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第59讲　微生物的培养技术及应用
1 下列有关无菌技术的说法正确的项数是(　　)
①无菌技术的关键是杀灭实验室中所有的微生物
②煮沸消毒法中100 ℃煮沸5～6 min可以杀死微生物细胞和所有芽孢、孢子
③经巴氏消毒法处理的食品因微生物未被彻底消灭，所以不能在常温长期保存
④将接种环直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧，可以迅速彻底地灭菌
⑤无菌技术中，若处理对象为液体，则只能消毒，不能灭菌
A. 2 B. 3 C. 4 D. 5
2 [2024天津卷]实验中常根据菌落外表特征鉴别微生物，进而对实验结果做出判断，下列实验不是根据菌落外表特征做出判断的是(　　)
A. 艾弗里证明肺炎链球菌的转化因子是DNA
B. 判断分离酵母菌的固体培养基是否被毛霉污染
C. 利用浸有抗生素的滤纸片筛选大肠杆菌中耐药性强的菌株
D. 判断在尿素为唯一氮源的培养基上生长的尿素降解菌是否有不同种类
3 [2025淮安联考]微生物需要从外界吸收营养物质并通过代谢来维持正常的生长和繁殖。下列与此有关的说法正确的是(　　)
A. 有的氮源可以作为细菌的能源物质
B. 加入酚红指示剂的培养基，可以筛选大肠杆菌
C. 大肠杆菌与分解尿素的细菌所利用的氮源相同
D. 以尿素为唯一氮源的培养基上长出的一定是能分解尿素的细菌
4 某同学用如图所示的接种方法对样品中的微生物进行分离实验。下列相关叙述正确的是(　　)
A. 该接种方法是涂布平板法，菌液应进行一系列梯度稀释
B. 将接种工具进行灼烧处理，冷却到50 ℃左右后再接种
C. 接种后的培养基倒置后置于摇床上振荡培养
D. 观察菌落时，应将培养皿盖拿掉以利于看清菌落的形态特征
5 养殖场粪便是农家肥的重要来源，其中某些微生物可使氨氮化合物转化为尿素进而产生NH3，影响畜禽健康。为筛选粪便中能利用氨氮化合物且减少NH3产生的微生物。某兴趣小组按图进行实验获得目的菌株，正确的是(　　)
A. ①通常在等比稀释后用平板划线法获取单个菌落
B. ②挑取在2种培养基上均能生长的用于后续的实验
C. ③可通过添加脲酶并检测活性，筛选得到甲、乙
D. 粪便中添加菌株甲比乙更有利于NH3的减少
6 工业生产中，常利用红酵母发酵生产β-胡萝卜素。培养红酵母时，碳源种类对β-胡萝卜素的产量有一定影响，相关数据如下表。下列有关叙述错误的是(　　)
碳源种类 麦芽糖 蔗糖 淀粉
Β-胡萝卜素含量/(mg/L) 3.52 4.81 1.68
A. 利用红酵母生产β-胡萝卜素时，应使用液体培养基并振荡培养
B. 蔗糖为碳源可提高β-胡萝卜素产量，还可维持培养液的渗透压
C. 培养过程中可使用平板划线法对红酵母进行计数，但数据会偏低
D. 利用紫外线处理红酵母得到高产菌株后，用甘油管藏法长期保存
7 [2026徐州月考]植酸酶能水解饲料中的植酸磷，将其转化为可吸收的无机磷，显著提高畜禽对磷的利用率，降低饲料成本。下图表示分离、纯化和保存产植酸酶菌株的过程，下列相关叙述正确的是(　　)
A. 将培养基分装于培养皿中后灭菌，可降低培养基被污染的概率
B. 筛选培养基中需要加入植酸酶的底物，通过菌落特征挑出产植酸酶的菌落
C. 涂布平板上长出的菌落数须为30～300时，才可以通过划线进一步纯化
D. 斜面培养基中含有大量营养物，可在常温下长期保存菌株
8 [2026南京月考]某研究小组通过实验来探究某种病原微生物对四种抗生素的敏感程度。图1为部分实验器材；图2中的Ⅰ～Ⅳ是将浸有相同浓度但不同种类抗生素的四个大小相同的滤纸片，分别贴在均匀涂布了测试菌的平板上培养一段时间后的结果。下列叙述正确的是(　　)
图1
图2
A. 接种测试菌的过程中，需要使用图1中器材①②③
B. 图2结果Ⅱ中抑菌圈较小，可能是病原微生物对药物较敏感
C. 图2结果Ⅳ中离滤纸片越近的菌落对该抗生素的抗性越强
D. 不同抗生素在平板上的扩散速度属于实验的无关变量
9 研究人员对布氏田鼠盲肠中的纤维素分解菌进行分离、鉴定，过程如图。下列说法正确的是(　　)
A. ①②③应在95%空气和5%氧气的气体环境中倒置培养
B. ①②③中的培养基是以纤维素为唯一碳源的选择培养基
C. 通过比较透明圈大小可知，甲、乙分解纤维素的能力相同
D. 若①②③菌落数分别为20、37、39，则内容物中纤维素分解菌密度为1.6×107个/mL
10 自生固氮菌是土壤中能独立进行固氮的细菌。科研人员进行了土壤中自生固氮菌的分离和固氮能力测定的研究，部分实验流程如图。已知步骤④获得的三个平板的菌落数分别为90、95、100，对照组平板为0。下列相关叙述正确的是(　　)
A. 步骤②振荡20 min的目的是扩大菌种数量，属于选择培养
B. 步骤④使用接种环划线接种，使用前需要灼烧灭菌
C. 1 g土壤中平均自生固氮菌数约为9.5×104个
D. ④所用培养基应加入碳源、无机盐、水和琼脂
11 [2025青岛模拟]随着能源和环境问题日益严峻，利用纤维素酶降解秸秆生产燃料乙醇，对缓解全球能源危机有着重大意义。科研人员开展筛选、诱变及选育高产纤维素酶菌株的相关研究，过程如下图。下列说法正确的是(　　)
A. 诱变选育高产菌株时，通过向培养基加入刚果红染液，选择透明圈大的即为目的菌株
B. 可使用紫外线进行诱变，无需筛选即可得到产纤维素酶高的菌种
C. 能在以纤维素为唯一碳源培养基中生长的菌株一定是纤维素分解菌
D. 富集培养应使用液体培养基，目的是能得到更多能产纤维素酶的菌株
12 (多选)青霉菌处在葡萄糖浓度不足的环境中时，会通过分泌青霉素杀死细菌，以保证自身生存所需的能量供应。下列说法正确的有(　　)
A. 青霉菌的这种特点是长期自然选择的结果
B. 生产青霉素时，不宜使用葡萄糖作为碳源
C. 青霉素能杀菌，生产青霉素的培养基无需灭菌
D. 青霉菌和周围细菌之间的关系为竞争关系
13 (多选)幽门螺杆菌(能产生脲酶)感染是急慢性胃炎和消化性溃疡的主要致病因素。在患者体内采集样本并制成菌液后进行分离培养。下列有关叙述正确的有(　　)
A. 分离纯化幽门螺杆菌时应使用以尿素为唯一氮源的培养基
B. 鉴别幽门螺杆菌时应在培养基中加入酚红指示剂和缓冲物质
C. 可用牛肉膏蛋白胨培养基作对照证明选择培养基的选择作用
D. 对幽门螺杆菌进行分离和计数可用平板划线法或稀释涂布平板法
14 (多选)[2026南京中华中学期中]抗生素是某些微生物产生的能杀死或抑制其他微生物生长的化学物质。下图表示从土壤中筛选某种抗生素产生菌的过程。下列叙述正确的有(　　)
A. 有些菌株无透明圈产生是因为其不能产生抗生素
B. 菌株的透明圈越大，其产生的抗生素抑制S菌效果越好
C. 接种测试菌3时，接种环可能在灼烧后未完全冷却
D. 测试菌2、5对该筛选出的菌产生的抗生素具有抗性
15 [2025南京月考]牛、羊等反刍动物具有特殊的器官——瘤胃。在瘤胃中生活着多种微生物，其中许多微生物能分解纤维素。某科研团队按照如图1所示的流程分离瘤胃中的纤维素分解菌，实验中需要甲、乙两种培养基。
图1
(1) 获得纯净的微生物培养物的关键是________，无菌技术主要包括________。
(2) 从①开始分离筛选纤维素分解菌，甲培养基中除含有水、无机盐、氮源外还应以________，该培养基按功能来分应为________培养基。甲、乙两培养基的主要区别是________。
(3) 过程②所使用的接种方法是____________。可在培养基表面均加入一层无菌的石蜡，其作用是_________________________________________。
