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第3章 基因工程工程
第2节 基因工程的基本操作程序
（第一课时）
目标
01
02
03
针对人类生产和生活的某一需求，尝试提出初步的基因工程构想，完成初步设计。
（科学探究）
结合实例，采用文字和图示方式说明基因工程的基本操作程序。（科学思维）
运用结构与功能观等观念理解PCR技术的过程、原理、条件等（生命观念）
学习目标
1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。
问题1:你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤呢？
转基因抗虫棉
普通棉花
培育转基因抗虫棉的简要过程
普通棉花
（无抗虫特性）
棉花细胞
抗虫棉
提取
表达Bt基因
导入
与载体拼接
重组DNA分子
1.目的基因的筛选与获取
2.基因表达载体的构建
（核心）
3.将目的基因导入受体细胞
4.目的基因的检测与鉴定
Bt基因
苏云金杆菌
目录
CONTENTS
第二步：基因表达载体的构建
2/
第一步：目的基因的筛选与获取
1/
第三步：将目的基因导入受体细胞
3/
第四步：目的基因的检测与鉴定
4/
DNA 片段的扩增及电泳鉴定
5/
01
第一步：目的基因的筛选与获取
什么是目的基因，请举例；如何筛选目的基因呢？
为什么培育转基因抗虫棉用到的目的基因是Bt基因？
2
3
4
1
合作探究一：请同学们自主阅读教材P76-77，小组合作思考讨论完成问题。
Bt基因的杀虫机理是怎样的？
抗虫棉中的Bt抗虫蛋白会不会对人畜产生危害？为什么？
一、目的基因的筛选与获取
一、目的基因的筛选与获取
（一）目的基因：
概念
在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。
实例
与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。
主要指的是编码蛋白质的基因
资料：苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt 抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。科学家将“杀虫基因”转入棉花中，棉花产生Bt抗虫蛋白抵抗虫害。
目的基因--Bt抗虫蛋白基因
问题2:那么，如何筛选目的基因呢？
筛选方法
从相关的
已知结构
和功能清晰
的基因中进行筛选
已知结构
科学家掌握了Bt基因的序列信息。
功能清晰
Bt抗虫蛋白只在某类昆虫肠道的碱性环境中才表现出毒性，对人和牲畜无影响。
一、目的基因的筛选与获取
（二）筛选合适目的基因：
实例：苏云金杆菌——Bt基因
筛选Bt基因作为培育转基因抗虫棉的目的基因。
测序技术
序列数据库
序列比对工具
利用测序技术、序列数据库（如GenBank）、序列对比工具（如BLAST）等，找到合适的目的基因
一、目的基因的筛选与获取
（二）筛选合适目的基因：
DNA测序仪
核苷酸序列比对
氨基酸序列比对
美国国家生物信息中心
测定核酸和蛋白质序列
以碱基顺序或氨基酸残基顺序为基本内容的分子生物信息数据库
把感兴趣的序列跟已经存在的序列数据库进行比较的工具。通过比对识别相关的序列，从而能获得目的基因和蛋白质的功能。
先对目的基因进行扩增
一、目的基因的筛选与获取
问题3:获取一个Bt基因之后，是否就该立即开始准备转基因操作？
抗虫基因
快速获得大量抗虫基因
苏云金杆菌
提取
总结出PCR的概念、提出者、原理、目的、优点。
结合体内DNA复制过程，思考PCR的进行需要哪些条件？所需设备是什么？
2
3
4
1
构建出PCR的大致过程；PCR扩增为什么需要引物？
如何对产物进行鉴定？PCR技术与DNA复制过程有哪些异同？
合作探究二：请同学们自主阅读教材P76-77，小组合作思考讨论完成问题。
