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(共52张PPT)
第52讲基因工程的基本工具与操作程序
内容索引
NEIRONGSUOYIN
考点二
基因工程的基本操作程序
基因工程的基本工具
考点一
考点三
DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增与电泳鉴定
基因工程的基本工具
考点一
梳理 必备知识
1.重组DNA技术的基本工具
(1)限制性内切核酸酶(简称“限制酶”)
原核生物
特定核苷酸序列
磷酸二酯
键
磷酸二酯键
拾遗 挖掘
(选择性必修3 P71“旁栏思考”)存在于原核生物中的限制酶的作用是切割外源DNA以保证自身安全,防止外来病原物的危害。
(2)DNA连接酶
常用类型 E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶
来源 __________ __________
功能 将双链DNA片段“缝合”起来,恢复被限制酶切开的 ,形成重组DNA。 E.coli DNA连接酶连接具有平末端的DNA片段的效率要远远 T4 DNA连接酶
大肠杆菌
T4噬菌体
磷酸二酯键
低于
(3)载体
有一个至多个
自我复制
受体DNA
标记
精练 迁移应用
考向　基因工程的基本工具的辨析
1.(2023·新课标卷,6)某同学拟用限制酶(酶1、酶
2、酶3 和酶4)、DNA 连接酶为工具,将目的基因
(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接,以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是(　　)
A.质粒和目的基因都用酶3切割,用E.coli DNA连接酶连接
B.质粒用酶3 切割、目的基因用酶1 切割,用T4 DNA连接酶连接
C.质粒和目的基因都用酶1 和酶2 切割,用T4 DNA连接酶连接
D.质粒和目的基因都用酶2 和酶4 切割,用E.coli DNA连接酶连接
C
解析:酶3切割后得到的是平末端,用T4 DNA连接酶连接效率更高,A错误;质粒用酶3切割后得到平末端,目的基因用酶1切割后得到的是黏性末端,二者不能连接,B错误;质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端,可以用T4 DNA连接酶连接,能保证目的基因在质粒上连接的方向正确,此重组表达载体的构建方案最合理且高效,C正确;若用酶2和酶4切割质粒和目的基因,会破坏质粒上的抗生素抗性基因,连接形成的基因表达载体缺少标记基因,无法进行后续的筛选,D错误。
2.(2026·河南新乡模拟)质粒是基因工程中最常用的载体,质粒有标记基因(如图所示),通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转化成功。质粒上箭头表示三种限制酶的酶切位点。外源基因插入的位置不同,细菌在培养基上的生长情况不同。如表是外源基因插入(插入点有a、b、c)后细菌的生长情况。下列有关叙述正确的是(　　)
项目 细菌在含氨苄青霉素的培养基上的生长情况 细菌在含四环素的培养基上的生长情况
① 能生长 不能生长
② 能生长 能生长
③ 不能生长 能生长
A.质粒的复制原点上有RNA聚合酶的结合位点
B.①②③三种重组后细菌的外源基因插入点①是a,②是c,③是b
C.质粒被一种限制酶切开时,被水解的磷酸二酯键有2个
D.将外源基因与质粒连接时需用DNA聚合酶
答案:C
解析:质粒的复制原点上有DNA聚合酶的结合位点,A错误;①②③三种重组后细菌的外源基因插入点①是b,②是c,③是a,B错误;质粒被一种限制酶切开时,被水解的磷酸二酯键有2个,C正确;将外源基因与质粒连接时需用DNA连接酶,D错误。
基因工程的基本操作程序
考点二
梳理 必备知识
1.目的基因的筛选与获取
(1)目的基因:在基因工程的设计和操作中,用于改变受体细胞 或获得预期 等的基因。
(2)筛选合适的目的基因
①从相关的 的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。
②利用 和序列比对工具进行筛选。
性状
表达产物
已知结构和功能清晰
序列数据库
(3)目的基因的获取
①人工合成目的基因。
②PCR 和扩增目的基因
原理 DNA____________
条件 DNA模板、 引物、 脱氧核苷酸、
酶、缓冲液
仪器 PCR扩增仪
获取
半保留复制
两种
四种
耐高温的DNA聚合
过程 变性 当温度 时,碱基对之间的
断开,双链DNA解聚为单链
复性 当温度下降到50 ℃左右时, 与母链的 端通过 结合
延伸 当温度上升到72 ℃左右时,脱氧核苷酸在 的作用下根据碱基互补配对原则合成DNA子链
结果 DNA分子成 形式扩增,约为2n,其中n为______________
超过90 ℃
氢键
两种引物
3'
碱基互补配对
耐高温的DNA聚合酶
指数
扩增循环的次数
③通过构建基因文库来获取目的基因。
拾遗 挖掘
(选择性必修3 P79“旁栏思考”)PCR不可以扩增mRNA的原因是PCR是以DNA双链作为模板的,不能直接用单链RNA进行PCR,必须把mRNA逆转录成cDNA之后再进行PCR。
2.基因表达载体的构建——基因工程的核心
(1)构建目的:使目的基因在受体细胞中 ;同时,使目的基因能够表达和发挥作用。
(2)基因表达载体的组成及作用
稳定存在,并且遗传给下一代
上游
RNA聚合酶
转录
下游
终止转录
目的基因
3.将目的基因导入受体细胞
目的基因
子房
T-DNA
染色体
显微注
射
受精卵
4.目的基因的检测与鉴定
类型 步骤 检测内容 方法 结果显示
分子 水平 检测 导入 检测 目的基因是否插入受体细胞的DNA上 __________ 电泳结果对比
表达 检测 目的基因是否转录出mRNA _________ 电泳结果对比
目的基因是否翻译出相应蛋白质 ______________________ 是否出现杂交带
个体生物学水平的鉴定 确定是否具有抗性及抗性程度 抗虫、抗病、抗低温等实验 是否赋予了预期抗性
PCR技术
PCR技术
抗原—抗体
杂交技术
拾遗 挖掘
(选择性必修3 P82正文)转基因抗虫棉培育过程中,检测目的基因是否成功表达的常见方法有抗原—抗体杂交法、用棉叶饲喂棉铃虫。
深研 重难问题
探究　BamHⅠ、HindⅢ、SmaⅠ三种限制酶的识别序列和切割位点分别为ATCC、GCTT、,图甲、乙中的箭头表示三种限制性内切核酸酶的切割位点,AmpR表示氨苄青霉素抗性基因,neo表示新霉素抗性基因。
(1)质粒和获取目的基因若都用SmaⅠ切割,在构建重组表达载体时,往往使用T4 DNA连接酶,而不用E.coli DNA连接酶,为什么
提示:T4 DNA连接酶连接具有平末端的DNA片段的效率要远远高于E.coli DNA连接酶。
(2)在构建重组质粒时,若只用SmaⅠ处理质粒和外源DNA分子片段,会导致什么结果
提示:除形成重组质粒外,还会导致目的基因和质粒的自身环化,或目的基因和质粒的反向连接。
(3)在构建重组质粒时,限制酶应该选SmaⅠ和HindⅢ,原因是什么
提示:能确保目的基因和质粒的正向连接,并且质粒上保留新霉素抗性基因作为标记基因。
“模型法”解读限制酶选择的四个要求
(1)位置要求:限制酶的切割位点不能位于启动子、终止子、复制原点、标记基因当中,所选切割位点应位于启动子和终止子之间,若载体有多个标记基因,并非都不能破坏,至少保留一个用于重组DNA的鉴定和筛选。另外,目的基因上如果有某限制酶的切割位点,该酶不能选择。
归纳提升
(2)酶切要求
①单酶切:为使目的基因与载体形成的DNA片段末端能够连接,通常使用同一种限制酶将两者切割(如图,选用XhoⅠ),但单酶切会出现目的基因与质粒的自身环化和随意连接,还可造成目的基因的多拷贝插入。
②双酶切:双酶切可以确保目的基因的正确插入,要求两个酶切位点位于目的基因的两侧,如图可选择PstⅠ和BamHⅠ,但也要注意酶切位点个数和相对位置,如:不能选择XhoⅠ和BamHⅠ进行双酶切。另外,不同的限制酶所产生的末端相同,两端也可连接,例如,因MunⅠ和EcoRⅠ酶切后产生的末端相同,可选择XhoⅠ和MunⅠ酶切目的基因,用XhoⅠ和EcoRⅠ酶切质粒。
限制酶 PstⅠ XhoⅠ BamHⅠ
识别序列 和切割位点 CTGC CGTC CGAG GAGC ATCC
CCTA

限制酶 MunⅠ EcoRⅠ SmaⅠ
识别序列 和切割位点 ATTG GTTA ATTC CTTA CCGG
GGCC
(3)数量要求:如果所选限制酶的切割位点不止一个,如选择SmaⅠ进行切割,则切割重组后会丢失复制原点,那么载体进入受体细胞后不能自主复制,故所选限制酶在载体上最好只有一个切割位点。
(4)特殊要求:例如根据Ti质粒的T-DNA片段选择限制酶,假设切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ,则甲、乙、丁质粒均不宜选取,丙质粒宜选取。
精练 迁移应用
考向1　PCR技术原理的判断
1.(2026·湖北襄阳模拟)“X基因”是DNA分子上一个有遗传效应的片段,若要用PCR技术特异性地拷贝“X基因”,需在PCR反应中加入两种引物,两种引物及其与模板链的结合位置如图1所示。下列叙述错误的是(　　)
A.第一轮复制得到2个DNA分子,即①②各一个
B.第二轮复制得到4个DNA分子,即①②③④各一个
C.第四轮复制得到16个DNA分子,其中有4个X基因
D.经五轮循环后产物中有五种不同的DNA分子
答案:C
解析:据图分析可知,第一轮复制形成2个DNA分子,即①②各一个,A正确;第二轮复制得到22=4(个)DNA分子,①复制得①和③,②复制得②和④,即得到①②③④各一个,B正确;第四轮复制得到16个DNA分子,其中有8个⑤(X基因),C错误;经五轮循环后共形成32个DNA分子,其中①②各一个,③④各四个,22个⑤,故产物中有五种不同的DNA分子,D正确。
考向2　基因工程的基本操作程序的分析
2.(2025·安徽卷,15)质粒K中含有β-半乳糖苷酶基因,将该质粒导入大肠杆菌细胞后,其编码的酶可分解X-gal,产生蓝色物质,进而形成蓝色菌落,如图所示。科研小组以该质粒作为载体,采用基因工程技术实现人源干扰素基因在大肠杆菌中的高效表达。下列叙述错误的是(　　)
A.使用氯化钙处理大肠杆菌以提高转化效率,可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数
B.如果筛选平板中仅含卡那霉素,生长出的白色菌落不可判定为含目的基因的菌株
C.因质粒K中含两个标记基因,筛选平板中长出的白色菌落即为表达目标蛋白的菌株
D.若筛选平板中蓝色菌落偏多,原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌
答案:C
解析:使用氯化钙处理大肠杆菌,可使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,提高转化效率,即更多的大肠杆菌能吸收质粒,无论吸收的是含目的基因的重组质粒(可能形成白色菌落)还是未重组的质粒K(形成蓝色菌落),都可增加筛选平板上菌落数,A正确;如果筛选平板中仅含卡那霉素,生长出的白色菌落是含有质粒的菌株,但不一定含有目的基因,B正确;因质粒K中含两个标记基因,目的基因的插入破坏了β-半乳糖苷酶基因,使其无法表达β-半乳糖苷酶,筛选平板中长出的白色菌落即为导入了重组质粒的菌株,但是否表达目标蛋白,还需要用抗原—抗体杂交技术检测,C错误;若筛选平板中蓝色菌落偏多,说明质粒上的β-半乳糖苷酶基因仍然保持完整并且成功表达出β-半乳糖苷酶,可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌,D正确。
3.(2023·湖北卷,4)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒,构建基因表达载体(重组质粒),并导入受体菌中。根据题目所提供的信息判断,下列叙述正确的是(　　)
A.若用Hind Ⅲ酶切质粒和目的基因,转录的产物可能不同
B.若用Hind Ⅲ和ScaⅠ酶切,一定可防止目的基因与质粒的反向连接
C.若用PvuⅠ酶切,在含四环素的培养基中形成的菌落一定含有目的基因
D.若用SphⅠ酶切,筛选时应先将转化处理的菌液涂布到含四环素的培养基中长成菌落,再影印接种到含氨苄青霉素的培养基中
A
解析:若用Hind Ⅲ酶切质粒,目的基因可能正向插入,也可能反向插入,转录的产物可能不同,A正确;由于质粒中有2个ScaⅠ酶的切割位点,因而用Hind Ⅲ和ScaⅠ酶切不一定能防止目的基因与质粒的反向连接,B错误;用PvuⅠ酶切会破坏氨苄青霉素抗性基因,则重组质粒中只有四环素抗性基因,因此成功导入重组质粒的受体细胞具有对四环素的抗性,同时若导入的是不含目的基因的空质粒,受体细胞依然具有对四环素的抗性,故在含四环素的培养基中形成的菌落不一定含有目的基因,C错误;用SphⅠ酶切会破坏四环素抗性基因(TetR),氨苄青霉素抗性基因(AmpR)不受影响,即重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因(AmpR),因此携带目的基因的受体菌在含氨苄青霉素的培养基中能形成菌落,在含四环素的培养基中不能形成菌落,故筛选时应先将转化处理的菌液涂布到含氨苄青霉素的培养基中长成菌落,再影印接种到含四环
