资源简介

(共41张PPT)
第11单元
生物技术与工程
第64讲　基因工程的基本工具和操作程序
内容索引
核心体系
学习目标
活动方案
名卷优选
学 习 目 标
1. 概述基因工程的基本原理。2. 概述基因工程的一般步骤。
核 心 体 系
活 动 方 案
下图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图，请回答下列问题。
活动一　概述基因工程操作过程
(1) 请写出基因工程操作的基本步骤。
【答案】 获取目的基因、构建基因表达载体、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。
(2) 获取目的基因的一般方法有哪些？
【答案】 从基因文库中获取、人工合成法。
(3) ②的构建需要哪些酶的参与？限制酶主要来源于原核生物，但限制酶不能切割自身所在原核生物的DNA分子，为什么？DNA连接酶和DNA聚合酶作用有什么不同？从④→⑤采用的是什么技术？
【答案】 限制性内切核酸酶、DNA连接酶。 自身所在原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。DNA连接酶连接的是DNA片段，DNA聚合酶催化游离的单个脱氧核苷酸连接到子链3′端。植物组织培养。
(4) 将目的基因导入受体细胞通常有哪些方法？图示农杆菌转化法，目的基因(抗虫基因)需要插入Ti质粒的什么部位？原因是什么？
【答案】 导入植物细胞：农杆菌转化法、花粉管通道法；导入动物细胞：显微注射法；导入微生物：感受态转化法(Ca2＋处理法)。T－DNA内部。只有T－DNA能转移并整合到植物细胞染色体组中。
(5) 检测抗虫基因是否转移到植物细胞中以及检测抗虫基因是否能转录的方法是什么？检测抗虫基因是否能翻译的方法是什么？检测植物能否表现出抗虫性状的方法是什么？
【答案】 PCR等技术。抗原—抗体杂交。抗虫接种试验。
下表是四种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中标注了相关限制酶的酶切位点。请回答下列问题。
活动二　回顾基因工程中工具酶的使用
限制酶 BamH Ⅰ Bcl Ⅰ Sau3A Ⅰ Hind Ⅲ
识别序列及 切割位点 G↓GATCC CCTAG↑G T↓GATCA ACTAG↑T ↓GATC CTAG↑ A↓AGCTT
TTCGA↑A
图1
图2
(1) 质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有哪些？作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有哪些条件？
【答案】 能够自我复制、具有标记基因、具有一个或多个限制酶切割位点。启动子和终止子。
(2) 用图中质粒和目的基因构建重组质粒，应选用哪两种限制酶切割？
【答案】 BclⅠ和Hind Ⅲ。
(3) 与单酶切相比，双酶切的优点是什么？
【答案】 可保证插入外源片段的方向，防止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化。
(4) 质粒中四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因的作用是什么？
【答案】 作为标记基因，用于阳性筛选。
(5) 酶切后的载体和目的基因片段，通过什么酶作用后获得重组质粒？此酶作用于什么化学键？此酶通常有哪两类，区别是什么？
【答案】 DNA连接酶。磷酸二酯键。E.coli DNA连接酶，只能催化黏性末端连接；T4 DNA连接酶，可催化黏性末端或平末端的连接。
(6) 将此质粒载体用BamH Ⅰ酶切后，与用Sau3A Ⅰ(BamHⅠ与Sau3AⅠ酶来源不同，识别序列也不同，但是切割后可以产生相同的游离单链黏性末端)酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化，被转化的大肠杆菌有哪三种？
【答案】 分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。
(7) 平板上长出的菌落，常用PCR鉴定，所用的引物组成为图2中的哪两个？
【答案】 引物甲和引物丙。
(8) 若用Sau3AⅠ切图1质粒，最多可能获得几种大小不同的DNA片段？
【答案】 7种。
某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamHⅠ酶切后，与用BamHⅠ酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。请回答下列问题。
活动三　认同基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤
(1) 构建基因表达载体的目的是？如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是什么？
【答案】 使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，且目的基因能够表达和发挥作用。二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长。
(2) 含有质粒载体和含有插入了目的基因的重组质粒的细胞也不能区分的原因是什么？
【答案】 二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长。
(3) 在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需在固体培养基中添加什么物质？
【答案】 四环素。
(4) 基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自哪里？
【答案】 受体细胞。
(5) 若受体细胞是原核生物，来自真核生物的目的基因通常来源于PCR技术还是RT－PCR技术？
【答案】 RT－PCR技术。
名 卷 优 选
2
4
5
1
3
7
9
6
8
1. 下列与生物工程中有关酶的说法，正确的是(　　)
A. 胰蛋白酶和胃蛋白酶都能用于制备细胞悬液
B. DNA聚合酶和RNA聚合酶都能催化磷酸二酯键的形成
C. 逆转录酶和DNA连接酶发挥作用时都需要模板
D. 限制性内切核酸酶和解旋酶都作用于氢键
B
2
4
5
1
3
7
9
6
8
2. [2025南京月考]下列有关限制酶和DNA连接酶的叙述，正确的是(　　)
A. 用限制酶酶切获得一个外源基因时得到两个切口，有2个磷酸二酯键被断开
B. 限制酶识别序列越短，则该序列在DNA中出现的概率就越小
C. 序列—C↓ATG—和—G↓GATCC—被限制酶切出的黏性末端碱基数不同
D. T4 DNA连接酶不能催化黏性末端的连接
C
2
4
5
1
3
7
9
6
8
