资源简介

第66讲　DNA片段的扩增(PCR技术)
1 PCR扩增时需考虑高质量的基因组DNA模板以及反应体系中各种成分的优化组合。下列相关叙述错误的是(　　)
A. 反应体系中模板DNA的量和纯度影响PCR的成功与否
B. 设计引物时需考虑引物的长度、碱基序列和GC含量
C. Taq酶的浓度过低会引起非特异性扩增产物量的增多
D. 目标DNA的获得取决于引物在模板DNA上的结合位置
2 用PCR技术对DNA分子中的A1片段进行扩增，设计了引物Ⅰ、Ⅱ，其连接部位如下图所示，X为某限制酶识别序列。扩增后得到的绝大部分DNA片段是下图中的(　　)
A B C D
3 下图表示PCR扩增某个目的基因的基本过程。下列有关叙述正确的是(　　)
A. PCR技术的主要原理是DNA复制，解旋酶和DNA聚合酶分别在图中①③两步中起作用
B. 据图分析，PCR操作过程中使用的DNA聚合酶至少要能忍受72 ℃的高温
C. PCR技术使用的前提是能够利用目的基因的部分序列合成至少1种引物
D. 因为引物不能重复使用，所以在第n轮扩增过程中至少消耗2n个引物
4 [2025南通海安实验中学模拟]下列有关PCR技术的叙述，正确的是(　　)
A. 不同反应体系PCR的温度差别主要表现为延伸温度的差异
B. 引物较短以及退火温度较低均可能形成大量非特异性扩增产物
C. 利用重叠延伸PCR技术和凝胶电泳技术对镰状细胞贫血致病基因进行测序
D. 应用RT PCR技术检测某RNA病毒，反应体系中的酶仅有耐高温DNA聚合酶
5 [2026南通如皋开学考]下图表示PCR过程中某个阶段反应体系的情况，①～④表示相关物质，L、R表示方向。下列叙述正确的是(　　)
A. DNA体内复制与体外复制(PCR)所需能量均只来自dNTP
B. PCR过程中需要添加缓冲液，其中所含的Mg2+可用于激活DNA聚合酶
C. ②链从L到R的方向为3′→5′，①②链均可作为子链合成的模板
D. 引物③的5′端添加了某序列，至少需经3次循环才可获得该序列的双链产物
6 [2025扬州期末]荧光定量PCR技术可定量检测样本中某种DNA含量。其原理是在PCR体系中每加入一对引物的同时加入一个与某条模板链互补的荧光探针，当Taq酶催化子链延伸至探针处，会水解探针，使荧光监测系统接收到荧光信号，即每扩增一次，就有一个荧光分子生成。下列叙述错误的是(　　)
A. PCR反应体系中需要加入Mg2+以激活Taq酶
B. Taq酶催化DNA的合成方向总是从模板链的5′端向3′端延伸
C. 在反应体系中，检测到的荧光信号越强则消耗的引物越多
D. 若扩增n次，则共需要消耗2n1个探针
7 [2025南通海门中学月考]下列有关“DNA的粗提取与鉴定”“PCR扩增”“琼脂糖凝胶电泳”实验的叙述，错误的是(　　)
A. 新鲜洋葱、鸡血、猪肝等都可以作为提取DNA的实验材料
B. 利用DNA和蛋白质在2 mol/L NaCl溶液、95%酒精中的溶解度差异提取DNA
C. PCR扩增反应体系中dNTP既可为扩增提供原料，也可为子链合成提供能量
D. 凝胶载样缓冲液中加入的核酸染料，能使DNA分子在紫外灯下被检测出来
8 [2025苏州月考]不对称PCR是利用不等量的一对引物来产生大量单链DNA(ssDNA)的方法。加入的一对引物中含量较少的被称为限制性引物，含量较多的被称为非限制性引物。PCR反应最初的若干次循环中，其扩增产物主要是双链DNA(dsDNA)，但当限制性引物消耗完后，就会产生大量的ssDNA。不对称PCR的简单过程如图所示。下列叙述错误的是(　　)
A. 在PCR过程中，可通过温度来控制DNA的解旋
B. 上述过程中子链均由两种引物的5′端向3′端延伸
C. 据图可知，最后大量获得的ssDNA与图中甲链的碱基序列互补
D. 图中非限制性引物和限制性引物分别与甲链和乙链的一段碱基序列互补
9 (多选)用PCR方法检测转基因植株中是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱。其中1号为DNA标准样液(Marker)，10号为蒸馏水。PCR时加入的模板DNA如下图所示。据此作出的分析，合理的有(　　)
A. PCR产物的分子大小在250至500 bp之间
B. 3号样品为不含目的的基因的载体DNA
C. 9号样品对应植株不是所需的转基因植株
D. 10号确定反应体系等对结果没有干扰
10 (多选)[2024南通开学考]hNaDC3(人钠/二羧酸协同转运蛋白3)主要分布于肾脏等重要器官。为进一步研究hNaDC3的生理功能，科研人员利用基因工程技术构建了绿色荧光蛋白(GFP)基因与hNaDC3基因的融合基因，其过程如图所示。下列相关叙述错误的有(　　)
A. 设计引物的目的是能够从其5′端开始连接脱氧核苷酸
B. 设计引物P1和P2的依据是GFP基因两端的核苷酸序列
C. PCR扩增GFPhNaDC3基因，经过1轮可形成所需的等长片段
D. 杂交链延伸生成GFPhNaDC3融合基因的过程中需要加入引物P1和P4
11 (多选)[2026南通如皋开学考]双脱氧测序法(Sanger法)是第一代DNA测序方法。在4支试管中分别加入4种dNTP和少量的1种ddNTP进行PCR，再把PCR产物变性，利用电泳进行分离，根据结果确定特定碱基的位置。通过该方法测定并比较某疾病患者与对照个体DNA模板链的一段碱基序列，结果如图所示。下列叙述正确的是(　　)
注：dNTP是PCR的四种原料；双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)有ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP四种；在DNA聚合酶作用下，ddNTP与dNTP竞争核苷酸链延长位点，以加入ddATP的体系为例；若配对的为ddATP，延伸终止；若配对的为dATP，继续延伸
A. 5′—CTACCCGTGAT—3′为对照个体的一段序列
B. ddNTP与dNTP竞争的延长位点为核苷酸链的5′末端
C. 上述PCR反应体系通常需要足够多的模板链
D. 患者该段序列中某位点的碱基T突变为C
12 (多选)[2026南通海安期中]为了将Irk3基因(800 bp)和EGFP基因(1 200 bp)在果蝇中融合表达，运用重组酶技术构建重组质粒，如图1。有关基因序列如图2。下列相关叙述正确的是(　　)
图1
图2
A. 将一个pUAST/aatB载体线性化至少增加两个游离的磷酸基团
B. F1F的序列为5′—CAATCGGACAGATCTATG—3′
C. F1R的序列为5′—TCCTCCTTCCTTTCTGTA—3′
D. 运用F1F和F2R对重组质粒进行PCR得到的片段的长度为2 000 bp
13 [2024南通模拟]磷脂酸(PA)是调节植物生长发育和逆境响应的重要信使物质。为了解植物细胞中PA的动态变化，研究人员用无缝克隆技术将高度专一的PA结合蛋白(PABD)基因与绿色荧光蛋白(GFP)基因融合，构建有效监测细胞PA变化的荧光探针，并测定拟南芥细胞内PA含量。无缝克隆技术连接DNA片段的机理和构建荧光探针表达载体过程如图所示，请回答下列问题。
(1) 无缝克隆时，T5核酸外切酶沿________的方向水解DNA，其目的是形成________。T5核酸外切酶催化的最适温度为37 ℃，而过程①选择的温度为50 ℃，目的是降低酶活性，__________________________。