素的培养基中,只在含氨苄青霉素的培养基上生长的菌落为
目的菌,D错误。
DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增与电泳鉴定
考点三
梳理 必备知识
1.DNA的粗提取与鉴定
(1)实验原理
不溶于
2 mol/L
二苯胺
(2)操作流程
95%
沸水
拾遗 挖掘
(选择性必修3 P74“探究·实践”拓展)DNA粗提取实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料,原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核(无DNA)。
2.DNA片段的扩增
(1)原理:DNA的 原理。
(2)PCR实验的操作步骤
热变性
离心管
3.DNA片段的电泳鉴定
(1)原理
①电泳的原理:DNA分子具有 ,在一定的pH下,这些基团可以带上 。在电场的作用下,这些带电分子会向着与它所带电荷 的电极移动。
②鉴定的原理:PCR的产物一般通过 来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的 等有关。凝胶中的DNA分子通过 ,可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。
可解离的基团
正电荷或负电荷
相反
琼脂糖凝胶电泳
大小和构象
染色
(2)过程
电泳
凝胶载样
紫外灯
(3)结果分析与评价
①成功扩增出DNA片段的判断依据是_____________________________
_______。
②进行电泳鉴定的结果应该是 条条带。如图所示,该片段大小约为
bp。
可以在紫外灯下直接观察到DNA
条带
一
750
精练 迁移应用
考向1　DNA的粗提取与鉴定
1.(2024·安徽卷,14)下列关于“DNA粗提取与鉴定”实验的叙述,错误的是
(　　)
A.实验中如果将研磨液更换为蒸馏水,DNA提取的效率会降低
B.利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异,可以初步分离DNA
C.DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同,该原理可用于纯化DNA粗提物
D.将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应,可以检测溶液中是否含有蛋白质杂质
D
解析:研磨液有利于DNA的溶解,换为蒸馏水,DNA提取的效率会降低,A正确;DNA不溶于酒精溶液,但某些蛋白质溶于酒精,可利用这一原理分离DNA,B正确;DNA在NaCl溶液中的溶解度随着NaCl浓度的变化而改变,因此可用不同浓度的NaCl溶液对DNA进行粗提取,C正确;在沸水浴的条件下,DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色,因此二苯胺试剂用于鉴定DNA,D错误。
2.(2024·山东卷,13)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验,下列说法正确的是
(　　)
A.整个提取过程中可以不使用离心机
B.研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后,应充分摇匀再倒入烧杯中
C.鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变
D.仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰
A
解析:在DNA的粗提取与鉴定实验中,可将获得的研磨液用纱布过滤后,在4 ℃的冰箱中放置几分钟,再取上清液,也可以直接将研磨液用离心机离心后取上清液,A正确;研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后,DNA在上清液中,应取上清液倒入烧杯中,B错误;鉴定过程中用沸水浴加热,DNA双螺旋结构会发生改变,C错误;仅设置一个只加二苯胺的对照组可以排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰,D错误。
考向2　DNA片段的扩增及电泳鉴定
3.(2025·课标卷,6)琼脂糖凝胶电泳常用于核酸样品的分析,样品1~4的电泳结果如图所示(“+”“-”分别代表电泳槽的阳极和阴极)。已知样品1和2中的DNA分子分别是甲和乙,甲只有限制酶R的一个酶切位点,样品3和4中有一个样品是甲的酶切产物。下列叙述错误的是(　　)
A.配制琼脂糖凝胶时需选用适当的缓冲液
B.该实验条件下甲、乙两种DNA分子均带负电荷
C.甲、乙两种DNA分子所含碱基对的数量可能不同
D.据图推测样品3可能是甲被酶R完全酶切后的产物
D
解析:配制琼脂糖凝胶时选用适当缓冲液,可维持电泳过程中体系的pH稳定,保证核酸分子正常泳动,A正确。电泳时,样品向+极移动,说明在该实验条件下甲、乙两种 DNA 分子均带负电荷,B正确。电泳中,DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等多种因素有关。
甲、乙电泳条带位置虽然相同,但影响DNA分子迁移速率的因素很多,所以碱基对的数量可能不同,C正确。甲只有限制酶R的一个酶切位点,若被酶R完全酶切,只会得到2种DNA片段(2个条带),这两个
条带的碱基数量比甲要少,电泳距离要比甲更远,所以
据图推测样品4是甲被酶R完全酶切后的产物,D 错误。第52讲基因工程的基本工具与操作程序
考点一　基因工程的基本工具
1.重组DNA技术的基本工具
(1)限制性内切核酸酶(简称“限制酶”)
拾遗·挖掘
(选择性必修3 P71“旁栏思考”)存在于原核生物中的限制酶的作用是切割外源DNA以保证自身安全,防止外来病原物的危害。
(2)DNA连接酶
常用类型 E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶
来源 大肠杆菌 T4噬菌体
功能 将双链DNA片段“缝合”起来,恢复被限制酶切开的磷酸二酯键,形成重组DNA。 E.coli DNA连接酶连接具有平末端的DNA片段的效率要远远低于T4 DNA连接酶
(3)载体
考向　基因工程的基本工具的辨析
1.(2023·新课标卷,6)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3 和酶4)、DNA 连接酶为工具,将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接,以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是(　　)
A.质粒和目的基因都用酶3切割,用E.coli DNA连接酶连接
B.质粒用酶3 切割、目的基因用酶1 切割,用T4 DNA连接酶连接
C.质粒和目的基因都用酶1 和酶2 切割,用T4 DNA连接酶连接
D.质粒和目的基因都用酶2 和酶4 切割,用E.coli DNA连接酶连接
答案:C
解析:酶3切割后得到的是平末端,用T4 DNA连接酶连接效率更高,A错误;质粒用酶3切割后得到平末端,目的基因用酶1切割后得到的是黏性末端,二者不能连接,B错误;质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端,可以用T4 DNA连接酶连接,能保证目的基因在质粒上连接的方向正确,此重组表达载体的构建方案最合理且高效,C正确;若用酶2和酶4切割质粒和目的基因,会破坏质粒上的抗生素抗性基因,连接形成的基因表达载体缺少标记基因,无法进行后续的筛选,D错误。
2.(2026·河南新乡模拟)质粒是基因工程中最常用的载体,质粒有标记基因(如图所示),通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转化成功。质粒上箭头表示三种限制酶的酶切位点。外源基因插入的位置不同,细菌在培养基上的生长情况不同。如表是外源基因插入(插入点有a、b、c)后细菌的生长情况。下列有关叙述正确的是(　　)
项目 细菌在含氨苄青霉素的培养基上的生长情况 细菌在含四环素的培养基上的生长情况
① 能生长 不能生长
② 能生长 能生长
③ 不能生长 能生长
A.质粒的复制原点上有RNA聚合酶的结合位点
B.①②③三种重组后细菌的外源基因插入点①是a,②是c,③是b
C.质粒被一种限制酶切开时,被水解的磷酸二酯键有2个
D.将外源基因与质粒连接时需用DNA聚合酶
答案:C
解析:质粒的复制原点上有DNA聚合酶的结合位点,A错误;①②③三种重组后细菌的外源基因插入点①是b,②是c,③是a,B错误;质粒被一种限制酶切开时,被水解的磷酸二酯键有2个,C正确;将外源基因与质粒连接时需用DNA连接酶,D错误。
考点二　基因工程的基本操作程序
1.目的基因的筛选与获取
(1)目的基因:在基因工程的设计和操作中,用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。
(2)筛选合适的目的基因
①从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。
②利用序列数据库和序列比对工具进行筛选。
(3)目的基因的获取
①人工合成目的基因。
②PCR获取和扩增目的基因
原理 DNA半保留复制
条件 DNA模板、两种引物、四种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶、缓冲液
仪器 PCR扩增仪
过程 变性 当温度超过90 ℃时,碱基对之间的氢键断开,双链DNA解聚为单链
复性 当温度下降到50 ℃左右时,两种引物与母链的3'端通过碱基互补配对结合
延伸 当温度上升到72 ℃左右时,脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下根据碱基互补配对原则合成DNA子链
结果 DNA分子成指数形式扩增,约为2n,其中n为扩增循环的次数
③通过构建基因文库来获取目的基因。
拾遗·挖掘
(选择性必修3 P79“旁栏思考”)PCR不可以扩增mRNA的原因是PCR是以DNA双链作为模板的,不能直接用单链RNA进行PCR,必须把mRNA逆转录成cDNA之后再进行PCR。
2.基因表达载体的构建——基因工程的核心
(1)构建目的:使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且遗传给下一代;同时,使目的基因能够表达和发挥作用。
(2)基因表达载体的组成及作用
3.将目的基因导入受体细胞
4.目的基因的检测与鉴定
类型 步骤 检测内容 方法 结果显示
分子 水平 检测 导入 检测 目的基因是否插入受体细胞的DNA上 PCR技术 电泳结果对比
表达 检测 目的基因是否转录出mRNA PCR技术 电泳结果对比
目的基因是否翻译出相应蛋白质 抗原—抗体杂交技术 是否出现杂交带
个体生物学水平的鉴定 确定是否具有抗性及抗性程度 抗虫、抗病、抗低温等实验 是否赋予了预期抗性
拾遗·挖掘
(选择性必修3 P82正文)转基因抗虫棉培育过程中,检测目的基因是否成功表达的常见方法有抗原—抗体杂交法、用棉叶饲喂棉铃虫。
探究　BamHⅠ、HindⅢ、SmaⅠ三种限制酶的识别序列和切割位点分别为ATCC、GCTT、,图甲、乙中的箭头表示三种限制性内切核酸酶的切割位点,AmpR表示氨苄青霉素抗性基因,neo表示新霉素抗性基因。
(1)质粒和获取目的基因若都用SmaⅠ切割,在构建重组表达载体时,往往使用T4 DNA连接酶,而不用E.coli DNA连接酶,为什么
提示:T4 DNA连接酶连接具有平末端的DNA片段的效率要远远高于E.coli DNA连接酶。
(2)在构建重组质粒时,若只用SmaⅠ处理质粒和外源DNA分子片段,会导致什么结果
提示:除形成重组质粒外,还会导致目的基因和质粒的自身环化,或目的基因和质粒的反向连接。
(3)在构建重组质粒时,限制酶应该选SmaⅠ和HindⅢ,原因是什么
提示:能确保目的基因和质粒的正向连接,并且质粒上保留新霉素抗性基因作为标记基因。
“模型法”解读限制酶选择的四个要求
(1)位置要求:限制酶的切割位点不能位于启动子、终止子、复制原点、标记基因当中,所选切割位点应位于启动子和终止子之间,若载体有多个标记基因,并非都不能破坏,至少保留一个用于重组DNA的鉴定和筛选。另外,目的基因上如果有某限制酶的切割位点,该酶不能选择。