【解析】 限制酶切割DNA双链时，每个切口会断开2个磷酸二酯键(双链各1个)，若获得一个外源基因需切两次产生两个切口，则共断开4个磷酸二酯键，A错误；限制酶识别序列越短，可能的组合数越少，因此短序列在DNA中出现的概率更大，B错误；序列—C↓ATG—被切割后，黏性末端为2个碱基，而—G↓GATCC—被切割后，黏性末端为4个碱基，两者碱基数不同，C正确；T4 DNA连接酶可连接黏性末端和平末端，D错误。
2
4
5
3
7
9
6
8
3. [2025盐城五校联考]基因工程的核心是构建基因表达载体，下列不属于载体作用的是(　　)
A. 载体具有标记基因，便于筛选含目的基因的受体细胞
B. 载体能协助目的基因在受体细胞中稳定存在
C. 载体含有启动子和终止子协助目的基因表达
D. 载体能防止目的基因被受体细胞限制酶“切割”
1
【解析】 载体具有标记基因，标记基因便于筛选含有目的基因的受体细胞，A正确；载体在受体细胞中能够稳定存在，并且自我复制，使目的基因数量扩大，B正确；载体含有的启动子和终止子可协助目的基因的表达，C正确；载体不能防止目的基因被受体细胞限制酶“切割”，D错误。
D
2
4
5
3
7
9
6
8
1
D
2
4
5
3
7
9
6
8
A. 基因A与基因a互为等位基因，其突变不具有可逆性
B. 两种限制酶酶切形成的末端类型不同，均可用E.coli DNA连接酶连接
C. Hind Ⅲ切割基因A时，催化磷酸二酯键和氢键的断裂
D. 产前诊断时，该致病基因可选用Hind Ⅲ限制酶开展酶切鉴定
1
【解析】 突变是不定向的，具有可逆性，A错误；E.coli DNA连接酶连接平末端的效率低于T4 DNA连接酶，而AluⅠ限制酶切割DNA形成的是平末端，应该用T4 DNA连接酶，B错误；HindⅢ切割基因A时，破坏的是磷酸二酯键，C错误；因为正常基因A和致病基因a的HindⅢ切割位点不同，所以产前诊断时，该致病基因可用HindⅢ限制酶开展酶切鉴定，D正确。
2
4
5
3
7
9
6
8
5. [2026苏州中学月考]一种新型DNA聚合酶可耐受92 ℃高温。其通过引入古菌特有糖基化修饰位点形成保护性水合层，进而显著提升热稳定性。下列关于这类耐高温的DNA聚合酶的叙述，正确的是(　　)
A. 这类耐高温的DNA聚合酶的基本单位是脱氧核苷酸
B. 当模板DNA和脱氧核苷酸存在时即可催化反应
C. 为维持较高的催化活性，适宜在70 ℃～75 ℃下保存
D. 对酶活性结构域特定氨基酸位点突变可进一步提升其耐热性
1
D
2
4
5
3
7
9
6
8
1
【解析】 DNA聚合酶的本质是蛋白质，其基本单位为氨基酸，A错误；DNA聚合酶催化反应需模板DNA、引物及脱氧核苷酸，仅模板和底物无法启动反应，B错误；酶保存通常需低温(如4 ℃)以维持活性，高温保存会破坏酶结构，即使耐高温酶长期保存仍需低温，C错误；通过突变特定氨基酸位点可优化酶结构域稳定性，如糖基化修饰以提升耐热性，进一步突变可能增强特性，D正确。
2
4
5
3
7
9
6
8
6. 用XhoⅠ和SalⅠ两种限制性内切核酸酶分别处理同一DNA片段(限制酶在对应切点一定能切开)，酶切位点及酶切产物分离结果如图所示。下列叙述错误的是(　　)
1
图1　酶切位点图
图2　电泳结果示意图
A. 图1中两种酶识别的核苷酸序列不同
B. 图1中酶催化反应的化学键是磷酸二酯键
C. 图2中②可能是用XhoⅠ处理得到的酶切产物
D. 用XhoⅠ和SalⅠ同时处理该DNA电泳后得到7种产物
D
2
4
5
3
7
9
6
8
7. [2025徐州期末]下图表示利用基因工程技术生产人血清白蛋白的两条途径。下列相关叙述错误的是(　　)
1
A. 若A基因是从人细胞内提取的mRNA经逆转录产生的，则A基因中不含启动子序列
B. 扩增目的基因时，利用耐高温的DNA聚合酶从引物a、b的3′端进行子链合成
C. 利用显微注射法将人血清白蛋白基因导入的绵羊受体细胞是乳腺细胞
D. 为了保证从乳汁中获得人血清白蛋白，需将人血清白蛋白基因与乳腺蛋白基因的启动子重组
C
2
4
5
3
7
9
6
8
1
【解析】 成熟的mRNA是由基因转录后经剪切而成，不含启动子序列，A正确；在引物作用下，DNA聚合酶从引物3′端开始延伸DNA链，扩增目的基因时，利用耐高温的DNA聚合酶从引物a、b的3′端进行子链合成，B正确；导入人血清白蛋白基因的绵羊受体细胞通常是受精卵，C错误；要使目的基因在乳腺细胞中表达，需要在目的基因的上游加上乳腺蛋白基因的启动子，D正确。
2
4
5
3
7
9
6
8
8. (多选)[2024连云港赣榆高中检测]图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，其中TetR是四环素抗性基因、AmpR是氨苄青霉素抗性基因。图2为重组质粒，甲、乙、丙为3种引物所在的相应位置。下列有关叙述错误的有( )
1
BCD
图1
图2
2
4
5
3
7
9
6
8
A. 质粒P1经“酶处理”后平末端转变成黏性末端，有利于与目的基因片段的连接
B. 质粒P2和目的基因片段可在DNA聚合酶或DNA连接酶的作用下形成重组质粒
C. 若受体微生物能在含有氨苄青霉素的培养基上生长，说明成功导入了重组质粒P3
D. 用PCR鉴定筛选出的菌落中是否含正确插入目的基因的重组质粒，选择引物甲和丙最合适
1
2
4
5
3
7
9
6
8
1
【解析】 质粒P1经“酶处理”后由平末端转变成黏性末端，黏性末端游离，易与互补末端碰撞，因此能提高目的基因片段和质粒的连接效率，A正确；质粒P2和目的基因片段可在DNA连接酶的作用下形成重组质粒，不需要DNA聚合酶，B错误；图示的质粒均含有抗氨苄青霉素的基因，因此，若受体微生物能在含有氨苄青霉素的培养基上生长，不能说明成功导入了重组质粒P3，C错误；用PCR鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，选择引物乙和丙即可，因为PCR扩增的DNA片段是引物之间的序列，扩增乙和丙之间的序列就包含了目的基因，D错误。
2
4
5
3
7
9
6
8
9. [2026四川绵阳南山中学开学考]卡拉胶是一类源于海洋红藻的大分子多糖，可被某些细菌降解为具有多种应用前景的卡拉胶寡糖。某研究小组拟筛选具有高活性卡拉胶酶(CG)的菌种用于生产卡拉胶寡糖。请回答下列问题。
(1) 选择海藻和海泥作为样本筛选卡拉胶降解菌的原因是_____________________________________________________________。将培养后的菌液混匀并充分________，再接种至微孔板中，经培养和筛选获得了CG活性最高的菌种。
1
在富含卡拉胶的环境中，存在能够分解卡拉胶的微生物的可能性较大
稀释
2
4
5
3
7
9
6
8
(2) 为构建携带cg(CG的编码基因)的大肠杆菌表达载体(图1)，对cg的PCR扩增产物和质粒进行双酶切，随后用E.coli DNA连接酶连接。为保证连接准确性和效率，cg转录模板链的5′端最好含有__________酶切位点。另有两组同学选用了各不相同的双酶切组合和T4 DNA连接酶重复上述实验，获得的部分重组质粒分子大小符合预期，但均无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割，其原因是___________________ _______________________________。