一、目的基因的筛选与获取
PCR由穆里斯等人于1985年发明，为此，穆里斯于1993年获得诺贝尔化学奖。
如果说，沃森和克里克发现DNA双螺旋结构，标志着分子生物学时代的开启，那么PCR技术则标志着分子生物学的腾飞。PCR技术的出现，彻底变革了生物化学、分子生物学、遗传学、以及现代医学等等。
一、目的基因的筛选与获取
（三）利用PCR获取和扩增目的基因：
1.发明者
DNA半保留复制
原理
体外
操作环境
对目的基因的核苷酸序列进行大量复制
目的
可在短时间内大量
扩增目的基因
优点
聚合酶链式反应
全称
它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
PCR
一、目的基因的筛选与获取
（三）利用PCR获取和扩增目的基因：
一、目的基因的筛选与获取
问题4:结合体内DNA复制过程，思考PCR的进行需要哪些条件？
要点回顾:体内DNA复制
模板：
原料：
能量：
酶：
DNA的两条母链
4种游离的脱氧核苷酸
解旋酶、DNA聚合酶
复制特点:
①边解旋边复制 ②半保留复制
碱基互补配对原则
（保证复制的准确进行）
条件
复制原则:
子链的延伸方向：
5'端→3'端
因为 DNA聚合酶只能从5'端向3'端延伸子链。
PCR技术所需的基本条件
参与的组分 在PCR中的作用
前提条件
高温
模板DNA
4种脱氧核苷酸
耐高温的DNA聚合酶
引物
一定的缓冲溶液(Mg2＋)
打开DNA双链
提供DNA复制的模板
合成DNA子链的原料
催化合成DNA子链
主要是DNA单链或RNA,使耐高温的DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸
已知基因的核苷酸序列
提供合适的酸碱度和离子，DNA聚合酶需要Mg2＋激活
一、目的基因的筛选与获取
2.所需的基本条件
（三）利用PCR获取和扩增目的基因：
一、目的基因的筛选与获取
2.所需的基本条件
（三）利用PCR获取和扩增目的基因：
DNA模板
引物(2种)
四种脱氧核苷酸
引物
引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸
(dNTP)
提供DNA复制的模板
合成子链DNA的原料
脱氧核糖
磷酸基团
含N碱基
一、目的基因的筛选与获取
2.所需的基本条件
（三）利用PCR获取和扩增目的基因：
拓展延伸：引物
(1)引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物通常为20~30个核苷酸。在细胞中为一段单链RNA，在PCR中为一段人工合成的单链DNA。
(2)引物为DNA聚合酶提供了游离的3′端，使DNA聚合酶从3′端延伸子链。
（DNA聚合酶不具有从头合成子链的功能）
一、目的基因的筛选与获取
2.所需的基本条件
（三）利用PCR获取和扩增目的基因：
拓展延伸：引物
引物为DNA聚合酶提供了游离的3′端，使DNA聚合酶从3′端延伸子链。（DNA聚合酶不具有从头合成子链的功能）
-3′
5′-
3′-
-5′
子链延伸
-5′
3′-
5′-
-3′
子链延伸
一、目的基因的筛选与获取
2.所需的基本条件
（三）利用PCR获取和扩增目的基因：
Taq DNA聚合酶
稳定的缓冲溶液
激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶
使耐高温的DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸。
提供合适的酸碱度和离子，DNA聚合酶需要Mg2＋激活
一般添加Mg2+
耐高温的DNA聚合酶
催化形成磷酸二酯键，进而合成DNA子链
PCR扩增仪
DNA分子电泳
一、目的基因的筛选与获取
3.所需设备
（三）利用PCR获取和扩增目的基因：
一、目的基因的筛选与获取
4.过程
（三）利用PCR获取和扩增目的基因：
耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）