(2)酶切要求
①单酶切:为使目的基因与载体形成的DNA片段末端能够连接,通常使用同一种限制酶将两者切割(如图,选用XhoⅠ),但单酶切会出现目的基因与质粒的自身环化和随意连接,还可造成目的基因的多拷贝插入。
②双酶切:双酶切可以确保目的基因的正确插入,要求两个酶切位点位于目的基因的两侧,如图可选择PstⅠ和BamHⅠ,但也要注意酶切位点个数和相对位置,如:不能选择XhoⅠ和BamHⅠ进行双酶切。另外,不同的限制酶所产生的末端相同,两端也可连接,例如,因MunⅠ和EcoRⅠ酶切后产生的末端相同,可选择XhoⅠ和MunⅠ酶切目的基因,用XhoⅠ和EcoRⅠ酶切质粒。
限制酶 PstⅠ XhoⅠ BamHⅠ
识别序列 和切割位点 CTGC CGTC CGAG GAGC ATCC CCTA
限制酶 MunⅠ EcoRⅠ SmaⅠ
识别序列 和切割位点 ATTG GTTA ATTC CTTA CCGG GGCC
(3)数量要求:如果所选限制酶的切割位点不止一个,如选择SmaⅠ进行切割,则切割重组后会丢失复制原点,那么载体进入受体细胞后不能自主复制,故所选限制酶在载体上最好只有一个切割位点。
(4)特殊要求:例如根据Ti质粒的T-DNA片段选择限制酶,假设切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ,则甲、乙、丁质粒均不宜选取,丙质粒宜选取。
考向1　PCR技术原理的判断
1.(2026·湖北襄阳模拟)“X基因”是DNA分子上一个有遗传效应的片段,若要用PCR技术特异性地拷贝“X基因”,需在PCR反应中加入两种引物,两种引物及其与模板链的结合位置如图1所示。下列叙述错误的是(　　)
A.第一轮复制得到2个DNA分子,即①②各一个
B.第二轮复制得到4个DNA分子,即①②③④各一个
C.第四轮复制得到16个DNA分子,其中有4个X基因
D.经五轮循环后产物中有五种不同的DNA分子
答案:C
解析:据图分析可知,第一轮复制形成2个DNA分子,即①②各一个,A正确;第二轮复制得到22=4(个)DNA分子,①复制得①和③,②复制得②和④,即得到①②③④各一个,B正确;第四轮复制得到16个DNA分子,其中有8个⑤(X基因),C错误;经五轮循环后共形成32个DNA分子,其中①②各一个,③④各四个,22个⑤,故产物中有五种不同的DNA分子,D正确。
考向2　基因工程的基本操作程序的分析
2.(2025·安徽卷,15)质粒K中含有β-半乳糖苷酶基因,将该质粒导入大肠杆菌细胞后,其编码的酶可分解X-gal,产生蓝色物质,进而形成蓝色菌落,如图所示。科研小组以该质粒作为载体,采用基因工程技术实现人源干扰素基因在大肠杆菌中的高效表达。下列叙述错误的是(　　)
A.使用氯化钙处理大肠杆菌以提高转化效率,可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数
B.如果筛选平板中仅含卡那霉素,生长出的白色菌落不可判定为含目的基因的菌株
C.因质粒K中含两个标记基因,筛选平板中长出的白色菌落即为表达目标蛋白的菌株
D.若筛选平板中蓝色菌落偏多,原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌
答案:C
解析:使用氯化钙处理大肠杆菌,可使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,提高转化效率,即更多的大肠杆菌能吸收质粒,无论吸收的是含目的基因的重组质粒(可能形成白色菌落)还是未重组的质粒K(形成蓝色菌落),都可增加筛选平板上菌落数,A正确;如果筛选平板中仅含卡那霉素,生长出的白色菌落是含有质粒的菌株,但不一定含有目的基因,B正确;因质粒K中含两个标记基因,目的基因的插入破坏了β-半乳糖苷酶基因,使其无法表达β-半乳糖苷酶,筛选平板中长出的白色菌落即为导入了重组质粒的菌株,但是否表达目标蛋白,还需要用抗原—抗体杂交技术检测,C错误;若筛选平板中蓝色菌落偏多,说明质粒上的β-半乳糖苷酶基因仍然保持完整并且成功表达出β-半乳糖苷酶,可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌,D正确。
3.(2023·湖北卷,4)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒,构建基因表达载体(重组质粒),并导入受体菌中。根据题目所提供的信息判断,下列叙述正确的是(　　)
A.若用Hind Ⅲ酶切质粒和目的基因,转录的产物可能不同
B.若用Hind Ⅲ和ScaⅠ酶切,一定可防止目的基因与质粒的反向连接
C.若用PvuⅠ酶切,在含四环素的培养基中形成的菌落一定含有目的基因
D.若用SphⅠ酶切,筛选时应先将转化处理的菌液涂布到含四环素的培养基中长成菌落,再影印接种到含氨苄青霉素的培养基中
答案:A
解析:若用Hind Ⅲ酶切质粒,目的基因可能正向插入,也可能反向插入,转录的产物可能不同,A正确;由于质粒中有2个ScaⅠ酶的切割位点,因而用Hind Ⅲ和ScaⅠ酶切不一定能防止目的基因与质粒的反向连接,B错误;用PvuⅠ酶切会破坏氨苄青霉素抗性基因,则重组质粒中只有四环素抗性基因,因此成功导入重组质粒的受体细胞具有对四环素的抗性,同时若导入的是不含目的基因的空质粒,受体细胞依然具有对四环素的抗性,故在含四环素的培养基中形成的菌落不一定含有目的基因,C错误;用SphⅠ酶切会破坏四环素抗性基因(TetR),氨苄青霉素抗性基因(AmpR)不受影响,即重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因(AmpR),因此携带目的基因的受体菌在含氨苄青霉素的培养基中能形成菌落,在含四环素的培养基中不能形成菌落,故筛选时应先将转化处理的菌液涂布到含氨苄青霉素的培养基中长成菌落,再影印接种到含四环素的培养基中,只在含氨苄青霉素的培养基上生长的菌落为目的菌,D错误。
考点三　DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增与电泳鉴定
1.DNA的粗提取与鉴定
(1)实验原理
(2)操作流程
拾遗·挖掘
(选择性必修3 P74“探究·实践”拓展)DNA粗提取实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料,原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核(无DNA)。
2.DNA片段的扩增
(1)原理:DNA的热变性原理。
(2)PCR实验的操作步骤
3.DNA片段的电泳鉴定
(1)原理
①电泳的原理:DNA分子具有可解离的基团,在一定的pH下,这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下,这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动。
②鉴定的原理:PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。凝胶中的DNA分子通过染色,可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。
(2)过程
(3)结果分析与评价
①成功扩增出DNA片段的判断依据是可以在紫外灯下直接观察到DNA条带。
②进行电泳鉴定的结果应该是一条条带。如图所示,该片段大小约为750 bp。
考向1　DNA的粗提取与鉴定
1.(2024·安徽卷,14)下列关于“DNA粗提取与鉴定”实验的叙述,错误的是(　　)
A.实验中如果将研磨液更换为蒸馏水,DNA提取的效率会降低
B.利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异,可以初步分离DNA
C.DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同,该原理可用于纯化DNA粗提物
D.将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应,可以检测溶液中是否含有蛋白质杂质
答案:D
解析:研磨液有利于DNA的溶解,换为蒸馏水,DNA提取的效率会降低,A正确;DNA不溶于酒精溶液,但某些蛋白质溶于酒精,可利用这一原理分离DNA,B正确;DNA在NaCl溶液中的溶解度随着NaCl浓度的变化而改变,因此可用不同浓度的NaCl溶液对DNA进行粗提取,C正确;在沸水浴的条件下,DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色,因此二苯胺试剂用于鉴定DNA,D错误。
2.(2024·山东卷,13)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验,下列说法正确的是(　　)
A.整个提取过程中可以不使用离心机
B.研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后,应充分摇匀再倒入烧杯中
C.鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变
D.仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰
答案:A
解析:在DNA的粗提取与鉴定实验中,可将获得的研磨液用纱布过滤后,在4 ℃的冰箱中放置几分钟,再取上清液,也可以直接将研磨液用离心机离心后取上清液,A正确;研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后,DNA在上清液中,应取上清液倒入烧杯中,B错误;鉴定过程中用沸水浴加热,DNA双螺旋结构会发生改变,C错误;仅设置一个只加二苯胺的对照组可以排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰,D错误。
考向2　DNA片段的扩增及电泳鉴定
3.(2025·课标卷,6)琼脂糖凝胶电泳常用于核酸样品的分析,样品1~4的电泳结果如图所示(“+”“-”分别代表电泳槽的阳极和阴极)。已知样品1和2中的DNA分子分别是甲和乙,甲只有限制酶R的一个酶切位点,样品3和4中有一个样品是甲的酶切产物。下列叙述错误的是(　　)
A.配制琼脂糖凝胶时需选用适当的缓冲液
B.该实验条件下甲、乙两种DNA分子均带负电荷
C.甲、乙两种DNA分子所含碱基对的数量可能不同
D.据图推测样品3可能是甲被酶R完全酶切后的产物
答案:D
解析:配制琼脂糖凝胶时选用适当缓冲液,可维持电泳过程中体系的pH稳定,保证核酸分子正常泳动,A正确。电泳时,样品向+极移动,说明在该实验条件下甲、乙两种 DNA 分子均带负电荷,B正确。电泳中,DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等多种因素有关。甲、乙电泳条带位置虽然相同,但影响DNA分子迁移速率的因素很多,所以碱基对的数量可能不同,C正确。甲只有限制酶R的一个酶切位点,若被酶R完全酶切,只会得到2种DNA片段(2个条带),这两个条带的碱基数量比甲要少,电泳距离要比甲更远,所以据图推测样品4是甲被酶R完全酶切后的产物,D 错误。
1.(2026·河南安阳模拟)下列关于基因工程基本工具的叙述,正确的是(　　)
A.限制酶只能特异性地识别6个核苷酸序列
B.限制酶切割DNA分子一次可断开2个磷酸二酯键,产生2个游离的磷酸基团
C.用做分子运输车的质粒常有特殊的抗生素合成基因,便于重组DNA分子的筛选
D.DNA连接酶能连接双链DNA片段互补的黏性末端或平末端,从而恢复被限制酶切开的氢键
答案:B
解析:大多数限制酶能特异性地识别6个核苷酸序列,A错误;限制酶切割双链DNA时,会在两条链上各断开一个磷酸二酯键,共断开2个,每个切口产生1个游离的磷酸基团,总计2个,B正确;质粒作为载体需携带标记基因(即抗生素抗性基因),而非抗生素合成基因,C错误;DNA连接酶的作用是连接磷酸二酯键,而非恢复氢键,D错误。
2.(2026·河北廊坊月考)下列关于基因工程的叙述,正确的是(　　)
A.基因工程是在细胞水平上进行设计和施工的,又叫重组DNA技术
B.DNA连接酶和DNA聚合酶催化的化学键分别是磷酸二酯键和氢键
C.不同的限制酶切割不同的DNA序列后一定产生不同的黏性末端
D.质粒是一种裸露的、结构简单的具有自我复制能力的环状DNA分子
答案:D
解析:基因工程是在分子水平上进行设计和施工的,而非细胞水平,A错误;DNA连接酶和DNA聚合酶均催化磷酸二酯键的形成,而氢键的断裂或形成由解旋酶或DNA自身结构决定,B错误;不同限制酶可能切割产生相同的黏性末端(如同尾酶),C错误;质粒是存在于细菌等细胞中的环状双链DNA,结构简单且能自主复制,D正确。
3.下列关于DNA聚合酶、限制酶、DNA连接酶有关的叙述,错误的是(　　)