1
BamH Ⅰ
重组质粒连接处的序列不再是原来的限制酶识别序列
2
4
5
3
7
9
6
8
注：限制酶的识别序列和切割位点如下：
1
图1
2
4
5
3
7
9
6
8
(3) 为将构建好的表达载体转入大肠杆菌，需要先用Ca2＋处理大肠杆菌细胞，目的是_______________________________________________ ____，随后在含__________和__________的培养基中培养一段时间后，根据菌落周围有无水解透明圈筛选目的菌株。
1
使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状
态
卡拉胶
四环素
2
4
5
3
7
9
6
8
(4) 已知空间上邻近的两个半胱氨酸易形成二硫键，从而提升蛋白质的耐热性。为提高CG的耐热性，研究人员分析了五个氨基酸位点的空间距离和保守度(保守度值越大表明该位点对酶的功能越关键)，如图2 所示。根据分析结果，选择第_____位的氨基酸替换成半胱氨酸最合适，原因是___________________________________________________________ ___________________________________。
1
图2
44
该位点的氨基酸空间上离半胱氨酸更近，容易形成二硫键，而且保守度低，替换后对酶功能的影响较小
2
4
5
3
7
9
6
8
1
【解析】 (2) E.coli DNA连接酶只能连接具有黏性末端的片段，因此切割质粒和目的基因时不能选择切成平末端的限制酶，即不能选择EcoRⅤ酶和SmaⅠ酶，而SpeⅠ酶与XbaⅠ酶切割后的黏性末端相同，若选择SpeⅠ酶与XbaⅠ酶切割，会出现质粒和目的基因的自连，甚至目的基因倒接的情况，因此切割质粒时，SpeⅠ酶与XbaⅠ酶中只能选择一个，而另一个限制酶需要选择BamHⅠ酶，又由于转录的方向是由启动子→终止子，且mRNA形成的方向是5′→3′，且mRNA与DNA的模板链方向相反，因此基因模板链的3′端应靠近启动子，故为保证连接准确性和效率，cg转录模板链的5′端最好含有BamHⅠ酶切位点。不同的平末端均可由T4 DNA连接酶连接，但由于限制酶的识别序
2
4
5
3
7
9
6
8
1
列具有专一性，若连接后的序列不存在最初限制酶的识别序列，则可能导致重组质粒无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割。(3) 由于具有高活性卡拉胶酶(CG)的菌种可分解卡拉胶，使其菌落周围形成透明圈，且重组质粒上含有四环素抗性基因，因此导入目的基因的大肠杆菌可接种在含卡拉胶和四环素的培养基中培养一段时间后，根据菌落周围有无水解透明圈筛选目的菌株。(4) 据图可知，虚线长度代表氨基酸间的空间距离，由于第44位点的氨基酸空间上离半胱氨酸更近，容易形成二硫键，而且保守度低，替换后对酶功能的影响较小，因此选择第44位的氨基酸替换成半胱氨酸最合适。
谢谢观看
Thank you for watching第64讲　基因工程的基本工具和操作程序
1 [2025连云港期中]下列有关限制性内切核酸酶的叙述，错误的是(　　)
A. 用不同的限制酶处理含目的基因的片段和质粒，也可能形成重组质粒
B. －CATG↓－和－G↓GATCC－序列被限制酶切出的黏性末端碱基数相同
C. 限制酶识别序列越短，则该序列在DNA中出现的概率就越小
D. 用限制酶从一个DNA分子中部获取一个目的基因时，4个磷酸二酯键断裂
2 下列关于基因工程的说法，错误的是(　　)
A. 基因工程所需要的工具酶有限制酶和DNA连接酶
B. 将某药用蛋白基因导入乳腺细胞中，获得乳腺生物反应器
C. 启动子是RNA聚合酶的识别并结合的位点，驱动基因转录出mRNA
D. 利用农杆菌转化法将目的基因插入TDNA上进而整合到受体细胞的DNA中，其实质是基因重组
3 基因工程中需使用多种工具酶，四种限制酶的切割位点如图所示。下列说法正确的是(　　)
A. 限制酶SmaⅠ和EcoRⅤ切割形成的末端，不能通过T4 DNA连接酶相互连接
B. DNA连接酶、DNA聚合酶和RNA聚合酶均可催化磷酸二酯键的形成
C. 限制酶EcoRⅠ进行一次切割，会切断2个磷酸二酯键，形成1个游离的5′末端
D. 若两种限制酶的识别序列相同，则形成的末端一定能通过DNA连接酶相互连接
4 [2025江西卷]为了获得抗白叶枯病的水稻品种，研究人员构建了含有抗病基因D的重组Ti质粒(如图)，通过农杆菌转化法将D基因导入水稻种子诱导的愈伤组织，最终获得抗病植株。下列叙述正确的是(　　)
A. 水稻愈伤组织细胞中的RNA聚合酶无法识别U6启动子
B. 在含重组Ti质粒的农杆菌中U6启动子不能驱动卡那霉素抗性基因表达
C. 农杆菌侵染愈伤组织后所用的筛选培养基中需加入卡那霉素
D. 愈伤组织再分化获得的含有D基因的幼苗属于抗病植株
5 [2025无锡期末]CRISPR/Cas9基因编辑技术，可以实现对DNA的定点切割，其工作原理如下图所示。下列叙述错误的是(　　)
A. 细菌体内的Cas9能切割外源DNA保护自身，类似于限制酶
B. 可通过此技术敲除突变基因根治猫叫综合征等遗传病
C. Cas9对不同目标DNA进行编辑时，应使用不同的向导RNA
D. Cas9蛋白剪切DNA片段的精确性随着向导RNA的延长而增加
6 为使玉米获得抗除草剂性状，科研人员进行了相关操作(如图所示)。含有内含子的报告基因不能在原核生物中正确表达，其正确表达产物能催化无色物质K呈现蓝色。转化过程中愈伤组织表面常残留农杆菌，会导致未转化的愈伤组织可能在含除草剂的培养基中生长。下列叙述错误的是(　　)
A. T-DNA可将基因G转移并整合到愈伤组织细胞的染色体DNA上
B. 利用物质K和抗生素进行筛选1，可获得农杆菌的蓝色菌落
C. 利用物质K和除草剂进行筛选2，更易于获得抗除草剂的转基因植株
D. 愈伤组织重新分化为芽、根等器官的过程中，需要添加植物激素
7 基因工程利用某目的基因(如图甲所示)和P1噬菌体载体(如图乙所示)构建重组DNA。限制性内切核酸酶的酶切位点分别是BglⅡ、EcoRⅠ和Sau3AⅠ。下列相关分析错误的是(　　)
甲 乙
A. 构建重组DNA时，可用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体
B. 构建重组DNA时，可用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体
C. 图乙中的P1噬菌体载体只用EcoRⅠ切割后，含有2个游离的磷酸基团
D. 用EcoRⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体，再用DNA连接酶连接，只能产生一种重组DNA
8 下图是外源基因插入位置(插入点有a、b、c)，请根据表中提供的细菌的生长情况，推测①②③三种重组后细菌的外源基因插入点，正确的是(　　)