(2) 过程②两个片段退火后存在“缺口”的原因是______________________，过程③所需的酶有__________________。
(3) 与传统的酶切再连法相比，无缝克隆技术构建重组质粒的优点有_______。
A. 不受限制酶切位点的限制
B. 不会引入多余碱基
C. 操作时间短，成功率高
D. 有利于多个小片段(<50 bp)连接
(4) PCR扩增PABD基因时需依据________________________________设计引物R1。据图分析，扩增目的片段的引物F1和R2对应于下表中的________。
1 5′—TCCGGACTCAGATCTCGAGC—3′
2 5′—AGCTATAGTTCTAGATCTAGATTAACTAGTCTTAGTGGCGTC—3′
3 5′—TATCGATGGCGCCAGCTGAGGATGGTGAGCAAGGGCGA—3′
4 5′—GCTCGAGATCTGAGTCCGGACTTGTACAGCTCGTCCA—3′
(5) 利用农杆菌花序侵染法转化拟南芥，将获得的种子(T1)进行表面消毒，均匀铺在含有________的MS培养基上进行筛选和鉴定。T1自交获得的T2幼苗的抗性表现和比例为________________________，说明T1为单位点插入的转基因株系。
(6) 通过观测转基因拟南芥根尖细胞中__________________，了解PA的动态变化。
14 [2026江苏五校联考]研究显示Gata3基因是大量肿瘤细胞的潜在突变位点，Gata3蛋白由444个氨基酸构成。为研究Gata3蛋白在细胞中的定位，科研人员将GFP(绿色荧光蛋白)基因与Gata3基因融合，构建基因表达载体转入小鼠受精卵，并整合到受精卵的染色体上，获得能正常表达融合蛋白的杂合雌、雄小鼠各一只。相关限制酶识别序列及限制酶识别位点如图所示，A、B、C、F、R为不同引物，请回答相关问题。
(1) 在利用PCR扩增GFP编码区序列的过程中，需要设计引物F和R，在两个引物的________端需分别添加限制酶识别序列。为了使GFP基因能正确插入载体中，需要设计的引物的F和R分别为________(填序号)。
①5′—CCCGTCGACAAAAACACTTTTTGATATTCG—3′
②5′—CCCGTCGACTTCATGCTTGATATGCCAATC—3′
③5′—CCCCTCGAGTTCATGCTTGATATGCCAATC—3′
④5′—CCCGAATTCTTCTAGTCGACCACAAGAAG—3′
(2) 在构建Gata3基因与GFP基因的融合基因时，应将__________基因中编码终止密码子的序列删除，目的是________________________________。
(3) 重组载体的构建过程中，用到的限制酶具体有_______________________，将酶处理过的目的基因和载体连接时，需要在低温环境中操作，原因是__________
__________________________。
(4) 为了确定目的基因插入到小鼠细胞中染色体上的具体位置，科研人员常用DNA分子原位杂交技术，分子杂交需使用特定序列的单链DNA(ss-DNA)作为分子探针。为制备大量单链DNA片段，研究人员常采用不对称PCR技术。若反应体系中原有50个模板DNA，最初10个循环后限制性引物耗尽，再进行15个循环，理论上可制备ss-DNA________(用科学记数法计数)个。
(5) 研究人员从荧光小鼠中提取融合基因的相关DNA片段，若用引物A和B进行PCR扩增，但没能扩增出GFP基因，从PCR操作过程中温度控制角度分析，可能的原因有______________________________(至少写出两点)。
第66讲　DNA片段的扩增(PCR技术)
1 C　2 D　3 C
4 B　不同反应体系PCR的温度差别主要表现为退火温度的差异，A错误；若退火温度低，引物较短时，引物和模板匹配低时，也能稳定存在，那么模板上可能存在很多区域能和引物上的少量碱基匹配，可能形成大量非特异性扩增产物，B正确；应用RT-PCR技术检测某RNA病毒，反应体系中的酶有耐高温DNA聚合酶、逆转录酶，D错误。
5 B　体内DNA复制由ATP(解旋)、dNTP提供能量，体外DNA复制(PCR)由dNTP和加热提供能量，A错误；DNA聚合酶都需要Mg2+激活，因此PCR反应的缓冲液中一般要添加Mg2+，B正确；根据DNA分子中两条链的反向平行关系可判断，②链从L到R的方向为5′→3′，图中①②链均可作为子链合成的模板，C错误；引物③的5′端添加了某序列，经过第1次循环，得到的1个DNA分子中有1条链含有该序列；经过第2次循环，得到的1个DNA分子的两条链均含有该序列，所以至少需经2次循环就可获得该序列的双链产物，D错误。
6 B　PCR反应体系中需要加入Mg2+以激活Taq酶，有利于PCR过程的进行，A正确；Taq酶催化DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸，B错误；由题意可知，每扩增一次，就有一个荧光分子生成，据此推测荧光信号越强，说明PCR循环次数越多，则消耗的引物越多，C正确；由题意可知，在PCR体系中每加入一对引物的同时加入一个与某条模板链互补的荧光探针，即每个DNA分子需要1个探针，扩增n次，可得到2n个DNA分子，则共需要消耗2n1个探针，D正确。
7 D　新鲜洋葱(植物细胞)、鸡血(鸟类红细胞含细胞核)、猪肝(动物细胞含细胞核)均可作为提取DNA的材料，因它们均含有细胞核DNA，A正确；DNA在2 mol/L NaCl溶液中溶解度较高，而蛋白质溶解度较低，DNA不溶于95%冷酒精而蛋白质溶，B正确；凝胶载样缓冲液中的染料(如溴酚蓝)用于指示电泳进程，而检测DNA需在凝胶中加入核酸染料或电泳后染色，D错误。
8 C　不对称PCR最终大量产生的单链实际上与下方乙链互补，因乙链本身与甲链互补，所以所获得的大量单链序列与甲链相同而非与甲链互补，C错误。
9 ACD　PCR过程，可以通过设计特定的引物来扩增特定的DNA片段，4～9号转基因植株，理论上应包含目的基因，结合2号野生型和10号蒸馏水组的结果，推测包含目的基因的片段大小应为250至500 bp之间，A正确；3号PCR结果包含250至500 bp片段，应包含目的基因，B错误；9号PCR结果不包含250至500 bp片段，所以不是所需转基因植株，C正确；10号以蒸馏水为对照，可排除反应体系等对结果的干扰，由图可知，10号的电泳结果能确定反应体系等对实验结果没有干扰，D正确。
10 ABD　DNA复制从子链的5′端→3′端，因此设计引物的目的是能够从其3′端开始连接脱氧核苷酸，A错误；设计引物P1和P2的依据是GFP基因两端的核苷酸序列以及引物P2和引物P3部分核苷酸序列的互补配对，B错误；PCR扩增GFP-hNaDC3基因，利用引物P1和引物P4经过1轮可形成所需的等长片段，C正确；杂交链延伸生成 GFP-hNaDC3融合基因的过程中，不需要加入引物，两条母链的起始位置的碱基序列即为引物，可以作为子链合成的引物，为DNA聚合酶提供3′端，D错误。
11 AC　根据双脱氧测序法原理，电泳方向从下往上(因为小分子片段迁移快在下方)，对照个体的序列应从下往上读，为5′—CTACCCGTGAT—3′，A正确；DNA聚合酶只能使新合成的DNA链从5′向3′方向延伸，所以ddNTP与dNTP竞争的延长位点为核苷酸链的3′末端，B错误；在进行测序时，模板量的数量需要足够多，以确保测序的准确性和可测性，如果模板DNA量不足，可能会导致测序结果不准确或无法进行，C正确；患者的测序结果为5′—CTACCTGTGAT—3′，对照个体的测序结果为5′—CTACCCGTGAT—3′，测序用的是PCR技术，得到的子链为模板链的互补链，并不是模板链，所以从电泳图上直接得到的结果是模板链的互补链，进一步推导模板链，最终得到的结果是碱基G突变为碱基A，D错误。