A.都是由脱氧核苷酸连接而成的多聚体
B.都能降低相应化学反应所需的活化能
C.催化活性都要受温度、pH等的影响
D.其合成过程都需经过转录和翻译阶段
答案:A
解析:DNA聚合酶、限制酶、DNA连接酶的化学本质都是蛋白质,都是由氨基酸连接而成的多聚体,A错误;酶能降低化学反应所需的活化能,因此这三种酶都能降低相关化学反应所需的活化能,B正确;酶的作用条件较温和,温度、pH等都会影响酶活性,故这三种酶的作用过程都要受温度、pH等的影响,C正确;这三种酶的化学本质都是蛋白质,蛋白质的合成需经过转录和翻译阶段,D正确。
4.(2026·贵州安顺月考)将外源基因导入受体细胞的过程中需要使用载体,下列有关载体的叙述,错误的是(　　)
A.载体应对宿主细胞无伤害,以免影响宿主细胞的正常生命活动
B.载体应具有一个至多个限制酶切割位点,以便于目的基因的插入
C.基因工程中被用作载体的质粒都是在天然质粒的基础上改造的
D.将外源基因送入受体细胞的载体可以是切割DNA分子的酶
答案:D
解析:载体需和目的基因一起进入宿主细胞并与其共存,因此载体应对宿主细胞无伤害,以免影响宿主细胞的正常生命活动,A正确;载体应具有一个至多个限制酶切割位点,以便与目的基因拼接形成重组载体,B正确;天然的质粒往往存在不足,基因工程中用到的质粒都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的,C正确;切割DNA分子的酶为限制酶,是基因工程的工具之一,不是载体,D错误。
5.(2026·湖南邵阳模拟)将某外源基因与质粒结合形成重组质粒的过程如图。下列说法错误的是(　　)
A.氨苄青霉素抗性基因可作为筛选重组DNA的标记基因
B.用不同限制酶分别切割含目的基因的DNA 和质粒也能产生相同的黏性末端
C.构建重组质粒时,除了需BamHⅠ酶外,还需 DNA 连接酶
D.图中方法可保证目的基因定向与质粒相连形成重组质粒
答案:D
解析:氨苄青霉素抗性基因是质粒上的标记基因,可用于筛选含有重组DNA的受体细胞,A正确;不同的限制酶识别不同的核苷酸序列,但可能由于识别序列部分相同,切割后产生相同的黏性末端,B正确;构建重组质粒时,首先要用BamHⅠ酶切割质粒和含目的基因的DNA,产生相同的黏性末端,然后再用DNA连接酶将目的基因和质粒连接起来,C正确;仅用BamHⅠ一种限制酶切割,目的基因和质粒都可能会发生自身环化,或者目的基因与质粒反向连接,不能保证目的基因定向与质粒相连形成重组质粒,D错误。
6.(2026·河北秦皇岛模拟)土壤农杆菌侵染植物细胞时,Ti质粒上的T-DNA片段转入植物的基因组。利用农杆菌以Ti质粒作为载体进行转基因,下列相关叙述正确的是(　　)
A.目的基因应插入T-DNA片段外,以防止破坏T-DNA
B.用Ca2+处理农杆菌,以利于其侵染植物细胞
C.Ti质粒是一种环状DNA分子,没有双螺旋结构
D.可以用PCR技术检测外源DNA是否整合到植物的染色体DNA上
答案:D
解析:在农杆菌转化法中,需要将目的基因插入T-DNA片段上,有利于介导外源DNA整合到植物的染色体DNA上,A错误;农杆菌侵染植物细胞不需要用Ca2+处理,B错误;Ti质粒是一种环状DNA分子,是存在于细菌细胞质中的DNA,具有双螺旋结构,C错误;可以用PCR技术检测外源DNA是否整合到植物的染色体DNA上,D正确。
7.(2026·山东泰安模拟)下列有关“DNA的粗提取与鉴定”和“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验的叙述,错误的是(　　)
A.DNA的粗提取与鉴定实验中可利用DNA不溶于酒精而某些蛋白质溶于酒精来粗提取DNA
B.PCR反应体系中需加入耐高温的DNA聚合酶,该酶可在延伸过程中起作用
C.琼脂糖溶液混合的核酸染料与DNA分子结合,便于在紫外灯下观察
D.DNA片段大的在琼脂糖溶液中扩散速度快,DNA片段小的在琼脂糖溶液中扩散速度慢
答案:D
解析:在DNA的粗提取与鉴定实验中,利用DNA不溶于酒精,而某些蛋白质溶于酒精的特性,能将DNA与蛋白质初步分离,从而粗提取 DNA,A正确;PCR反应需要经过高温变性、低温复性、中温延伸等过程,所以体系中需加入耐高温的DNA聚合酶,该酶在延伸过程中催化子链合成,B正确;琼脂糖溶液混合的核酸染料可与DNA分子结合,结合后在紫外灯下能被观察到,便于对DNA进行观察,C正确;在琼脂糖凝胶电泳中,DNA片段小的,受到的阻力小,在琼脂糖溶液中扩散速度快,DNA片段大的,受到的阻力大,扩散速度慢,D错误。
8.(2026·广东潮州模拟)探针技术可以用来筛选目的基因。研究人员根据目的基因的一部分DNA序列,可以设计一个DNA单链探针。DNA单链探针作用原理如图所示。下列说法错误的是(　　)
A.DNA探针与目的基因某条链的部分碱基序列相同
B.若DNA样本具有目的基因,该DNA只有一条链能与探针结合
C.探针与目的基因的基本组成单位都是脱氧核苷酸
D.若该DNA探针与被测生物的mRNA未形成杂合双链,不能说明该生物不含目的基因
答案:C
解析:DNA样本的两条链是碱基互补配对的,由图示中c可知,DNA探针可以与DNA样本中一条链发生碱基互补配对,可推知DNA探针与目的基因的另一条链的部分碱基序列相同,A正确;由于DNA样本的两条链是碱基互补配对的,DNA探针通过碱基互补配对发生分子杂交与目的基因结合,所以若DNA样本具有目的基因,该DNA只有一条链能与探针结合,B正确;探针是一段带有检测标记且顺序已知的与目的基因互补的核酸序列(DNA或RNA),其基本组成单位是脱氧核苷酸或核糖核苷酸,C错误;mRNA是以DNA的一条链为模板转录而成的,而DNA探针可与DNA样本中一条链发生碱基互补配对,若该DNA探针与被测生物的mRNA未形成杂合双链,不能说明该生物不含目的基因,D正确。
9.如图表示利用基因工程技术培育抗除草剂作物的部分过程,其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ为四种限制酶,且切割DNA分子后形成的末端均不同。下列说法正确的是(　　)
A.图示质粒分子在SmaⅠ切割前、后分别含有0、1个游离的磷酸基团
B.培育抗除草剂作物的核心是将含bar基因的表达载体导入受体细胞
C.可选用PstⅠ和EcoRⅠ切割质粒和bar基因,确保目的基因正确插入
D.利用PCR技术可从分子水平检测bar基因是否翻译出抗除草剂蛋白
答案:C
解析:质粒为环状DNA,在SmaⅠ切割前含有0个游离的磷酸基团,SmaⅠ切割后形成线性DNA,含2个游离的磷酸基团,A错误;基因工程的核心是构建基因表达载体,B错误;选用PstⅠ和EcoRⅠ切割可避免质粒自身环化和目的基因反向连接,C正确;PCR检测目的基因是否导入及转录,抗原—抗体杂交检测目的基因是否翻译,D错误。
10.(2026·广东深圳模拟)土壤农杆菌天然Ti质粒的结构如图所示。植物受伤后会释放酚类物质,可激活农杆菌vir基因,其中vir基因是一组基因,可编码virA、virB、virC等一系列对T-DNA转移及整合必不可少的蛋白质;冠瘿碱为农杆菌提供碳源和氮源,可诱导植物产生瘤状结构。Ti质粒需经过改造才能广泛应用于植物基因工程,下列对于Ti质粒功能及改造过程的推断,不合理的是(　　)
A.农杆菌中的Ti质粒作为遗传物质,侵染植物细胞时并不是整个Ti质粒进行转移
B.当农杆菌附着在植物细胞表面后,Ti质粒vir基因便会被激活和表达,从而发挥作用
C.冠瘿碱合成基因只能在宿主植物体内表达,表达产物会被农杆菌利用
D.需要在T-DNA区域和T-DNA之外的区域加上不同的标记基因,为便于后续筛选
答案:B
解析:农杆菌侵染植物时,仅Ti质粒中的T-DNA区域转移并整合到植物染色体,并非整个质粒转移,A不符合题意;vir基因的激活需要植物受伤释放酚类物质,而非农杆菌附着在植物细胞表面就会激活,B符合题意;冠瘿碱合成基因在T-DNA区域,转移并整合到植物染色体上后,只能在植物体内表达,可诱导植物产生瘤状结构,其表达产物可为农杆菌提供碳源和氮源,会被农杆菌利用,C不符合题意;需要在T-DNA区域和T-DNA之外的区域加上不同的标记基因,T-DNA区域加标记基因,筛选出T-DNA整合到植物染色体上的细胞,T-DNA之外的区域加上不同的标记基因,在重组Ti质粒构建时,筛选成功导入质粒的农杆菌,D不符合题意。
11.(2026·广东惠州模拟)目的基因和载体如果用同一种限制酶处理,连接时会出现正反接的情况,为鉴定筛选出的表达载体中是否含有正确插入目的基因的重组质粒,拟设计引物进行PCR后,结合电泳技术鉴定,图示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置,其中目的基因为长度300 bp的片段。下列说法错误的是(　　)
A.PCR复性温度不宜过高或过低,过高引物与模板链不易结合,过低会导致非特异性结合
B.电泳条带迁移的位置和速率与DNA分子的大小、带电量和构象有关
C.选取引物甲、丙,扩增出450 bp长度片段时,可说明目的基因正接
D.选取引物甲、乙,扩增出400 bp长度片段时,可以说明目的基因反接
答案:C
解析:复性是在高温解旋后降低温度让引物与模板链结合的环节,复性温度不宜太低,避免引物错配和模板链形成双链,即过低会导致非特异性结合,而复性的温度过高会导致引物与模板链不易结合,A正确;电泳条带迁移的位置和速率与DNA分子的大小、带电量和构象有关,如电泳一段时间后,较大的DNA分子迁移距离小,离加样孔近,而较小的DNA分子迁移距离大,离加样孔远,B正确;根据题意可知,目的基因为长度300 bp的片段,若选取引物甲、丙扩增,由于引物甲、丙并不与目的基因的部分碱基序列互补配对,因此无论目的基因是正接还是反接,都会扩增出50+300+100=450 bp的片段,因此选取引物甲、丙,扩增出450 bp长度片段时,不能说明目的基因正接,C错误;引物乙与目的基因的部分碱基互补配对,引物甲与非目的基因的片段发生碱基互补配对,若目的基因如图中正接,则引物甲和乙与同一模板链互补,不能扩增出片段,若目的基因反接,则引物甲和乙与DNA中不同的模板链发生碱基互补,扩增出引物乙和甲中间的DNA片段,因此选取引物甲、乙,扩增出400 bp长度片段时,可以说明目的基因反接,D正确。
12.(2026·四川成都模拟)研究人员将PCR扩增得到的毒物诱导型启动子S(箭头表示转录方向)插入图中载体P区,构建表达载体,转入大肠杆菌,获得能够检测水中毒物的大肠杆菌。下列叙述正确的是(　　)
A.PCR扩增时,应在启动子两侧引入EcoRⅠ、BamHⅠ识别序列
B.用Mg2+处理大肠杆菌以便转入构建好的表达载体
C.可通过转基因大肠杆菌的荧光情况判断水中是否含有毒物
D.在添加氨苄青霉素的培养基上存活的菌株即为所需菌株
答案:C
解析:据图可知,目的基因中存在SmaⅠ和EcoRⅠ两种酶的识别序列,若用这两种酶会破坏目的基因,因此为防止目的基因和质粒自身环化和反向连接,应该用XhoⅠ、BamHⅠ切割,因此PCR扩增启动子S时,图中引物Ⅰ、Ⅱ应分别加入XhoⅠ、BamHⅠ的识别序列,A错误;用Ca2+处理大肠杆菌,会使其处于易于吸收周围环境中DNA分子的状态,便于转入构建好的表达载体,B错误;若水中含有毒物,启动子启动绿色荧光蛋白基因的表达,因此可通过转基因大肠杆菌的荧光情况判断水中是否含有毒物,C正确;氨苄青霉素抗性基因是标记基因,可使用添加氨苄青霉素的培养基筛选转入重组质粒的菌株,在添加氨苄青霉素的培养基上存活的菌株不一定为所需菌株,也可能是导入了空质粒的菌株,D错误。
13.(2026·湖北武汉模拟)研究者分别选取小麦感病品系和抗病品系的叶片,对候选染色体1和2上的相关基因进行PCR 扩增,泳道1、2分别对应染色体1、2相关基因PCR产物,结果如图1所示。DNA序列分析发现抗病基因的出现是感病基因缺失一部分碱基序列造成的,图2 为感病基因序列示意图。下列分析错误的是(　　)
A.在PCR 扩增时,所用引物越短,引物特异性越低
B.两个PCR产物分子量接近时适当延长电泳时间,凝胶中这两个条带距离会变大
C.推测抗病品系抗病性状出现的根本原因是染色体2上感病基因发生突变
D.推测图1中泳道2的条带是选用引物1和引物2进行PCR扩增后的电泳结果
答案:D
解析:PCR技术中,引物是与模板DNA特定序列结合的短单链核酸。引物越短,能与之互补结合的DNA序列就越多,特异性就越低;反之,引物越长,特异性越高,A正确。电泳时,DNA分子在凝胶中因分子量差异而分离。分子量接近的DNA分子,在电场中移动速率相近,适当延长电泳时间,会让这种速率差异带来的位移差更明显,两个条带的距离就会变大,B正确。据题意可知,抗病基因的出现是感病基因缺失一部分碱基序列造成的,碱基序列发生改变属于基因突变。再结合图1,抗病品系染色体2对应的电泳结果与感病品系不同,推测抗病品系抗病性状出现的根本原因是染色体2上感病基因发生突变,C正确。图1中泳道2,感病品系有条带,抗病品系无条带,根据题意可知抗病基因的出现是感病基因缺失一部分碱基序列造成的,引物3和缺失片段互补,因此推测图1中泳道2的条带是选用引物1和引物3进行PCR扩增后的电泳结果,D错误。