组号 细菌在含青霉素培养基上的生长情况 细菌在含四环素培养基上的生长情况
① 能生长 能生长
② 能生长 不能生长
③ 不能生长 能生长
A. ①是c、②是b、③是a
B. ①是a和b、②是a、③是b
C. ①是a和b、②是b、③是a
D. ①是c、②是a、③是b
9 某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是(　　)
　
　
A. 质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coli DNA连接酶连接
B. 质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接
C. 质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接
D. 质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coli DNA连接酶连接
10 苹果富含多种维生素，口感脆，苹果切开后不久颜色便会加深，这种现象称为“褐变”。褐变是由位于细胞的多酚氧化酶(PPO)催化位于液泡中的多酚类物质生成棕色色素所致。据此，科研人员培育出了抗褐变的转基因苹果，其工作流程如图所示，下列相关叙述错误的是(　　)
A. 想获得抗褐变的转基因苹果，目的基因可以是抑制PPO表达的基因
B. 过程①是基因工程的核心步骤，一般需要限制性内切核酸酶和DNA聚合酶的参与
C. 在步骤③之前，需要用70%酒精和5%次氯酸钠溶液对苹果嫩叶碎片进行消毒处理
D. 与导入不含目的基因质粒的植株作对照，评估目的基因对抑制苹果褐变的效果
11 [2025山东泰安模拟]双向启动子可同时结合两个RNA聚合酶来驱动下游基因的表达，研究人员构建了如图所示的表达载体，以检测双向启动子作用效果。下列分析正确的是(　　)
A. 表达载体中GUS基因和LUC基因转录时使用同一条DNA单链为模板
B. 为连入GUS基因，需用SalⅠ和SphⅠ酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒
C. 在培养基中添加壮观霉素可筛选出成功导入表达载体的受体细胞
D. 通过观察是否出现荧光和蓝色物质可检测双向启动子的作用效果
12 (多选)[2025宿迁期中]下表列举了四种限制酶的识别序列及其切割位点(箭头表示相关酶的切割位点)。图①～⑤是酶切后产生的几种末端。下列说法错误的有(　　)
限制酶 AluⅠ BamHⅠ SmaⅠ Sau3AⅠ
识别序列 AG↓CT TC↑GA G↓GATCC CCTAG↑G CCC↓GGG GGG↑CCC ↓GATC CTAG↑
① ② ③ ④ ⑤
A. BamHⅠ切割的是氢键，AluⅠ切割的是磷酸二酯键
B. Sau3AⅠ和BamHⅠ切割产生的片段能够相连，但连接后的片段两者都不能再切割
C. 相同的DNA分子被Sau3AⅠ识别并切割的概率一般高于BamHⅠ
D. T4 DNA连接酶既能连接①③，也能连接②⑤，但后者连接效率低
13 (多选)[2025安徽卷]质粒K中含有β-半乳糖苷酶基因，将该质粒导入大肠杆菌细胞后，其编码的酶可分解X-gal，产生蓝色物质，进而形成蓝色菌落，如图所示。科研小组以该质粒作为载体，采用基因工程技术实现人源干扰素基因在大肠杆菌中的高效表达。下列叙述正确的有(　　)
A. 使用氯化钙处理大肠杆菌以提高转化效率，可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数
B. 如果筛选平板中仅含卡那霉素，生长出的白色菌落不可判定为含目的基因的菌株
C. 因质粒K中含两个标记基因，筛选平板中长出的白色菌落即为表达目标蛋白的菌株
D. 若筛选平板中蓝色菌落偏多，原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌
14 下图是将乙肝病毒表面主蛋白基因HBsAg导入巴斯德毕赤酵母菌生产乙肝疫苗的过程示意图。巴斯德毕赤酵母菌是一种甲基营养型酵母，能将甲醇作为其唯一碳源，此时AOX1基因受到诱导而表达，图中pPIC9K质粒上5′AOX1和3′AOX1(TT)分别是基因AOX1的启动子和终止子。该酵母菌体内无天然质粒，科学家改造出了如图所示质粒用作载体，其与目的基因形成的重组质粒经酶切后可以与酵母菌染色体发生同源重组，将目的基因整合于染色体中以实现表达。请回答下列问题。
注：①限制酶识别序列SnaBⅠ：TAC↓GTA，AvrⅡ：C↓CTAGG，Sac Ⅰ：GAGCT↓C，Bgl Ⅱ：A↓GATCT；②HBsAg 基因中的白色箭头表示基因转录的方向
(1) 用PCR技术扩增HBsAg基因时原料是____________，Taq酶需要________激活。
(2) 为实现HBsAg基因和pPIC9K质粒重组，设计引物时需要在引物的______端添加相应限制酶的识别序列，则在HBsAg基因两侧的A和B位置添加的碱基序列分别是________、________，这样设计的优点是_________________________。
(3) 酶切获取HBsAg基因后，需用____________(填“E·coli DNA连接酶”或“T4 DNA连接酶”)将其连接到pPIC9K质粒上，形成重组质粒，构建重组质粒的目的是______________________________________________________________
______________________________________________________________________。
(4) 若用限制酶SnaBⅠ、BglⅡ联合酶切pPIC9K质粒，获得的DNA片段按顺时针方向，依次是38 kb、27 kb、67 kb；用限制酶BglⅡ、AvrⅡ联合酶切pPIC9K质粒，得到的DNA片段按顺时针方向，依次是38 kb、40 kb、54 kb；已知HBsAg基因长度是55 kb。步骤3中应选用限制酶________来切割重组质粒以获得重组DNA，切割后的重组DNA的长度是________。
(5) 转化的酵母菌在培养基上培养一段时间后，需要向其中加入甲醇，其目的是__________________。
15 [2026扬州七校联考]组织型纤溶酶原激活剂(tPA)是一种广泛用于溶解血栓的蛋白质类药物，但tPA在血液中的半衰期很短(3～5 min)，在临床治疗中需大剂量静脉注射才能维持其有效浓度，但会增加出血风险。研究团队借助PCR技术改造tPA基因，最终获得药效时间更长的突变型tPA。回答下列问题。
(1) 研究人员设计突变型t-PA的空间结构，推测其______________，再根据“中心法则”逆推t-PA基因的核苷酸序列。研究发现，将t-PA的第117位天冬酰胺替换为谷氨酰胺可延长其作用时间。已知决定谷氨酰胺的密码子是CAA或CAG，则改造后的基因编码链上对应的碱基序列是____________。制造出性能优异的改良t-PA过程被称为____________工程。