12 AC　pUAST aatB为环状DNA分子，不含游离的磷酸基团，将其线性化至少用限制酶切割一次，这样至少加两个游离的磷酸基团，A正确；根据引物的特点可知，F1-F从模板链的3′到5′延伸子链，所以该引物的右侧序列应和模板链的5′端序列相同，Irk3基因需要与载体结合，据图可知F1-F作为引物需要保证在Irk3基因的左侧扩增出与载体相同的限制酶切序列，所以F1-F左侧的序列应该与载体的5′端序列相同，这样F1-F的序列为5′—AGATCTATGCAATCGGAC—3′，B错误；据图可知F1R引物的左侧序列和Irk3基因的右侧序列互补配对，F1R引物的右侧序列与EGFP基因的左侧序列相同。F1-R引物是从右侧向左侧扩增DNA，再根据子链是沿着引物的3′延伸，可知F1-R的序列为5′—TCCTCCTTCCTTTCTGTA—3′，C正确；F1-F引物左侧的序列和F2R右侧的序列包括一段载体同源序列，所以运用F1F和F2R对重组质粒进行PCR得到的片段长度大于2 000 bp，D错误。
13 (1) 5′→3′　黏性末端　防止过度水解DNA　(2) 过程①形成的黏性末端长度不同　DNA聚合酶和DNA连接酶　(3) ABC (4) PABD基因一端的核苷酸序列和载体一端的核苷酸序列　1、4　(5) 草胺膦　抗草胺膦∶不抗草胺膦＝3∶1　(6) 绿色荧光点的分布
解析：(1) 由图可知，过程①中T5核酸外切酶沿5′→3′的方向水解DNA，以形成黏性末端。温度能影响酶活性，T5核酸外切酶催化的最适温度为37 ℃，而过程①选择的温度为50 ℃，目的是降低酶活性，防止过度水解DNA。(2) 过程②在退火的过程中，两个片段的黏性末端可根据互补序列进行配对结合，但由于过程①形成的黏性末端长度不同，因此在过程②退火后存在“缺口”。过程③缺口处DNA链的补齐，可以看作DNA分子的复制过程，所需的酶有DNA聚合酶和DNA连接酶。(4) 由重组DNA图可知，GFP基因和PABD基因进行连接，PCR扩增GFP基因时需根据GFP基因一端的核苷酸序列和PABD基因一端的核苷酸序列设计引物R2，而设计引物F1仅需根据PABD基因一端的核苷酸序列，因此引物F1的碱基序列比引物R2的碱基序列短，引物F1对应于表中的1。引物R2的一部分能与引物F1进行碱基互补配对，R2对应于4。(5) bar(草胺膦抗性基因)为标记基因，位于T DNA上，整合到受体细胞染色体的DNA上，因此利用含有草胺膦的MS培养基进行筛选和鉴定。若T1为单位点插入的转基因株系，假设抗性基因用A表示，非抗性为a，则T1的基因型为Aa，T1代自交获得的T2幼苗的基因型及比例为A_∶aa＝3∶1。
14 (1) 5′　②④　(2) GFP　避免融合基因只表达出GFP蛋白 (3) SalⅠ、EcoRⅠ、MunⅠ、XhoⅠ　低温有利于黏性末端碱基之间形成氢键　(4) 7.68×105　(5) 变性温度低、退火温度太高
解析：(1) DNA聚合酶的催化方向是5′→3′，限制酶识别序列必须添加在引物的5′端，这样既不会影响引物与模板的配对和PCR扩增，又能让扩增出的目标片段两端带上对应的酶切位点。根据基因插入前后对比可知，将GFP(绿色荧光蛋白)基因与Gata3基因融合，需要两种DNA片段具有相同的黏性末端，GFP基因的终止子在右侧(即转录方向为从左到右)，故插入的调控序列应颠倒进行插入，即设计的时候：R引物末端插入对应下方载体的XhoⅠ酶切位点，F引物末端插入对应下方载体的MunⅠ酶切位点，又因为GFP基因中含有的XhoⅠ位点，因此不能用XhoⅠ酶来切，否则会破坏基因序列。结合题干当中所给的5种限制酶的识别序列，XhoⅠ和SalⅠ互为同尾酶；MunⅠ和EcoRⅠ互为同尾酶。因此可通过使用同尾酶进行替代，即剪切扩增产物时，F末端添加的序列所对应的限制酶应选择SalⅠ，这样可以与下方载体中XhoⅠ的酶切位点结合；同理R末端应选用与MunⅠ同尾的EcoRⅠ剪切。因此引物的F和R分别为②④。(2) 结合图示可知，GFP基因插入在Gata3的前方，两个基因需要共用同一个启动子和终止子，而原先两个基因具有独立的启动子和终止子，为了避免融合基因只表达出GFP蛋白，在构建Gata3基因与GFP基因的融合基因时，应将GFP基因中编码终止密码子的序列删除。(4) 不对称PCR通过设置限制性引物(低浓度)和非限制性引物(高浓度)，前若干循环先进行常规PCR扩增双链DNA，当限制性引物耗尽后，后续循环仅以非限制性引物合成单链DNA。分析前10个循环(限制性引物未耗尽，常规PCR扩增)PCR的双链DNA扩增规律为：一个循环双链数变为原来的2倍，n个循环后双链DNA数为N0×2n。已知初始模板双链DNA数N0＝50，前10个循环后，双链DNA总数＝50×210＝50×1 024＝51 200。后15个循环(限制性引物耗尽，单链线性扩增)：每个双链DNA分子每次循环只能合成1条单链DNA，15个循环新增单链数＝51 200×15＝768 000＝7.68×105。(5) PCR扩增时，引物和模板链之间形成双链才能开始扩增，两者之间的氢键数量和PCR扩增时变性的温度和退火的温度有直接关系，若用引物A和B进行PCR扩增，但没能扩增出GFP基因，从PCR操作过程中温度控制角度分析，可能的原因有变性温度低、退火温度太高。第66讲　DNA片段的扩增(PCR技术)
学习目标　1. 概述DNA片段扩增(PCR)技术的原理及其过程。2. 熟悉PCR技术的相关计算。
核心体系
活动方案
活动一 概述PCR技术的原理及其过程
PCR技术(聚合酶链式反应)成为分子生物学实验室里的一种常规手段，其原理是利用DNA半保留复制，在试管中进行DNA的人工复制(如下图所示)，在很短的时间内，将DNA扩增几百万倍甚至几十亿倍，使实验所需要的遗传物质不再受限于活的生物体。请回答下列问题。
(1) 生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是____________。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是________________。这两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的__________。
(2) 当温度降低时，引物与模板________端结合，在______________的作用下，引物沿模板延伸，最终合成两个DNA分子，此过程中原料是______________，遵循的原则是________________。
(3) PCR技术的必要条件，除了模板、原料、ATP、酶以外，至少还需要三个条件，即：含________(离子，作用为____________)的液体环境、适宜的________和________，前者由PCR仪自动调控，后者则靠________来维持。
(4) 为什么PCR过程需要添加引物？PCR引物的化学本质是什么？其与细胞内DNA复制所需引物有何区别？
(5) PCR的首要任务就是引物设计，引物设计的好坏，直接影响了PCR的结果。成功的PCR反应既要高效，又要特异性扩增产物。PCR引物设计的依据是什么？设计引物时应注意哪些方面？
