的图谱(DNA指纹),进行相关鉴定
应用基因工程可培育具有优良性状的农牧业品种 通过基因工程,很多农作物在抗虫、抗病、抗逆、产品的品质等方面不断被改良
获得生长快、体型大、性状优良的转基因动物 如转基因羊、转基因奶牛的培育
保护生态环境 利用转基因工程菌进行采矿或分解有毒污染物
【易错判断】
(1)用含H1N1碱基序列的核酸探针,可检测发热病人体内是否含流感病毒。(　×　)
提示:含H1N1碱基序列的核酸探针,只能检测是否被H1N1感染。
(2)利用乳腺生物反应器能够获得一些重要的医药产品,如人的血清白蛋白,这是因为将人的血清白蛋白基因导入了动物的乳腺细胞中。(　×　)
提示:乳腺生物反应器通常是将目的基因导入受精卵获得的,即血清白蛋白基因是导入到受精卵细胞中。
(3)基因工程育种比传统育种所需的时间短,并且可以解决远缘亲本难以杂交的问题。(　√　)
二、蛋白质工程是基因工程的延伸
1.蛋白质工程的定义
指通过设计和改造编码蛋白质的基因,从而改变氨基酸序列,最终获得特定功能的蛋白质。
2.蛋白质工程的设计流程
(1)建立蛋白质功能与结构的联系。
(2)依据所需蛋白质的功能,设计改造天然蛋白质的空间结构,推测出其氨基酸的序列。
(3)根据“中心法则”逆推出基因的核苷酸序列。
(4)利用基因工程技术改变DNA上特定位点的核苷酸序列。
(5)将改造了的基因导入受体细胞后进行表达,获得特定功能的蛋白质。
【易错判断】
(1)蛋白质工程和基因工程的根本区别是操作对象的差异。(　×　)
提示:蛋白质工程和基因工程的操作对象都是基因。
(2)蛋白质工程能产生自然界中不存在的新型蛋白质分子。(　√　)
(3)当前限制蛋白质工程发展的关键因素是基因工程技术还不成熟。(　×　)
提示:当前限制蛋白质工程发展的关键因素是人们对蛋白质的高级结构了解太少。
三、以测序为基础建立的基因数据库是人类共有的财富
1.2003年人类基因组计划测序完成,我国也参与其中并做出很大的贡献。
2.基因测序技术不断发展,不仅速度越来越快,而且成本也越来越低。
3.多个国家和机构建立了庞大的生物信息数据库。
(1)数据库信息不仅通过互联网共享,还定期交换数据进行更新。
(2)现在通过访问互联网,任何人都可以方便地检索出需要的信息。
(3)科学家也能通过比对核酸或蛋白质的序列重新审视生命进化的历程,深度解码个人的遗传信息。
任务1　对比分析基因工程的应用
1.阅读教材内容,概括PCR技术检测是否感染RNA病毒的过程。
2.阅读教材内容,列表比较乳腺生物反应器与工程菌。
比较项目 乳腺生物反应器 工程菌
基因结构 动物基因的结构与人类基因的结构基本相同 细菌等微生物基因的结构与人类基因的结构有较大差异
基因表达 合成的药物蛋白与天然蛋白质相同 细菌细胞内没有内质网、高尔基体等具膜结构的细胞器,产生的药物蛋白可能没有活性,需要进一步加工获得活性
受体细胞 动物的受精卵 微生物细胞
导入目 的基因 的方式 显微注射法 CaCl2处理,制备感受态细胞
生产条件 不需要严格灭菌,温度等外界条件对其影响不大 需严格灭菌,严格控制工程菌所需的温度、pH、营养物质等外界条件
药物提取 从动物的乳汁中提取 从微生物细胞或代谢物中提取
迁移应用
1.(台州十校高二期中)镰刀形细胞贫血症是一种单基因遗传病,由正常血红蛋白基因(HbA)突变为异常血红蛋白基因(Hbs)引起,它们的某片段如图甲。现对一胎儿进行基因检测,主要原理:限制酶Mst Ⅱ处理扩增后的DNA,加热使酶切片段解旋后用荧光标记的CTGACTCCT序列与其杂交,最后电泳分离。图乙为电泳后荧光出现的三种可能性。下列叙述错误的是(　C　)
A.正常血红蛋白基因与异常血红蛋白基因的根本区别在于碱基的排列顺序不同
B.若该胎儿检测结果为图乙-b,则其为镰刀形细胞贫血症患者
C.荧光标记序列越长,图乙-c中两个DNA条带间的距离越大
D.用限制酶MstⅡ处理DNA不充分,可能把正常人误判为携带者
解析:镰刀形细胞贫血症是由基因中碱基对发生替换导致的,即正常血红蛋白基因与异常血红蛋白基因的根本区别在于碱基的排列顺序不同;图乙-b中的DNA条带距离加样孔较近,说明DNA相对分子质量较大,并且只有一种类型,因此可以确定为镰刀形细胞贫血症基因的一条链与荧光标记的序列进行了杂交,即只含有致病基因,因此若该胎儿检测结果为图乙-b,则其为镰刀形细胞贫血症患者;凝胶电泳中,DNA相对分子质量越大跑得越慢,即距离加样孔越近,因此图乙-c中两个DNA条带间的距离与切割后DNA相对分子质量的大小有关,与荧光标记序列长短无关;正常血红蛋白基因(HbA)的中间也含有MstⅡ限制酶的酶切位点,而异常血红蛋白基因(Hbs)中没有,如果用MstⅡ限制酶处理DNA不充分,则正常血红蛋白基因(HbA)中的中间位置可能没有被切割,结果可能与异常血红蛋白基因(Hbs)酶切后电泳结果一样,因此可能把正常人误判为携带者。
2.如图表示抗凝血酶乳腺生物反应器的制备过程,下列说法正确的是(　D　)
A.该转基因牛中的抗凝血酶基因只存在于乳腺细胞中
B.②表示性别为雄性的胚胎
C.常用农杆菌转化法将基因导入受体细胞
D.①表示受精卵
解析:该转基因牛中的抗凝血酶基因存在于所有体细胞中,只是在乳腺细胞中表达;由于只有母牛能产奶,因此②表示性别为雌性的胚胎;常用显微注射法将基因导入动物受体细胞;培育转基因动物时应该以受精卵为受体细胞,因此①表示受精卵。
任务2　概述蛋白质工程的原理,并能与基因
工程的原理、操作等进行对比分析