(2) 利用山羊乳腺生物反应器生产突变型t-PA
图1
图2
图3
①重组载体的构建
乳球蛋白(BLG)是山羊乳汁中主要的乳清蛋白。研究人员首先通过查找基因数据库获取乳球蛋白信号肽(BLGSP)核苷酸序列信息，并通过化学合成法获得该DNA序列。其次，将该序列与t-PA突变基因(如图1所示)构建获得融合基因(图2)；为了确定BLGSP序列和t-PA突变基因正确连接，需进行PCR检测，若仅用一对引物，则应选择图2中的引物________。最后，将融合基因与质粒(图3)经____________酶和________酶处理构建形成重组载体。
②重组载体的表达与检测
重组载体经____________筛选后利用____________技术导入山羊________细胞，经胚胎体外培养、胚胎移植等技术获得转基因山羊。在泌乳期收集转基因山羊的乳汁，分离提纯后，用______技术检测确定乳汁中存在突变型t-PA。
(3) t-PA突变基因只在山羊乳腺上皮细胞中表达，而不在其他组织细胞内表达的原因是________________________________。采用转基因山羊乳腺生物反应器生产t-PA，具有药用蛋白活性更高、____________________________等优点。
第64讲　基因工程的基本工具和操作程序
1 C　限制酶识别序列越短，则该序列在DNA中出现的概率就越大，C错误；用限制酶从一个DNA分子中部获取一个目的基因时，需要切开两个切口，断裂4个磷酸二酯键，D正确。
2 B　基因工程所需的工具酶包括限制酶(用于切割DNA特定序列)和DNA连接酶(用于连接DNA片段)，A正确；乳腺生物反应器需将目的基因导入受精卵，而非直接导入乳腺细胞，体细胞的遗传物质无法通过有性生殖遗传给后代，无法稳定表达产物，B错误；启动子是RNA聚合酶识别并结合的位点，可启动基因的转录过程，生成mRNA，C正确；农杆菌转化法中，T-DNA携带目的基因整合到受体细胞DNA中，属于不同DNA分子的重新组合，实质为基因重组，D正确。
3 B　
4 B　将T-DNA整合到水稻愈伤组织的染色体DNA后，若要使D基因表达并使水稻植株表现出抗病性状，那么D基因上游的U6启动子需被水稻愈伤组织细胞中RNA聚合酶识别，A错误；由图得出，上述重组Ti质粒中的U6启动子并非位于卡那霉素抗性基因的上游，因而不能驱动卡那霉素抗性基因的表达，B正确；只有T-DNA之间的部分整合到水稻细胞染色体的DNA中，卡那霉素抗性基因不位于T-DNA上，不会发生上述生理过程，因此，在农杆菌侵染愈伤组织后所用的筛选培养基中需加入潮霉素，C错误；检测是否成功获得转基因品种还需要进行个体生物学水平的鉴定，因此愈伤组织再分化获得的含有D基因的幼苗不一定是抗病植株，D错误。
5 B　由题干可知，细菌体内的Cas9能切割外源DNA保护自身，类似于限制酶，A正确；通过CRISPR/Cas9基因编辑技术可以敲除突变的基因而达到根除致病基因的目的，但猫叫综合征是由人体的5号染色体结构部分缺失导致的，不属于基因突变，B错误；向导RNA可识别并与靶基因部分碱基发生碱基互补配对，具有特异性，因此Cas9对不同目标DNA进行编辑时，应使用不同的向导RNA，C正确；向导RNA与目标DNA结合的前提条件是RNA序列与DNA序列精准结合，如果向导RNA过短，则基因组中能与之结合的DNA序列就会越多，出现Cas9结合剪切多个基因的现象，因此Cas9蛋白剪切DNA片段的精确性随着向导RNA长度的延长而增加，D正确。
6 B　农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上，根据农杆菌的这一特点，将目的基因(基因G)插入到Ti质粒的T-DNA上，通过农杆菌的转化作用，就可以把目的基因(基因G)整合到愈伤组织细胞的染色体DNA上，A正确；农杆菌属于原核生物，含有内含子的报告基因不能在原核生物中正确表达，故不会出现蓝色的农杆菌菌落，B错误；根据题意可知，报告基因的产物能催化无色物质K呈现蓝色，而愈伤组织表面残留的农杆菌会导致未转化的愈伤组织能在含除草剂的培养基中生长，因此利用物质K和除草剂进行筛选2，更易于获得抗除草剂的转基因植株，C正确。
7 D　8 A
9 C　酶3切割后得到的是平末端，应该用T4 DNA连接酶连接，A不符合题意；质粒用酶3切割后得到平末端，目的基因用酶1切割后得到的是黏性末端，二者不能连接，B不符合题意；质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4 DNA连接酶连接后，还能保证目的基因在质粒上的连接方向，此重组表达载体的构建方案最合理且高效，C符合题意；若用酶2和酶4切割质粒和目的基因，会破坏质粒上的抗生素抗性基因，连接形成的基因表达载体缺少标记基因，无法进行后续的筛选，D不符合题意。
10 B　要想获得抗褐变的转基因苹果，可选抑制PPO表达的基因作为目的基因，使液泡中的多酚类物质不能生成棕色色素，A正确；过程①是目的基因表达载体的构建，是基因工程的核心步骤，该过程中至少需要限制性内切核酸酶和DNA连接酶的参与，B错误；在步骤③之前，先用70%酒精消毒30 s，然后用无菌水清洗后再用5%次氯酸钠溶液对苹果嫩叶碎片处理30 min，最后还要用无菌水清洗，从而保证脱分化过程正常进行，C正确；为了评估目的基因对抑制苹果褐变的效果，可与导入不含目的基因质粒的植株作对照，该设计的目的是排除质粒导入本身对实验结果的影响，同时也能检测导入目的基因的效果，D正确。
11 D　转录是从子链(mRNA)5′→3′方向进行的，由图可知，双向启动子位于GUS基因和LUC基因之间，所以GUS基因和LUC基因转录时的模板链不是DNA分子的同一条链，A错误；如果用SphⅠ酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒时就会破坏LUC基因，B错误；T-DNA中含有潮霉素抗性基因，而不包含壮观霉素抗性基因，因此可以通过在培养基中添加潮霉素来筛选成功导入表达载体的受体细胞，C错误；双向启动子如果正常表达，就会合成荧光素酶和β葡萄糖苷酶，催化底物分别产生荧光或生成蓝色物质，从而确定双向启动子的作用，D正确。
12 ABD　BamHⅠ与AluⅠ切割的均是磷酸二酯键，A错误；BamHⅠ识别和切割G↓GATCC，Sau3AⅠ识别和切割↓GATC，故二者切割后产生的黏性末端是相同的，因此二者切割后产生的黏性末端能够相连，连接后仍然存在GATC的序列，能被Sau3AⅠ识别和切割，但是不一定存在GGATCC序列，所以BamHⅠ不一定能再识别和切割连接后的片段，B错误；与BamHⅠ相比，Sau3AⅠ的识别序列更短，DNA中含有该酶识别位点的可能性更大，因此，相同的DNA分子被Sau3AⅠ识别并切割的概率一般高于BamHⅠ，C正确；T4 DNA连接酶既可以连接黏性末端也可以连接平末端，而图中①③属于平末端，②⑤是黏性末端，T4 DNA连接酶连接平末端时效率较低，D错误。