(4) 刚果红可以与纤维素形成________复合物，但并不与纤维素降解产物纤维二糖和葡萄糖发生这种反应，研究人员在刚果红培养基平板上，筛到了几株有透明降解圈的菌落(见图2)，图中降解纤维素能力最强的菌株是________(填图中序号)，原因是__________________________。
图2
(5) 在5个细菌培养基平板上，均接种稀释倍数为104的胃部样液0.1 mL，培养一段时间后，平板上长出的细菌菌落数分别为189、25、417、175和179。则每毫升样品中含有细菌数量为_____________个。通过该方法所得细菌数量一般较实际结果________，原因是________________________________________。
第59讲　微生物的培养技术及应用
1 A
2 C　艾弗里将S型细菌的DNA、蛋白质、糖类等物质分离开，单独的、直接的观察它们各自的作用并进行对比，R型肺炎双球菌没有荚膜(菌落表面粗糙)，S型肺炎双球菌有荚膜(菌落表面光滑)，该实验是通过观察培养基上形成的不同菌落特征，来判断转化是否成功的，A不符合题意；毛霉属于多细胞的真菌，由细胞形成菌丝，可根据毛霉的形态判定固体培养基是否是被毛霉污染，B不符合题意；抗生素可消灭细菌，利用浸有抗生素的滤纸片筛选大肠杆菌中耐药性强的菌株是从抑菌圈边缘菌落挑取大肠杆菌来获得目的菌株，没有依靠菌落外表形态特征做出判断，C符合题意；不同尿素降解菌降解尿素的能力不同，因此在分离出的以尿素为唯一氮源的尿素降解菌后，若要验证其中是否有不同种类降解菌，可在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，接种并培养初步筛选的菌种，若根据菌落周围出现红色环带的大小判定其种类，D不符合题意。
3 A　有的氮源可以作为细菌的能源物质，如有机氮也可以作为细菌的能源物质，A正确；加入酚红指示剂的培养基不能筛选大肠杆菌，B错误；大肠杆菌利用的氮源是有机氮，分解尿素的细菌利用的氮源是尿素，C错误；以尿素为唯一氮源的培养基上长出的可能是固氮菌，它可以利用空气中的N2作为氮源，D错误。
4 A
5 C　平板划线法无需稀释，A错误；由图可知，②筛选不能在尿素唯一氮源培养基上生长，而能在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌株用于后续的实验，B错误；所筛选出的菌株之所以不能利用尿素，可能是由于不产生脲酶或分泌脲酶抑制剂，所以③可通过添加脲酶并检测活性，筛选得到甲、乙，C正确；由图可知，甲不产生脲酶而乙可以产生脲酶抑制剂，所以粪便中添加菌株乙比甲更有利于NH3的减少，D错误。
6 C　培养过程中可使用稀释涂布平板法对红酵母进行计数，但数据会偏低，C错误。
7 B　培养基的灭菌应在分装到培养皿之前进行，若分装后灭菌，培养皿也需灭菌，操作复杂且易污染，A错误；筛选产植酸酶的菌株时，需在培养基中加入植酸磷(植酸酶的底物)，能产植酸酶的菌株可分解植酸磷利用磷元素生长，通过菌落特征(如形状、大小、颜色等)可挑选出目标菌落，B正确；涂布平板法中，菌落数在30～300之间时可用于计数，但划线法纯化菌株对涂布平板的菌落数没有此限制，只要有单菌落生长即可通过划线进一步纯化，C错误；斜面培养基保存菌株时，需置于低温(如4 ℃冰箱)环境中，常温下菌株易代谢繁殖甚至死亡，无法长期保存，D错误。
8 D　为获得长满测试菌的平板，接种测试菌的过程中，需要使用图1中的①酒精灯、③培养皿、④涂布器，A错误；图2结果中Ⅱ抑菌圈较小，说明病原微生物对该抗生素的敏感性较低，而不是较敏感，B错误；抑菌圈中的菌落是涂布接种时的菌体形成的，菌落离滤纸片的距离与对该抗生素的抗性之间并无必然联系，C错误；不同抗生素在平板上的扩散速度属于实验的无关变量，应保持相同，D正确。
9 B　分析题意，菌株是从盲肠中分离的厌氧细菌，故在平板培养时需置于厌氧环境中，A错误；筛选纤维素分解菌需要以纤维素为唯一碳源，B正确；需要根据菌落和透明圈之间的直径作比较来判断分解能力的大小，甲、乙分解纤维素的能力不相同，C错误；若①②③菌落数分别为20(舍弃)、37、39，则平均菌落数是38，内容物中纤维素分解菌密度为C/V×M＝38/0.2×105＝1.9×107个/mL，D错误。
10 D　由题图可知，步骤②振荡20 min的目的是让样品中的微生物充分释放到无菌水中并均匀分布，A错误；由题图可知，步骤④获得的菌落分散在平板上，利用的是稀释涂布平板法，B错误；1 g土壤中平均自生固氮菌数约为(90＋95＋100)÷3÷0.1×104＝9.5×106个，C错误；该实验的目的是分离土壤中自生固氮菌和固氮能力的测定，自生固氮菌能够利用空气中的氮作为氮源，故④培养基中不需要加入氮源，D正确。
11 D　诱变选育高产菌株时，通过向培养基加入刚果红染液，应选择透明圈直径/菌落直径值最大的为目的菌株，A错误；基因突变具有不定向性和多害少利性，因此使用紫外线进行诱变需要对菌株进行筛选，B错误；能在以纤维素为唯一碳源培养基中生长的菌株可能是纤维素分解菌，也可能是一些自养型细菌，C错误。
12 ABD　青霉菌处在葡萄糖浓度不足的环境中时，会通过分泌青霉素杀死细菌，若用葡萄糖作为碳源，则青霉菌不会分泌青霉素，不利于生产青霉素，B正确；生产青霉素的培养基也需要灭菌，防止杂菌的污染，C错误；青霉菌和周围细菌利用相同的培养基，它们之间为竞争关系，D正确。
13 AC
14 BD　有些菌株无透明圈产生，可能是其产生的抗生素不能抑制指示菌S的生长，而非不能产生抗生素，A错误；接种测试菌3时，若接种环灼烧后未完全冷却，会导致测试菌3生长受抑制甚至死亡，而图中测试菌3有生长，因此接种环不可能未完全冷却，C错误。
15 (1) 防止杂菌污染　消毒和灭菌　(2) 纤维素为唯一碳源　选择 甲中无琼脂　(3) 稀释涂布平板法　瘤胃中的纤维素分解菌属于厌氧微生物，石蜡密封创设无氧环境，有利于瘤胃中的纤维素分解菌生长发育　(4) 红色　菌落①　降解圈直径和菌落直径比值最大　(5) 1.81×107　偏低　当两个或多个菌落连在一起时，平板上观察到的只是单个菌落
解析：(5) 在5个细菌培养基平板上，均接种稀释倍数为104的胃部样液0.1 mL，培养一段时间后，平板上长出的细菌菌落数分别为189、25、417、175和179，一般取菌落数在30～300之间的平板，则平板的平均菌落数为(189＋175＋179)÷3＝181，则每毫升土壤样液中的细菌数量约为181÷0.1×104＝1.81×107个。由于当两个或多个菌落连在一起时，平板上观察到的只是单个菌落，所以通过该方法所得细菌数量一般较实际结果偏低。(共47张PPT)
第11单元
生物技术与工程
第59讲　微生物的培养技术及应用
内容索引
核心体系
学习目标
活动方案
名卷优选
学 习 目 标
1. 阐明培养基的成分和种类。2. 了解纯化酵母菌的方法和操作过程，说出消毒与灭菌的区别。3. 举例说明微生物接种和培养的方法。4. 举例说明分离和计数某种特定的目标微生物的原理、方法等。
核 心 体 系
活 动 方 案
下面是某微生物培养基的配方表，请回答下列问题。
活动一　阐明培养基的成分和种类
编号 ① ② ③ ④ ⑤
成分 (NH4)2SO4 KH2PO4 FeSO4 CaCl2 H2O
含量 0.4 g 4.0 g 0.5 g 0.5 g 100 mL
(1) 按物理性质划分，此培养基属于什么类型？原因是什么？
【答案】 液体培养基。没有加凝固剂(琼脂)。
(2) 按功能划分，此培养基属于什么培养基？原因是什么？此培养基能培养什么类型的微生物？