(6) PCR技术中两条子链都是连续合成的，体内DNA是半不连续复制的，其原因是什么？不同的PCR体系，设置温度的主要区别是退火步骤，该步骤温度主要取决于什么？
(7) PCR技术需要的条件适宜，但又不同于细胞内DNA复制的条件，请从酶、原料、ATP等角度比较两者的区别。
(8) 目前在PCR反应中使用耐高温的DNA聚合酶(Taq酶)而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是什么？
(9) 哪些原因可能导致PCR非特异性扩增，请尝试写出几个常见的原因？
活动二 概述PCR的实验操作方法
在实验室中进行PCR的实验操作步骤主要包括准备、移液、混合、离心、反应五个步骤。PCR实验操作中，通常要用到微量离心管，具体操作时用微量移液器按PCR反应体系的配方在微量离心管中依次加入各组分，再参照下表的设置设计好PCR仪的循环程序即可，一次PCR一般要经历30多次循环。请回答下列问题。
项目 变性 复性 延伸
预变性 94 ℃，5 min — —
30次 94 ℃，30 s 55 ℃，30 s 72 ℃，1 min
最后1次 94 ℃，1 min 55 ℃，30 s 72 ℃，1 min
(1) 为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行怎样的处理？
(2) PCR实验操作时首先应进行预变性处理，其目的是什么？
(3) 从上表可以看出PCR扩增过程中温度是关键因素，退火温度既不能过高又不能过低的原因什么？
(4) 一个目的基因通过PCR技术扩增n次时，总共需要多少个引物？扩增第n次时，需要多少个引物？第几次循环后，最可能出现两端等长的目的基因片段？从理论上推测第四轮循环产物中，含有某种引物(如引物Ⅰ)的DNA片段占比多少？
(5) 如何利用PCR技术检测受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因和目的基因是否转录出mRNA
名卷优选
1. [2026南通如皋质量检测]下列关于PCR技术的叙述，错误的是(　　)
A. 引物过短、过长以及循环次数过多均可能导致PCR特异性差
B. 不同反应体系PCR的温度差别主要表现为复性温度的差异
C. 利用高温解旋DNA，延伸时需要ATP与dNTP提供能量
D. 含a个DNA分子进行扩增，第n次循环共需要引物a·2n个
2. PCR技术是一种DNA的扩增技术。在一定条件下，加入模板DNA、DNA聚合酶、dATP、dCTP、dGTP、dTTP可以实现DNA的扩增。据此判断不合理的是(　　)
A. dATP在DNA扩增中可以提供能量，同时作为DNA合成的原料
B. dTTP完全水解后产物有胸腺嘧啶、磷酸、核糖
C. DNA扩增过程未加解旋酶，可以通过先适当加温的方法破坏氢键，使模板DNA解旋
D. CTP水解脱去两个磷酸基后是组成RNA的基本单位之一
3. [2024南通如皋适应性考试]在Mg2+存在的条件下，DNA聚合酶可被激活。下列说法正确的是(　　)
A. 细菌细胞的DNA聚合酶发挥作用不需要Mg2+
B. PCR技术中的DNA聚合酶在90 ℃条件下不会失活
C. DNA聚合酶需先与启动子结合，继而从引物的3′端延伸子链
D. 真核细胞内的DNA聚合酶均属于在细胞核内发挥作用的亲核蛋白
4. [2026江苏百校联考]关于“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验，下列相关叙述错误的是(　　)
A. 实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前可进行高压灭菌处理
B. PCR复性温度过低可能导致引物与模板非目标序列结合，电泳出现非目标条带
C. 扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液混匀后需缓慢注入加样孔以防样品飘散
D. 待指示剂前沿迁移到达凝胶加样孔边缘时需停止电泳以防DNA跑出凝胶
5. [2025江苏十一校联考]PCR仪实际上是一个温控设备，能在每次循环的3个步骤间进行温度切换，主要过程如下图所示，图中a、b、c表示过程。下列叙述错误的是(　　)
A. PCR循环过程控制的温度高低关系为a>c>b
B. 延伸的温度和时间与引物和待扩增片段的长度均有关
C. 每次循环需要的引物Ⅰ的数量与引物Ⅱ的相同
D. 若设计的引物与模板不完全配对，可适当降低PCR复性的温度
6. [2026扬州期中]下图是从被农杆菌侵染的棉花植株中分离得到的DNA片段。为确定T-DNA插入的具体位置，研究者将其连接成环，并以此环为模板进行PCR，扩增出T-DNA插入位置两侧的未知序列。下列有关说法正确的是(　　)
A. 农杆菌在自然条件下主要侵染单子叶植物和裸子植物
B. 图中T-DNA两侧应该用不同限制酶切割
C. 应选择图中的引物②③组合以扩增出T-DNA插入位置两侧的未知序列
D. 将扩增出的未知序列与棉花基因组序列比对可确定T-DNA的插入位置
7. (多选)[2026南通月考]已知T DNA插入失活是研究植物基因功能的常用方法，研究者将带有卡那霉素抗性基因的T DNA插入拟南芥2号染色体的A基因内，使其突变为丧失功能的a基因，花粉中A基因功能的缺失会造成其不育。为进一步验证基因A的功能，将另一个A基因插入Aa植株的3号染色体。对该植株自交后代F1利用图1所示引物分别进行PCR检测，电泳结果如图2所示。下列叙述错误的有(　　)
图1 图2
A. 以Aa植株为父本与野生型杂交，F1中卡那霉素抗性植株的比例为1/2
B. 仅考虑基因A和a，该植株会产生2种基因型的可育花粉
C. 根据电泳结果，图2中Ⅰ型植株占比为2/3
D. 子代数量太少导致F1中没有检测到仅扩增出600 bp条带的植株
8. RT-PCR是将RNA逆转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增反应相结合的技术，具体过程如图所示。请回答下列问题。
(1) 过程Ⅰ需要加入缓冲液、原料、_______、_______和引物A等。
(2) 过程Ⅱ首先要将反应体系的温度升高到95 ℃，其目的是______________、__________________。
(3) 过程Ⅱ拟对单链cDNA进行n次循环的扩增，理论上至少需要________个引物B。
(4) 利用RT-PCR技术获取的目的基因__________(填“能”或“不能”)在物种之间交流；该技术还可用于对某些微量RNA病毒的检测，可提高检测的灵敏度，原因是___________________________________________________________。
(5) RT-PCR过程中主要借助对________的控制来影响酶的活性，从而使得化学反应有序高效地进行。
9. [2026南京七校联考]2，3-丁二醇是一种在诸多领域具有广泛应用价值的化合物，常用产气肠杆菌进行生产。产气肠杆菌发酵产生2，3-丁二醇的同时，也会生成乳酸等多种副产物，影响产量。已知P基因(位于拟核DNA分子中)与产气肠杆菌发酵过程中副产物的生成有关，研究人员欲利用生物技术敲除P基因以获得高产2，3-丁二醇的产气肠杆菌。请回答下列问题。
图1　融合片段N及质粒A限制酶酶切位点
(1) 利用PCR扩增含有P基因上游片段和下游片段序列的融合片段N时，模板与引物在PCR反应的________阶段开始结合。PCR中使用的DNA聚合酶需耐高温，其原因为____________________。