阅读教材内容,比较蛋白质工程和基因工程。
项目 蛋白质工程 基因工程
区 别 原理 中心法则的逆推 基因重组
对基 因的 操作 对目的基因进行实质性的改造或根据预期蛋白质功能设计合成全新基因 对基因进行DNA片段的切割和连接,不改变基因的遗传信息
实质 定向改造或生产人类所需蛋白质 定向改造生物的遗传特性,以获得人类所需的生物类型或生物产品(基因的异体表达)
结果 生产自然界没有的蛋白质 原则上只能生产自然界已有的蛋白质
联系 蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出的第二代基因工程,因为是对现有蛋白质的改造或制造新的蛋白质,所以必须通过基因修饰或基因合成来实现
迁移应用
3.(A9协作体高二期中)蛋白质工程是新崛起的一项生物工程,又称第二代基因工程。下列叙述正确的是(　B　)
A.蛋白质工程就是根据人们需要,直接对蛋白质进行加工改造
B.蛋白质工程首先要建立蛋白质功能与结构的联系
C.经蛋白质工程改造后的性状不可以遗传
D.蛋白质工程最终要达到的目的是获取编码蛋白质的基因序列信息
解析:由蛋白质工程的概念可知,蛋白质工程改造的是DNA上特定位点的核苷酸序列,不是蛋白质;蛋白质工程首先要建立蛋白质功能与结构的联系,然后依据所需蛋白质的功能,设计改造天然蛋白质的空间结构;蛋白质工程是通过对基因进行修饰改造或重新合成,从而改造蛋白质进而改造性状,其本质是通过基因控制性状,故可遗传;蛋白质工程最终要获得特定功能的蛋白质。
4.(舟山高二月考)研究发现,胰岛素进入血液循环后容易被降解,糖尿病患者需要反复注射胰岛素才能达到治疗效果。科研人员借助蛋白质工程改变了胰岛素中的某些氨基酸,提高了胰岛素在患者体内的稳定性,延长了其作用时间。下列有关叙述错误的是(　C　)
A.蛋白质工程的实质是在DNA分子水平上进行设计和改造
B.氨基酸序列的差异是影响胰岛素在患者体内稳定性的原因之一
C.改造胰岛素应首先从设计胰岛素基因中的脱氧核苷酸序列出发
D.蛋白质工程难度很大与蛋白质发挥功能必须依赖于正确的高级结构有关
解析:蛋白质工程最终要利用基因工程来解决蛋白质的合成,因此蛋白质工程的实质是在 DNA 分子水平上进行设计和改造蛋白质;氨基酸序列差异,导致胰岛素的空间结构有所改变,影响了它的功能;胰岛素属于蛋白质,改造胰岛素应首先建立蛋白质功能与结构的联系;多数蛋白质除具有一级结构(即氨基酸顺序)外,还具有复杂的高级结构,即空间结构,而很多蛋白质的空间结构是人们目前还不清楚的,因此实施蛋白质工程的难度很大。
课堂小结
素养测练
对点达标练
题组一　基因工程的应用
1.下列哪一项不是动物基因工程的应用(　D　)
A.转入外源生长激素基因的鲤鱼
B.将肠乳糖酶基因导入奶牛基因组
C.乳腺生物反应器生产医药产品
D.利用工程菌生产干扰素
解析:利用工程菌生产干扰素,其中工程菌不是动物,因此不属于动物基因工程的应用。
2.下列关于基因治疗和基因芯片的叙述,不正确的是(　D　)
A.基因治疗是把正常的外源基因导入有基因缺陷的细胞中
B.基因芯片可以用于基因测序
C.基因芯片可用于遗传病的诊断,基因治疗可用于遗传病的治疗
D.人类所有遗传病都可以采用基因治疗的方法进行医治
解析:基因治疗是指向有基因缺陷的细胞中引入正常功能的基因以纠正或补偿基因的缺陷,从而达到治疗疾病的目的;基因芯片可以用于基因测序,其测序原理是DNA分子的杂交;基因芯片可以用于遗传病的诊断,而基因治疗可用于遗传病的治疗;并非遗传病都可以采用基因治疗的方法进行医治,如染色体异常遗传病无法通过基因治疗医治。
3.科学家利用基因工程培育出了能产生乙肝病毒蛋白质的西红柿,被称之为“西红柿乙肝疫苗”。具体操作是:将乙肝抗原基因M导入农杆菌,然后利用农杆菌将M导入西红柿细胞。实验显示小白鼠连续五周吃这样的西红柿,体内产生了抗乙肝病毒的抗体,下列叙述错误的是(　B　)
A.实验用PCR技术对M基因进行扩增,需要两种引物
B.含M的重组Ti质粒必须插入到西红柿染色体DNA上
C.即使M在西红柿中成功表达,也要做个体生物学水平鉴定
D.西红柿乙肝疫苗成本相对较低且易于储存
解析:导入前需要对M基因扩增,PCR需要两种引物结合M基因的两条链合成相应子链;含M的T-DNA插入西红柿染色体DNA上,才能稳定存在和表达,而不是整个Ti质粒;即使M在西红柿中成功表达,也必须在个体生物学水平鉴定,来确定实际效果;西红柿种植容易,成本低且易储存。
题组二　蛋白质工程
4.下列有关基因工程和蛋白质工程的叙述中,正确的是(　B　)
A.基因工程完全不同于蛋白质工程
B.基因工程合成的是天然存在的蛋白质,蛋白质工程合成的不一定是天然存在的蛋白质
C.蛋白质工程的作用对象是蛋白质分子,基因工程的作用对象是基因
D.蛋白质工程只是依据中心法则逆推,其蛋白质合成过程不依据中心法则
解析:蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出来的第二代基因工程;基因工程合成的是天然存在的蛋白质,蛋白质工程合成的一般不是天然存在的蛋白质;基因工程和蛋白质工程的操作对象都是基因;蛋白质工程依据中心法则逆推,其蛋白质合成过程也需要依据中心法则。
5.如图为蛋白质工程操作的基本思路,下列叙述不正确的是(　C　)
A.图中①代表转录,②代表翻译,④代表推测,⑤代表改造或合成
B.蛋白质工程中对蛋白质高级结构的了解是非常关键的工作
C.蛋白质工程的目的是对基因的结构进行分子设计