【答案】 选择培养基。因为没有碳源，只有自养型微生物才能生长(利用空气中的CO2)。
(3) 此培养基含有的微生物的营养成分包括哪几类？若加入氨基酸，则它可充当的营养成分是什么？
【答案】 水、无机盐和氮源三类。碳源、氮源和生长因子。
(4) 若要观察微生物的菌落特征，培养基中应添加的成分是什么？
【答案】 凝固剂(琼脂)。
(5) 若用该培养基来分离尿素分解菌，应除去表中哪一类成分？同时还需添加什么成分？
【答案】 (NH4)2SO4。加入尿素和不含氮元素的有机物。
(6) 培养基需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及O2的需求，请补充完成下表。
微生物 对培养基的需求
乳酸杆菌 添加________
霉菌 将培养基调至____性
细菌 将培养基调至____________性
厌氧微生物 提供______的条件
维生素
酸
中性或弱碱
无氧
下图是酵母菌纯培养的操作步骤。请回答下列问题。
步骤1：制备培养基→步骤2：接种和分离→步骤3：培养→步骤4：结果分析与评价
(1) 培养基的配制原则有哪些？调节pH需要在灭菌之前进行，原因是什么？培养酵母菌常用哪种培养基？
【答案】 目的明确、营养协调、pH适宜等。灭菌后调节pH，容易造成杂菌污染。马铃薯葡萄糖培养基。
活动二　了解纯化酵母菌的方法和操作过程、熟悉灭菌和无菌操作的要求
(2) 什么是纯培养物？什么叫纯培养？通常包括哪些步骤过程？
【答案】 由单一个体繁殖所获得的微生物群体是纯培养物。获得纯培养物的过程就是纯培养。包括配制培养基、灭菌、接种、分离和培养等。
(3) 获得纯净的微生物培养物的关键是______________。培养基灭菌采用的方法是______________，该方法灭菌的条件是_________________ ___________________________________，在这种条件下，不仅杀死微生物的__________，还能杀死微生物的______________。
防止杂菌污染
高压蒸汽灭菌
在压力为100 kPa、
温度为121 ℃的条件下保持15～30 min
营养体
芽孢、孢子
(4) 培养皿、接种针等工具还可以用干热灭菌法进行灭菌，干热灭菌时的温度是_____________，灭菌时间是________。
(5) 培养基灭菌后，需要冷却到______℃左右时，才能用来倒平板。可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶来估计培养基温度；倒平板在酒精灯火焰附近进行，目的是_________________________________________；平板冷却凝固后，需将平板倒置，目的是___________________________ _____________________________________。
(6) 步骤2可采用____________法纯化、分离微生物。
160～170 ℃
1～2 h
50
酒精灯火焰周围存在无菌区，避免杂菌污染
防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染；避免培养基水分过快蒸发
平板划线
(7) 步骤3培养时如何检测是否有杂菌污染？
【答案】 设置对照组(未接种平板)与实验组(接种)一起培养，对照组若有菌落生长，则说明培养基被杂菌污染。
(8) 如何根据实验结果判断分离是否成功？
【答案】 接种的培养基表面出现单菌落，菌落大小、形状、颜色等一致，且符合该微生物特征。
为了调查某河流的水质状况，某研究小组测定了该河流水样中的大肠杆菌含量，并进行了大肠杆菌的分离等工作。请回答下列问题。
(1) 该小组采用稀释涂布平板法检测水样中的细菌含量。在涂布接种前，随机取若干灭菌后的空平板先行培养了一段时间，这样做的目的是什么？在涂布平板时，滴加到培养基表面的菌悬液量不宜过多的原因是什么？
【答案】 检查培养基灭菌是否彻底。培养基表面的菌悬液会出现积液，导致菌体堆积，影响分离效果。
活动三　举例说明微生物接种和培养方法
(2) 该小组采用平板划线法分离水样中的细菌。操作时，接种环通过________灭菌，在第二次及以后划线时，总是从上一次的末端开始划线。这样做的目的是什么？
【答案】 将聚集的菌体逐步稀释以便获得单个菌落。
(3) 平板划线法如果划线5次需要灼烧接种环多少次？第一次划线前、每次划线前、划线结束后灼烧接种环的目的分别是什么？
【答案】 6次。第一次划线前：杀死接种环上的微生物，避免污染培养物；每次划线前：杀死残留菌种，保证每次划线菌种来自上次划线末端；划线结束后：杀死残留菌种，避免污染环境和感染操作者。
灼烧
(4) 接种环和涂布器都通过________灭菌。将涂布器从酒精中取出时，要让__________________________，然后再放在火焰上灼烧。
(5) 下图是采用两种接种法接种后培养的结果，A、B分别采用的是什么接种法？
A
B
【答案】 A是平板划线法，B是稀释涂布平板法。
灼烧
多余的酒精在烧杯中滴尽
(6) 该小组将得到的菌株接种到液体培养基中并混匀，一部分进行静置培养，另一部分进行振荡培养。结果发现：振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。原因是什么？
【答案】 振荡培养能提高培养液的溶解氧的含量，同时可以使菌体与培养液充分接触，提高营养物质的利用率。
(7) 一般情况下，使用过的培养基不能随便丢弃，原因是什么？应该如何处理？
【答案】 有些微生物可能是致病微生物，需灭菌后方可丢弃。
尿素是一种重要的农业氮肥，不能直接被农作物吸收，只有当土壤中的微生物将尿素分解后才能被植物吸收利用，因此对土壤中分解尿素的微生物进行分离和鉴定具有重要意义。下图表示研究者从土壤中筛选分解尿素的细菌并计数的相关实验，请据图回答下列问题。
活动四　举例说明分离某种特定微生物的过程
(1) 选择培养的作用原理：人为提供____________________的条件(包括营养、温度、pH等)，同时______________________________。
有利于目的菌生长
抑制或阻止其他微生物的生长
(2) 进行过程①和②的目的分别是__________和__________________ _________；图中弧线箭头上“？”的具体操作是____________。
(3) 进行培养基配制和灭菌时，灭菌与调节pH的先后顺序是______________________。纯化菌种时为了得到单一菌落，常采用的接种方法是______________和__________________。
(4) 若分离得到的是尿素分解菌，该培养基中尿素作为________。培养基中pH升高，酚红指示剂变为______色，pH升高的原因是______________________________________。
选择培养
增加分解尿素的细
菌的数量
挑出菌落
先调节pH，后灭菌
平板划线法
稀释涂布平板法
氮源
红
尿素分解菌合成的脲酶将尿素分解成氨
(5) 若分离的是纤维素分解菌，配制培养基的特点是？简述鉴别原理？
【答案】 以纤维素作为唯一碳源。刚果红可以与像纤维素这样的多糖物质结合形成红色复合物，但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。在含有纤维素的培养基中加入刚果红，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。