(2) 融合片段N两端的酶切位点如图1所示，为使融合片段N定向插入到质粒A中，应先选择图1中的限制酶________和________对质粒A进行完全酶切，利用________酶将质粒特定的黏性末端补平后，再在________酶的作用下可获得含有融合片段N的重组质粒B。
(3) 用限制酶SmaⅠ和BamHⅠ对重组质粒B进行完全酶切后，电泳可得到________个条带，原因是_________________________________________________
______________________________________________________________________。
图2
图3
(4) 将重组质粒B(长度为4 000 bp)导入到用_______处理的产气肠杆菌细胞中，利用重组质粒B和产气肠杆菌DNA片段中同源区段可发生交换的原理，对P基因进行敲除(如图2)，敲除后的P基因将被有关的酶降解。P基因敲除过程中，可发生多种形式的同源区段交换，交换后用图2中的引物________进行PCR扩增，检测结果如图3所示，其中菌落________(填序号)为P基因敲除株。
第66讲　DNA片段的扩增(PCR技术)
【活动方案】
活动一
(1) 解旋酶　加热至90～95 ℃　氢键
(2) 3′　耐高温的DNA聚合酶(Taq酶)　dNTP(脱氧核苷三磷酸)　碱基互补配对
(3) Mg2+　激活DNA聚合酶　温度　酸碱度　缓冲液
(4) DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3′端延伸DNA链。PCR所需引物的化学本质是一段长度为20～30个核苷酸组成的DNA片段。细胞内复制所用引物是RNA短链，在体外扩增(PCR)需要的引物是DNA单链片段。
(5) PCR设计引物的依据是目的基因两端的部分核苷酸序列。PCR扩增DNA片段进行引物设计时，需要设计两种分别与两条模板链碱基互补的引物，两引物之间以及每种引物内部不能发生碱基互补配对，引物的长度既不能过长也不能过短。
(6) 在细胞内DNA复制时，双链只有部分打开，其中一条子链是连续合成，而另一条子链是不连续合成的。引物序列的长度和碱基比例。
(7) 细胞内DNA复制需要解旋酶和DNA聚合酶，原料为4种游离的脱氧核苷酸，需添加ATP；PCR技术不需要添加ATP，4种dNTP既可作为原料又可提供能量，不需解旋酶，需要耐高温的DNA聚合酶(Taq酶)。
(8) PCR反应体系需要在较高温度条件下进行，因此PCR反应中需使用热稳定性高的Taq酶，而大肠杆菌的DNA聚合酶在高温下会失活。
(9) 退火(复性)温度过低、引物过短、循环轮次过多、模板和引物浓度过高、引物内和引物间形成二级结构等。
活动二
(1) 高压蒸汽灭菌。
(2) 破坏DNA中可能存在的较难破坏的二级结构，使DNA充分变性，减少DNA 复杂结构对扩增的影响，以利于引物更好地和模板结合。
(3) 复性(退火)阶段温度过高，引物与模板不易结合；温度过低，引物与模板结合时特异性差。
(4) 2n+1－2。2n。3。15/16。
(5) ①提取受体细胞的DNA，设计一对引物，可以一个与染色体DNA互补结合，另一个引物与目的基因互补结合，这样只有以重组DNA为模板才能获得扩增产物(也可以都跟目的基因互补结合，这样只有含有目的基因，才能获得扩增产物)，之后再进行电泳检测。②提取受体细胞的mRNA，进行逆转录，获得cDNA，用上述方法进行PCR扩增，之后再进行电泳检测。
引物的归类分析
1 DNA的复制需要引物的原因：DNA聚合酶只能催化脱氧核糖核苷酸加至已有单链的游离3′－OH上，而不能使脱氧核糖核苷酸自身发生聚合。
(1) 引物是一小段单链DNA或RNA，它能与DNA母链的一段已知碱基互补配对。
(2) 细胞内DNA复制以RNA作引物，PCR反应一般以DNA作引物(因为RNA易降解)。
2 设计引物的主要原则
(1) 引物长度应大于16个核苷酸(通常为20～30个核苷酸)，可防止随机结合。
(2) 引物不应有发夹结构，即不能有4 bp以上的回文序列。
(3) 2个引物间不应有4 bp以上的互补序列或同源序列，在3′端不应有任何互补的碱基。
(4) 引物中碱基的分布尽可能均匀，G＋C含量接近50%。
3 引物的处理
由于引物延伸从3′端开始，3′端不能进行任何修饰，引物5′端对扩增特异性影响不大。有时需要使经PCR扩增的目的基因能与载体正常结合，需要在2种引物的5′端添加不同的限制酶的识别序列，保证目的基因定向插入载体并可避免目的基因自身环化。
4 PCR技术中的数量关系
复制次数/次 1 2 3 n
DNA分子数 2 4 8 2n
含引物的DNA分子数 2 4 8 2n
含引物A(或B)的DNA分子数 1＝21－1 3＝22－1 7＝23－1 2n－1
同时含引物A、B的DNA分子数 0＝21－2 2＝22－2 6＝23－2 2n－2
共消耗的引物(A和B)数量 2＝22－2 6＝23－2 14＝24－2 2n+1－2
两条单链等长的DNA分子数 0＝21－2 0＝22－4 2＝23－6 2n－2n
DNA分子种类 2 4 5 5
【名卷优选】
1 C　引物过短易导致非特异性结合，过长可能影响退火温度，循环次数过多会增加非特异性产物，均影响特异性，A正确；不同PCR体系因引物不同，复性温度需调整，而变性、延伸温度相对固定，B正确；PCR延伸时由dNTP的高能磷酸键供能，无需额外ATP，C错误；DNA为半保留复制，第n次循环是以a×2n-1个DNA分子为模板合成a×2n个DNA分子，故需a·2n个引物，D正确。
2 B
3 B　细菌细胞的DNA聚合酶发挥作用也需要Mg2+，A错误；DNA聚合酶不需与启动子结合，C错误；真核细胞内的DNA聚合酶也可以在细胞质发挥作用，D错误。
4 D　PCR实验使用到的器具和试剂如微量离心管、枪头和蒸馏水等，在使用前必须进行高压灭菌处理，避免对实验结果产生影响，A正确；PCR复性温度过低时，引物可能与模板DNA的非特异性位点结合，导致非目标条带扩增，电泳时出现杂带，B正确；将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入加样孔，以防样品飘散，C正确；待指示剂前沿迁移至凝胶边缘时停止电泳，以防止样品流失到缓冲液中，D错误。
5 B　PCR循环过程包括变性、复性和延伸三个步骤，其中变性温度(a)最高，超过90 ℃，目的是使DNA双链解开；复性温度(b)较低，一般为50 ℃左右，使引物与模板链结合；延伸温度(c)一般为72 ℃左右，是DNA聚合酶催化DNA合成的温度，温度高低关系为a＞c＞b，A正确。延伸过程是在DNA聚合酶的作用下，以脱氧核苷酸为原料，按照碱基互补配对原则合成DNA的过程。延伸的时间与待扩增片段的长度有关，片段越长，所需的延伸时间越长，但延伸温度主要由DNA聚合酶的最适温度决定，B错误。PCR每次循环中，引物Ⅰ和引物Ⅱ都分别与模板链的两端进行结合，参与DNA的合成，所以每次循环需要的引物Ⅰ的数量与引物Ⅱ的数量是相同的，C正确。PCR技术中，复性过程是引物与模板链结合的过程，若设计的引物与模板不完全配对，适当降低PCR复性的温度，可使引物与模板更易结合，提高引物与模板的结合效率，D正确。
