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(共53张PPT)
第2节 基因工程的基本操作程序
本节聚焦:
基因工程的基本操作程序主要包括哪几个步骤？
基因工程操作的每一步涉及的技术和方法有哪些？
第三章 基因工程
一条小虫引发的科技大战
—中国农科院棉花研究所开发抗虫棉纪实
思考问题：1.你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？
2.培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤呢？
3.将目的基因导入受体细胞
苏云金杆菌
与载体拼接
普通棉花
（无抗虫特性）
棉花细胞
抗虫棉
提取
表达Bt基因
导入
Bt基因
重组DNA分子
1.目的基因的筛选与获取
2.基因表达载体的构建
4.目的基因的 检测与鉴定
基因工程的基本操作程序
1.概念：
在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期
表达产物等的基因。
2.实例：
与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。
主要指的是编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子。
一、目的基因
资料：苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt 抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。
科学家将“杀虫基因”转入棉花中，棉花产生Bt 抗虫蛋白抵抗虫害。
目的基因
那么，如何筛选目的基因呢？
二、筛选合适的目的基因
序列数据库（如GenBank）
序列比对工具（如BLAST）
公共生物医学数据库、分析分子及基因组数据的软件工具NCBI
从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选目的基因
问题：筛选出来的目的基因，该怎么获得它呢？
三、利用PCR获取和扩增目的基因
提取
苏云金芽孢杆菌
抗虫基因
？
快速获得大量抗虫基因
结合体内DNA复制过程，思考PCR的进行需要哪些条件？
PCR——聚合酶链式反应
PCR是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
【回顾】DNA复制的过程
三、利用PCR获取和扩增目的基因（阅读课本P77）
1
中文全称：
2
原理：
3
操作环境：
4
基本条件：
聚合酶链式反应
DNA半保留复制
体外（PCR扩增仪/PCR仪）
①模板：
②原料：
③酶：
④其他条件：
DNA母链
4种脱氧核苷酸
耐高温的DNA聚合酶
引物
思考讨论
什么是引物？引物的作用是什么？
定义：引物是一小段能与DNA母链的一小段碱基序列互补配对的短单
链核酸。（长度通常为20-30个核苷酸）
作用：为DNA聚合酶提供了游离的3’端，使DNA聚合酶从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸。
解旋酶
由于DNA双链是反向平行的，所以需要2种引物。
作用：打开DNA双链（若是在体外可以用高温代替解旋酶打开DNA双链）
5
PCR扩增过程：
5
扩增过程：
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
A.变性
90℃以上，双链DNA解聚为单链
B.复性
50℃左右，两种引物与两条单链DNA结合
C.延伸
72℃左右，4种脱氧核苷酸在Taq酶的作用下，合成新的DNA链
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
5
扩增过程：
第一轮循环的产物作为第二轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环的产物；
第二轮循环的产物作为第三轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮的产物；
第二轮循环的产物
第三轮的产物
完成后，常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物
琼脂糖凝胶电泳
DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就叫电泳。
6
产物鉴定：
较小的DNA片段在凝胶中的移动相对容易，较大的DNA片段移动难。
当电泳结束时，比较DNA样品所在
的位置和一系列已知大小的DNA片
段的位置(标准)，这些已知大小的
片段称为DNA分子量标准样。
5’ 3’
3’ 5’
3’ 5’
5’ 3’
5’ 3’
引物1
3’ 5’
引物2
3’ 5’
5’ 3’
3’ 5’
引物2
5’ 3’
引物1
5’ 3’
引物1
3’ 5’
引物2
3’ 5’
引物2
5’ 3’
引物1
目的基因
思考
1、引物在PCR中能重复利用吗？
不能
2、用PCR可以扩增mRNA吗？(P79旁栏思考题）