(6) 实验过程中如何防止其他微生物的污染？
【答案】 培养基灭菌，接种环境灭菌，接种过程无菌操作。
(7) 研究者可以通过观察培养形成的菌落的____________________、隆起程度等特征，来判断培养基上是否感染了其他细菌。在实验中，研究者每隔24 h统计一次菌落数目，并选取菌落数目稳定时的记录作为结果，这样可以防止__________________________________。
形状、大小、颜色
因培养时间不足导致遗漏细菌数目
自然界中的微生物往往是混杂生长的。人们在研究微生物时一般要将它们分离提纯，然后进行数量的测定。下面是对大肠杆菌进行数量测定的实验，请回答有关问题。
(1) 制备稀释倍数为102、103、104、105、106的系列稀释液。
(2) 为了得到更加准确的结果，你选用__________________接种样品。
活动五　举例说明微生物的计数方法
稀释涂布平板法
(3) 适宜温度下培养。
结果分析：
①测定的大肠杆菌数，为了保证结果准确，一般选择菌落数为__________的平板进行计数。在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下4种统计结果，与事实更加接近的是______。
A. 涂布了1个平板，统计的菌落数是230
B. 涂布了2个平板，统计的菌落数是215和260，取平均值238
C. 涂布了3个平板，统计的菌落数分别是221、212和56，取平均值163
D. 涂布了3个平板，统计的菌落数分别是210、240和256，取平均值235
30～300
D
②一同学在稀释倍数为106的培养基中测得平板上菌落数的平均值为212，那么每毫升样品中的菌落数是(涂布平板时所用稀释液的体积为 0.2 mL)_____________。
③用这种方法测定密度，实际活菌数量要比测得的数量______，原因是______________________________________________________。若采用直接计数法(显微计数法)计数，结果可能________的原因是____________________________________。
④某同学在测定大肠杆菌的密度时发现，在培养基上还有其他杂菌的菌落，能否肯定该大肠杆菌的品系被污染了？为什么？
【答案】 不能，因为不能排除杂菌来自培养基或来自培养过程。
1.06×109个
多
当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察的是一个菌落
偏大
计数的结果是死菌数与活菌数的总和
名 卷 优 选
2
4
5
1
3
7
6
8
1. [2025镇江检测]防止杂菌污染是获得纯净的微生物培养物的关键。下列叙述错误的是(　　)
A. 利用微生物能够寄生于多种细菌体内使细菌裂解，可实现生物消毒
B. 利用紫外线对超净工作台进行消毒前，喷洒消毒液可加强消毒效果
C. 利用干热灭菌箱对培养基进行灭菌时，应在160 ℃的热空气中维持2～3 h
D. 利用酒精灯对金属用具进行灼烧灭菌时，应在酒精灯火焰充分燃烧层进行
C
2
4
5
1
3
7
6
8
【解析】 有的微生物能够寄生于多种细菌体内使细菌裂解，因此可以使用这些微生物进行生物消毒，如净化污水、污泥等，A正确；干热灭菌应在160 ℃～170 ℃的热空气中维持1～2 h，培养基一般用高压蒸汽灭菌法，C错误；接种环等金属用具一般用灼烧灭菌，即直接在酒精灯火焰充分燃烧层灼烧灭菌，D正确。
2
4
5
1
3
7
6
8
2. [2025福建卷]科研人员将光合系统相关基因整合到大肠杆菌后，该菌能在无碳源培养基中生长繁殖。下列叙述错误的是(　　)
A. 必需整合光反应和暗反应系统的相关基因
B. 暗反应所需的所有能量来源于细胞中的ATP
C. 改造成功的大肠杆菌可用CO2作为唯一碳源
D. 该菌在无碳源培养基中生长繁殖一定需要光照
B
2
4
5
1
3
7
6
8
【解析】 光反应和暗反应两者缺一不可，因此必须整合光反应和暗反应相关基因，A正确；暗反应的能量不仅来源于ATP，还需NADPH提供能量且作为还原剂，B错误；改造后的大肠杆菌通过暗反应固定CO2合成有机物，CO2可作为唯一碳源，C正确；光反应需要光照提供能量，若培养基无碳源，菌体必须依赖光反应进行自养，因此生长繁殖需要光照，D正确。
2
4
5
3
7
6
8
3. 下列关于土壤中分解尿素的细菌的分离与计数的叙述，正确的是(　　)
A. 只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素
B. 筛选分解尿素的细菌时，应以尿素作为培养基中唯一的营养物质
C. 统计样品中的活菌数目一般用平板划线法
D. 在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，若指示剂变蓝，则表明筛选到了分解尿素的细菌
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A
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8
4. [2026江苏百校联考]为了提高乳糖酶的产量，科研人员从奶酪中分离纯化出了能高效生产乳糖酶的酵母菌，操作过程如图所示。其中X－gal是一种无色物质，能被乳糖酶分解为半乳糖和蓝色的溴靛蓝，使菌落呈蓝色。下列相关叙述正确的是(　　)
1
A. 将菌液接种到培养基乙所采用的方法是平板划线法
B. 含X－gal培养基从功能上划分，属于选择培养基
C. 纯培养过程中，配制好培养基后须依次进行灭菌、调节酸碱度和倒平板操作
D. 牛奶中添加适量乳糖酶获得无乳糖牛奶，一般不会破坏牛奶中的其他营养成分
D
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1
【解析】 将菌液接种到培养基乙所采用的方法是稀释涂布平板法，A错误；“X－gal是一种无色物质，能被乳糖酶分解为半乳糖和蓝色的溴靛蓝，使菌落呈蓝色”，含X－gal培养基从功能上划分，应属于鉴别培养基，B错误；纯培养过程中，培养基配制好后，需先进行酸碱度的调节，然后灭菌，最后进行倒平板操作，如果先灭菌再调节酸碱度，会引入杂菌，影响培养基的无菌性，C错误；乳糖酶专一性地分解乳糖，牛奶中添加适量乳糖酶获得无乳糖牛奶，一般不会破坏牛奶中的其他营养成分，D正确。
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8
5. [2026南通通州期中]某种除草剂不易降解，长期使用会污染土壤。研究人员按下图流程，选育能降解该除草剂的细菌(含一定量该除草剂的培养基不透明)。下列相关叙述正确的是(　　)
1
A. 进行Ⅰ操作前，必须对土壤液进行等比稀释
B. 由Ⅱ可推测，接种环共进行了5次灼烧灭菌
C. 配制Ⅱ、Ⅲ的培养基时，先湿热灭菌再调节pH
D. Ⅲ中透明圈直径/菌落直径的比值越大，说明其降解效果越好
D
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3
7
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8
1
【解析】 蘸取上清液前不需等比稀释土壤液，因为图Ⅱ中的接种方法是平板划线法，A错误；接种需在酒精灯火焰周围进行，每次接种前需对接种环进行灼烧灭菌，以去除接种环上残留的菌液，由Ⅱ可推测，接种环共进行了6次灼烧灭菌，B错误；配制Ⅱ、Ⅲ的培养基时，先调节pH，再湿热灭菌，C错误；透明圈是降解该除草剂而形成的，故Ⅲ中透明圈/菌落面积比值越大说明其降解效果越好，D正确。