6 D　农杆菌在自然条件下主要侵染双子叶植物和裸子植物，A错误；图中T DNA两侧应该用相同限制酶切割，以便酶切后连接成环状，B错误；耐高温的DNA聚合酶可在引物的3′端延伸子链，利用图中的引物①④组合可扩增出两侧的未知序列，C错误；不同的DNA分子或DNA区段具有特异性，将扩增出的未知序列与棉花基因组序列比对可确定T-DNA的插入位置，D正确。
7 ABD　根据题分析可知，带有卡那霉素抗性基因的TDNA插入拟南芥2号染色体的A基因内，使其突变为丧失功能的a基因，花粉中A基因功能缺失(a基因)会导致不育，因此Aa植株作为父本时，其含a基因花粉不育，无法参与受精，仅产生含A基因的花粉，故以Aa植株为父本与野生型(AA)拟南芥杂交，F1(AA)中卡那霉素抗性植株的占比为0，A错误；仅考虑基因A和a，插入A基因后，植株基因型为A0Aa(2号染色体为Aa，3号染色体为A0)，该植株会产生AA、A0、Aa、a0，其中a0花粉不育，即产生3种可育基因型的花粉，B错误；该植株雌配子即AA、A0、Aa、a0均可育，其自交得到F1，利用棋盘法可知，F1的基因型及比例为AAAA∶AAA0∶AA00∶AAAa∶AAa0∶AAaa∶Aa00∶Aaa0＝1∶2∶1∶2∶3∶1∶
1∶1，利用图1所示引物P1和P2、P1和P3分别对F1进行PCR检测，电泳结果如图2所示。根据电泳结果F1植株分为Ⅰ型和Ⅱ型，Ⅰ型(含A、a)：PCR扩增出600 bp(a)和900 bp(A)条带，Ⅱ型(仅含A)：仅扩增出900 bp条带，其中Ⅰ型植株占比为2/3，C正确；F1中没有检测到仅扩增出600 bp条带的植株，其原因为a花粉不育，无法形成纯合aa植株，D错误。
8 (1) RNA提取物　逆转录酶
(2) 让逆转录酶变性失活　使mRNAcDNA杂合双链解开
(3) 2n-1　
(4) 能　增加了待测RNA逆转录产生的DNA的数量(或浓度)，便于检测　
(5) 温度
9 (1) 复性　PCR需要在高温下进行变性(普通的DNA聚合酶在高温下会变性失活)
(2) BamHⅠ　SpeⅠ　DNA聚合　DNA连接
(3) 1　重组质粒B不能被BamHⅠ酶切，只能被限制酶SmaⅠ酶切得到1个条带
(4) Ca2+　1和4　④
解析：(2) 融合片段N两端的酶切位点如图1所示，为使融合片段N定向插入到质粒A中，应选择图1中的限制酶BamHⅠ和SpeⅠ对质粒A进行完全酶切，这是因为限制酶BamHⅠ和BclⅠ是同尾酶，PstⅠ切割后黏性末端无法补平。(3) BamHⅠ和BclⅠ相同的黏性末端连接后，重组质粒B不能被BamHⅠ酶切，只能被限制酶SmaⅠ酶切，所以用限制酶SmaⅠ和BamHⅠ对重组质粒B进行完全酶切后，电泳可得到1个条带。(4) 将重组质粒B导入到用Ca2+处理的产气肠杆菌细胞中，这样可以提高转化率。利用重组质粒B和产气肠杆菌DNA片段中同源区段可发生交换的原理，对P基因进行敲除(如图2)，敲除后的P基因将被有关的酶降解。P基因敲除过程中，可发生多种形式的同源区段交换，交换后，用图2中的引物1和4进行PCR扩增，因为引物需要与模板链的3′结合，沿着5′到3′延伸子链，检测结果如图3所示，其中菌落④为P基因敲除株，因为其中的目标DNA片段为1 200 bp，即为融合基因的长度。(共42张PPT)
第11单元
生物技术与工程
第66讲　DNA片段的扩增(PCR技术)
内容索引
核心体系
学习目标
活动方案
名卷优选
学 习 目 标
1. 概述DNA片段扩增(PCR)技术的原理及其过程。2. 熟悉PCR技术的相关计算。
核 心 体 系
活 动 方 案
PCR技术(聚合酶链式反应)成为分子生物学实验室里的一种常规手段，其原理是利用DNA半保留复制，在试管中进行DNA的人工复制(如下图所示)，在很短的时间内，将DNA扩增几百万倍甚至几十亿倍，使实验所需要的遗传物质不再受限于活的生物体。请回答下列问题。
活动一　概述PCR技术的原理及其过程
(1) 生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是________。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是_________________。这两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的________。
(2) 当温度降低时，引物与模板______端结合，在________________ ___________的作用下，引物沿模板延伸，最终合成两个DNA分子，此过程中原料是______________________，遵循的原则是_______________。
解旋酶
加热至90～95 ℃
氢键
3′
耐高温的DNA聚
合酶(Taq酶)
dNTP(脱氧核苷三磷酸)
碱基互补配对
(3) PCR技术的必要条件，除了模板、原料、ATP、酶以外，至少还需要三个条件，即：含________(离子，作用为____________________)的液体环境、适宜的________和__________，前者由PCR仪自动调控，后者则靠__________来维持。
Mg2＋
激活DNA聚合酶
温度
酸碱度
缓冲液
(4) 为什么PCR过程需要添加引物？PCR引物的化学本质是什么？其与细胞内DNA复制所需引物有何区别？
【答案】 DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3′端延伸DNA链。PCR所需引物的化学本质是一段长度为20～30个核苷酸组成的DNA片段。细胞内复制所用引物是RNA短链，在体外扩增(PCR)需要的引物是DNA单链片段。
(5) PCR的首要任务就是引物设计，引物设计的好坏，直接影响了PCR的结果。成功的PCR反应既要高效，又要特异性扩增产物。PCR引物设计的依据是什么？设计引物时应注意哪些方面？
【答案】 PCR设计引物的依据是目的基因两端的部分核苷酸序列。PCR扩增DNA片段进行引物设计时，需要设计两种分别与两条模板链碱基互补的引物，两引物之间以及每种引物内部不能发生碱基互补配对，引物的长度既不能过长也不能过短。
(6) PCR技术中两条子链都是连续合成的，体内DNA是半不连续复制的，其原因是什么？不同的PCR体系，设置温度的主要区别是退火步骤，该步骤温度主要取决于什么？
【答案】 在细胞内DNA复制时，双链只有部分打开，其中一条子链是连续合成，而另一条子链是不连续合成的。引物序列的长度和碱基比例。
(7) PCR技术需要的条件适宜，但又不同于细胞内DNA复制的条件，请从酶、原料、ATP等角度比较两者的区别。
【答案】 细胞内DNA复制需要解旋酶和DNA聚合酶，原料为4种游离的脱氧核苷酸，需添加ATP；PCR技术不需要添加ATP,4种dNTP既可作为原料又可提供能量，不需解旋酶，需要耐高温的DNA聚合酶(Taq酶)。
(8) 目前在PCR反应中使用耐高温的DNA聚合酶(Taq酶)而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是什么？
【答案】 PCR反应体系需要在较高温度条件下进行，因此PCR反应中需使用热稳定性高的Taq酶，而大肠杆菌的DNA聚合酶在高温下会失活。
(9) 哪些原因可能导致PCR非特异性扩增，请尝试写出几个常见的原因？
【答案】 退火(复性)温度过低、引物过短、循环轮次过多、模板和引物浓度过高、引物内和引物间形成二级结构等。
在实验室中进行PCR的实验操作步骤主要包括准备、移液、混合、离心、反应五个步骤。PCR实验操作中，通常要用到微量离心管，具体操作时用微量移液器按PCR反应体系的配方在微量离心管中依次加入各组分，再参照下表的设置设计好PCR仪的循环程序即可，一次PCR一般要经历30多次循环。请回答下列问题。