4种脱氧核苷酸（DNTP）
引物
待扩增的DNA片段（模板）
5’
5’
变性
复性
延伸
温度上升到90℃以上，双链DNA解聚为单链
当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。
一、目的基因的筛选与获取
4.过程
（三）利用PCR获取和扩增目的基因：
90
50
72
℃
变性
3`
5`
5`
3`
一、目的基因的筛选与获取
4.过程
（三）利用PCR获取和扩增目的基因：
90
50
72
℃
复性
一、目的基因的筛选与获取
4.过程
（三）利用PCR获取和扩增目的基因：
90
50
72
℃
延伸
一、目的基因的筛选与获取
4.过程
（三）利用PCR获取和扩增目的基因：
90
50
72
℃
变性
一、目的基因的筛选与获取
4.过程
（三）利用PCR获取和扩增目的基因：
90
50
72
℃
复性
一、目的基因的筛选与获取
4.过程
（三）利用PCR获取和扩增目的基因：
90
50
72
℃
延伸
一、目的基因的筛选与获取
4.过程
（三）利用PCR获取和扩增目的基因：
90
50
72
℃
变性
一、目的基因的筛选与获取
4.过程
（三）利用PCR获取和扩增目的基因：
90
50
72
℃
复性
一、目的基因的筛选与获取
4.过程
（三）利用PCR获取和扩增目的基因：
90
50
72
℃
延伸
一、目的基因的筛选与获取
4.过程
（三）利用PCR获取和扩增目的基因：
一、目的基因的筛选与获取
（三）利用PCR获取和扩增目的基因：
5.PCR的结果
由于一个循环得到的产物又可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍。
即成 形式扩增（约为 ，其中n为扩增循环的次数）。
指数
2n
一、目的基因的筛选与获取
PCR中的数量关系
复制次数 1 2 3 n
DNA分子数 2 4 8 2n
含引物的DNA分子数 2 4 8 2n
含其中一种引物的DNA分子数 1＝21－1 3＝22－1 7＝23－1 2n－1
同时含两种引物的DNA分子数 0＝21－2 2＝22－2 6＝23－2 2n－2
共消耗引物的对数 1＝21－1 3＝22－1 7＝23－1 2n－1
含脱氧核苷酸链等长的DNA分子数 0＝21－2 0＝22－4 2＝23－6 2n－2n
5.PCR的结果
（三）利用PCR获取和扩增目的基因：
　实战训练　
1.一个DNA，一对引物（A与B），复制n次：
（1）子代DNA分子等长的DNA分子数为：_________个
（2）子代DNA分子中不等长链DNA分子数为：_________个
（3）子代DNA分子中含模板链DNA分子数为：__________个
（4）子代DNA分子中含引物A（或B）的DNA分子数为：____个
（5）复制过程中共需引物________个
（6）第n次复制需要引物_________个
2n-2n
2n
2
2n-1
2n＋1-2
2n
　实战训练　
2.下列有关PCR技术的叙述,错误的是 (　　)
A.每一次循环后目的基因的数量可以增加一倍
B.PCR反应过程中需要3个不同的温度范围
C.PCR反应过程中加入的酶的显著特性是耐高温
D.模板DNA和引物能在每一次扩增中重复使用
　实战训练　
3.在核酸分子杂交技术中,常常使用已知序列的单链核酸片段作为探针(探针是指以放射性同位素、生物素或荧光染料等进行标记的已知核苷酸序列的核酸片段)。为了获得B链作探针,可应用PCR技术进行扩增,应选择的引物种类是(　　)
A.引物1与引物2 B.引物3与引物4
C.引物2与引物3 D.引物1与引物4
一、目的基因的筛选与获取
（三）利用PCR获取和扩增目的基因：
6.产物进行鉴定
PCR过程可以在 中自动完成，完成以后，常采用 来鉴定PCR的产物
琼脂糖凝胶电泳
PCR扩增仪
一、目的基因的筛选与获取
问题5:PCR技术与DNA复制过程比较？
比较项目 细胞内DNA复制 PCR技术