不能，由于RNA不稳定，需要将RNA反转录为cDNA，然后再进行扩增。
PCR应用——新冠病毒核酸检测
PCR技术 DNA复制
相同点 模板 原料 不同点 解旋 方式
场所
酶
能量
结果
DNA的两条母链
四种脱氧核苷酸
DNA在高温下变性解旋
解旋酶催化
体外复制
细胞内（主要在细胞核内）
耐高温的DNA聚合酶
解旋酶、DNA聚合酶
大量的DNA片段
形成整个DNA分子
7
PCR技术与DNA复制过程比较
dNTP（原料）提供
细胞内的ATP提供
利用PCR获取和扩增目的基因
问题探讨二
2.PCR技术获取目的基因时要经过几次循环才能从DNA分子中分离出目的基因？
至少3次
第一次
第二次
5’
3’
5’
3’
3’
5’
利用PCR获取和扩增目的基因
第三次
思考：继续循环N次，会得到多少个DNA分子呢？
每一次循环后目的基因的量可以增加一倍，即成指数形式扩增（约为2n，其中n为扩增循环的次数）。
例1 下列有关PCR技术的叙述,错误的是 (　　)
A.每一次循环后目的基因的数量可以增加一倍
B.PCR反应过程中需要3个不同的温度范围
C.PCR反应过程中加入的酶的显著特性是耐高温
D.模板DNA和引物能在每一次扩增中重复使用
任 务 活 动
D
DNA片段
基因1 基因2 基因3
放大
终止子
非编码区
非编码区
编码区
编码区上游
编码区下游
启动子
知识拓展：基因结构：
编码区：编码蛋白质的合成
非编码区：不能编码蛋白质，调控遗传信息的表达
阅读教材P80，回答下列问题：
1.获取Bt基因后，如果直接把目的基因导入受体细胞，可能会出现什么样的结果？如何避免该结果的发生呢？
2.将Bt基因送入受体细胞的载体需要具备什么条件？
3.要使Bt基因在受体细胞中稳定存在，并能够表达和发挥作用，载体还需要具有哪些结构？
游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解，且游离的DNA片段不能稳定遗传。
限制酶切割位点；自我复制或将DNA整合到受体细胞；具有标记基因；安全
启动子、终止子
一、基因表达载体的作用
---基因工程的核心
1.使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以遗传给下一代；
2.使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。
二、基因表达载体的组成
位置：
功能：
RNA聚合酶识别和结合的部位，转录的起始信号
基因的首端
人们所需要的基因
位置：
功能：
基因的尾端
转录的终止信号
用来鉴别或筛选含有重组DNA分子的细胞
DNA复制所需结构
---基因工程的核心
三、基因表达载体的构建过程
载体
（质粒）
DNA分子
（含目的基因）
限制酶处理
带有黏性末端或平末端的切口
带有相同黏性末端或平末端的目的基因片段
DNA连接酶
重组DNA分子
（重组质粒）
同一种
问题：该过程需要用到基因工程哪些工具？
---基因工程的核心
问题探讨：
1、使用一种DNA限制酶进行切割，是否只会得到目的基因与载体结合的这一种重组DNA？
活动一：基因表达载体的构建
用Ecol RⅠ限制酶（识别GAATTC，切割GA之间）切割载体和目的基因。
目的基因能否自连？质粒能否自连？目的基因与质粒能否反向连接？
---基因工程的核心
问题探讨：
1、使用一种DNA限制酶进行切割，是否只会得到目的基因与载体结合的这一种重组DNA？
载体
目的基因
自连
片段间的连接
目的基因自连
质粒自连
目的基因与质粒连接
目的基因与目的基因连接
质粒与质粒连接
正向连接 反向连接
1
1’
2
2’
1
2
2’
1’
2
2’
1’
1
2.如何防止目的基因和质粒的自身环化以及目的基因的反向连接？
问题探讨：
活动二：基因表达载体的构建
用Ecol RⅠ（识别GAATTC，切割GA之间）和BglⅡ限制酶（识别AGATCT，切割AG之间），切割载体和目的基因，并将其连接。
双酶切
-G
-CTTAA
-A
-TCTAG
选择两种不同的限制酶同时对目的基因和载体切割，防止目的基因和载体的自身环化和反向连接。
【情境】目的基因导入受体细胞之前,需构建基因表达载体,图甲、乙表示质粒及目的基因所在DNA片段,图中箭头表示相关限制酶的酶切位点。
(1)构建基因表达载体时需要使用的工具酶为　　　　　　　　　　　　。
(2)用图中的质粒和DNA构建基因表达载体时,不能使用SmaⅠ切割,原因是　　　　　　　　　　　　　　 　　　　　　　　　　
　。
(3)构建基因表达载体时,可用EcoRⅠ同时切割质粒和DNA,但会导致
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　等问题,为避免以上问题出现,应使用 　　 　　　　　　　　　 两种限制酶。
SmaⅠ会破坏质粒的抗生素抗性基因和外源DNA中的目的基因
目的基因自身环化、目的基因不能定向连接
BamHⅠ和HindⅢ(或EcoRⅠ和HindⅢ)
限制酶和DNA连接酶
任务二　基因表达载体的构建(导学案P75)
【情境】目的基因导入受体细胞之前,需构建基因表达载体,图甲、乙表示质粒及目的基因所在DNA片段,图中箭头表示相关限制酶的酶切位点。