D.从图中可以看出蛋白质工程是通过改造基因而达到改造蛋白质的目的
解析:图中①代表转录,②代表翻译,④代表推测,⑤代表改造或合成;蛋白质工程依据所需蛋白质的功能,设计改造天然蛋白质的结构,推测其氨基酸序列,因此蛋白质工程中对蛋白质分子结构的了解是非常关键的工作;蛋白质工程的目的是对蛋白质的结构进行分子设计,通过基因合成或修饰实现。
6.(嘉兴高三教学测试)胰高血糖素样肽-1(GLP-1)是小肠分泌的激素,具有促进胰岛素分泌、抑制胰高血糖素分泌的功能。内源性 GLP-1 在体内会很快被分解。通过蛋白质工程开发的 GLP-1类似物可作为降血糖药使用。下列叙述正确的是(　B　)
A.GLP-1的改造方向是易被 GLP-1受体识别
B.先设计多肽的氨基酸序列,再设计基因的碱基序列
C.用限制性内切核酸酶从基因数据库中获取目的基因
D.将含目的基因的克隆载体导入生物反应器生产GLP-1类似物
解析:内源性 GLP-1 在体内会很快被分解,因此GLP-1的改造方向是不易被分解;蛋白质工程基本思路是:从预期的蛋白质功能出发,设计预期的蛋白质结构推测应有的氨基酸序列,找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因,获得所需要的蛋白质;可通过检索基因数据库获取其编码序列,最后再用化学合成法制备;用生物反应器生产药物蛋白,需将目的基因与所用生物反应器(如乳腺)的蛋白质基因相关调控组件重组在一起,将目的基因导入受精卵中。
7.(台州十校高二期中)葡萄糖异构酶能将葡萄糖转化为果糖,其最适温度约为60 ℃,生产上常用于高果糖浆的生产。科学家将葡萄糖异构酶的第138位甘氨酸用脯氨酸替代,结果它的最适温度提高了约10 ℃。下列有关叙述正确的是(　B　)
A.蛋白质工程直接对蛋白质进行操作,从而改造或制造自然界没有的蛋白质
B.编码葡萄糖异构酶的基因的脱氧核苷酸序列会有相应的改变
C.经改造后的葡萄糖异构酶热稳定性提高这一性状不可遗传
D.改造后的葡萄糖异构酶在60 ℃时催化活性高于70 ℃时的
解析:蛋白质工程不是通过改造蛋白质来实现的,而是通过对基因进行操作来实现对蛋白质的改造;编码葡萄糖异构酶的基因是DNA上的片段,故经改造后编码葡萄糖异构酶的基因的脱氧核苷酸序列会有相应的改变;葡萄糖异构酶热稳定性提高这一性状,是通过改变基因的序列获得的,可以遗传;改造后的葡萄糖异构酶最适温度约为70 ℃,在60 ℃时活性较低,生产高果糖浆的效率可能低于70 ℃时的。
8.HAMA效应是指人体针对鼠源单克隆抗体所产生的反应,该反应可使鼠源抗体加速被清除,有时可引起过敏性反应,科学家通过基因改造完成了下图的改造,鼠源抗体诱发免疫反应的强度就会降低很多。下列有关说法错误的是(　C　)
A.生产鼠-人嵌合抗体的过程属于蛋白质工程
B.改造过程涉及鼠的基因和人的基因的拼接
C.把来自不同抗体的可变区和恒定区直接拼接
D.改造过程没有利用基因定点诱变技术改造基因
解析:生产鼠-人嵌合抗体的过程属于对现有蛋白质分子进行改造,属于蛋白质工程;蛋白质工程操作的对象是基因,因此改造过程涉及鼠的基因和人的基因的拼接;蛋白质工程操作的对象是基因,因此应将鼠抗体可变区基因与人抗体恒定区基因拼接; 对鼠源抗体进行改造,首先要根据预期嵌合抗体功能(或蛋白质功能),设计嵌合抗体结构,然后通过基因拼接,将鼠源抗体基因改造成鼠-人嵌合抗体基因,最后导入到鼠淋巴细胞中表达,改造过程没有利用基因定点诱变技术改造基因。
综合提升练
9.水蛭素(EH)具有较好的抗凝血活性,临床上被用作抗血栓药物。利用酵母菌工业化生产EH时,生产周期长、目标蛋白表达效率较低;利用大肠杆菌进行生产时,基因的转录和翻译都正常,但多肽链错误折叠,产生的无活性的EH会聚集形成水不溶性的包涵体。研究人员通过改造EH基因,以期获得能在大肠杆菌中表达的可溶性EH。下列有关叙述,错误的是(　B　)
A.大肠杆菌在细胞增殖和代谢速率上较快,可用来改进酵母菌生产EH时的缺点
B.包涵体中错误折叠的EH与酵母菌生产的EH在氨基酸序列上有较大差异
C.要得到能表达可溶性EH的大肠杆菌,需要用Ca2+处理大肠杆菌
D.判断转基因大肠杆菌是否成功,需要对可溶性EH的抗凝血活性进行测定
解析:大肠杆菌是原核生物中的细菌类,繁殖速度和代谢速率都较快,可以用来改进酵母菌生产EH时生产周期长、目标蛋白表达效率较低的缺点;利用大肠杆菌进行生产时,基因的转录和翻译都正常,说明在核糖体上合成的多肽正常,与酵母菌生产的EH在氨基酸序列上应该相同;在基因工程操作中,受体细胞是原核生物如大肠杆菌时,为提高转化效率,可用Ca2+处理大肠杆菌,使细胞处于一种更容易吸收周围DNA分子的生理状态,促进重组质粒的转入;转基因大肠杆菌是否成功,还需要在个体水平进行检测,即对可溶性EH的抗凝血活性进行测定。
10.肿瘤患者体内T细胞产生的IFN-γ会减少,科学家尝试用“细菌疗法”提高患者体内的IFN-γ含量来治疗癌症:将含有IFN-γ基因的重组温控质粒导入细菌制成工程菌注入患者体内,利用超声诱导产生的短暂热效应调控工程菌的基因表达。已知含有IFN-γ基因的重组温控质粒产生的Clts蛋白能抑制IFN-γ基因启动子的活性,大于42 ℃时Clts蛋白失活。下列说法错误的是(　D　)
A.细菌获得的能产生IFN-γ的变异可以遗传
B.“细菌疗法”可根据需要无创调控IFN-γ的量
C.正常体温条件下患者体内IFN-γ不会增加
D.工程菌在患者体内不会被破坏,能持久发挥效应