区别 解旋方式 解旋酶催化 DNA在高温下变性解旋
场所 主要在细胞核内 细胞外(主要在PCR扩增仪内)
酶 解旋酶、DNA聚合酶等 热稳定的DNA聚合酶（Taq 酶）
温度 细胞内温和条件 控制温度，需在不同温度下进行
结果 合成整个DNA分子 扩增特定的DNA片段或基因
联系 ①模板:均需要脱氧核苷酸双链作为模板 ②原料:均为四种脱氧核苷酸（dATP、dTTP、dGTP、dCTP） ③酶:均需DNA聚合酶 ④引物:都需要引物，使DNA聚合酶从引物开始进行互补链的合成 拓展延伸：目的基因的获取的其他方法
利用PCR获取和扩增目的基因
人工合成
从基因文库中获取
　实战训练　
（1）PCR反应中温度的周期性改变是为了DNA聚合酶催化不同的反应 （　 　）
（2）PCR扩增技术中，需用解旋酶使双链DNA解聚 （　 　）
（3）PCR过程使用的DNA聚合酶的特点是耐高温 （　 　）
（4）PCR技术中，DNA模板链上碱基G和C的比例越高，DNA变性解链的温度就越高 （　 　）
4.判断常考语句，澄清易混易错
　实战训练　
5．新型冠状病毒的增殖过程如下图所示。下列相关叙述错误的是（ ）
A．新型冠状病毒的RNA含有决定氨基酸的遗传密码B．新型冠状病毒在增殖时会形成RNA和蛋白质复合物C．新型冠状病毒RNA的嘌呤数与互补RNA的嘧啶数相等D．利用PCR对新型冠状病毒检测时，需要RNA复制酶
　实战训练　
6．在细菌和病毒类疾病检测、遗传疾病诊断、肿瘤筛查和诊断中，都可采用PCR 技术。PCR反应由变性→复性→延伸三个基本反应步骤构成，PCR 完成以后常需要鉴定PCR的产物。下列叙述正确的是（ ）
A．变性：耐高温的 DNA 聚合酶将双链DNA 解链为单链B．复性：两种引物与两条单链DNA结合不必控制温度C．延伸：4 种脱氧核苷酸加到引物的5端D．鉴定：DNA 聚合酶质量不好可能导致鉴定结果不仅有一条带
　实战训练　
7．在相对湿度为92%时，沃森和克里克对所得到的含 300个碱基对的双螺旋 DNA钠盐纤维进行分析发现，腺嘌呤占 20%，碱基对与中心轴垂直，相邻碱基对之间垂直距离为0．34 nm，螺旋一圈的垂直长度约为 3．4 nm。下列叙述正确的是（　　）
A．该 DNA碱基对之间共含有氢键390个B．该 DNA 复制5 次需要消耗鸟嘌呤5680个C．每圈螺旋约包含 10个碱基对D．扩增DNA 时，通常破坏DNA的磷酸二酯键使其变性
　实战训练　
8．科学家将抵御干旱胁迫反应中具有调控作用的 AhCMO 基因转入棉花细胞中，培育出了转基因抗旱棉花。下列相关叙述错误的是（ ）
A．将AhCMO基因导入棉花细胞可用农杆菌转化法B．构建基因表达载体是培育转基因抗旱棉花的核心工作C．AhCMO基因成功插入棉花细胞染色体上也未必能正常表达D．PCR 扩增AhCMO 基因时需要设计两种碱基互补的引物
　实战训练　
9．如图为利用生物技术获得生物新品种的过程，有关说法不正确的是
（　　）
A．a→b过程中一般用4种脱氧核苷酸为原料，并加入两种引物B．b→c为转基因绵羊的培育过程，常选用的受体细胞是受精卵C．a→b过程利用了DNA半保留复制的原理，需要使用RNA聚合酶D．b→d为转基因植物的培育过程，其中④过程常用的方法是农杆菌转化法
　实战训练　
10．下列关于PCR反应体系中所加物质作用的叙述，错误的是（ ）
A．耐高温的DNA聚合酶用于催化DNA子链的合成B．引物使Taq DNA聚合酶能从引物的5′端延伸DNA链C．目标DNA的双链用作合成DNA复制的模板D．四种脱氧核苷酸为PCR提供原料
　实战训练　
11．有关PCR技术的说法错误的是（ ）
A．PCR是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术B．高温变性过程中被切断的是DNA分子内碱基对之间的氢键C．PCR反应需要在一定的缓冲溶液中才能进行D．PCR扩增中必须有解旋酶才能解开双链DNA
　实战训练　