任务二　基因表达载体的构建(导学案P75)
(4)构建好的基因表达载体在目的基因前要加上　 　,其是　　 　识别和结合的部位。
(5)请简要描述基因表达载体的构建过程。

RNA聚合酶
用相同的限制酶分别切割载体和含目的基因的DNA片段,产生末端相同的切口,再用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处。
启动子
任 务 活 动
例3 在基因表达载体的构建中,下列说法正确的是 (　　)
①一个基因表达载体的组成只包括目的基因、启动子、终止子
②有了启动子才能驱动基因转录出mRNA
③终止子的作用是使转录在所需要的地方停止
④所有基因表达载体的构建是完全相同的
⑤必须在细胞外进行
A.②③⑤ B.①④ C.①②⑤ D.③④
A
3.某目基因两侧的 DNA序列所含的限制酶酶切位点如图所示,下列可作该目的基因最佳载体的是 (　　)
　　　　　　　　
A　　　　　　　　 B C　　　　　　 　D
A
当 堂 自 评
启动(终止)转录
启动(终止)翻译
作用
位于DNA上
位于mRNA上
位置
DNA片段
三个相邻碱基
本质
启动(终止)子
启始(终止)密码子
归纳比较
目的基因的筛选与获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
第一步
第二步
第三步
第四步
目的基因的检测与鉴定
基因工程的基本操作程序
自主思考：阅读课本相关内容（P80-81），总结将目的基因导入受体细胞的方法有哪些，各个方法的原理是什么？各自适用于什么生物？
将目的基因导入受体细胞的方法
将目的基因导入
植物细胞
将目的基因导入
动物细胞
将目的基因导入
微生物细胞
农杆菌转化法
花粉管通道法
——显微注射法
——Ca2+处理法
我国科学家独创
1.花粉管通道法
①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；
②在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。
一
将目的基因导入植物细胞
子房
花粉
柱头
花粉管
精子
卵细胞
胚囊
2.农杆菌转化法
农杆菌特点：
a.能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物。
b.农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。
一
将目的基因导入植物细胞
2.农杆菌转化法
一
将目的基因导入植物细胞
两次拼接：
第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上；
第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上。
两次导入：
第一次导入是将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌；
第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA导入受体细胞。
1、导入方法：
2、受体细胞:
显微注射法
受精卵
为什么常选用受精卵作为受体细胞呢？
①体积大，易操作。
②易表现出全能性。
3、过程：
构建基因表达载体并提纯
利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中
早期胚胎培养
胚胎移植
获得具有新性状的动物
二
将目的基因导入动物细胞
1、常用方法：
Ca2+处理
原核细胞（常选择大肠杆菌）
可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。
3、过程：
2、受体细胞：
三
将目的基因导入微生物细胞
Ca2+处理细胞
感受态细胞
表达载体与感受态细胞混合
感受态细胞吸收DNA分子
吸收
Ca2+
感受态细胞
成熟mRNA
相应酶去除内含子
转录
翻译
真核基因：编码区（外显子+内含子）
多肽链
前体mRNA
蛋白质
加工
如果把一个真核生物的基因导入原核细胞中表达，一定会产生原来的蛋白质吗？
提示：一般不能产生原来的蛋白质
原因：
①原核生物细胞里没有相应的酶来去除内含子；
②原核生物没有真核的蛋白质加工系统（如内质网、高尔基体等）
提取
如果把真核基因导入原核细胞中表达，不考虑蛋白质加工的问题，如何产生与原来结构相同的蛋白质吗？
mRNA单链
逆转录酶
DNA
单链
DNA双链
酶
这种双链DNA是不含内含子的DNA，叫做cDNA
成熟mRNA
去除内含子
转录
真核基因：编码区（外显子+内含子）
前体mRNA
相应酶
提示：把真核基因的cDNA导入到原核细胞中表达。（具体做法，如图）
将生物的所有DNA直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，效果会怎样？
有人采用总DNA注射法进行遗传转化，即将一个生物的总DNA提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体植物，没有进行基因表达载体的构建。这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定哪些基因导入了受体植物。