解析:该工程菌是通过体外DNA重组技术制得,细胞的遗传物质发生了变化,故该变异可以遗传给子代;可利用超声诱导产生的短暂热效应调控工程菌的基因表达,因此“细菌疗法”可根据需要无创调控IFN-γ的量;Clts蛋白能抑制IFN-γ基因启动子的活性,大于42 ℃时Clts蛋白失活,而人体正常体温为37 ℃左右,故正常体温条件下患者体内IFN-γ不会增加;工程菌发挥作用后会被机体免疫系统清除,不能持久发挥效应。
11.(2025·浙江1月选考)3-磷酸甘油脱氢酶(GPD)是酵母细胞中甘油合成的关键酶。利用某假丝酵母菌株为材料,克隆具有高效催化效率的3-磷酸甘油脱氢酶的基因(Gpd)。采用的方案是:先通过第1次PCR扩增出该基因的中间部分,再通过第2次PCR分别扩增出该基因的两侧,经拼接获得完整基因的序列,如图所示:
回答下列问题。
(1)分析不同物种的GPD蛋白序列,确定蛋白质上相同的氨基酸区段,依据这些氨基酸所对应的　　　　,确定DNA序列,进而设计1对引物。以该菌株基因组DNA为模板进行第1次PCR,利用　　　　凝胶电泳分离并纯化DNA片段,进一步测定PCR产物的序列。在制备PCR反应体系时,每次用微量移液器吸取不同试剂前,需要确认或调整刻度和量程,还需要　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(2)若在上述PCR扩增结果中,除获得一条阳性条带外,还出现了另外一条条带,不可能的原因是　　　 　。
A.DNA模板被其他酵母细胞的基因组DNA污染
B.每个引物与DNA模板存在2个配对结合位点
C.在基因组中Gpd基因有2个拷贝
D.在基因组中存在1个与Gpd基因序列高度相似的其他基因
(3)为获得完整的Gpd基因,分别用限制性核酸内切酶PstⅠ和SalⅠ单酶切基因组DNA后,各自用DNA连接酶连接形成环形DNA,再用苯酚-氯仿抽提除去杂质,最后加入　　　　　　　　沉淀环形DNA。根据第一次PCR产物测定获得的序列,重新设计一对引物,以环形DNA为模板进行第二次PCR,最后进行测序。用于第二次PCR的一对引物,其序列应是DNA链上的　　　　(A.P1和P2　B.P3和P4　C.P1和P4　D.P2和P3)。根据测序结果拼接获得完整的Gpd基因序列,其中的启动子和终止子具有　　　功能。
(4)为确定克隆获得的Gpd基因的准确性,可将获得的基因序列与已建立的　　　　　　进行比对。将Gpd基因的编码区与　　　　　　连接,构建重组质粒,再将重组质粒导入酿酒酵母细胞中,实现利用酿酒酵母高效合成甘油的目的。
解析:(1)分析不同物种的GPD蛋白序列,确定蛋白质上相同的氨基酸区段,依据这些氨基酸所对应的密码子,根据碱基互补配对,确定DNA序列,进而设计1对引物。可通过琼脂糖凝胶电泳分离并纯化目标DNA片段。在制备PCR反应体系时,每次用微量移液器吸取不同试剂前,需要更换微量移液器的枪头,以避免交叉污染。
(2)DNA模板被其他酵母细胞的基因组DNA污染,可能扩增出其他DNA,从而出现另外一条条带;每个引物与DNA模板存在2个配对结合位点,从而扩增出不同的DNA片段,从而出现另外一条条带;在基因组中Gpd基因有2个拷贝,扩增出的DNA是相同DNA,电泳时只会出现一条条带;在基因组中存在1个与Gpd基因序列高度相似的其他基因,可能将相似的基因扩增出来,从而出现另外一条条带。
(3)DNA在95%的冷酒精中溶解度较低。将酶切后的DNA经苯酚-氯仿抽提除去杂质,再加入95%的冷酒精中沉淀,得到纯度较高的DNA。PCR过程中子链的延伸方向为5′端→3′端,4种引物与DNA结合位置和子链延伸方向如下图:
第二次PCR需扩增出基因的两侧,应选择P2和P3引物进行扩增。启动子可启动转录,终止子可终止转录,即启动子和终止子具有调控功能。
(4)为确定克隆获得的Gpd基因的准确性,可将获得的基因序列与已建立的基因数据库进行对比,若二者相同,则说明克隆获得的Gpd基因准确。将Gpd基因的编码区与表达载体连接,构建重组质粒,再将重组质粒导入酿酒酵母细胞中,使之进行表达,实现利用酿酒酵母高效合成甘油的目的。
答案:(1)密码子　琼脂糖　更换微量移液器的枪头
(2)C
(3)95%的冷酒精　D　调控
(4)基因数据库　表达载体
12.神经生长因子(NGF)是一种在神经细胞生长、分化和再生过程中起着重要作用的蛋白质,对治疗青光眼、阿尔茨海默病等神经性疾病有着良好的效果。为大规模合成功能性人NGF,科学家制备了在唾液腺中特异、高效表达人 NGF 的转基因猪。回答下列问题。
(1)获取目的基因:检索基因数据库,获取人NGF基因的序列,用　　　　法制备得到该基因。为使其在转基因猪的唾液腺中特异性表达,需在其上游加入　　　　　　　　　　　　　序列。
(2)扩增目的基因:将目的基因与含氨苄青霉素抗性基因和LacZ基因(其表达产物能催化无色的X-gal分解为半乳糖和蓝色物质)的克隆质粒连接,导入到大肠杆菌中。转化的大肠杆菌在含有　　　　　　　　　　　　　　　　的培养基中形成蓝色单菌落,可挑取并继续培养实现目的基因的菌体内扩增;也可设计特异性引物,在　　　　酶的作用下,通过 PCR 技术实现目的基因体外扩增。
(3)导入目的基因及筛选转基因细胞:将目的基因与表达质粒相连,构建如图A 所示的载体,导入经　　　　消化的猪胚胎成纤维细胞,用含胎牛血清的完全培养液稀释、培养,当一个单细胞长至几十个细胞团时,添加适量　　　　进行淘汰筛选,再选择都表达出绿色荧光蛋白的单克隆细胞团即是转基因细胞。