13 ABD　使用氯化钙处理大肠杆菌，可使其处于感受态，提高转化效率，即更多的大肠杆菌能吸收质粒，无论吸收的是含目的基因的重组质粒(可能形成白色菌落)还是未重组的质粒K(形成蓝色菌落)，都可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数，A正确；由于仅含卡那霉素，未添加X-gal，无论导入的是重组质粒还是空白质粒，都无法产生蓝色物质，故生长出的菌落均为白色，B正确；筛选平板中长出的白色菌落，可能是导入了重组质粒(含目的基因)，但也可能是虽然导入了质粒但目的基因没有成功表达目标蛋白，不能仅仅因为是白色菌落就判定为表达目标蛋白的菌株，C错误；若筛选平板中蓝色菌落偏多，原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌，因为自身环化的质粒K中β-半乳糖苷酶基因完整，能表达活性β半乳糖苷酶，分解X-gal形成蓝色菌落，D正确。
14 (1) 脱氧核苷酸(dNTP)　Mg2+　(2) 5′　TACGTA　CCTAGG 避免目的基因反向接入质粒(保证目的基因定向接入质粒) (3) T4 DNA连接酶　让目的基因在受体细胞中稳定存在和遗传，并使目的基因能够表达和发挥作用　(4) BglⅡ　136 kb　(5) 诱导HBsAg基因表达
解析：(2) DNA聚合酶是沿着DNA的单链移动，从5′端向3′端合成新的DNA链，因此设计引物时需要在引物的5′端添加相应限制酶的识别序列。图中质粒含有SnaBⅠ、AvrⅡ、BglⅡ和SacⅠ限制酶切割位点，其中SacⅠ位于启动子上，BglⅡ位于终止子上。要将HBsAg基因和pPIC9K质粒重组，只能用限制酶SnaBⅠ和AvrⅡ切割质粒，则在HBsAg基因两侧的A和B位置添加的碱基序列分别是TACGTA、CCTAGG，用双酶切的优点是避免目的基因反向接入质粒(保证目的基因定向接入质粒)。(3) 基因工程中常需要使用DNA连接酶，既能连接黏性末端，又能连接平末端的DNA连接酶是T4 DNA连接酶，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来的是E·coli DNA连接酶，用SnaBⅠ得到的是平末端，用AvrⅡ得到的是黏性末端，故应用T4 DNA连接酶将其连接到pPIC9K质粒上，构建重组质粒的目的是让目的基因在受体细胞中稳定存在和遗传，并使目的基因能够表达和发挥作用。(4) 若用限制酶SnaBⅠ、BglⅡ联合酶切pPIC9K质粒，获得的DNA片段按顺时针方向，依次是38 kb、27 kb、67 kb；用限制酶BglⅡ、AvrⅡ联合酶切pPIC9K质粒，得到的DNA片段按顺时针方向，依次是38 kb、40 kb、54 kb，因此，以5′AOX1上的BglⅡ为基准计算，BglⅡ与SnaBⅠ之间的DNA片段的长度为27 kb，BglⅡ与AvrⅡ之间的DNA片段的长度为40 kb，用限制酶SnaBⅠ和AvrⅡ切割质粒，故目的基因位于SnaBⅠ和AvrⅡ之间，目的基因(HBsAg基因)长度是55 kb，故切割后的重组DNA的长度是27 kb＋54 kb＋55 kb＝136 kb。(5) 巴斯德毕赤酵母菌是一种甲基营养型酵母，能将甲醇作为其唯一碳源，此时AOX1基因受到诱导而表达，5′AOX1和3′AOX1分别是基因AOX1的启动子和终止子，目的基因(HBsAg基因)位于启动子和终止子之间，故加入甲醇的目的是诱导HBsAg基因表达。
15 (1) 氨基酸序列　CAA或CAG　蛋白质　(2) ①F1、R2　KpnⅠ、XhoⅠ　DNA连接酶　②氨苄青霉素　显微注射法　受精卵　抗原—抗体杂交　(3) BLG启动子为乳腺细胞特异性启动子　可通过乳汁持续获取、乳汁成分相对简单明确，便于药物的提纯、频繁采集不会对动物产生危害、产量高
解析：(1) mRNA是以基因中非编码链为模板转录形成的，所以mRNA中碱基序列和编码链中的碱基序列相同，决定谷氨酰胺的密码子是CAA或CAG，则改造后的基因编码链上对应的碱基序列为CAA或CAG。(2) PCR检测时引物的选择要根据目的基因及引物的方向来选择，根据图2可以得出选择的引物应该是F1和R2；构建基因表达载体过程中需要用到限制酶和DNA连接酶，而限制酶的选择要注意限制酶的位置和种类，根据图1和图3可知，限制酶应该选目的基因两端的也就是KpnⅠ、XhoⅠ；质粒含氨苄青霉素抗性基因，可通过氨苄青霉素筛选含重组载体的细胞。动物基因工程常用显微注射法将重组载体导入受精卵。检测乳汁中是否含目标蛋白质，常用抗原—抗体杂交技术。第64讲　基因工程的基本工具和操作程序
学习目标　1. 概述基因工程的基本原理。2. 概述基因工程的一般步骤。
核心体系
活动方案
活动一 概述基因工程操作过程
下图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图，请回答下列问题。
(1) 请写出基因工程操作的基本步骤。
(2) 获取目的基因的一般方法有哪些？
(3) ②的构建需要哪些酶的参与？限制酶主要来源于原核生物，但限制酶不能切割自身所在原核生物的DNA分子，为什么？DNA连接酶和DNA聚合酶作用有什么不同？从④→⑤采用的是什么技术？
(4) 将目的基因导入受体细胞通常有哪些方法？图示农杆菌转化法，目的基因(抗虫基因)需要插入Ti质粒的什么部位？原因是什么？
(5) 检测抗虫基因是否转移到植物细胞中以及检测抗虫基因是否能转录的方法是什么？检测抗虫基因是否能翻译的方法是什么？检测植物能否表现出抗虫性状的方法是什么？
活动二 回顾基因工程中工具酶的使用
下表是四种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中标注了相关限制酶的酶切位点。请回答下列问题。
限制酶 BamH Ⅰ Bcl Ⅰ Sau3A Ⅰ Hind Ⅲ
识别序列及 切割位点 G↓GATCC CCTAG↑G T↓GATCA ACTAG↑T ↓GATC CTAG↑ A↓AGCTT TTCGA↑A
图1 图2
(1) 质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有哪些？作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有哪些条件？
(2) 用图中质粒和目的基因构建重组质粒，应选用哪两种限制酶切割？
(3) 与单酶切相比，双酶切的优点是什么？
(4) 质粒中四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因的作用是什么？
(5) 酶切后的载体和目的基因片段，通过什么酶作用后获得重组质粒？此酶作用于什么化学键？此酶通常有哪两类，区别是什么？
(6) 将此质粒载体用BamH Ⅰ酶切后，与用Sau3A Ⅰ(BamHⅠ与Sau3AⅠ酶来源不同，识别序列也不同，但是切割后可以产生相同的游离单链黏性末端)酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化，被转化的大肠杆菌有哪三种？
(7) 平板上长出的菌落，常用PCR鉴定，所用的引物组成为图2中的哪两个？
(8) 若用Sau3AⅠ切图1质粒，最多可能获得几种大小不同的DNA片段？