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6. [2025盐城射阳中学模拟]某野生型细菌能通过图Ⅰ途径合成色氨酸，其突变株则不能。将突变株TrpB、TrpC、TrpE(仅图1中的某一步受阻)分别接种在图2培养基的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 区域，短时间培养三个区域均有少量细菌生长增殖，继续培养后Ⅰ区域的两端和Ⅱ区域的一端的菌株继续生长增殖，而 Ⅲ 区域菌株不再生长。下列叙述不正确的是(　　)
1
图1　色氨酸合成途径
图2
A
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6
8
A. 配制图2培养基时加入了琼脂和少量色氨酸，pH通常呈酸性
B. 使用接种环接种3种突变菌株，接种前需对接种环进行灼烧灭菌
C. TrpC菌株继续生长增殖的一端为靠近Ⅲ区域的一端
D. TrpE菌株不再生长可能是由于缺乏催化吲哚合成色氨酸的酶
1
【解析】 该培养基是固体培养基，所以加入了琼脂，从接种后短时间三个区域均有少量细菌生长增殖可知，培养基中加入了少量色氨酸，能让突变株在短时间生长，细菌生长的培养基pH通常呈中性或微碱性，而不是酸性，A错误。在微生物接种操作中，使用接种针或接种环接种前需进行灼烧灭菌，以杀死接种针或接种环上可能存在的微生物，防止杂菌污染，B正确。Ⅲ区域菌株不再生长，说明不能利用其他两种
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3
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8
1
突变体合成的物质，应是最后一环节受阻；Ⅰ区域的两端菌株继续生长增殖，说明可以利用其他两种突变体合成的物质，应是第一环节受阻；从色氨酸合成途径来看，TrpC突变株是邻氨基苯甲酸合成吲哚这一步受阻，Ⅰ区域的两端和Ⅱ区域的一端的菌株继续生长增殖，说明Ⅲ区域能为TrpC突变株提供吲哚，所以TrpC菌株继续生长增殖的一端为靠近Ⅲ区域的一端(因为Ⅲ区域能产生吲哚，扩散到 Ⅱ区域靠近Ⅲ区域的一端，使TrpC突变株能继续生长)，C正确。TrpE突变株不能生长，根据色氨酸合成途径，可能是由于缺乏催化吲哚合成色氨酸的酶，导致无法合成色氨酸，在培养基中少量色氨酸消耗完后就不能再生长，D正确。
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3
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8
7. (多选)研究人员拟从土壤样品中分离出高效降解甲醇的酵母并进行大量培养，操作流程如下。下列相关叙述正确的有( )
1
BD
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5
3
7
6
8
A. 为保证无菌操作，培养基、接种环等使用前都必须干热灭菌
B. 平板浇注分离法适宜于厌氧型或兼性厌氧型的微生物的分离和计数
C. 挑取菌落时，应挑取多个菌落，分别测定酵母细胞中甲醇的含量
D. 扩大培养时，可以通过监测发酵过程中残余糖的浓度来决定何时终止发酵
1
2
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1
【解析】 为从土壤样品中分离出高效降解甲醇的酵母，要保证全程无菌操作，对培养基、接种环等进行灭菌处理，其中培养基使用高压蒸汽灭菌，而接种环使用灼烧灭菌，A错误；平板浇注分离法适宜于厌氧型或兼性厌氧型的微生物的分离和计数，B正确；挑取菌落时，应挑取多个菌落，分别测定培养液中甲醇的含量，C错误；发酵液中残留糖的浓度可指示发酵的进程，随着发酵的进行，当发酵液中糖的浓度降到较低水平时，酵母代谢减慢，此时可终止发酵，D正确。
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8
8. 泡菜传统自然发酵方式的发酵周期相对较长，生产效率低。研究人员欲从泡菜中分离筛选出高产酸乳酸菌，为泡菜工厂化生产提供依据。请分析并回答下列问题。
(1) 配制CaCO3-MRS培养基
成分：蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、磷酸氢二钾、葡萄糖、琼脂粉、碳酸钙等。
①根据物理性质分类，该培养基属于________培养基，为乳酸菌提供氮源的成分是__________________________；
②培养过程中，乳酸菌产生乳酸溶解碳酸钙，形成溶钙圈，便于____________________。
1
固体
蛋白胨、牛肉膏、酵母粉
筛选高产酸乳酸菌
2
4
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3
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6
8
(2) 高产酸乳酸菌的培养与分离
其部分实验目的与具体操作如下表所示，请完成下表。
1
实验目的 简要操作过程
梯度稀释 在无菌条件下取样品中泡菜汁1 mL，加入①______________进行10倍梯度稀释，依次得到10－5、10－6、10－7的稀释液
接种培养 分别取上述稀释液1 mL加入无菌培养皿中，然后将CaCO3-MRS培养基浇注混匀冷凝后，将培养皿②______，并连续培养48 h
分离纯化 挑取③____________________进行平板划线培养
长期保存 将菌种加入30%的甘油中在－20 ℃保存
9 mL无菌水
倒置
有明显溶钙圈的菌落
2
4
5
3
7
6
8
(3) 高产酸乳酸菌的鉴定
提取筛选乳酸菌的DNA，通常采用16S rDNA(编码rRNA对应的DNA序列)的通用引物进行PCR扩增并测序鉴定。以16S rDNA作为细菌分类依据的原因是不同菌属的16S rDNA具有____________。
1
差(特)异性
2
4
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3
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6
8
(4) 高产酸乳酸菌发酵效果检测
研究人员研究了两种高产酸乳酸菌(乳酸菌A50f7和A50b9)在发酵泡菜过程中pH的变化，结果如下图所示。据图分析，该研究实验的自变量是_____________________________，可以看出，接种两种乳酸菌效果相近，其相近之处表现为均能快速降低_______________________，且接种量越大作用效果越明显。
1
图1
图2
乳酸菌种类和接种量(发酵时间)
泡菜发酵过程中的pH值
2
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7
6
8
1