12．下列关于DNA片段的扩增及电泳鉴定实验的叙述，错误的是（　　）
A．PCR过程需要Taq DNA聚合酶B．PCR过程通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合C．PCR扩增区域由两种引物来决定D．电泳时，DNA的迁移速率与凝胶的浓度有关，与DNA分子的大小无关
　实战训练　
13．利用PCR将某小段含目的基因的DNA分子扩增循环n次，则（　　）
A．需要已知目的基因的全部序列以便设计引物B．共需2n-2个引物参与子代DNA分子的合成C．应向反应体系中加入解旋酶、DNA聚合酶、缓冲液等D．理论上第4轮循环产物中含两种引物的DNA片段占7/8
　实战训练　
14．某病毒的检测可以采用实时荧光RT PCR（逆转录聚合酶链式反应）的方法，RT PCR的具体过程如图。下列有关叙述错误的是（　　）
A．过程①以mRNA为模板合成单链DNAB．过程②③拟对单链cDNA进行第n次循环的扩增，理论上需要n个引物BC．该技术用于对某些微量RNA病毒的检测，可提高检测的灵敏度D．游离的脱氧核苷酸只能从引物的3′端开始连接
　实战训练　
15．在基因工程中，常用PCR 特异性地快速扩增目的基因。下列叙述正确的是（ ）
A．PCR 的变性是通过解旋酶将 DNA 的两条模板链分开的过程B．PCR 的复性是目的基因的两条模板链相互结合的过程C．在 PCR 的延伸过程中，DNA 聚合酶将脱氧核苷酸加到引物的5'端D．PCR 过程中每循环一次会使目的基因的数目增加一倍
　实战训练　
16．下列有关PCR技术的实验过程叙述，正确的是（　　）
A．PCR利用了DNA的热变性原理，实际操作中为了提高循环效率，变性后要迅速冷却，以使引物和模板链尽快结合B．PCR操作中引物的添加量取决于模板DNA的加入量，如果只加入一个模板DNA进行PCR扩增，需要加入两个不同的引物。C．延伸过程是溶液中的四种核糖核苷酸在DNA聚合酶作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。D．在循环过程中，引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸
　实战训练　
17．木耳营养价值很高，但长时间泡发的木耳可能会滋生一种细菌——椰毒假单胞菌，导致误食者出现恶心呕吐、腹胀、腹痛等症状。为检测泡发的木耳中是否滋生了椰毒假单胞菌，下列方法中，错误的是（　　）
A．对样本中的蛋白质种类进行鉴定B．对样本中含有的核苷酸种类进行鉴定C．利用PCR等技术对样本进行基因检测D．接种至固体培养基观察长出的菌落特征
　实战训练　
18．胰岛素可用于治疗糖尿病，我国科学家打破国外技术垄断，研发了拥有自主知识产权的重组人胰岛素药物，下列叙述错误的是（ ）
A．用PCR技术扩增人胰岛素基因时，每次循环包括变性、复性、延伸三步B．构建人胰岛素基因表达载体时，需使用限制性内切核酸酶和DNA连接酶C．大肠杆菌细胞经Ca2+处理后，更容易吸收重组的人胰岛素基因表达载体D．抗原-抗体杂交法不能检测人胰岛素基因表达载体是否导入大肠杆菌细胞
　实战训练　
19．将两对PCR引物作特殊的设计，外侧两个引物大小为25bp，复性温度较高（68℃）；内侧两个引物大小为17bp，复性温度较低（46℃）。通过控制复性温度（68℃）使外侧引物先行扩增，经过20～30次循环后（第一轮PCR结束），再降低复性温度（46℃）使内侧引物以第一轮PCR产物为模板进行再次扩增，整个过程被称为巢式PCR，该技术更适用于DNA含量低的待扩增的样品。两轮PCR反应均在一个PCR管中进行。下列说法错误的是（ ）
A．与常规PCR技术相比，两套引物的使用提高了扩增的特异性和敏感性B．第二轮PCR反应能否进行，是对第一轮PCR反应正确性的鉴定C．复性温度与引物长度成正相关D．在一个PCR管中进行两轮PCR反应均使用了相同的模板
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