(4)核移植:从猪的卵巢中获取卵母细胞,经体外培养成熟及去核后作为　　　　,再注入转基因的胚胎成纤维细胞,通过　　　　处理促进细胞融合,激活重组细胞的发育。重组细胞体外培养至早期胚胎,移植到经　　　　处理的代孕母猪体内,直至转基因小猪出生。
(5)筛选转基因动物:对原代转基因小猪进行荧光观察,提取其尾部的基因组DNA,用限制性内切核酸酶EcoRⅤ进行酶切,产物经琼脂糖凝胶电泳,结果如图B所示,其中P为阳性对照,加入的是酶切的hNGF表达质粒样品;WT为阴性对照,加入的是酶切的　　　　　　　　　　　样品。 结果表明第　　　　组小猪是所需要的目标转基因小猪。
(6)检测目的基因的表达:采集目标转基因小猪的唾液,用　　　　　　　　方法测定是否含有人NGF,分离纯化后的人NGF可应用于临床治疗。
(7)利用生物反应器生产人类所需要的蛋白质类药物,具有非常广阔的应用前景。转基因大肠杆菌表达的人NGF稳定性和生物活性较低,可通过　　　　　　在基因水平上实现对蛋白质中氨基酸序列的改造,来提高稳定性和生物活性。与乳腺生物反应器相比,利用唾液腺生产蛋白质类药物的优点有:　

　。
解析:(1)获取目的基因的方法有多种,从基因文库中获取、PCR扩增、化学合成等。若要获取人NGF基因,可通过检索基因数据库获取其编码序列,最后再用化学合成法制备得到。目的基因要在猪的唾液腺中特异性表达,要在人NGF基因上游加入唾液腺特异性(专一性)启动子序列。
(2)氨苄青霉素抗性基因和LacZ基因为标记基因,目的是鉴别受体细胞中是否含有目的基因,以便筛选出含有目的基因的细胞。若大肠杆菌中已成功导入了克隆质粒,则其在含有氨苄青霉素和X-gal的培养基中形成蓝色菌落,可挑取并继续培养实现目的基因的菌体内扩增。目的基因合成后可在Taq DNA聚合酶的作用下通过PCR技术大量扩增,该技术的原理是DNA半保留复制。
(3)在进行动物细胞培养之前,需先用胰蛋白(胶原蛋白)酶处理、消化组织切块,使其分散成单个细胞,获得猪胚胎成纤维细胞悬液。图 A 所示的载体含有绿色荧光蛋白基因和抗新霉素基因,可添加适量新霉素进行淘汰筛选,再选择都表达出绿色荧光蛋白的转基因细胞。
(4)细胞核移植过程中,因为卵母细胞中含有促使细胞核表达全能性的物质和营养条件,所以常用处于减数第二次分裂中期的去核卵母细胞作为受体细胞。诱导细胞核和卵母细胞融合的方法是电(脉冲)刺激,该方法除了能促进细胞融合,同时具有激活重组细胞发育的作用。构成的重组细胞经细胞分裂、分化可形成新个体,需要对代孕母猪进行同期发情
处理。
(5)图B 所示, P 为阳性对照,加入的是酶切的hNGF表达质粒样品,WT为阴性对照,加入野生型猪基因组DNA样品,不含hNGF;从图示条带看出,只有第5组小猪有条带与P组阳性对照组相同,说明第5组小猪含有酶切的hNGF表达质粒,即为目标转基因猪。
(6)基因的表达过程包括转录和翻译,转录和翻译的产物分别是(m)RNA和蛋白质。若检测目的基因是否翻译成人NGF,可用抗原-抗体杂交方法检测,即用单克隆抗体技术(杂交瘤技术)获得特异性探针,与提取的蛋白质进行杂交。
(7)提高人NGF的稳定性和生物活性,该技术先从蛋白质功能出发,最后通过改造基因结构改变蛋白质结构而达到预期功能,属于蛋白质工程。“乳腺生物反应器”只能从泌乳期雌性生物的乳汁中获取产物,与“乳腺生物反应器”相比,“唾液腺生物反应器”的优点是雌性和雄性生物的唾液中都可提取到产物,整个生命周期都可生产,不受性别、年龄和时间的限制,唾液腺产生蛋白质种类少,便于分离纯化。
答案:(1)化学合成　唾液腺特异性(专一性)启动子
(2)氨苄青霉素和X-gal　Taq DNA聚合
(3)胰蛋白酶　新霉素
(4)受体细胞　电(脉冲)刺激　同期发情
(5)野生型猪基因组DNA　5
(6)抗原-抗体杂交
(7)蛋白质工程　整个生命周期都可生产;雌性和雄性都可生产;唾液腺产生蛋白质种类少,便于分离纯化第二节　基因工程及其延伸技术应用广泛
素养测练
对点达标练
题组一　基因工程的应用
1.下列哪一项不是动物基因工程的应用(　D　)
A.转入外源生长激素基因的鲤鱼
B.将肠乳糖酶基因导入奶牛基因组
C.乳腺生物反应器生产医药产品
D.利用工程菌生产干扰素
解析:利用工程菌生产干扰素,其中工程菌不是动物,因此不属于动物基因工程的应用。
2.下列关于基因治疗和基因芯片的叙述,不正确的是(　D　)
A.基因治疗是把正常的外源基因导入有基因缺陷的细胞中
B.基因芯片可以用于基因测序
C.基因芯片可用于遗传病的诊断,基因治疗可用于遗传病的治疗
D.人类所有遗传病都可以采用基因治疗的方法进行医治
解析:基因治疗是指向有基因缺陷的细胞中引入正常功能的基因以纠正或补偿基因的缺陷,从而达到治疗疾病的目的;基因芯片可以用于基因测序,其测序原理是DNA分子的杂交;基因芯片可以用于遗传病的诊断,而基因治疗可用于遗传病的治疗;并非遗传病都可以采用基因治疗的方法进行医治,如染色体异常遗传病无法通过基因治疗医治。
3.科学家利用基因工程培育出了能产生乙肝病毒蛋白质的西红柿,被称之为“西红柿乙肝疫苗”。具体操作是:将乙肝抗原基因M导入农杆菌,然后利用农杆菌将M导入西红柿细胞。实验显示小白鼠连续五周吃这样的西红柿,体内产生了抗乙肝病毒的抗体,下列叙述错误的是(　B　)
A.实验用PCR技术对M基因进行扩增,需要两种引物
B.含M的重组Ti质粒必须插入到西红柿染色体DNA上
C.即使M在西红柿中成功表达,也要做个体生物学水平鉴定