14.(2025·福建卷,20)为建立一种效率高、毒性小的基因敲除系统,将图1所示的质粒1和质粒2导入大肠杆菌,质粒2中的sgRNA基因依据目的基因设计,其转录的短链RNA通过与目的基因碱基互补配对,与Cas9蛋白共同作用,敲除大肠杆菌基因组中的目的基因。
回答下列问题。
(1)大肠杆菌LacZ基因的表达产物可催化X-gal生成蓝色物质从而使菌落呈现蓝色,否则菌落为白色。将质粒1与含LacZ基因相应sgRNA基因的质粒2同时转化到大肠杆菌中,涂布到含抗生素　　　　　　　　　　的平板(含有X-gal)上进行培养。若长出的是　　　色菌落则为LacZ基因被敲除的大肠杆菌。
(2)Cas9基因的表达量会影响敲除效率,但其过量表达会对大肠杆菌有毒。为评估毒性和敲除效率,用5种启动子(A、B、C、D和E)启动Cas9的转录,相应检测结果如图2所示。结果表明,启动子　　　对细胞毒性最小;综合考量毒性和敲除效率,应选用启动子　　　用于该系统。
(3)含有质粒的大肠杆菌在无抗生素选择压力下培养,少数子代细胞会丢失质粒。结合质粒1和质粒2的特点,在成功敲除LacZ基因的大肠杆菌中消除质粒1和质粒2,实验流程如图3所示。
①培养12小时后,图3试管1中大部分的大肠杆菌　　　　(填字母)。
A.含质粒1和质粒2　　　　 B.只含质粒1
C.只含质粒2 D.无质粒1和质粒2
②若要从图3平板上筛出质粒1和质粒2均被消除的大肠杆菌,简要写出实验思路和预期结果: 　 。
答案:(1)卡那霉素和四环素　白
(2)C　A
(3)①B　②将同一菌落的大肠杆菌分别用含卡那霉素和四环素培养基进行培养,两者均不生长则为筛出的大肠杆菌
解析:(1)质粒2中含有与LacZ基因对应的sgRNA基因,其转录出来的短链RNA与目的基因(LacZ基因)发生碱基互补配对,使其不能表达,从而不能使X-gal分解产生蓝色物质。将质粒1和质粒2导入大肠杆菌,在含四环素和卡那霉素且含X-gal的培养基中,筛选白色的菌落即为LacZ基因成功敲除的菌落。
(2)Cas9基因的表达量过高会对大肠杆菌产生毒性,使其数量减少,结合图示可知,启动子C对应的菌落数最多,因此启动子C对细胞毒性最小。结合菌落数和敲除率可知,启动子A的菌落数和敲除率均较高,因此综合考虑,应选择启动子A用于该系统。
(3)①质粒2为温度敏感型质粒,在37 ℃下不能进行复制,培养12小时后,试管1中大部分的大肠杆菌只含质粒1,B正确。
②为进一步筛选质粒1和质粒2均消除成功的大肠杆菌,可将同一菌落的大肠杆菌分别用含卡那霉素和四环素培养基进行培养,在无抗生素平板上可以生长,在含抗生素平板上均不生长的则为筛出的大肠杆菌。
15.(2026·广东广州模拟)水体中的雌激素能使斑马鱼细胞产生E蛋白,激活卵黄蛋白原(vtg)基因(如图1所示)的表达,因此斑马鱼可用于监测环境雌激素污染程度。为了实现可视化监测,科学家将斑马鱼的vtg基因与人工构建的含萤火虫荧光素酶基因(无启动子)的载体(如图2所示)连接,形成vtg-Luc基因重组载体,成功培育了转基因斑马鱼。图2中Luc表示萤火虫荧光素酶基因,可以催化荧光素氧化产生荧光;AmpR为氨苄青霉素抗性基因,TetR表示四环素抗性基因,BamHⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ、BsrGⅠ为限制酶,→表示转录方向。回答下列问题。
(1)基因vtg启动子的基本组成单位是　　　　　。选用限制酶EcoRⅠ、HindⅢ双酶切Luc基因载体,其优点是　 　 。
(2)为使vtg基因与Luc基因载体形成重组载体,通过PCR技术扩增vtg基因时,需设计合适的引物。依据图1、图2信息推测引物1包含的碱基序列为5'-　　　　　　　　　　-3'。
(3)筛选导入vtg-Luc基因重组载体的大肠杆菌,可将大肠杆菌依次接种在含
(填“氨苄青霉素”“四环素”或“氨苄青霉素和四环素”)的培养基中,为确定这两个基因是否在大肠杆菌体内转录,应检测 　 。
(4)利用　　　　　　　　方法将vtg-Luc基因重组载体导入斑马鱼。若要判断斑马鱼转基因是否成功,可在水体中添加　　　　　　进行检测。
答案:(1)脱氧核苷酸　防止目的基因、质粒自身环化或质粒与目的基因反向连接
(2)GAATTCAACTAT
(3)氨苄青霉素和四环素　vtg基因和Luc基因的mRNA
(4)显微注射技术　雌激素和荧光素
解析:(1)基因vtg启动子是一段DNA序列,其基本组成单位是脱氧核苷酸。选用限制酶EcoRⅠ、HindⅢ双酶切Luc基因载体,可以防止目的基因、质粒自身环化或质粒与目的基因反向连接,从而实现质粒与目的基因正向连接。
(2)综合分析图1、图2,vtg基因的启动子端应与EcoRⅠ的识别位点端连接,含有EcoRⅠ的识别序列,且含有能与相应模板链碱基互补配对的碱基序列,故引物1的碱基序列为5'-GAATTCAACTAT-3'。
(3)分析图2,质粒上有氨苄青霉素和四环素的抗性基因作为标记基因,导入vtg基因成功的质粒,TetR基因被破坏,故可将大肠杆菌依次接种在含氨苄青霉素和四环素的培养基中,则在氨苄青霉素培养基上存活,在四环素培养基上不存活的大肠杆菌为导入vtg-Luc基因重组载体的大肠杆菌。转录的产物是RNA,为确定这两个基因是否在大肠杆菌体内转录,应检测vtg基因和Luc基因的mRNA。
(4)将目的基因导入动物细胞最常用的方法是显微注射技术,故可利用显微注射技术将vtg-Luc基因重组载体导入斑马鱼。结合题意,水体中的雌激素能使斑马鱼细胞产生E蛋白,激活卵黄蛋白原(vtg)基因的表达,且Luc为萤火虫荧光素酶基因,可以催化荧光素氧化产生荧光,故可在水体中添加雌激素和荧光素判断斑马鱼转基因是否成功。1.(2026·河南安阳模拟)下列关于基因工程基本工具的叙述,正确的是(　　)
A.限制酶只能特异性地识别6个核苷酸序列
B.限制酶切割DNA分子一次可断开2个磷酸二酯键,产生2个游离的磷酸基团
C.用做分子运输车的质粒常有特殊的抗生素合成基因,便于重组DNA分子的筛选
D.DNA连接酶能连接双链DNA片段互补的黏性末端或平末端,从而恢复被限制酶切开的氢键
答案:B
解析:大多数限制酶能特异性地识别6个核苷酸序列,A错误;限制酶切割双链DNA时,会在两条链上各断开一个磷酸二酯键,共断开2个,每个切口产生1个游离的磷酸基团,总计2个,B正确;质粒作为载体需携带标记基因(即抗生素抗性基因),而非抗生素合成基因,C错误;DNA连接酶的作用是连接磷酸二酯键,而非恢复氢键,D错误。
2.(2026·河北廊坊月考)下列关于基因工程的叙述,正确的是(　　)
A.基因工程是在细胞水平上进行设计和施工的,又叫重组DNA技术
B.DNA连接酶和DNA聚合酶催化的化学键分别是磷酸二酯键和氢键
C.不同的限制酶切割不同的DNA序列后一定产生不同的黏性末端
D.质粒是一种裸露的、结构简单的具有自我复制能力的环状DNA分子
答案:D
解析:基因工程是在分子水平上进行设计和施工的,而非细胞水平,A错误;DNA连接酶和DNA聚合酶均催化磷酸二酯键的形成,而氢键的断裂或形成由解旋酶或DNA自身结构决定,B错误;不同限制酶可能切割产生相同的黏性末端(如同尾酶),C错误;质粒是存在于细菌等细胞中的环状双链DNA,结构简单且能自主复制,D正确。
3.下列关于DNA聚合酶、限制酶、DNA连接酶有关的叙述,错误的是(　　)
A.都是由脱氧核苷酸连接而成的多聚体
B.都能降低相应化学反应所需的活化能
C.催化活性都要受温度、pH等的影响
D.其合成过程都需经过转录和翻译阶段
答案:A
解析:DNA聚合酶、限制酶、DNA连接酶的化学本质都是蛋白质,都是由氨基酸连接而成的多聚体,A错误;酶能降低化学反应所需的活化能,因此这三种酶都能降低相关化学反应所需的活化能,B正确;酶的作用条件较温和,温度、pH等都会影响酶活性,故这三种酶的作用过程都要受温度、pH等的影响,C正确;这三种酶的化学本质都是蛋白质,蛋白质的合成需经过转录和翻译阶段,D正确。
4.(2026·贵州安顺月考)将外源基因导入受体细胞的过程中需要使用载体,下列有关载体的叙述,错误的是(　　)
A.载体应对宿主细胞无伤害,以免影响宿主细胞的正常生命活动
B.载体应具有一个至多个限制酶切割位点,以便于目的基因的插入
C.基因工程中被用作载体的质粒都是在天然质粒的基础上改造的
D.将外源基因送入受体细胞的载体可以是切割DNA分子的酶
答案:D
解析:载体需和目的基因一起进入宿主细胞并与其共存,因此载体应对宿主细胞无伤害,以免影响宿主细胞的正常生命活动,A正确;载体应具有一个至多个限制酶切割位点,以便与目的基因拼接形成重组载体,B正确;天然的质粒往往存在不足,基因工程中用到的质粒都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的,C正确;切割DNA分子的酶为限制酶,是基因工程的工具之一,不是载体,D错误。
5.(2026·湖南邵阳模拟)将某外源基因与质粒结合形成重组质粒的过程如图。下列说法错误的是(　　)
A.氨苄青霉素抗性基因可作为筛选重组DNA的标记基因
B.用不同限制酶分别切割含目的基因的DNA 和质粒也能产生相同的黏性末端
C.构建重组质粒时,除了需BamHⅠ酶外,还需 DNA 连接酶
D.图中方法可保证目的基因定向与质粒相连形成重组质粒
答案:D
解析:氨苄青霉素抗性基因是质粒上的标记基因,可用于筛选含有重组DNA的受体细胞,A正确;不同的限制酶识别不同的核苷酸序列,但可能由于识别序列部分相同,切割后产生相同的黏性末端,B正确;构建重组质粒时,首先要用BamHⅠ酶切割质粒和含目的基因的DNA,产生相同的黏性末端,然后再用DNA连接酶将目的基因和质粒连接起来,C正确;仅用BamHⅠ一种限制酶切割,目的基因和质粒都可能会发生自身环化,或者目的基因与质粒反向连接,不能保证目的基因定向与质粒相连形成重组质粒,D错误。
6.(2026·河北秦皇岛模拟)土壤农杆菌侵染植物细胞时,Ti质粒上的T-DNA片段转入植物的基因组。利用农杆菌以Ti质粒作为载体进行转基因,下列相关叙述正确的是(　　)
A.目的基因应插入T-DNA片段外,以防止破坏T-DNA
B.用Ca2+处理农杆菌,以利于其侵染植物细胞
C.Ti质粒是一种环状DNA分子,没有双螺旋结构
D.可以用PCR技术检测外源DNA是否整合到植物的染色体DNA上
答案:D
解析:在农杆菌转化法中,需要将目的基因插入T-DNA片段上,有利于介导外源DNA整合到植物的染色体DNA上,A错误;农杆菌侵染植物细胞不需要用Ca2+处理,B错误;Ti质粒是一种环状DNA分子,是存在于细菌细胞质中的DNA,具有双螺旋结构,C错误;可以用PCR技术检测外源DNA是否整合到植物的染色体DNA上,D正确。
7.(2026·山东泰安模拟)下列有关“DNA的粗提取与鉴定”和“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验的叙述,错误的是(　　)
A.DNA的粗提取与鉴定实验中可利用DNA不溶于酒精而某些蛋白质溶于酒精来粗提取DNA
B.PCR反应体系中需加入耐高温的DNA聚合酶,该酶可在延伸过程中起作用
C.琼脂糖溶液混合的核酸染料与DNA分子结合,便于在紫外灯下观察
D.DNA片段大的在琼脂糖溶液中扩散速度快,DNA片段小的在琼脂糖溶液中扩散速度慢
答案:D
解析:在DNA的粗提取与鉴定实验中,利用DNA不溶于酒精,而某些蛋白质溶于酒精的特性,能将DNA与蛋白质初步分离,从而粗提取 DNA,A正确;PCR反应需要经过高温变性、低温复性、中温延伸等过程,所以体系中需加入耐高温的DNA聚合酶,该酶在延伸过程中催化子链合成,B正确;琼脂糖溶液混合的核酸染料可与DNA分子结合,结合后在紫外灯下能被观察到,便于对DNA进行观察,C正确;在琼脂糖凝胶电泳中,DNA片段小的,受到的阻力小,在琼脂糖溶液中扩散速度快,DNA片段大的,受到的阻力大,扩散速度慢,D错误。
8.(2026·广东潮州模拟)探针技术可以用来筛选目的基因。研究人员根据目的基因的一部分DNA序列,可以设计一个DNA单链探针。DNA单链探针作用原理如图所示。下列说法错误的是(　　)
A.DNA探针与目的基因某条链的部分碱基序列相同
B.若DNA样本具有目的基因,该DNA只有一条链能与探针结合
C.探针与目的基因的基本组成单位都是脱氧核苷酸
D.若该DNA探针与被测生物的mRNA未形成杂合双链,不能说明该生物不含目的基因
答案:C
解析:DNA样本的两条链是碱基互补配对的,由图示中c可知,DNA探针可以与DNA样本中一条链发生碱基互补配对,可推知DNA探针与目的基因的另一条链的部分碱基序列相同,A正确;由于DNA样本的两条链是碱基互补配对的,DNA探针通过碱基互补配对发生分子杂交与目的基因结合,所以若DNA样本具有目的基因,该DNA只有一条链能与探针结合,B正确;探针是一段带有检测标记且顺序已知的与目的基因互补的核酸序列(DNA或RNA),其基本组成单位是脱氧核苷酸或核糖核苷酸,C错误;mRNA是以DNA的一条链为模板转录而成的,而DNA探针可与DNA样本中一条链发生碱基互补配对,若该DNA探针与被测生物的mRNA未形成杂合双链,不能说明该生物不含目的基因,D正确。