【解析】 (1) ①该培养基含有琼脂，琼脂是凝固剂，根据物理性质分类，该培养基属于固体培养基；氮源是指提供氮元素的物质，蛋白胨、牛肉膏、酵母粉含有氮元素，可为乳酸菌提供氮源。②培养基中含有碳酸钙，乳酸菌产生乳酸会与碳酸钙反应形成溶钙圈，便于筛选高产酸乳酸菌。(2) 要分离和培养高产酸乳酸菌，首先可以对泡菜汁进行梯度稀释，稀释时需要用无菌水，如1 mL泡菜汁＋9 mL无菌水，相当于对泡菜汁稀释了10倍，以此类推；培养时为了防止冷凝水滴落冲散菌落，应将培养皿倒置培养；溶钙圈明显的菌落，产乳酸的能力强，应挑选有明显溶钙圈的菌落进行平板划线培养。(3) 不同菌属的16S rDNA具有差(特)异性，PCR能鉴定不同的DNA。(4) 自变量是人为改变的量，据图分析，该研究实验的自变量是乳酸菌种类(乳酸菌A50f7和A50b9)和接种量(发酵时间)；结合图示结果可知，两种乳酸菌均能快速降低泡菜发酵过程中的pH值，且接种量越大作用效果越明显，效果相近。
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学习目标　1. 阐明培养基的成分和种类。2. 了解纯化酵母菌的方法和操作过程，说出消毒与灭菌的区别。3. 举例说明微生物接种和培养的方法。4. 举例说明分离和计数某种特定的目标微生物的原理、方法等。
核心体系
活动方案
活动一 阐明培养基的成分和种类
下面是某微生物培养基的配方表，请回答下列问题。
编号 ① ② ③ ④ ⑤
成分 (NH4)2SO4 KH2PO4 FeSO4 CaCl2 H2O
含量 0.4 g 4.0 g 0.5 g 0.5 g 100 mL
(1) 按物理性质划分，此培养基属于什么类型？原因是什么？
(2) 按功能划分，此培养基属于什么培养基？原因是什么？此培养基能培养什么类型的微生物？
(3) 此培养基含有的微生物的营养成分包括哪几类？若加入氨基酸，则它可充当的营养成分是什么？
(4) 若要观察微生物的菌落特征，培养基中应添加的成分是什么？
(5) 若用该培养基来分离尿素分解菌，应除去表中哪一类成分？同时还需添加什么成分？
(6) 培养基需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及O2的需求，请补充完成下表。
微生物 对培养基的需求
乳酸杆菌 添加________
霉菌 将培养基调至________性
细菌 将培养基调至________性
厌氧微生物 提供________的条件
活动二 了解纯化酵母菌的方法和操作过程、熟悉灭菌和无菌操作的要求
下图是酵母菌纯培养的操作步骤。请回答下列问题。
步骤1：制备培养基→步骤2：接种和分离→步骤3：培养→步骤4：结果分析与评价
(1) 培养基的配制原则有哪些？调节pH需要在灭菌之前进行，原因是什么？培养酵母菌常用哪种培养基？
(2) 什么是纯培养物？什么叫纯培养？通常包括哪些步骤过程？
(3) 获得纯净的微生物培养物的关键是______。培养基灭菌采用的方法是______________________，该方法灭菌的条件是__________________________，在这种条件下，不仅杀死微生物的_______________，还能杀死微生物的_______
_____。
(4) 培养皿、接种针等工具还可以用干热灭菌法进行灭菌，干热灭菌时的温度是________，灭菌时间是________。
(5) 培养基灭菌后，需要冷却到________℃左右时，才能用来倒平板。可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶来估计培养基温度；倒平板在酒精灯火焰附近进行，目的是____________________________________；平板冷却凝固后，需将平板倒置，目的是_____________________________________________________________。
(6) 步骤2可采用________法纯化、分离微生物。
(7) 步骤3培养时如何检测是否有杂菌污染？
(8) 如何根据实验结果判断分离是否成功？
活动三 举例说明微生物接种和培养方法
为了调查某河流的水质状况，某研究小组测定了该河流水样中的大肠杆菌含量，并进行了大肠杆菌的分离等工作。请回答下列问题。
(1) 该小组采用稀释涂布平板法检测水样中的细菌含量。在涂布接种前，随机取若干灭菌后的空平板先行培养了一段时间，这样做的目的是什么？在涂布平板时，滴加到培养基表面的菌悬液量不宜过多的原因是什么？
(2) 该小组采用平板划线法分离水样中的细菌。操作时，接种环通过________灭菌，在第二次及以后划线时，总是从上一次的末端开始划线。这样做的目的是什么？
(3) 平板划线法如果划线5次需要灼烧接种环多少次？第一次划线前、每次划线前、划线结束后灼烧接种环的目的分别是什么？
(4) 接种环和涂布器都通过________灭菌。将涂布器从酒精中取出时，要让______________________，然后再放在火焰上灼烧。
(5) 下图是采用两种接种法接种后培养的结果，A、B分别采用的是什么接种法？
A B
(6) 该小组将得到的菌株接种到液体培养基中并混匀，一部分进行静置培养，另一部分进行振荡培养。结果发现：振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。原因是什么？
(7) 一般情况下，使用过的培养基不能随便丢弃，原因是什么？应该如何处理？
活动四 举例说明分离某种特定微生物的过程
尿素是一种重要的农业氮肥，不能直接被农作物吸收，只有当土壤中的微生物将尿素分解后才能被植物吸收利用，因此对土壤中分解尿素的微生物进行分离和鉴定具有重要意义。下图表示研究者从土壤中筛选分解尿素的细菌并计数的相关实验，请据图回答下列问题。
(1) 选择培养的作用原理：人为提供________的条件(包括营养、温度、pH等)，同时____________。
(2) 进行过程①和②的目的分别是____________和______________________；图中弧线箭头上“？”的具体操作是________________。
(3) 进行培养基配制和灭菌时，灭菌与调节pH的先后顺序是_____________
_____________________。纯化菌种时为了得到单一菌落，常采用的接种方法是______________和______________。
(4) 若分离得到的是尿素分解菌，该培养基中尿素作为________。培养基中pH升高，酚红指示剂变为________色，pH升高的原因是_____________________
_______________________________________________。
(5) 若分离的是纤维素分解菌，配制培养基的特点是？简述鉴别原理？
(6) 实验过程中如何防止其他微生物的污染？
(7) 研究者可以通过观察培养形成的菌落的________________、隆起程度等特征，来判断培养基上是否感染了其他细菌。在实验中，研究者每隔24 h统计一次菌落数目，并选取菌落数目稳定时的记录作为结果，这样可以防止____________
______________________________________。
活动五 举例说明微生物的计数方法
自然界中的微生物往往是混杂生长的。人们在研究微生物时一般要将它们分离提纯，然后进行数量的测定。下面是对大肠杆菌进行数量测定的实验，请回答有关问题。
(1) 制备稀释倍数为102、103、104、105、106的系列稀释液。
(2) 为了得到更加准确的结果，你选用________接种样品。
(3) 适宜温度下培养。
结果分析：
①测定的大肠杆菌数，为了保证结果准确，一般选择菌落数为________的平板进行计数。在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下4种统计结果，与事实更加接近的是________。
A. 涂布了1个平板，统计的菌落数是230