D.西红柿乙肝疫苗成本相对较低且易于储存
解析:导入前需要对M基因扩增,PCR需要两种引物结合M基因的两条链合成相应子链;含M的T-DNA插入西红柿染色体DNA上,才能稳定存在和表达,而不是整个Ti质粒;即使M在西红柿中成功表达,也必须在个体生物学水平鉴定,来确定实际效果;西红柿种植容易,成本低且易储存。
题组二　蛋白质工程
4.下列有关基因工程和蛋白质工程的叙述中,正确的是(　B　)
A.基因工程完全不同于蛋白质工程
B.基因工程合成的是天然存在的蛋白质,蛋白质工程合成的不一定是天然存在的蛋白质
C.蛋白质工程的作用对象是蛋白质分子,基因工程的作用对象是基因
D.蛋白质工程只是依据中心法则逆推,其蛋白质合成过程不依据中心法则
解析:蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出来的第二代基因工程;基因工程合成的是天然存在的蛋白质,蛋白质工程合成的一般不是天然存在的蛋白质;基因工程和蛋白质工程的操作对象都是基因;蛋白质工程依据中心法则逆推,其蛋白质合成过程也需要依据中心法则。
5.如图为蛋白质工程操作的基本思路,下列叙述不正确的是(　C　)
A.图中①代表转录,②代表翻译,④代表推测,⑤代表改造或合成
B.蛋白质工程中对蛋白质高级结构的了解是非常关键的工作
C.蛋白质工程的目的是对基因的结构进行分子设计
D.从图中可以看出蛋白质工程是通过改造基因而达到改造蛋白质的目的
解析:图中①代表转录,②代表翻译,④代表推测,⑤代表改造或合成;蛋白质工程依据所需蛋白质的功能,设计改造天然蛋白质的结构,推测其氨基酸序列,因此蛋白质工程中对蛋白质分子结构的了解是非常关键的工作;蛋白质工程的目的是对蛋白质的结构进行分子设计,通过基因合成或修饰实现。
6.(嘉兴高三教学测试)胰高血糖素样肽-1(GLP-1)是小肠分泌的激素,具有促进胰岛素分泌、抑制胰高血糖素分泌的功能。内源性 GLP-1 在体内会很快被分解。通过蛋白质工程开发的 GLP-1类似物可作为降血糖药使用。下列叙述正确的是(　B　)
A.GLP-1的改造方向是易被 GLP-1受体识别
B.先设计多肽的氨基酸序列,再设计基因的碱基序列
C.用限制性内切核酸酶从基因数据库中获取目的基因
D.将含目的基因的克隆载体导入生物反应器生产GLP-1类似物
解析:内源性 GLP-1 在体内会很快被分解,因此GLP-1的改造方向是不易被分解;蛋白质工程基本思路是:从预期的蛋白质功能出发,设计预期的蛋白质结构推测应有的氨基酸序列,找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因,获得所需要的蛋白质;可通过检索基因数据库获取其编码序列,最后再用化学合成法制备;用生物反应器生产药物蛋白,需将目的基因与所用生物反应器(如乳腺)的蛋白质基因相关调控组件重组在一起,将目的基因导入受精卵中。
7.(台州十校高二期中)葡萄糖异构酶能将葡萄糖转化为果糖,其最适温度约为60 ℃,生产上常用于高果糖浆的生产。科学家将葡萄糖异构酶的第138位甘氨酸用脯氨酸替代,结果它的最适温度提高了约10 ℃。下列有关叙述正确的是(　B　)
A.蛋白质工程直接对蛋白质进行操作,从而改造或制造自然界没有的蛋白质
B.编码葡萄糖异构酶的基因的脱氧核苷酸序列会有相应的改变
C.经改造后的葡萄糖异构酶热稳定性提高这一性状不可遗传
D.改造后的葡萄糖异构酶在60 ℃时催化活性高于70 ℃时的
解析:蛋白质工程不是通过改造蛋白质来实现的,而是通过对基因进行操作来实现对蛋白质的改造;编码葡萄糖异构酶的基因是DNA上的片段,故经改造后编码葡萄糖异构酶的基因的脱氧核苷酸序列会有相应的改变;葡萄糖异构酶热稳定性提高这一性状,是通过改变基因的序列获得的,可以遗传;改造后的葡萄糖异构酶最适温度约为70 ℃,在60 ℃时活性较低,生产高果糖浆的效率可能低于70 ℃时的。
8.HAMA效应是指人体针对鼠源单克隆抗体所产生的反应,该反应可使鼠源抗体加速被清除,有时可引起过敏性反应,科学家通过基因改造完成了下图的改造,鼠源抗体诱发免疫反应的强度就会降低很多。下列有关说法错误的是(　C　)
A.生产鼠-人嵌合抗体的过程属于蛋白质工程
B.改造过程涉及鼠的基因和人的基因的拼接
C.把来自不同抗体的可变区和恒定区直接拼接
D.改造过程没有利用基因定点诱变技术改造基因
解析:生产鼠-人嵌合抗体的过程属于对现有蛋白质分子进行改造,属于蛋白质工程;蛋白质工程操作的对象是基因,因此改造过程涉及鼠的基因和人的基因的拼接;蛋白质工程操作的对象是基因,因此应将鼠抗体可变区基因与人抗体恒定区基因拼接; 对鼠源抗体进行改造,首先要根据预期嵌合抗体功能(或蛋白质功能),设计嵌合抗体结构,然后通过基因拼接,将鼠源抗体基因改造成鼠-人嵌合抗体基因,最后导入到鼠淋巴细胞中表达,改造过程没有利用基因定点诱变技术改造基因。
综合提升练
9.水蛭素(EH)具有较好的抗凝血活性,临床上被用作抗血栓药物。利用酵母菌工业化生产EH时,生产周期长、目标蛋白表达效率较低;利用大肠杆菌进行生产时,基因的转录和翻译都正常,但多肽链错误折叠,产生的无活性的EH会聚集形成水不溶性的包涵体。研究人员通过改造EH基因,以期获得能在大肠杆菌中表达的可溶性EH。下列有关叙述,错误的是(　B　)
A.大肠杆菌在细胞增殖和代谢速率上较快,可用来改进酵母菌生产EH时的缺点
B.包涵体中错误折叠的EH与酵母菌生产的EH在氨基酸序列上有较大差异