将表达载体导入受体细胞后，如何判断导入是否成功？即使导入成功，如何判断目的基因是否可以正常表达？
基因工程第四步：目的基因的检测与鉴定
讨论：请大家回顾基因表达的过程，推测可以从哪些方面进行检测与鉴定？
思考：在棉花细胞中，重组表达载体是否导入成功？是否可以稳定维持并表达出Bt蛋白？表达出的Bt蛋白是否具有杀虫的功效？
1.分子水平检测
2.个体水平鉴定
③检测目的基因是否翻译成蛋白质
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
②检测目的基因是否转录出了mRNA
①检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因
1.检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因
方法：PCR扩增和DNA分子杂交技术
基本思路：
1.制作出与目的基因序列相同的有同位素标记的DNA片段，并用PCR扩增（基因探针）
2、提取受体细胞全部DNA，与基因探针置于同一培养液。
3、高温变性处理，使之全部变为单链，观察是否出现杂交DNA片段。
转基因生
物的DNA
探针
15N
变性
变性
15N
思考：DNA分子杂交检测目的基因的原理是什么？
碱基互补配对原则
杂交DNA分子（可检测）
2.检测目的基因是否转录出了mRNA
方法：PCR扩增和分子杂交技术
基本思路：
1.制作出与目的基因序列相同的有同位素标记的DNA片段，并用PCR扩增（基因探针）
2、提取受体细胞全部RNA，直接与基因探针置于同一培养液。或先将RNA逆转录为cDNA，再与基因探针置于同一培养液。
3、高温变性处理，使之全部变为单链，观察是否出现分子杂交片段。
3.检测目的基因是否翻译成蛋白质
方法:
过程:
抗原-抗体杂交技术
若出现杂交带，则目的基因成功翻译出蛋白质。
苏云金芽孢杆菌
提取
Bt毒蛋白
注射小鼠体内
抗体
标记抗体
提取蛋白
电泳分离
抗原
抗体
杂交
脱分化
转基因生物 鉴定方法 成功标志
抗虫植物
抗病毒（菌）植物
抗盐植物
抗除草剂植物
饲喂害虫（抗虫接种实验）
害虫死亡
病毒（菌）感染（抗病接种实验）
未出现病斑
盐水浇灌
正常生长
喷洒除草剂
正常生长
个体水平：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
目的基因的筛选和获取
利用PCR获取和扩增
化学方法人工合成
构建基因表达载体-核心
目的基因、启动子、终止子、标记基因
将目的基因导入受体细胞
农杆菌转化法(植物)、显微注射法(动物) 、Ca2+处理(微生物);
目的基因的检测与鉴定
分子检测：是否插入、转录、翻译
个体水平：是否具有抗性以及抗性强度等。
基因工程的基本操作程序（4个步骤）
1.研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因afp整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。判断下列相关表述是否正确。
（1）afp基因是培育抗冻番茄用到的目的基因。 （ ）
（2）构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶（ ）
（3）只要检测出番茄细胞中含有afp基因，就代表抗冻番茄培育成功（ ）
2.利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关PCR的叙述错误的是 （ ）
A.PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶
B.变性过程中双链DNA的解开不需要解旋酶
C.复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则
D.延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和 4种核糖核苷酸
√
×
×
一.概念检测
D
2.八氢番茄红素合酶（其基因用psy表示） 和胡萝卜素脱饱和酶（其基因用crtⅠ表示）参与β-胡萝卜素的合成。pmi为磷酸甘露醇异构酶基因，它编码的蛋白质可使细胞在特殊培养基上生长。科学家将psy和crtⅠ基因转入水稻，使水稻胚乳中富含β-胡萝卜素，由此生产出的大米称为 “黄金大米”。请根据以上信息回答下列问题。
二、拓展应用
（1）科学家在培育“黄金大米”时，将ctrⅠ和psy基因导入含pmi基因的质粒中，构建了质粒pSYN12424。该项研究的目的基因是______ ，标记基因是_____ ，质粒pSYN12424的作用是______ 。
ctrⅠ基因和psy基因
pmi基因
将目的基因送入水稻细胞
（2）在构建质粒载体时，目的基因序列中能否含有用到的限制酶的识别序列？为什么？
不能。限制酶可能将它切断。
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