9.如图表示利用基因工程技术培育抗除草剂作物的部分过程,其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ为四种限制酶,且切割DNA分子后形成的末端均不同。下列说法正确的是(　　)
A.图示质粒分子在SmaⅠ切割前、后分别含有0、1个游离的磷酸基团
B.培育抗除草剂作物的核心是将含bar基因的表达载体导入受体细胞
C.可选用PstⅠ和EcoRⅠ切割质粒和bar基因,确保目的基因正确插入
D.利用PCR技术可从分子水平检测bar基因是否翻译出抗除草剂蛋白
答案:C
解析:质粒为环状DNA,在SmaⅠ切割前含有0个游离的磷酸基团,SmaⅠ切割后形成线性DNA,含2个游离的磷酸基团,A错误;基因工程的核心是构建基因表达载体,B错误;选用PstⅠ和EcoRⅠ切割可避免质粒自身环化和目的基因反向连接,C正确;PCR检测目的基因是否导入及转录,抗原—抗体杂交检测目的基因是否翻译,D错误。
10.(2026·广东深圳模拟)土壤农杆菌天然Ti质粒的结构如图所示。植物受伤后会释放酚类物质,可激活农杆菌vir基因,其中vir基因是一组基因,可编码virA、virB、virC等一系列对T-DNA转移及整合必不可少的蛋白质;冠瘿碱为农杆菌提供碳源和氮源,可诱导植物产生瘤状结构。Ti质粒需经过改造才能广泛应用于植物基因工程,下列对于Ti质粒功能及改造过程的推断,不合理的是(　　)
A.农杆菌中的Ti质粒作为遗传物质,侵染植物细胞时并不是整个Ti质粒进行转移
B.当农杆菌附着在植物细胞表面后,Ti质粒vir基因便会被激活和表达,从而发挥作用
C.冠瘿碱合成基因只能在宿主植物体内表达,表达产物会被农杆菌利用
D.需要在T-DNA区域和T-DNA之外的区域加上不同的标记基因,为便于后续筛选
答案:B
解析:农杆菌侵染植物时,仅Ti质粒中的T-DNA区域转移并整合到植物染色体,并非整个质粒转移,A不符合题意;vir基因的激活需要植物受伤释放酚类物质,而非农杆菌附着在植物细胞表面就会激活,B符合题意;冠瘿碱合成基因在T-DNA区域,转移并整合到植物染色体上后,只能在植物体内表达,可诱导植物产生瘤状结构,其表达产物可为农杆菌提供碳源和氮源,会被农杆菌利用,C不符合题意;需要在T-DNA区域和T-DNA之外的区域加上不同的标记基因,T-DNA区域加标记基因,筛选出T-DNA整合到植物染色体上的细胞,T-DNA之外的区域加上不同的标记基因,在重组Ti质粒构建时,筛选成功导入质粒的农杆菌,D不符合题意。
11.(2026·广东惠州模拟)目的基因和载体如果用同一种限制酶处理,连接时会出现正反接的情况,为鉴定筛选出的表达载体中是否含有正确插入目的基因的重组质粒,拟设计引物进行PCR后,结合电泳技术鉴定,图示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置,其中目的基因为长度300 bp的片段。下列说法错误的是(　　)
A.PCR复性温度不宜过高或过低,过高引物与模板链不易结合,过低会导致非特异性结合
B.电泳条带迁移的位置和速率与DNA分子的大小、带电量和构象有关
C.选取引物甲、丙,扩增出450 bp长度片段时,可说明目的基因正接
D.选取引物甲、乙,扩增出400 bp长度片段时,可以说明目的基因反接
答案:C
解析:复性是在高温解旋后降低温度让引物与模板链结合的环节,复性温度不宜太低,避免引物错配和模板链形成双链,即过低会导致非特异性结合,而复性的温度过高会导致引物与模板链不易结合,A正确;电泳条带迁移的位置和速率与DNA分子的大小、带电量和构象有关,如电泳一段时间后,较大的DNA分子迁移距离小,离加样孔近,而较小的DNA分子迁移距离大,离加样孔远,B正确;根据题意可知,目的基因为长度300 bp的片段,若选取引物甲、丙扩增,由于引物甲、丙并不与目的基因的部分碱基序列互补配对,因此无论目的基因是正接还是反接,都会扩增出50+300+100=450 bp的片段,因此选取引物甲、丙,扩增出450 bp长度片段时,不能说明目的基因正接,C错误;引物乙与目的基因的部分碱基互补配对,引物甲与非目的基因的片段发生碱基互补配对,若目的基因如图中正接,则引物甲和乙与同一模板链互补,不能扩增出片段,若目的基因反接,则引物甲和乙与DNA中不同的模板链发生碱基互补,扩增出引物乙和甲中间的DNA片段,因此选取引物甲、乙,扩增出400 bp长度片段时,可以说明目的基因反接,D正确。
12.(2026·四川成都模拟)研究人员将PCR扩增得到的毒物诱导型启动子S(箭头表示转录方向)插入图中载体P区,构建表达载体,转入大肠杆菌,获得能够检测水中毒物的大肠杆菌。下列叙述正确的是(　　)
A.PCR扩增时,应在启动子两侧引入EcoRⅠ、BamHⅠ识别序列
B.用Mg2+处理大肠杆菌以便转入构建好的表达载体
C.可通过转基因大肠杆菌的荧光情况判断水中是否含有毒物
D.在添加氨苄青霉素的培养基上存活的菌株即为所需菌株
答案:C
解析:据图可知,目的基因中存在SmaⅠ和EcoRⅠ两种酶的识别序列,若用这两种酶会破坏目的基因,因此为防止目的基因和质粒自身环化和反向连接,应该用XhoⅠ、BamHⅠ切割,因此PCR扩增启动子S时,图中引物Ⅰ、Ⅱ应分别加入XhoⅠ、BamHⅠ的识别序列,A错误;用Ca2+处理大肠杆菌,会使其处于易于吸收周围环境中DNA分子的状态,便于转入构建好的表达载体,B错误;若水中含有毒物,启动子启动绿色荧光蛋白基因的表达,因此可通过转基因大肠杆菌的荧光情况判断水中是否含有毒物,C正确;氨苄青霉素抗性基因是标记基因,可使用添加氨苄青霉素的培养基筛选转入重组质粒的菌株,在添加氨苄青霉素的培养基上存活的菌株不一定为所需菌株,也可能是导入了空质粒的菌株,D错误。
13.(2026·湖北武汉模拟)研究者分别选取小麦感病品系和抗病品系的叶片,对候选染色体1和2上的相关基因进行PCR 扩增,泳道1、2分别对应染色体1、2相关基因PCR产物,结果如图1所示。DNA序列分析发现抗病基因的出现是感病基因缺失一部分碱基序列造成的,图2 为感病基因序列示意图。下列分析错误的是(　　)
A.在PCR 扩增时,所用引物越短,引物特异性越低
B.两个PCR产物分子量接近时适当延长电泳时间,凝胶中这两个条带距离会变大
C.推测抗病品系抗病性状出现的根本原因是染色体2上感病基因发生突变
D.推测图1中泳道2的条带是选用引物1和引物2进行PCR扩增后的电泳结果
答案:D
解析:PCR技术中,引物是与模板DNA特定序列结合的短单链核酸。引物越短,能与之互补结合的DNA序列就越多,特异性就越低;反之,引物越长,特异性越高,A正确。电泳时,DNA分子在凝胶中因分子量差异而分离。分子量接近的DNA分子,在电场中移动速率相近,适当延长电泳时间,会让这种速率差异带来的位移差更明显,两个条带的距离就会变大,B正确。据题意可知,抗病基因的出现是感病基因缺失一部分碱基序列造成的,碱基序列发生改变属于基因突变。再结合图1,抗病品系染色体2对应的电泳结果与感病品系不同,推测抗病品系抗病性状出现的根本原因是染色体2上感病基因发生突变,C正确。图1中泳道2,感病品系有条带,抗病品系无条带,根据题意可知抗病基因的出现是感病基因缺失一部分碱基序列造成的,引物3和缺失片段互补,因此推测图1中泳道2的条带是选用引物1和引物3进行PCR扩增后的电泳结果,D错误。
14.(2025·福建卷,20)为建立一种效率高、毒性小的基因敲除系统,将图1所示的质粒1和质粒2导入大肠杆菌,质粒2中的sgRNA基因依据目的基因设计,其转录的短链RNA通过与目的基因碱基互补配对,与Cas9蛋白共同作用,敲除大肠杆菌基因组中的目的基因。
回答下列问题。
(1)大肠杆菌LacZ基因的表达产物可催化X-gal生成蓝色物质从而使菌落呈现蓝色,否则菌落为白色。将质粒1与含LacZ基因相应sgRNA基因的质粒2同时转化到大肠杆菌中,涂布到含抗生素　　　　　　　　　　的平板(含有X-gal)上进行培养。若长出的是　　　色菌落则为LacZ基因被敲除的大肠杆菌。
(2)Cas9基因的表达量会影响敲除效率,但其过量表达会对大肠杆菌有毒。为评估毒性和敲除效率,用5种启动子(A、B、C、D和E)启动Cas9的转录,相应检测结果如图2所示。结果表明,启动子　　　对细胞毒性最小;综合考量毒性和敲除效率,应选用启动子　　　用于该系统。
(3)含有质粒的大肠杆菌在无抗生素选择压力下培养,少数子代细胞会丢失质粒。结合质粒1和质粒2的特点,在成功敲除LacZ基因的大肠杆菌中消除质粒1和质粒2,实验流程如图3所示。
①培养12小时后,图3试管1中大部分的大肠杆菌　　　　(填字母)。
A.含质粒1和质粒2　　　　 B.只含质粒1
C.只含质粒2 D.无质粒1和质粒2
②若要从图3平板上筛出质粒1和质粒2均被消除的大肠杆菌,简要写出实验思路和预期结果: 　 。
答案:(1)卡那霉素和四环素　白
(2)C　A
(3)①B　②将同一菌落的大肠杆菌分别用含卡那霉素和四环素培养基进行培养,两者均不生长则为筛出的大肠杆菌
解析:(1)质粒2中含有与LacZ基因对应的sgRNA基因,其转录出来的短链RNA与目的基因(LacZ基因)发生碱基互补配对,使其不能表达,从而不能使X-gal分解产生蓝色物质。将质粒1和质粒2导入大肠杆菌,在含四环素和卡那霉素且含X-gal的培养基中,筛选白色的菌落即为LacZ基因成功敲除的菌落。
(2)Cas9基因的表达量过高会对大肠杆菌产生毒性,使其数量减少,结合图示可知,启动子C对应的菌落数最多,因此启动子C对细胞毒性最小。结合菌落数和敲除率可知,启动子A的菌落数和敲除率均较高,因此综合考虑,应选择启动子A用于该系统。
(3)①质粒2为温度敏感型质粒,在37 ℃下不能进行复制,培养12小时后,试管1中大部分的大肠杆菌只含质粒1,B正确。
②为进一步筛选质粒1和质粒2均消除成功的大肠杆菌,可将同一菌落的大肠杆菌分别用含卡那霉素和四环素培养基进行培养,在无抗生素平板上可以生长,在含抗生素平板上均不生长的则为筛出的大肠杆菌。
15.(2026·广东广州模拟)水体中的雌激素能使斑马鱼细胞产生E蛋白,激活卵黄蛋白原(vtg)基因(如图1所示)的表达,因此斑马鱼可用于监测环境雌激素污染程度。为了实现可视化监测,科学家将斑马鱼的vtg基因与人工构建的含萤火虫荧光素酶基因(无启动子)的载体(如图2所示)连接,形成vtg-Luc基因重组载体,成功培育了转基因斑马鱼。图2中Luc表示萤火虫荧光素酶基因,可以催化荧光素氧化产生荧光;AmpR为氨苄青霉素抗性基因,TetR表示四环素抗性基因,BamHⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ、BsrGⅠ为限制酶,→表示转录方向。回答下列问题。
(1)基因vtg启动子的基本组成单位是　　　　　。选用限制酶EcoRⅠ、HindⅢ双酶切Luc基因载体,其优点是　 　 。
(2)为使vtg基因与Luc基因载体形成重组载体,通过PCR技术扩增vtg基因时,需设计合适的引物。依据图1、图2信息推测引物1包含的碱基序列为5'-　　　　　　　　　　-3'。
(3)筛选导入vtg-Luc基因重组载体的大肠杆菌,可将大肠杆菌依次接种在含
(填“氨苄青霉素”“四环素”或“氨苄青霉素和四环素”)的培养基中,为确定这两个基因是否在大肠杆菌体内转录,应检测 　 。
(4)利用　　　　　　　　方法将vtg-Luc基因重组载体导入斑马鱼。若要判断斑马鱼转基因是否成功,可在水体中添加　　　　　　进行检测。
答案:(1)脱氧核苷酸　防止目的基因、质粒自身环化或质粒与目的基因反向连接
(2)GAATTCAACTAT
(3)氨苄青霉素和四环素　vtg基因和Luc基因的mRNA
(4)显微注射技术　雌激素和荧光素
解析:(1)基因vtg启动子是一段DNA序列,其基本组成单位是脱氧核苷酸。选用限制酶EcoRⅠ、HindⅢ双酶切Luc基因载体,可以防止目的基因、质粒自身环化或质粒与目的基因反向连接,从而实现质粒与目的基因正向连接。
(2)综合分析图1、图2,vtg基因的启动子端应与EcoRⅠ的识别位点端连接,含有EcoRⅠ的识别序列,且含有能与相应模板链碱基互补配对的碱基序列,故引物1的碱基序列为5'-GAATTCAACTAT-3'。
(3)分析图2,质粒上有氨苄青霉素和四环素的抗性基因作为标记基因,导入vtg基因成功的质粒,TetR基因被破坏,故可将大肠杆菌依次接种在含氨苄青霉素和四环素的培养基中,则在氨苄青霉素培养基上存活,在四环素培养基上不存活的大肠杆菌为导入vtg-Luc基因重组载体的大肠杆菌。转录的产物是RNA,为确定这两个基因是否在大肠杆菌体内转录,应检测vtg基因和Luc基因的mRNA。
(4)将目的基因导入动物细胞最常用的方法是显微注射技术,故可利用显微注射技术将vtg-Luc基因重组载体导入斑马鱼。结合题意,水体中的雌激素能使斑马鱼细胞产生E蛋白,激活卵黄蛋白原(vtg)基因的表达,且Luc为萤火虫荧光素酶基因,可以催化荧光素氧化产生荧光,故可在水体中添加雌激素和荧光素判断斑马鱼转基因是否成功。(共42张PPT)