活动三 认同基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤
某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamHⅠ酶切后，与用BamHⅠ酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。请回答下列问题。
(1) 构建基因表达载体的目的是？如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是什么？
(2) 含有质粒载体和含有插入了目的基因的重组质粒的细胞也不能区分的原因是什么？
(3) 在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需在固体培养基中添加什么物质？
(4) 基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自哪里？
(5) 若受体细胞是原核生物，来自真核生物的目的基因通常来源于PCR技术还是RT-PCR技术？
名卷优选
1. 下列与生物工程中有关酶的说法，正确的是(　　)
A. 胰蛋白酶和胃蛋白酶都能用于制备细胞悬液
B. DNA聚合酶和RNA聚合酶都能催化磷酸二酯键的形成
C. 逆转录酶和DNA连接酶发挥作用时都需要模板
D. 限制性内切核酸酶和解旋酶都作用于氢键
2. [2025南京月考]下列有关限制酶和DNA连接酶的叙述，正确的是(　　)
A. 用限制酶酶切获得一个外源基因时得到两个切口，有2个磷酸二酯键被断开
B. 限制酶识别序列越短，则该序列在DNA中出现的概率就越小
C. 序列—C↓ATG—和—G↓GATCC—被限制酶切出的黏性末端碱基数不同
D. T4 DNA连接酶不能催化黏性末端的连接
3. [2025盐城五校联考]基因工程的核心是构建基因表达载体，下列不属于载体作用的是(　　)
A. 载体具有标记基因，便于筛选含目的基因的受体细胞
B. 载体能协助目的基因在受体细胞中稳定存在
C. 载体含有启动子和终止子协助目的基因表达
D. 载体能防止目的基因被受体细胞限制酶“切割”
4. [2026南通如皋开学考]图示人体正常基因A突变为致病基因a及Hind Ⅲ切割位点。AluⅠ限制酶识别序列及切割位点为，下列相关叙述正确的是(　　)
A. 基因A与基因a互为等位基因，其突变不具有可逆性
B. 两种限制酶酶切形成的末端类型不同，均可用E.coli DNA连接酶连接
C. Hind Ⅲ切割基因A时，催化磷酸二酯键和氢键的断裂
D. 产前诊断时，该致病基因可选用Hind Ⅲ限制酶开展酶切鉴定
5. [2026苏州中学月考]一种新型DNA聚合酶可耐受92 ℃高温。其通过引入古菌特有糖基化修饰位点形成保护性水合层，进而显著提升热稳定性。下列关于这类耐高温的DNA聚合酶的叙述，正确的是(　　)
A. 这类耐高温的DNA聚合酶的基本单位是脱氧核苷酸
B. 当模板DNA和脱氧核苷酸存在时即可催化反应
C. 为维持较高的催化活性，适宜在70 ℃～75 ℃下保存
D. 对酶活性结构域特定氨基酸位点突变可进一步提升其耐热性
6. 用XhoⅠ和SalⅠ两种限制性内切核酸酶分别处理同一DNA片段(限制酶在对应切点一定能切开)，酶切位点及酶切产物分离结果如图所示。下列叙述错误的是(　　)
图1　酶切位点图 图2　电泳结果示意图
A. 图1中两种酶识别的核苷酸序列不同
B. 图1中酶催化反应的化学键是磷酸二酯键
C. 图2中②可能是用XhoⅠ处理得到的酶切产物
D. 用XhoⅠ和SalⅠ同时处理该DNA电泳后得到7种产物
7. [2025徐州期末]下图表示利用基因工程技术生产人血清白蛋白的两条途径。下列相关叙述错误的是(　　)
A. 若A基因是从人细胞内提取的mRNA经逆转录产生的，则A基因中不含启动子序列
B. 扩增目的基因时，利用耐高温的DNA聚合酶从引物a、b的3′端进行子链合成
C. 利用显微注射法将人血清白蛋白基因导入的绵羊受体细胞是乳腺细胞
D. 为了保证从乳汁中获得人血清白蛋白，需将人血清白蛋白基因与乳腺蛋白基因的启动子重组
8. (多选)[2024连云港赣榆高中检测]图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，其中TetR是四环素抗性基因、AmpR是氨苄青霉素抗性基因。图2为重组质粒，甲、乙、丙为3种引物所在的相应位置。下列有关叙述错误的有(　　)
图1
图2
A. 质粒P1经“酶处理”后平末端转变成黏性末端，有利于与目的基因片段的连接
B. 质粒P2和目的基因片段可在DNA聚合酶或DNA连接酶的作用下形成重组质粒
C. 若受体微生物能在含有氨苄青霉素的培养基上生长，说明成功导入了重组质粒P3
D. 用PCR鉴定筛选出的菌落中是否含正确插入目的基因的重组质粒，选择引物甲和丙最合适
9. [2026四川绵阳南山中学开学考]卡拉胶是一类源于海洋红藻的大分子多糖，可被某些细菌降解为具有多种应用前景的卡拉胶寡糖。某研究小组拟筛选具有高活性卡拉胶酶(CG)的菌种用于生产卡拉胶寡糖。请回答下列问题。
(1) 选择海藻和海泥作为样本筛选卡拉胶降解菌的原因是________________
_____________________________。将培养后的菌液混匀并充分________，再接种至微孔板中，经培养和筛选获得了CG活性最高的菌种。
(2) 为构建携带cg(CG的编码基因)的大肠杆菌表达载体(图1)，对cg的PCR扩增产物和质粒进行双酶切，随后用E.coli DNA连接酶连接。为保证连接准确性和效率，cg转录模板链的5′端最好含有________酶切位点。另有两组同学选用了各不相同的双酶切组合和T4 DNA连接酶重复上述实验，获得的部分重组质粒分子大小符合预期，但均无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割，其原因是________________________________。
注：限制酶的识别序列和切割位点如下：
图1
(3) 为将构建好的表达载体转入大肠杆菌，需要先用Ca2+处理大肠杆菌细胞，目的是________________________________________________________________，
随后在含________和________的培养基中培养一段时间后，根据菌落周围有无水解透明圈筛选目的菌株。
(4) 已知空间上邻近的两个半胱氨酸易形成二硫键，从而提升蛋白质的耐热性。为提高CG的耐热性，研究人员分析了五个氨基酸位点的空间距离和保守度(保守度值越大表明该位点对酶的功能越关键)，如图2 所示。根据分析结果，选择第________位的氨基酸替换成半胱氨酸最合适，原因是_______________________。
图2
第64讲　基因工程的基本工具和操作程序
【活动方案】
活动一
(1) 获取目的基因、构建基因表达载体、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。
(2) 从基因文库中获取、人工合成法。