B. 涂布了2个平板，统计的菌落数是215和260，取平均值238
C. 涂布了3个平板，统计的菌落数分别是221、212和56，取平均值163
D. 涂布了3个平板，统计的菌落数分别是210、240和256，取平均值235
②一同学在稀释倍数为106的培养基中测得平板上菌落数的平均值为212，那么每毫升样品中的菌落数是(涂布平板时所用稀释液的体积为0.2 mL)__________。
③用这种方法测定密度，实际活菌数量要比测得的数量________，原因是__________________。若采用直接计数法(显微计数法)计数，结果可能________的原因是__________________________________________。
④某同学在测定大肠杆菌的密度时发现，在培养基上还有其他杂菌的菌落，能否肯定该大肠杆菌的品系被污染了？为什么？
名卷优选
1. [2025镇江检测]防止杂菌污染是获得纯净的微生物培养物的关键。下列叙述错误的是(　　)
A. 利用微生物能够寄生于多种细菌体内使细菌裂解，可实现生物消毒
B. 利用紫外线对超净工作台进行消毒前，喷洒消毒液可加强消毒效果
C. 利用干热灭菌箱对培养基进行灭菌时，应在160 ℃的热空气中维持2～3 h
D. 利用酒精灯对金属用具进行灼烧灭菌时，应在酒精灯火焰充分燃烧层进行
2. [2025福建卷]科研人员将光合系统相关基因整合到大肠杆菌后，该菌能在无碳源培养基中生长繁殖。下列叙述错误的是(　　)
A. 必需整合光反应和暗反应系统的相关基因
B. 暗反应所需的所有能量来源于细胞中的ATP
C. 改造成功的大肠杆菌可用CO2作为唯一碳源
D. 该菌在无碳源培养基中生长繁殖一定需要光照
3. 下列关于土壤中分解尿素的细菌的分离与计数的叙述，正确的是(　　)
A. 只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素
B. 筛选分解尿素的细菌时，应以尿素作为培养基中唯一的营养物质
C. 统计样品中的活菌数目一般用平板划线法
D. 在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，若指示剂变蓝，则表明筛选到了分解尿素的细菌
4. [2026江苏百校联考]为了提高乳糖酶的产量，科研人员从奶酪中分离纯化出了能高效生产乳糖酶的酵母菌，操作过程如图所示。其中Xgal是一种无色物质，能被乳糖酶分解为半乳糖和蓝色的溴靛蓝，使菌落呈蓝色。下列相关叙述正确的是(　　)
A. 将菌液接种到培养基乙所采用的方法是平板划线法
B. 含Xgal培养基从功能上划分，属于选择培养基
C. 纯培养过程中，配制好培养基后须依次进行灭菌、调节酸碱度和倒平板操作
D. 牛奶中添加适量乳糖酶获得无乳糖牛奶，一般不会破坏牛奶中的其他营养成分
5. [2026南通通州期中]某种除草剂不易降解，长期使用会污染土壤。研究人员按下图流程，选育能降解该除草剂的细菌(含一定量该除草剂的培养基不透明)。下列相关叙述正确的是(　　)
A. 进行Ⅰ操作前，必须对土壤液进行等比稀释
B. 由Ⅱ可推测，接种环共进行了5次灼烧灭菌
C. 配制Ⅱ、Ⅲ的培养基时，先湿热灭菌再调节pH
D. Ⅲ中透明圈直径/菌落直径的比值越大，说明其降解效果越好
6. [2025盐城射阳中学模拟]某野生型细菌能通过图Ⅰ途径合成色氨酸，其突变株则不能。将突变株TrpB、TrpC、TrpE(仅图1中的某一步受阻)分别接种在图2培养基的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 区域，短时间培养三个区域均有少量细菌生长增殖，继续培养后Ⅰ区域的两端和Ⅱ区域的一端的菌株继续生长增殖，而 Ⅲ 区域菌株不再生长。下列叙述不正确的是(　　)
图1　色氨酸合成途径 图2
A. 配制图2培养基时加入了琼脂和少量色氨酸，pH通常呈酸性
B. 使用接种环接种3种突变菌株，接种前需对接种环进行灼烧灭菌
C. TrpC菌株继续生长增殖的一端为靠近Ⅲ区域的一端
D. TrpE菌株不再生长可能是由于缺乏催化吲哚合成色氨酸的酶
7. (多选)研究人员拟从土壤样品中分离出高效降解甲醇的酵母并进行大量培养，操作流程如下。下列相关叙述正确的有(　　)
A. 为保证无菌操作，培养基、接种环等使用前都必须干热灭菌
B. 平板浇注分离法适宜于厌氧型或兼性厌氧型的微生物的分离和计数
C. 挑取菌落时，应挑取多个菌落，分别测定酵母细胞中甲醇的含量
D. 扩大培养时，可以通过监测发酵过程中残余糖的浓度来决定何时终止发酵
8. 泡菜传统自然发酵方式的发酵周期相对较长，生产效率低。研究人员欲从泡菜中分离筛选出高产酸乳酸菌，为泡菜工厂化生产提供依据。请分析并回答下列问题。
(1) 配制CaCO3 MRS培养基
成分：蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、磷酸氢二钾、葡萄糖、琼脂粉、碳酸钙等。
①根据物理性质分类，该培养基属于________培养基，为乳酸菌提供氮源的成分是________________________；
②培养过程中，乳酸菌产生乳酸溶解碳酸钙，形成溶钙圈，便于____________
____。
(2) 高产酸乳酸菌的培养与分离
其部分实验目的与具体操作如下表所示，请完成下表。
实验目的 简要操作过程
梯度稀释 在无菌条件下取样品中泡菜汁1 mL，加入①________进行10倍梯度稀释，依次得到10-5、10-6、10-7的稀释液
接种培养 分别取上述稀释液1 mL加入无菌培养皿中，然后将CaCO3 MRS培养基浇注混匀冷凝后，将培养皿②________，并连续培养48 h
分离纯化 挑取③______________进行平板划线培养
长期保存 将菌种加入30%的甘油中在－20 ℃保存
(3) 高产酸乳酸菌的鉴定
提取筛选乳酸菌的DNA，通常采用16S rDNA(编码rRNA对应的DNA序列)的通用引物进行PCR扩增并测序鉴定。以16S rDNA作为细菌分类依据的原因是不同菌属的16S rDNA具有________。
(4) 高产酸乳酸菌发酵效果检测
研究人员研究了两种高产酸乳酸菌(乳酸菌A50f7和A50b9)在发酵泡菜过程中pH的变化，结果如下图所示。据图分析，该研究实验的自变量是___________
_____________________，可以看出，接种两种乳酸菌效果相近，其相近之处表现为均能快速降低_____________，且接种量越大作用效果越明显。
图1 图2
第59讲　微生物的培养技术及应用
【活动方案】
活动一
(1) 液体培养基。没有加凝固剂(琼脂)。
(2) 选择培养基。因为没有碳源，只有自养型微生物才能生长(利用空气中的CO2)。
(3) 水、无机盐和氮源三类。碳源、氮源和生长因子。
(4) 凝固剂(琼脂)。
(5) (NH4)2SO4。加入尿素和不含氮元素的有机物。
(6) 维生素　酸　中性或弱碱　无氧
活动二
(1) 目的明确、营养协调、pH适宜等。灭菌后调节pH，容易造成杂菌污染。马铃薯葡萄糖培养基。
(2) 由单一个体繁殖所获得的微生物群体是纯培养物。获得纯培养物的过程就是纯培养。包括配制培养基、灭菌、接种、分离和培养等。
(3) 防止杂菌污染　高压蒸汽灭菌　在压力为100 kPa、温度为121 ℃的条件下保持15～30 min　营养体　芽孢、孢子
(4) 160～170 ℃　1～2 h
(5) 50　酒精灯火焰周围存在无菌区，避免杂菌污染　防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染；避免培养基水分过快蒸发