C.要得到能表达可溶性EH的大肠杆菌,需要用Ca2+处理大肠杆菌
D.判断转基因大肠杆菌是否成功,需要对可溶性EH的抗凝血活性进行测定
解析:大肠杆菌是原核生物中的细菌类,繁殖速度和代谢速率都较快,可以用来改进酵母菌生产EH时生产周期长、目标蛋白表达效率较低的缺点;利用大肠杆菌进行生产时,基因的转录和翻译都正常,说明在核糖体上合成的多肽正常,与酵母菌生产的EH在氨基酸序列上应该相同;在基因工程操作中,受体细胞是原核生物如大肠杆菌时,为提高转化效率,可用Ca2+处理大肠杆菌,使细胞处于一种更容易吸收周围DNA分子的生理状态,促进重组质粒的转入;转基因大肠杆菌是否成功,还需要在个体水平进行检测,即对可溶性EH的抗凝血活性进行测定。
10.肿瘤患者体内T细胞产生的IFN-γ会减少,科学家尝试用“细菌疗法”提高患者体内的IFN-γ含量来治疗癌症:将含有IFN-γ基因的重组温控质粒导入细菌制成工程菌注入患者体内,利用超声诱导产生的短暂热效应调控工程菌的基因表达。已知含有IFN-γ基因的重组温控质粒产生的Clts蛋白能抑制IFN-γ基因启动子的活性,大于42 ℃时Clts蛋白失活。下列说法错误的是(　D　)
A.细菌获得的能产生IFN-γ的变异可以遗传
B.“细菌疗法”可根据需要无创调控IFN-γ的量
C.正常体温条件下患者体内IFN-γ不会增加
D.工程菌在患者体内不会被破坏,能持久发挥效应
解析:该工程菌是通过体外DNA重组技术制得,细胞的遗传物质发生了变化,故该变异可以遗传给子代;可利用超声诱导产生的短暂热效应调控工程菌的基因表达,因此“细菌疗法”可根据需要无创调控IFN-γ的量;Clts蛋白能抑制IFN-γ基因启动子的活性,大于42 ℃时Clts蛋白失活,而人体正常体温为37 ℃左右,故正常体温条件下患者体内IFN-γ不会增加;工程菌发挥作用后会被机体免疫系统清除,不能持久发挥效应。
11.(2025·浙江1月选考)3-磷酸甘油脱氢酶(GPD)是酵母细胞中甘油合成的关键酶。利用某假丝酵母菌株为材料,克隆具有高效催化效率的3-磷酸甘油脱氢酶的基因(Gpd)。采用的方案是:先通过第1次PCR扩增出该基因的中间部分,再通过第2次PCR分别扩增出该基因的两侧,经拼接获得完整基因的序列,如图所示:
回答下列问题。
(1)分析不同物种的GPD蛋白序列,确定蛋白质上相同的氨基酸区段,依据这些氨基酸所对应的　　　　,确定DNA序列,进而设计1对引物。以该菌株基因组DNA为模板进行第1次PCR,利用　　　　凝胶电泳分离并纯化DNA片段,进一步测定PCR产物的序列。在制备PCR反应体系时,每次用微量移液器吸取不同试剂前,需要确认或调整刻度和量程,还需要　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(2)若在上述PCR扩增结果中,除获得一条阳性条带外,还出现了另外一条条带,不可能的原因是　　　 　。
A.DNA模板被其他酵母细胞的基因组DNA污染
B.每个引物与DNA模板存在2个配对结合位点
C.在基因组中Gpd基因有2个拷贝
D.在基因组中存在1个与Gpd基因序列高度相似的其他基因
(3)为获得完整的Gpd基因,分别用限制性核酸内切酶PstⅠ和SalⅠ单酶切基因组DNA后,各自用DNA连接酶连接形成环形DNA,再用苯酚-氯仿抽提除去杂质,最后加入　　　　　　　　沉淀环形DNA。根据第一次PCR产物测定获得的序列,重新设计一对引物,以环形DNA为模板进行第二次PCR,最后进行测序。用于第二次PCR的一对引物,其序列应是DNA链上的　　　　(A.P1和P2　B.P3和P4　C.P1和P4　D.P2和P3)。根据测序结果拼接获得完整的Gpd基因序列,其中的启动子和终止子具有　　　功能。
(4)为确定克隆获得的Gpd基因的准确性,可将获得的基因序列与已建立的　　　　　　进行比对。将Gpd基因的编码区与　　　　　　连接,构建重组质粒,再将重组质粒导入酿酒酵母细胞中,实现利用酿酒酵母高效合成甘油的目的。
解析:(1)分析不同物种的GPD蛋白序列,确定蛋白质上相同的氨基酸区段,依据这些氨基酸所对应的密码子,根据碱基互补配对,确定DNA序列,进而设计1对引物。可通过琼脂糖凝胶电泳分离并纯化目标DNA片段。在制备PCR反应体系时,每次用微量移液器吸取不同试剂前,需要更换微量移液器的枪头,以避免交叉污染。
(2)DNA模板被其他酵母细胞的基因组DNA污染,可能扩增出其他DNA,从而出现另外一条条带;每个引物与DNA模板存在2个配对结合位点,从而扩增出不同的DNA片段,从而出现另外一条条带;在基因组中Gpd基因有2个拷贝,扩增出的DNA是相同DNA,电泳时只会出现一条条带;在基因组中存在1个与Gpd基因序列高度相似的其他基因,可能将相似的基因扩增出来,从而出现另外一条条带。
(3)DNA在95%的冷酒精中溶解度较低。将酶切后的DNA经苯酚-氯仿抽提除去杂质,再加入95%的冷酒精中沉淀,得到纯度较高的DNA。PCR过程中子链的延伸方向为5′端→3′端,4种引物与DNA结合位置和子链延伸方向如下图:
第二次PCR需扩增出基因的两侧,应选择P2和P3引物进行扩增。启动子可启动转录,终止子可终止转录,即启动子和终止子具有调控功能。
(4)为确定克隆获得的Gpd基因的准确性,可将获得的基因序列与已建立的基因数据库进行对比,若二者相同,则说明克隆获得的Gpd基因准确。将Gpd基因的编码区与表达载体连接,构建重组质粒,再将重组质粒导入酿酒酵母细胞中,使之进行表达,实现利用酿酒酵母高效合成甘油的目的。