(3) 限制性内切核酸酶、DNA连接酶。 自身所在原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。DNA连接酶连接的是DNA片段，DNA聚合酶催化游离的单个脱氧核苷酸连接到子链3′端。植物组织培养。
(4) 导入植物细胞：农杆菌转化法、花粉管通道法；导入动物细胞：显微注射法；导入微生物：感受态转化法(Ca2+处理法)。T-DNA内部。只有T-DNA能转移并整合到植物细胞染色体组中。
(5) PCR等技术。抗原—抗体杂交。抗虫接种试验。
活动二　
(1) 能够自我复制、具有标记基因、具有一个或多个限制酶切割位点。启动子和终止子。
(2) BclⅠ和Hind Ⅲ。
(3) 可保证插入外源片段的方向，防止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化。
(4) 作为标记基因，用于阳性筛选。
(5) DNA连接酶。磷酸二酯键。E.coli DNA连接酶，只能催化黏性末端连接；T4 DNA连接酶，可催化黏性末端或平末端的连接。
(6) 分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。
(7) 引物甲和引物丙。
(8) 7种。
活动三
(1) 使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，且目的基因能够表达和发挥作用。二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长。
(2) 二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长。
(3) 四环素。
(4) 受体细胞。
(5) RT-PCR技术。
与DNA有关的酶
酶 作用 作用相关“键”
限制酶 切割DNA片段，产生两个(具有相同黏性末端或平末端)DNA片段 破坏磷酸二酯键
DNA 连接酶 催化两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，从而连接起来 形成磷酸二酯键
解旋酶 将双链DNA分子局部解旋为单链 破坏氢键(非化学键)
DNA聚合酶 把游离的脱氧核苷酸连接到引物或者已有的DNA单链的3′端上 形成磷酸二酯键
DNA(水解)酶 将DNA水解为脱氧核苷酸 破坏磷酸二酯键
【名卷优选】
1 B
2 C　限制酶切割DNA双链时，每个切口会断开2个磷酸二酯键(双链各1个)，若获得一个外源基因需切两次产生两个切口，则共断开4个磷酸二酯键，A错误；限制酶识别序列越短，可能的组合数越少，因此短序列在DNA中出现的概率更大，B错误；序列—C↓ATG—被切割后，黏性末端为2个碱基，而—G↓GATCC—被切割后，黏性末端为4个碱基，两者碱基数不同，C正确；T4 DNA连接酶可连接黏性末端和平末端，D错误。
3 D　载体具有标记基因，标记基因便于筛选含有目的基因的受体细胞，A正确；载体在受体细胞中能够稳定存在，并且自我复制，使目的基因数量扩大，B正确；载体含有的启动子和终止子可协助目的基因的表达，C正确；载体不能防止目的基因被受体细胞限制酶“切割”，D错误。
4 D　突变是不定向的，具有可逆性，A错误；E.coli DNA连接酶连接平末端的效率低于T4 DNA连接酶，而AluⅠ限制酶切割DNA形成的是平末端，应该用T4 DNA连接酶，B错误；HindⅢ切割基因A时，破坏的是磷酸二酯键，C错误；因为正常基因A和致病基因a的HindⅢ切割位点不同，所以产前诊断时，该致病基因可用HindⅢ限制酶开展酶切鉴定，D正确。
5 D　DNA聚合酶的本质是蛋白质，其基本单位为氨基酸，A错误；DNA聚合酶催化反应需模板DNA、引物及脱氧核苷酸，仅模板和底物无法启动反应，B错误；酶保存通常需低温(如4 ℃)以维持活性，高温保存会破坏酶结构，即使耐高温酶长期保存仍需低温，C错误；通过突变特定氨基酸位点可优化酶结构域稳定性，如糖基化修饰以提升耐热性，进一步突变可能增强特性，D正确。
6 D
7 C　成熟的mRNA是由基因转录后经剪切而成，不含启动子序列，A正确；在引物作用下，DNA聚合酶从引物3′端开始延伸DNA链，扩增目的基因时，利用耐高温的DNA聚合酶从引物a、b的3′端进行子链合成，B正确；导入人血清白蛋白基因的绵羊受体细胞通常是受精卵，C错误；要使目的基因在乳腺细胞中表达，需要在目的基因的上游加上乳腺蛋白基因的启动子，D正确。
8 BCD　质粒P1经“酶处理”后由平末端转变成黏性末端，黏性末端游离，易与互补末端碰撞，因此能提高目的基因片段和质粒的连接效率，A正确；质粒P2和目的基因片段可在DNA连接酶的作用下形成重组质粒，不需要DNA聚合酶，B错误；图示的质粒均含有抗氨苄青霉素的基因，因此，若受体微生物能在含有氨苄青霉素的培养基上生长，不能说明成功导入了重组质粒P3，C错误；用PCR鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，选择引物乙和丙即可，因为PCR扩增的DNA片段是引物之间的序列，扩增乙和丙之间的序列就包含了目的基因，D错误。
9 (1) 在富含卡拉胶的环境中，存在能够分解卡拉胶的微生物的可能性较大　稀释
(2) BamHⅠ　重组质粒连接处的序列不再是原来的限制酶识别序列
(3) 使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态　卡拉胶　四环素
(4) 44　该位点的氨基酸空间上离半胱氨酸更近，容易形成二硫键，而且保守度低，替换后对酶功能的影响较小
解析：(2) E．coli DNA连接酶只能连接具有黏性末端的片段，因此切割质粒和目的基因时不能选择切成平末端的限制酶，即不能选择EcoRⅤ酶和SmaⅠ酶，而SpeⅠ酶与XbaⅠ酶切割后的黏性末端相同，若选择SpeⅠ酶与XbaⅠ酶切割，会出现质粒和目的基因的自连，甚至目的基因倒接的情况，因此切割质粒时，SpeⅠ酶与XbaⅠ酶中只能选择一个，而另一个限制酶需要选择BamHⅠ酶，又由于转录的方向是由启动子→终止子，且mRNA形成的方向是5′→3′，且mRNA与DNA的模板链方向相反，因此基因模板链的3′端应靠近启动子，故为保证连接准确性和效率，cg转录模板链的5′端最好含有BamHⅠ酶切位点。不同的平末端均可由T4 DNA连接酶连接，但由于限制酶的识别序列具有专一性，若连接后的序列不存在最初限制酶的识别序列，则可能导致重组质粒无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割。(3) 由于具有高活性卡拉胶酶(CG)的菌种可分解卡拉胶，使其菌落周围形成透明圈，且重组质粒上含有四环素抗性基因，因此导入目的基因的大肠杆菌可接种在含卡拉胶和四环素的培养基中培养一段时间后，根据菌落周围有无水解透明圈筛选目的菌株。(4) 据图可知，虚线长度代表氨基酸间的空间距离，由于第44位点的氨基酸空间上离半胱氨酸更近，容易形成二硫键，而且保守度低，替换后对酶功能的影响较小，因此选择第44位的氨基酸替换成半胱氨酸最合适。

展开更多......

收起↑