活动二　概述PCR的实验操作方法
项目 变性 复性 延伸
预变性 94 ℃，5 min — —
30次 94 ℃，30 s 55 ℃，30 s 72 ℃，1 min
最后1次 94 ℃，1 min 55 ℃，30 s 72 ℃，1 min
(1) 为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行怎样的处理？
【答案】 高压蒸汽灭菌。
(2) PCR实验操作时首先应进行预变性处理，其目的是什么？
【答案】 破坏DNA中可能存在的较难破坏的二级结构，使DNA充分变性，减少DNA 复杂结构对扩增的影响，以利于引物更好地和模板结合。
(3) 从上表可以看出PCR扩增过程中温度是关键因素，退火温度既不能过高又不能过低的原因什么？
【答案】 复性(退火)阶段温度过高，引物与模板不易结合；温度过低，引物与模板结合时特异性差。
(4) 一个目的基因通过PCR技术扩增n次时，总共需要多少个引物？扩增第n次时，需要多少个引物？第几次循环后，最可能出现两端等长的目的基因片段？从理论上推测第四轮循环产物中，含有某种引物(如引物Ⅰ)的DNA片段占比多少？
【答案】 2n＋1－2。2n。3。15/16。
(5) 如何利用PCR技术检测受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因和目的基因是否转录出mRNA
【答案】 ①提取受体细胞的DNA，设计一对引物，可以一个与染色体DNA互补结合，另一个引物与目的基因互补结合，这样只有以重组DNA为模板才能获得扩增产物(也可以都跟目的基因互补结合，这样只有含有目的基因，才能获得扩增产物)，之后再进行电泳检测。②提取受体细胞的mRNA，进行逆转录，获得cDNA，用上述方法进行PCR扩增，之后再进行电泳检测。
名 卷 优 选
2
4
5
1
3
7
9
6
8
1. [2026南通如皋质量检测]下列关于PCR技术的叙述，错误的是(　　)
A. 引物过短、过长以及循环次数过多均可能导致PCR特异性差
B. 不同反应体系PCR的温度差别主要表现为复性温度的差异
C. 利用高温解旋DNA，延伸时需要ATP与dNTP提供能量
D. 含a个DNA分子进行扩增，第n次循环共需要引物a·2n个
C
2
4
5
1
3
7
9
6
8
【解析】 引物过短易导致非特异性结合，过长可能影响退火温度，循环次数过多会增加非特异性产物，均影响特异性，A正确；不同PCR体系因引物不同，复性温度需调整，而变性、延伸温度相对固定，B正确；PCR延伸时由dNTP的高能磷酸键供能，无需额外ATP，C错误；DNA为半保留复制，第n次循环是以a×2n－1个DNA分子为模板合成a×2n个DNA分子，故需a·2n个引物，D正确。
2
4
5
1
3
7
9
6
8
2. PCR技术是一种DNA的扩增技术。在一定条件下，加入模板DNA、DNA聚合酶、dATP、dCTP、dGTP、dTTP可以实现DNA的扩增。据此判断不合理的是(　　)
A. dATP在DNA扩增中可以提供能量，同时作为DNA合成的原料
B. dTTP完全水解后产物有胸腺嘧啶、磷酸、核糖
C. DNA扩增过程未加解旋酶，可以通过先适当加温的方法破坏氢键，使模板DNA解旋
D. CTP水解脱去两个磷酸基后是组成RNA的基本单位之一
B
2
4
5
3
7
9
6
8
3. [2024南通如皋适应性考试]在Mg2＋存在的条件下，DNA聚合酶可被激活。下列说法正确的是(　　)
A. 细菌细胞的DNA聚合酶发挥作用不需要Mg2＋
B. PCR技术中的DNA聚合酶在90 ℃条件下不会失活
C. DNA聚合酶需先与启动子结合，继而从引物的3′端延伸子链
D. 真核细胞内的DNA聚合酶均属于在细胞核内发挥作用的亲核蛋白
1
【解析】 细菌细胞的DNA聚合酶发挥作用也需要Mg2＋，A错误；DNA聚合酶不需与启动子结合，C错误；真核细胞内的DNA聚合酶也可以在细胞质发挥作用，D错误。
B
2
4
5
3
7
9
6
8
4. [2026江苏百校联考]关于“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验，下列相关叙述错误的是(　　)
A. 实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前可进行高压灭菌处理
B. PCR复性温度过低可能导致引物与模板非目标序列结合，电泳出现非目标条带
C. 扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液混匀后需缓慢注入加样孔以防样品飘散
D. 待指示剂前沿迁移到达凝胶加样孔边缘时需停止电泳以防DNA跑出凝胶
1
D
2
4
5
3
7
9
6
8
1
【解析】 PCR实验使用到的器具和试剂如微量离心管、枪头和蒸馏水等，在使用前必须进行高压灭菌处理，避免对实验结果产生影响，A正确；PCR复性温度过低时，引物可能与模板DNA的非特异性位点结合，导致非目标条带扩增，电泳时出现杂带，B正确；将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入加样孔，以防样品飘散，C正确；待指示剂前沿迁移至凝胶边缘时停止电泳，以防止样品流失到缓冲液中，D错误。
2
4
5
3
7
9
6
8
5. [2025江苏十一校联考]PCR仪实际上是一个温控设备，能在每次循环的3个步骤间进行温度切换，主要过程如下图所示，图中a、b、c表示过程。下列叙述错误的是(　　)
1
A. PCR循环过程控制的温度高低关系为a>c>b
B. 延伸的温度和时间与引物和待扩增片段的长度均有关
C. 每次循环需要的引物Ⅰ的数量与引物Ⅱ的相同
D. 若设计的引物与模板不完全配对，可适当降低PCR复性的温度
B
2
4
5
3
7
9
6
8
1
【解析】 PCR循环过程包括变性、复性和延伸三个步骤，其中变性温度(a)最高，超过90 ℃，目的是使DNA双链解开；复性温度(b)较低，一般为50 ℃左右，使引物与模板链结合；延伸温度(c)一般为72 ℃左右，是DNA聚合酶催化DNA合成的温度，温度高低关系为a＞c＞b，A正确。延伸过程是在DNA聚合酶的作用下，以脱氧核苷酸为原料，按照碱基互补配对原则合成DNA的过程。延伸的时间与待扩增片段的长度有关，片段越长，所需的延伸时间越长，但延伸温度主要由DNA聚合酶的最适温度决定，B错误。PCR每次循环中，引物Ⅰ和引物Ⅱ都分别与模板链的两端进行结合，参与DNA的合成，所以每次循环需要的引物Ⅰ的数量与引物Ⅱ的数量是相同的，C正确。PCR技术中，复性过程是引物与模板链结合的过程，若设计的引物与模板不完全配对，适当降低PCR复性的温度，可使引物与模板更易结合，提高引物与模板的结合效率，D正确。
2
4
5
3
7
9
6
8
6. [2026扬州期中]下图是从被农杆菌侵染的棉花植株中分离得到的DNA片段。为确定T－DNA插入的具体位置，研究者将其连接成环，并以此环为模板进行PCR，扩增出T－DNA插入位置两侧的未知序列。下列有关说法正确的是(　　)
1
A. 农杆菌在自然条件下主要侵染单子叶植物和裸子植物
B. 图中T－DNA两侧应该用不同限制酶切割
C. 应选择图中的引物②③组合以扩增出T－DNA插入位置两侧的未知序列
D. 将扩增出的未知序列与棉花基因组序列比对可确定T－DNA的插入位置
D
2
4
5
3
7
9