答案:(1)密码子　琼脂糖　更换微量移液器的枪头
(2)C
(3)95%的冷酒精　D　调控
(4)基因数据库　表达载体
12.神经生长因子(NGF)是一种在神经细胞生长、分化和再生过程中起着重要作用的蛋白质,对治疗青光眼、阿尔茨海默病等神经性疾病有着良好的效果。为大规模合成功能性人NGF,科学家制备了在唾液腺中特异、高效表达人 NGF 的转基因猪。回答下列问题。
(1)获取目的基因:检索基因数据库,获取人NGF基因的序列,用　　　　法制备得到该基因。为使其在转基因猪的唾液腺中特异性表达,需在其上游加入　　　　　　　　　　　　　序列。
(2)扩增目的基因:将目的基因与含氨苄青霉素抗性基因和LacZ基因(其表达产物能催化无色的X-gal分解为半乳糖和蓝色物质)的克隆质粒连接,导入到大肠杆菌中。转化的大肠杆菌在含有　　　　　　　　　　　　　　　　的培养基中形成蓝色单菌落,可挑取并继续培养实现目的基因的菌体内扩增;也可设计特异性引物,在　　　　酶的作用下,通过 PCR 技术实现目的基因体外扩增。
(3)导入目的基因及筛选转基因细胞:将目的基因与表达质粒相连,构建如图A 所示的载体,导入经　　　　消化的猪胚胎成纤维细胞,用含胎牛血清的完全培养液稀释、培养,当一个单细胞长至几十个细胞团时,添加适量　　　　进行淘汰筛选,再选择都表达出绿色荧光蛋白的单克隆细胞团即是转基因细胞。
(4)核移植:从猪的卵巢中获取卵母细胞,经体外培养成熟及去核后作为　　　　,再注入转基因的胚胎成纤维细胞,通过　　　　处理促进细胞融合,激活重组细胞的发育。重组细胞体外培养至早期胚胎,移植到经　　　　处理的代孕母猪体内,直至转基因小猪出生。
(5)筛选转基因动物:对原代转基因小猪进行荧光观察,提取其尾部的基因组DNA,用限制性内切核酸酶EcoRⅤ进行酶切,产物经琼脂糖凝胶电泳,结果如图B所示,其中P为阳性对照,加入的是酶切的hNGF表达质粒样品;WT为阴性对照,加入的是酶切的　　　　　　　　　　　样品。 结果表明第　　　　组小猪是所需要的目标转基因小猪。
(6)检测目的基因的表达:采集目标转基因小猪的唾液,用　　　　　　　　方法测定是否含有人NGF,分离纯化后的人NGF可应用于临床治疗。
(7)利用生物反应器生产人类所需要的蛋白质类药物,具有非常广阔的应用前景。转基因大肠杆菌表达的人NGF稳定性和生物活性较低,可通过　　　　　　在基因水平上实现对蛋白质中氨基酸序列的改造,来提高稳定性和生物活性。与乳腺生物反应器相比,利用唾液腺生产蛋白质类药物的优点有:　

　。
解析:(1)获取目的基因的方法有多种,从基因文库中获取、PCR扩增、化学合成等。若要获取人NGF基因,可通过检索基因数据库获取其编码序列,最后再用化学合成法制备得到。目的基因要在猪的唾液腺中特异性表达,要在人NGF基因上游加入唾液腺特异性(专一性)启动子序列。
(2)氨苄青霉素抗性基因和LacZ基因为标记基因,目的是鉴别受体细胞中是否含有目的基因,以便筛选出含有目的基因的细胞。若大肠杆菌中已成功导入了克隆质粒,则其在含有氨苄青霉素和X-gal的培养基中形成蓝色菌落,可挑取并继续培养实现目的基因的菌体内扩增。目的基因合成后可在Taq DNA聚合酶的作用下通过PCR技术大量扩增,该技术的原理是DNA半保留复制。
(3)在进行动物细胞培养之前,需先用胰蛋白(胶原蛋白)酶处理、消化组织切块,使其分散成单个细胞,获得猪胚胎成纤维细胞悬液。图 A 所示的载体含有绿色荧光蛋白基因和抗新霉素基因,可添加适量新霉素进行淘汰筛选,再选择都表达出绿色荧光蛋白的转基因细胞。
(4)细胞核移植过程中,因为卵母细胞中含有促使细胞核表达全能性的物质和营养条件,所以常用处于减数第二次分裂中期的去核卵母细胞作为受体细胞。诱导细胞核和卵母细胞融合的方法是电(脉冲)刺激,该方法除了能促进细胞融合,同时具有激活重组细胞发育的作用。构成的重组细胞经细胞分裂、分化可形成新个体,需要对代孕母猪进行同期发情
处理。
(5)图B 所示, P 为阳性对照,加入的是酶切的hNGF表达质粒样品,WT为阴性对照,加入野生型猪基因组DNA样品,不含hNGF;从图示条带看出,只有第5组小猪有条带与P组阳性对照组相同,说明第5组小猪含有酶切的hNGF表达质粒,即为目标转基因猪。
(6)基因的表达过程包括转录和翻译,转录和翻译的产物分别是(m)RNA和蛋白质。若检测目的基因是否翻译成人NGF,可用抗原-抗体杂交方法检测,即用单克隆抗体技术(杂交瘤技术)获得特异性探针,与提取的蛋白质进行杂交。
(7)提高人NGF的稳定性和生物活性,该技术先从蛋白质功能出发,最后通过改造基因结构改变蛋白质结构而达到预期功能,属于蛋白质工程。“乳腺生物反应器”只能从泌乳期雌性生物的乳汁中获取产物,与“乳腺生物反应器”相比,“唾液腺生物反应器”的优点是雌性和雄性生物的唾液中都可提取到产物,整个生命周期都可生产,不受性别、年龄和时间的限制,唾液腺产生蛋白质种类少,便于分离纯化。
答案:(1)化学合成　唾液腺特异性(专一性)启动子
(2)氨苄青霉素和X-gal　Taq DNA聚合
(3)胰蛋白酶　新霉素
(4)受体细胞　电(脉冲)刺激　同期发情
(5)野生型猪基因组DNA　5
(6)抗原-抗体杂交
(7)蛋白质工程　整个生命周期都可生产;雌性和雄性都可生产;唾液腺产生蛋白质种类少,便于分离纯化

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