(6) 平板划线
(7) 设置对照组(未接种平板)与实验组(接种)一起培养，对照组若有菌落生长，则说明培养基被杂菌污染。
(8) 接种的培养基表面出现单菌落，菌落大小、形状、颜色等一致，且符合该微生物特征。
活动三
(1) 检查培养基灭菌是否彻底。培养基表面的菌悬液会出现积液，导致菌体堆积，影响分离效果。
(2) 灼烧　将聚集的菌体逐步稀释以便获得单个菌落。
(3) 6次。第一次划线前：杀死接种环上的微生物，避免污染培养物；每次划线前：杀死残留菌种，保证每次划线菌种来自上次划线末端；划线结束后：杀死残留菌种，避免污染环境和感染操作者。
(4) 灼烧　多余的酒精在烧杯中滴尽
(5) A是平板划线法，B是稀释涂布平板法。
(6) 振荡培养能提高培养液的溶解氧的含量，同时可以使菌体与培养液充分接触，提高营养物质的利用率。
(7) 有些微生物可能是致病微生物，需灭菌后方可丢弃。
活动四
(1) 有利于目的菌生长　抑制或阻止其他微生物的生长
(2) 选择培养　增加分解尿素的细菌的数量　挑出菌落
(3) 先调节pH，后灭菌　平板划线法　稀释涂布平板法
(4) 氮源　红　尿素分解菌合成的脲酶将尿素分解成氨
(5) 以纤维素作为唯一碳源。刚果红可以与像纤维素这样的多糖物质结合形成红色复合物，但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。在含有纤维素的培养基中加入刚果红，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。
(6) 培养基灭菌，接种环境灭菌，接种过程无菌操作。
(7) 形状、大小、颜色　因培养时间不足导致遗漏细菌数目
活动五
(2) 稀释涂布平板法
(3) ①30～300　D　②1.06×109个　③多　当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察的是一个菌落　偏大　计数的结果是死菌数与活菌数的总和　④不能，因为不能排除杂菌来自培养基或来自培养过程。
微生物的鉴别方法
1 菌落特征鉴别法：根据微生物在固体平板培养基表面形成的菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等特征进行鉴别。
2 指示剂鉴别法：如在上述以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。
3 染色鉴别法：如利用刚果红染色法，根据培养基中出现以纤维素分解菌为中心的透明圈来筛选分解纤维素的微生物。
后两种方法需要利用鉴别培养基，是利用微生物的特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品，产生特定的颜色或其他变化。再如，伊红—亚甲蓝(美兰)琼脂培养基可以鉴别大肠杆菌，生长在此培养基上的大肠杆菌菌落呈深紫色，并有金属光泽。
【名卷优选】
1 C　有的微生物能够寄生于多种细菌体内使细菌裂解，因此可以使用这些微生物进行生物消毒，如净化污水、污泥等，A正确；干热灭菌应在160 ℃～170 ℃的热空气中维持1～2 h，培养基一般用高压蒸汽灭菌法，C错误；接种环等金属用具一般用灼烧灭菌，即直接在酒精灯火焰充分燃烧层灼烧灭菌，D正确。
2 B　光反应和暗反应两者缺一不可，因此必须整合光反应和暗反应相关基因，A正确；暗反应的能量不仅来源于ATP，还需NADPH提供能量且作为还原剂，B错误；改造后的大肠杆菌通过暗反应固定CO2合成有机物，CO2可作为唯一碳源，C正确；光反应需要光照提供能量，若培养基无碳源，菌体必须依赖光反应进行自养，因此生长繁殖需要光照，D正确。
3 A
4 D　将菌液接种到培养基乙所采用的方法是稀释涂布平板法，A错误；“X-gal是一种无色物质，能被乳糖酶分解为半乳糖和蓝色的溴靛蓝，使菌落呈蓝色”，含X-gal培养基从功能上划分，应属于鉴别培养基，B错误；纯培养过程中，培养基配制好后，需先进行酸碱度的调节，然后灭菌，最后进行倒平板操作，如果先灭菌再调节酸碱度，会引入杂菌，影响培养基的无菌性，C错误；乳糖酶专一性地分解乳糖，牛奶中添加适量乳糖酶获得无乳糖牛奶，一般不会破坏牛奶中的其他营养成分，D正确。
5 D　蘸取上清液前不需等比稀释土壤液，因为图Ⅱ中的接种方法是平板划线法，A错误；接种需在酒精灯火焰周围进行，每次接种前需对接种环进行灼烧灭菌，以去除接种环上残留的菌液，由Ⅱ可推测，接种环共进行了6次灼烧灭菌，B错误；配制Ⅱ、Ⅲ的培养基时，先调节pH，再湿热灭菌，C错误；透明圈是降解该除草剂而形成的，故Ⅲ中透明圈/菌落面积比值越大说明其降解效果越好，D正确。
6 A　该培养基是固体培养基，所以加入了琼脂，从接种后短时间三个区域均有少量细菌生长增殖可知，培养基中加入了少量色氨酸，能让突变株在短时间生长，细菌生长的培养基pH通常呈中性或微碱性，而不是酸性，A错误。在微生物接种操作中，使用接种针或接种环接种前需进行灼烧灭菌，以杀死接种针或接种环上可能存在的微生物，防止杂菌污染，B正确。Ⅲ区域菌株不再生长，说明不能利用其他两种突变体合成的物质，应是最后一环节受阻；Ⅰ区域的两端菌株继续生长增殖，说明可以利用其他两种突变体合成的物质，应是第一环节受阻；从色氨酸合成途径来看，TrpC突变株是邻氨基苯甲酸合成吲哚这一步受阻，Ⅰ区域的两端和Ⅱ区域的一端的菌株继续生长增殖，说明Ⅲ区域能为TrpC突变株提供吲哚，所以TrpC菌株继续生长增殖的一端为靠近Ⅲ区域的一端(因为Ⅲ区域能产生吲哚，扩散到 Ⅱ区域靠近Ⅲ区域的一端，使TrpC突变株能继续生长)，C正确。TrpE突变株不能生长，根据色氨酸合成途径，可能是由于缺乏催化吲哚合成色氨酸的酶，导致无法合成色氨酸，在培养基中少量色氨酸消耗完后就不能再生长，D正确。
7 BD　为从土壤样品中分离出高效降解甲醇的酵母，要保证全程无菌操作，对培养基、接种环等进行灭菌处理，其中培养基使用高压蒸汽灭菌，而接种环使用灼烧灭菌，A错误；平板浇注分离法适宜于厌氧型或兼性厌氧型的微生物的分离和计数，B正确；挑取菌落时，应挑取多个菌落，分别测定培养液中甲醇的含量，C错误；发酵液中残留糖的浓度可指示发酵的进程，随着发酵的进行，当发酵液中糖的浓度降到较低水平时，酵母代谢减慢，此时可终止发酵，D正确。
8 (1) ①固体　蛋白胨、牛肉膏、酵母粉　②筛选高产酸乳酸菌　
(2) ①9 mL无菌水　②倒置　③有明显溶钙圈的菌落　
(3) 差(特)异性　
(4) 乳酸菌种类和接种量(发酵时间)　泡菜发酵过程中的pH值
解析：(1) ①该培养基含有琼脂，琼脂是凝固剂，根据物理性质分类，该培养基属于固体培养基；氮源是指提供氮元素的物质，蛋白胨、牛肉膏、酵母粉含有氮元素，可为乳酸菌提供氮源。②培养基中含有碳酸钙，乳酸菌产生乳酸会与碳酸钙反应形成溶钙圈，便于筛选高产酸乳酸菌。(2) 要分离和培养高产酸乳酸菌，首先可以对泡菜汁进行梯度稀释，稀释时需要用无菌水，如1 mL泡菜汁＋9 mL无菌水，相当于对泡菜汁稀释了10倍，以此类推；培养时为了防止冷凝水滴落冲散菌落，应将培养皿倒置培养；溶钙圈明显的菌落，产乳酸的能力强，应挑选有明显溶钙圈的菌落进行平板划线培养。(3) 不同菌属的16S rDNA具有差(特)异性，PCR能鉴定不同的DNA。(4) 自变量是人为改变的量，据图分析，该研究实验的自变量是乳酸菌种类(乳酸菌A50f7和A50b9)和接种量(发酵时间)；结合图示结果可知，两种乳酸菌均能快速降低泡菜发酵过程中的pH值，且接种量越大作用效果越明显，效果相近。

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