6
8
1
【解析】 农杆菌在自然条件下主要侵染双子叶植物和裸子植物，A错误；图中T－DNA两侧应该用相同限制酶切割，以便酶切后连接成环状，B错误；耐高温的DNA聚合酶可在引物的3′端延伸子链，利用图中的引物①④组合可扩增出两侧的未知序列，C错误；不同的DNA分子或DNA区段具有特异性，将扩增出的未知序列与棉花基因组序列比对可确定T－DNA的插入位置，D正确。
2
4
5
3
7
9
6
8
7. (多选)[2026南通月考]已知T－DNA插入失活是研究植物基因功能的常用方法，研究者将带有卡那霉素抗性基因的T－DNA插入拟南芥2号染色体的A基因内，使其突变为丧失功能的a基因，花粉中A基因功能的缺失会造成其不育。为进一步验证基因A的功能，将另一个A基因插入Aa植株的3号染色体。对该植株自交后代F1利用图1所示引物分别进行PCR检测，电泳结果如图2所示。下列叙述错误的有( )
1
ABD
图1
图2
2
4
5
3
7
9
6
8
A. 以Aa植株为父本与野生型杂交，F1中卡那霉素抗性植株的比例为1/2
B. 仅考虑基因A和a，该植株会产生2种基因型的可育花粉
C. 根据电泳结果，图2中Ⅰ型植株占比为2/3
D. 子代数量太少导致F1中没有检测到仅扩增出600 bp条带的植株
1
【解析】 根据题分析可知，带有卡那霉素抗性基因的T－DNA插入拟南芥2号染色体的A基因内，使其突变为丧失功能的a基因，花粉中A基因功能缺失(a基因)会导致不育，因此Aa植株作为父本时，其含a基因花粉不育，无法参与受精，仅产生含A基因的花粉，故以Aa植株为父本与野生型(AA)拟南芥杂交，F1(AA)中卡那霉素抗性植株的占比为0，A
2
4
5
3
7
9
6
8
1
错误；仅考虑基因A和a，插入A基因后，植株基因型为A0Aa(2号染色体为Aa,3号染色体为A0)，该植株会产生AA、A0、Aa、a0，其中a0花粉不育，即产生3种可育基因型的花粉，B错误；该植株雌配子即AA、A0、Aa、a0均可育，其自交得到F1，利用棋盘法可知，F1的基因型及比例为AAAA∶AAA0∶AA00∶AAAa∶AAa0∶AAaa∶Aa00∶Aaa0＝1∶2∶1∶2∶3∶1∶1∶1，利用图1所示引物P1和P2、P1和P3分别对F1进行PCR检测，电泳结果如图2所示。根据电泳结果F1植株分为Ⅰ型和Ⅱ型，Ⅰ型(含A、a)：PCR扩增出600 bp(a)和900 bp(A)条带，Ⅱ型(仅含A)：仅扩增出900 bp条带，其中Ⅰ型植株占比为2/3，C正确；F1中没有检测到仅扩增出600 bp条带的植株，其原因为a花粉不育，无法形成纯合aa植株，D错误。
2
4
5
3
7
9
6
8
8. RT－PCR是将RNA逆转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增反应相结合的技术，具体过程如图所示。请回答下列问题。
1
(1) 过程Ⅰ需要加入缓冲液、原料、______________、__________和引物A等。
RNA提取物
逆转录酶
2
4
5
3
7
9
6
8
(2) 过程Ⅱ首先要将反应体系的温度升高到95 ℃，其目的是_______ _____________、_____________________________。
(3) 过程Ⅱ拟对单链cDNA进行n次循环的扩增，理论上至少需要______个引物B。
(4) 利用RT－PCR技术获取的目的基因______(填“能”或“不能”)在物种之间交流；该技术还可用于对某些微量RNA病毒的检测，可提高检测的灵敏度，原因是___________________________________________ ______________。
(5) RT－PCR过程中主要借助对________的控制来影响酶的活性，从而使得化学反应有序高效地进行。
1
让逆转
录酶变性失活
使mRNA－cDNA杂合双链解开
2n－1
能
增加了待测RNA逆转录产生的DNA的数量(或浓度)，便于检测
温度
2
4
5
3
7
9
6
8
9. [2026南京七校联考]2,3－丁二醇是一种在诸多领域具有广泛应用价值的化合物，常用产气肠杆菌进行生产。产气肠杆菌发酵产生2,3－丁二醇的同时，也会生成乳酸等多种副产物，影响产量。已知P基因(位于拟核DNA分子中)与产气肠杆菌发酵过程中副产物的生成有关，研究人员欲利用生物技术敲除P基因以获得高产2,3－丁二醇的产气肠杆菌。请回答下列问题。
1
2
4
5
3
7
9
6
8
1
图1　融合片段N及质粒A限制酶酶切位点
2
4
5
3
7
9
6
8
(1) 利用PCR扩增含有P基因上游片段和下游片段序列的融合片段N时，模板与引物在PCR反应的________阶段开始结合。PCR中使用的DNA聚合酶需耐高温，其原因为__________________________________ _______________________________。
(2) 融合片段N两端的酶切位点如图1所示，为使融合片段N定向插入到质粒A中，应先选择图1中的限制酶__________和_______对质粒A进行完全酶切，利用______________酶将质粒特定的黏性末端补平后，再在______________酶的作用下可获得含有融合片段N的重组质粒B。
1
复性
PCR需要在高温下进行变性(普通的DNA聚合酶在高温下会变性失活)
BamHⅠ
SpeⅠ
DNA聚合
DNA连接
2
4
5
3
7
9
6
8
(3) 用限制酶SmaⅠ和BamHⅠ对重组质粒B进行完全酶切后，电泳可得到______个条带，原因是_____________________________________ _______________________________。
1
图2
图3
1
重组质粒B不能被BamHⅠ酶切，只能被
限制酶SmaⅠ酶切得到1个条带
2
4
5
3
7
9
6
8
(4) 将重组质粒B(长度为4 000 bp)导入到用________处理的产气肠杆菌细胞中，利用重组质粒B和产气肠杆菌DNA片段中同源区段可发生交换的原理，对P基因进行敲除(如图2)，敲除后的P基因将被有关的酶降解。P基因敲除过程中，可发生多种形式的同源区段交换，交换后用图2中的引物_______进行PCR扩增，检测结果如图3所示，其中菌落____(填序号)为P基因敲除株。
1
Ca2＋
1和4
④
2
4
5
3
7
9
6
8
1
【解析】 (2) 融合片段N两端的酶切位点如图1所示，为使融合片段N定向插入到质粒A中，应选择图1中的限制酶BamHⅠ和SpeⅠ对质粒A进行完全酶切，这是因为限制酶BamHⅠ和BclⅠ是同尾酶，PstⅠ切割后黏性末端无法补平。(3) BamHⅠ和BclⅠ相同的黏性末端连接后，重组质粒B不能被BamHⅠ酶切，只能被限制酶SmaⅠ酶切，所以用限制酶SmaⅠ和BamHⅠ对重组质粒B进行完全酶切后，电泳可得到1个条带。(4) 将重组质粒B导入到用Ca2＋处理的产气肠杆菌细胞中，这样可以提高转化率。利用重组质粒B和产气肠杆菌DNA片段中同源区段可发生交换的原理，对P基因进行敲除(如图2)，敲除后的P基因将被有关的酶降解。P基因敲除过程中，可发生多种形式的同源区段交换，交换后，用图2中的引物1和4进行PCR扩增，因为引物需要与模板链的3′结合，沿着5′到3′延伸子链，检测结果如图3所示，其中菌落④为P基因敲除株，因为其中的目标DNA片段为1 200 bp，即为融合基因的长度。
谢谢观看
Thank you for watching

展开更多......

收起↑