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1.(2026·河南安阳模拟)下列关于基因工程基本工具的叙述,正确的是(　　)
A.限制酶只能特异性地识别6个核苷酸序列
B.限制酶切割DNA分子一次可断开2个磷酸二酯键,产生2个游离的磷酸基团
C.用做分子运输车的质粒常有特殊的抗生素合成基因,便于重组DNA分子的筛选
D.DNA连接酶能连接双链DNA片段互补的黏性末端或平末端,从而恢复被限制酶切开的氢键
B
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解析:大多数限制酶能特异性地识别6个核苷酸序列,A错误;限制酶切割双链DNA时,会在两条链上各断开一个磷酸二酯键,共断开2个,每个切口产生1个游离的磷酸基团,总计2个,B正确;质粒作为载体需携带标记基因(即抗生素抗性基因),而非抗生素合成基因,C错误;DNA连接酶的作用是连接磷酸二酯键,而非恢复氢键,D错误。
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2.(2026·河北廊坊月考)下列关于基因工程的叙述,正确的是(　　)
A.基因工程是在细胞水平上进行设计和施工的,又叫重组DNA技术
B.DNA连接酶和DNA聚合酶催化的化学键分别是磷酸二酯键和氢键
C.不同的限制酶切割不同的DNA序列后一定产生不同的黏性末端
D.质粒是一种裸露的、结构简单的具有自我复制能力的环状DNA分子
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解析:基因工程是在分子水平上进行设计和施工的,而非细胞水平,A错误;DNA连接酶和DNA聚合酶均催化磷酸二酯键的形成,而氢键的断裂或形成由解旋酶或DNA自身结构决定,B错误;不同限制酶可能切割产生相同的黏性末端(如同尾酶),C错误;质粒是存在于细菌等细胞中的环状双链DNA,结构简单且能自主复制,D正确。
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3.下列关于DNA聚合酶、限制酶、DNA连接酶有关的叙述,错误的是(　　)
A.都是由脱氧核苷酸连接而成的多聚体
B.都能降低相应化学反应所需的活化能
C.催化活性都要受温度、pH等的影响
D.其合成过程都需经过转录和翻译阶段
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解析:DNA聚合酶、限制酶、DNA连接酶的化学本质都是蛋白质,都是由氨基酸连接而成的多聚体,A错误;酶能降低化学反应所需的活化能,因此这三种酶都能降低相关化学反应所需的活化能,B正确;酶的作用条件较温和,温度、pH等都会影响酶活性,故这三种酶的作用过程都要受温度、pH等的影响,C正确;这三种酶的化学本质都是蛋白质,蛋白质的合成需经过转录和翻译阶段,D正确。
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A.载体应对宿主细胞无伤害,以免影响宿主细胞的正常生命活动
B.载体应具有一个至多个限制酶切割位点,以便于目的基因的插入
C.基因工程中被用作载体的质粒都是在天然质粒的基础上改造的
D.将外源基因送入受体细胞的载体可以是切割DNA分子的酶
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解析:载体需和目的基因一起进入宿主细胞并与其共存,因此载体应对宿主细胞无伤害,以免影响宿主细胞的正常生命活动,A正确;载体应具有一个至多个限制酶切割位点,以便与目的基因拼接形成重组载体,B正确;天然的质粒往往存在不足,基因工程中用到的质粒都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的,C正确;切割DNA分子的酶为限制酶,是基因工程的工具之一,不是载体,D错误。
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5.(2026·湖南邵阳模拟)将某外源基因与质粒结合形成重组质粒的过程如图。下列说法错误的是(　　)
A.氨苄青霉素抗性基因可作为筛选重组DNA的标记基因
B.用不同限制酶分别切割含目的基因的DNA 和质粒也能产生相同的黏性末端
C.构建重组质粒时,除了需BamHⅠ酶外,还需 DNA 连接酶
D.图中方法可保证目的基因定向与质粒相连形成重组质粒
D
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解析:氨苄青霉素抗性基因是质粒上的标记基因,可用于筛选含有重组DNA的受体细胞,A正确;不同的限制酶识别不同的核苷酸序列,但可能由于识别序列部分相同,切割后产生相同的黏性末端,B正确;构建重组质粒时,首先要用BamHⅠ酶切割质粒和含目的基因的DNA,产生相同的黏性末端,然后再用DNA连接酶将目的基因和质粒连接起来,C正确;仅用BamHⅠ一种限制酶切割,目的基因和质粒都可能会发生自身环化,或者目的基因与质粒反向连接,不能保证目的基因定向与质粒相连形成重组质粒,D错误。
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6.(2026·河北秦皇岛模拟)土壤农杆菌侵染植物细胞时,Ti质粒上的T-DNA片段转入植物的基因组。利用农杆菌以Ti质粒作为载体进行转基因,下列相关叙述正确的是(　　)
A.目的基因应插入T-DNA片段外,以防止破坏T-DNA
B.用Ca2+处理农杆菌,以利于其侵染植物细胞
C.Ti质粒是一种环状DNA分子,没有双螺旋结构
D.可以用PCR技术检测外源DNA是否整合到植物的染色体DNA上
D
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解析:在农杆菌转化法中,需要将目的基因插入T-DNA片段上,有利于介导外源DNA整合到植物的染色体DNA上,A错误;农杆菌侵染植物细胞不需要用Ca2+处理,B错误;Ti质粒是一种环状DNA分子,是存在于细菌细胞质中的DNA,具有双螺旋结构,C错误;可以用PCR技术检测外源DNA是否整合到植物的染色体DNA上,D正确。
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7.(2026·山东泰安模拟)下列有关“DNA的粗提取与鉴定”和“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验的叙述,错误的是(　　)
A.DNA的粗提取与鉴定实验中可利用DNA不溶于酒精而某些蛋白质溶于酒精来粗提取DNA
B.PCR反应体系中需加入耐高温的DNA聚合酶,该酶可在延伸过程中起作用
C.琼脂糖溶液混合的核酸染料与DNA分子结合,便于在紫外灯下观察
D.DNA片段大的在琼脂糖溶液中扩散速度快,DNA片段小的在琼脂糖溶液中扩散速度慢
D
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解析:在DNA的粗提取与鉴定实验中,利用DNA不溶于酒精,而某些蛋白质溶于酒精的特性,能将DNA与蛋白质初步分离,从而粗提取 DNA,A正确;PCR反应需要经过高温变性、低温复性、中温延伸等过程,所以体系中需加入耐高温的DNA聚合酶,该酶在延伸过程中催化子链合成,B正确;琼脂糖溶液混合的核酸染料可与DNA分子结合,结合后在紫外灯下能被观察到,便于对DNA进行观察,C正确;在琼脂糖凝胶电泳中,DNA片段小的,受到的阻力小,在琼脂糖溶液中扩散速度快,DNA片段大的,受到的阻力大,扩散速度慢,D错误。
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8.(2026·广东潮州模拟)探针技术可以用来筛选目的基因。研究人员根据目的基因的一部分DNA序列,可以设计一个DNA单链探针。DNA单链探针作用原理如图所示。下列说法错误的是(　　)
A.DNA探针与目的基因某条链的部分碱基序列相同
B.若DNA样本具有目的基因,该DNA只有一条链能与探针结合
C.探针与目的基因的基本组成单位都是脱氧核苷酸
D.若该DNA探针与被测生物的mRNA未形成杂合双链,不能说明该生物不含目的基因
C
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解析:DNA样本的两条链是碱基互补配对的,由图示中c可知,DNA探针可以与DNA样本中一条链发生碱基互补配对,可推知DNA探针与目的基因的另一条链的部分碱基序列相同,A正确;由于DNA样本的两条链是碱基互补配对的,DNA探针通过碱基互补配对发生分子杂交与目的基因结合,所以若DNA样本具有目的基因,该DNA只有一条链能与探针结合,B正确;探针是一段带有检测标记且顺序已知的与目的基因互补的核酸序列(DNA或RNA),其基本组成单位是脱氧核苷酸或核糖核苷酸,C错误;mRNA是以DNA的一条链为模板转录而成的,而DNA探针可与DNA样本中一条链发生碱
基互补配对,若该DNA探针与被测生物的mRNA
未形成杂合双链,不能说明该生物不含目的基因,
D正确。
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9.如图表示利用基因工程技术培育抗除草剂作物的部分过程,其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ为四种限制酶,且切割DNA分子后形成的末端均不同。下列说法正确的是(　　)
A.图示质粒分子在SmaⅠ切割前、后分别含
有0、1个游离的磷酸基团
B.培育抗除草剂作物的核心是将含bar基因
的表达载体导入受体细胞
C.可选用PstⅠ和EcoRⅠ切割质粒和bar基因,确保目的基因正确插入
D.利用PCR技术可从分子水平检测bar基因是否翻译出抗除草剂蛋白
C
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解析:质粒为环状DNA,在SmaⅠ切割前含有0个游离的磷酸基团,SmaⅠ切割后形成线性DNA,含2个游离的磷酸基团,A错误;基因工程的核心是构建基因表达载体,B错误;选用PstⅠ和EcoRⅠ切割可避免质粒自身环化和目的基因反向连接,C正确;PCR检测目的基因是否导入及转录,抗原—抗体杂交检测目的基因是否翻译,D错误。
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10.(2026·广东深圳模拟)土壤农杆菌天然Ti质粒的结构如图所示。植物受伤后会释放酚类物质,可激活农杆菌vir基因,其中vir基因是一组基因,可编码virA、virB、virC等一系列对T-DNA转移及整合必不可少的蛋白质;冠瘿碱为农杆菌提供碳源和氮源,可诱导植物产生瘤状结构。Ti质粒需经过改造才能广泛应用于植物基因工程,下列对于Ti质粒功能及改造过程的推断,不合理的是(　　)
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A.农杆菌中的Ti质粒作为遗传物质,侵染植物细胞时并不是整个Ti质粒进行转移
B.当农杆菌附着在植物细胞表面后,Ti质粒vir基因便会被激活和表达,从而发挥作用
C.冠瘿碱合成基因只能在宿主植物体内表达,表达产物会被农杆菌利用
D.需要在T-DNA区域和T-DNA之外的区域加上不同的标记基因,为便于后续筛选
答案:B
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解析:农杆菌侵染植物时,仅Ti质粒中的T-DNA区域转移并整合到植物染色体,并非整个质粒转移,A不符合题意;vir基因的激活需要植物受伤释放酚类物质,而非农杆菌附着在植物细胞表面就会激活,B符合题意;冠瘿碱合成基因在T-DNA区域,转移并整合到植物染色体上后,只能在植物体内表达,可诱导植物产生瘤状结构,其表达产物可为农杆菌提供碳源和氮源,会被农杆菌利用,C不符合题意;需要在T-DNA区域和T-DNA之外的区域加上不同的标记基因,T-DNA区域加标记基因,筛选出T-DNA整合到植物染色体上的细胞,T-DNA
之外的区域加上不同的标记基因,在重组Ti质粒构建时,
筛选成功导入质粒的农杆菌,D不符合题意。
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11.(2026·广东惠州模拟)目的基因和载体如果用同一种限制酶处理,连接时会出现正反接的情况,为鉴定筛选出的表达载体中是否含有正确插入目的基因的重组质粒,拟设计引物进行PCR后,结合电泳技术鉴定,图示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置,其中目的基因为长度300 bp的片段。下列说法错误的是(　　)
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A.PCR复性温度不宜过高或过低,过高引物与模板链不易结合,过低会导致非特异性结合
B.电泳条带迁移的位置和速率与DNA分子的大小、带电量和构象有关
C.选取引物甲、丙,扩增出450 bp长度片段时,可说明目的基因正接
D.选取引物甲、乙,扩增出400 bp长度片段时,可以说明目的基因反接
答案:C
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解析:复性是在高温解旋后降低温度让引物与模板链结合的环节,复性温度不宜太低,避免引物错配和模板链形成双链,即过低会导致非特异性结合,而复性的温度过高会导致引物与模板链不易结合,A正确;电泳条带迁移的位置和速率与DNA分子的大小、带电量和构象有关,如电泳一段时间后,较大的DNA分子迁移距离小,离加样孔近,而较小的DNA分子迁移距离大,离加样孔远,B正确;根据题意可知,目的基因为长度300 bp的片段,若选取引物甲、丙扩增,由于引物甲、丙并不与目的基因的部分碱基序列互补配对,因此无论目的基因是正接还是反接,都会扩增出50+300+100=450 bp的片段,因此选取引物甲、丙,扩增出450 bp长度片段时,不能说明目的基因正接,C错误;引物乙与目的基因的部分碱基互补配对,引物甲与非目的基因的片段发生碱基互补配对,若目的基因如图中正接,则引物甲和乙与同一模板链互补,不能
扩增出片段,若目的基因反接,则引物甲和乙与DNA中不同的模板链发生碱
基互补,扩增出引物乙和甲中间的DNA片段,因此选取引物甲、乙,扩增出
400 bp长度片段时,可以说明目的基因反接,D正确。
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12.(2026·四川成都模拟)研究人员将PCR扩增得到的毒物诱导型启动子S(箭头表示转录方向)插入图中载体P区,构建表达载体,转入大肠杆菌,获得能够检测水中毒物的大肠杆菌。下列叙述正确的是(　　)
A.PCR扩增时,应在启动子两侧引入
EcoRⅠ、BamHⅠ识别序列
B.用Mg2+处理大肠杆菌以便转入
构建好的表达载体
C.可通过转基因大肠杆菌的荧光情况判断水中是否含有毒物
D.在添加氨苄青霉素的培养基上存活的菌株即为所需菌株
C
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解析:据图可知,目的基因中存在SmaⅠ和EcoRⅠ两种酶的识别序列,若用这两种酶会破坏目的基因,因此为防止目的基因和质粒自身环化和反向连接,应该用XhoⅠ、BamHⅠ切割,因此PCR扩增启动子S时,图中引物Ⅰ、Ⅱ应分别加入XhoⅠ、BamHⅠ的识别序列,A错误;用Ca2+处理大肠杆菌,会使其处于易于吸收周围环境中DNA分子的状态,便于转入构建好的表达载体,B错误;若水中含有毒物,启动子启动绿色荧光蛋白基因的表达,因此可通过转基因大肠杆菌的荧光情况判断水中是否含有毒物,C正确;氨苄青霉素抗性基因是标记基因,可使用添加氨苄青霉素的培养基筛选转入重组质粒的菌株,
在添加氨苄青霉素的培养基上存活的菌株不一定
为所需菌株,也可能是导入了空质粒的菌株,D错误。
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13.(2026·湖北武汉模拟)研究者分别选取小麦感病品系和抗病品系的叶片,对候选染色体1和2上的相关基因进行PCR 扩增,泳道1、2分别对应染色体1、2相关基因PCR产物,结果如图1所示。DNA序列分析发现抗病基因的出现是感病基因缺失一部分碱基序列造成的,图2 为感病基因序列示意图。下列分析错误的是(　　)
A.在PCR 扩增时,所用引物越短,引物特异性越低
B.两个PCR产物分子量接近时适当延长电泳时间,凝胶中这两个条带距离会变大
C.推测抗病品系抗病性状出现的根本原因是染色体2上感病基因发生突变
D.推测图1中泳道2的条带是选用引物1和引物2进行PCR扩增后的电泳结果
D
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解析:PCR技术中,引物是与模板DNA特定序列结合的短单链核酸。引物越短,能与之互补结合的DNA序列就越多,特异性就越低;反之,引物越长,特异性越高,A正确。电泳时,DNA分子在凝胶中因分子量差异而分离。分子量接近的DNA分子,在电场中移动速率相近,适当延长电泳时间,会让这种速率差异带来的位移差更明显,两个条带的距离就会变大,B正确。据题意可知,抗病基因的出现是感病基因缺失一部分碱基序列造成的,碱基序列发生改变属于基因突变。再结合图1,抗病品系染色体2对应的电泳结果与感病品系不同,推测抗病品系抗病性状出现的根本原因是染色体2上感病基因发生突变,C正确。图1中泳道2,感病品系有条带,抗病品系无条带,根据题意可知抗病基因的出现是感病基因缺失一部分碱基序列造成
的,引物3和缺失片段互补,因此推测图1中泳道2
的条带是选用引物1和引物3进行PCR扩增后的
电泳结果,D错误。
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14.(2025·福建卷,20)为建立一种效率高、毒性小的基因敲除系统,将图1所示的质粒1和质粒2导入大肠杆菌,质粒2中的sgRNA基因依据目的基因设计,其转录的短链RNA通过与目的基因碱基互补配对,与Cas9蛋白共同作用,敲除大肠杆菌基因组中的目的基因。
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回答下列问题。
(1)大肠杆菌LacZ基因的表达产物可催化X-gal生成蓝色物质从而使菌落呈现蓝色,否则菌落为白色。将质粒1与含LacZ基因相应sgRNA基因的质粒2同时转化到大肠杆菌中,涂布到含抗生素　　　　　 　　的平板(含有X-gal)上进行培养。若长出的是　　　色菌落则为LacZ基因被敲除的大肠杆菌。
卡那霉素和四环素
白
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解析:质粒2中含有与LacZ基因对应的sgRNA基因,其转录出来的短链RNA与目的基因(LacZ基因)发生碱基互补配对,使其不能表达,从而不能使X-gal分解产生蓝色物质。将质粒1和质粒2导入大肠杆菌,在含四环素和卡那霉素且含X-gal的培养基中,筛选白色的菌落即为LacZ基因成功敲除的菌落。
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(2)Cas9基因的表达量会影响敲除效率,但其过量表达会对大肠杆菌有毒。为评估毒性和敲除效率,用5种启动子(A、B、C、D和E)启动Cas9的转录,相应检测结果如图2所示。结果表明,启动子　　　对细胞毒性最小;综合考量毒性和敲除效率,应选用启动子　　　用于该系统。
解析:Cas9基因的表达量过高会对大肠杆菌产生毒性,使其数量减少,结合图示可知,启动子C对应的菌落数最多,因此启动子C对细胞毒性最小。结合菌落数和敲除率可知,启动子A的菌落数和敲除率均较高,因此综合考虑,应选择启动子A用于该系统。
C
A
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(3)含有质粒的大肠杆菌在无抗生素选择压力下培养,少数子代细胞会丢失质粒。结合质粒1和质粒2的特点,在成功敲除LacZ基因的大肠杆菌中消除质粒1和质粒2,实验流程如图3所示。
①培养12小时后,图3试管1中大部分的大肠杆菌　　　　(填字母)。

A.含质粒1和质粒2　 B.只含质粒1
C.只含质粒2 D.无质粒1和质粒2
B
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解析:质粒2为温度敏感型质粒,在37 ℃下不能进行复制,培养12小时后,试管1中大部分的大肠杆菌只含质粒1,B正确。
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②若要从图3平板上筛出质粒1和质粒2均被消除的大肠杆菌,简要写出实验思路和预期结果:__________________________________________
　 。
将同一菌落的大肠杆菌分别用含卡那霉素和四环素培养基进行培养,两者均不生长则为筛出的大肠杆菌
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解析: 为进一步筛选质粒1和质粒2均消除成功的大肠杆菌,可将同一菌落的大肠杆菌分别用含卡那霉素和四环素培养基进行培养,在无抗生素平板上可以生长,在含抗生素平板上均不生长的则为筛出的大肠杆菌。
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15.(2026·广东广州模拟)水体中的雌激素能使斑马鱼细胞产生E蛋白,激活卵黄蛋白原(vtg)基因(如图1所示)的表达,因此斑马鱼可用于监测环境雌激素污染程度。为了实现可视化监测,科学家将斑马鱼的vtg基因与人工构建的含萤火虫荧光素酶基因(无启动子)的载体(如图2所示)连接,形成vtg-Luc基因重组载体,成功培育了转基因斑马鱼。图2中Luc表示萤火虫荧光素酶基因,可以催化荧光素氧化产生荧光;AmpR为氨苄青霉素抗性基因,TetR表示四环素抗性基因,BamHⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ、BsrGⅠ为限制酶,→表示转录方向。回答下列问题。
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(1)基因vtg启动子的基本组成单位是　　 　　　。选用限制酶EcoRⅠ、HindⅢ双酶切Luc基因载体,其优点是____________________
　 　 。
解析:基因vtg启动子是一段DNA序列,其基本组成单位是脱氧核苷酸。选用限制酶EcoRⅠ、HindⅢ双酶切Luc基因载体,可以防止目的基因、质粒自身环化或质粒与目的基因反向连接,从而实现质粒与目的基因正向连接。
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脱氧核苷酸
防止目的基因、质粒
自身环化或质粒与目的基因反向连接
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(2)为使vtg基因与Luc基因载体形成重组载体,通过PCR技术扩增vtg基因时,需设计合适的引物。依据图1、图2信息推测引物1包含的碱基序列为5'-　　　　　　　　　　-3'。
解析:综合分析图1、图2,vtg基因的启动子端应与EcoRⅠ的识别位点端连接,含有EcoRⅠ的识别序列,且含有能与相应模板链碱基互补配对的碱基序列,故引物1的碱基序列为5'-GAATTCAACTAT-3'。
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GAATTCAACTAT
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(3)筛选导入vtg-Luc基因重组载体的大肠杆菌,可将大肠杆菌依次接种在含 (填“氨苄青霉素”“四环素”或“氨苄青霉素和四环素”)的培养基中,为确定这两个基因是否在大肠杆菌体内转录,应检测 　 。
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氨苄青霉素和四环素
vtg基因和Luc基因的mRNA
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解析:分析图2,质粒上有氨苄青霉素和四环素的抗性基因作为标记基因,导入vtg基因成功的质粒,TetR基因被破坏,故可将大肠杆菌依次接种在含氨苄青霉素和四环素的培养基中,则在氨苄青霉素培养基上存活,在四环素培养基上不存活的大肠杆菌为导入vtg-Luc基因重组载体的大肠杆菌。转录的产物是RNA,为确定这两个基因是否在大肠杆菌体内转录,应检测vtg基因和Luc基因的mRNA。
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(4)利用　　　　　　　　方法将vtg-Luc基因重组载体导入斑马鱼。若要判断斑马鱼转基因是否成功,可在水体中添加　　　　 　　进行检测。
解析:将目的基因导入动物细胞最常用的方法是显微注射技术,故可利用显微注射技术将vtg-Luc基因重组载体导入斑马鱼。结合题意,水体中的雌激素能使斑马鱼细胞产生E蛋白,激活卵黄蛋白原(vtg)基因的表达,且Luc为萤火虫荧光素酶基因,可以催化荧光素氧化产生荧光,故可在水体中添加雌激素和荧光素判断斑马鱼转基因是否成功。
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显微注射技术
雌激素和荧光素

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