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第67讲　PCR产物鉴定——琼脂糖凝胶电泳技术
1 [2026南通启东中学月考]下列关于生物技术与工程实验的叙述，正确的是(　　)
A. 体积分数为70%的乙醇可使微生物的蛋白质变性，从而实现灭菌目的
B. 通过PCR和DNA电泳技术可鉴定导入受体细胞的是空载质粒还是重组质粒
C. 当“DNA粗提取实验”中获得的DNA纯度很高时，核酸电泳检测只显示一个条带
D. 利用茎尖进行植物组织培养可获得无病毒的新物种
2 [2026南通期末]下列关于“DNA的粗提取与鉴定”“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验的叙述，错误的是(　　)
A. 将洋葱研磨、过滤，所得滤液在4 ℃冰箱中静置后，DNA主要分布在上清液中
B. 将丝状物溶于2 mol/L NaCl溶液中，再加入二苯胺试剂，混匀后在沸水浴中加热，冷却后观察溶液颜色变化
C. 将PCR产物和电泳缓冲液混合后，需用微量移液器将混合液缓慢注入加样孔
D. 待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时停止电泳，取出凝胶置于紫外灯下观察
3 [2025吉林期末]用XhoⅠ和SalⅠ两种限制酶分别处理同一DNA片段(限制酶在对应切点均能切开)。酶切位点及酶切产物电泳结果分别如图1和图2所示。下列叙述错误的是(　　)
图1 图2
A. 大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成
B. 解旋酶与图1中的两种限制酶均能催化氢键断裂
C. 图2泳道②中可能是用XhoⅠ处理得到的酶切产物
D. 用两种限制酶同时处理该DNA电泳后可得到6种条带
4 [2025河北沧州模拟]在基因工程的PCR扩增及产物鉴定实验中，科学家需通过优化实验条件获得高特异性产物，并通过琼脂糖凝胶电泳验证结果(如图所示)。已知实验以质粒DNA为模板，目标产物为含EcoRⅠ酶切位点的500 bp基因片段，下列叙述正确的是(　　)
A. 引物设计时5′端可添加EcoRⅠ识别序列，且使3′端与模板完全互补
B. 当模板DNA和脱氧核苷酸存在时，Taq DNA聚合酶即可催化反应
C. 电泳时设置合适的电压和时间主要是防止大分子DNA片段跑出凝胶
D. 若标准样中c为750 bp，则500 bp目标产物应出现在b处
5 [2025广东梅州期末]杜氏进行性肌营养不良受一对等位基因(A/a)控制，患者由于骨盆带肌肉和肩胛带肌肉病变萎缩，导致肌无力。如图是该病患者家系的系谱图及部分成员有关基因的电泳图，电泳图中条带的有无可推测相关基因的存在与否。下列相关叙述错误的是(　　)
A. 该病在男性中的患病率高于在女性中的患病率
B. 2号个体的电泳图与3号个体的电泳图相同的概率是100%
C. 4号个体的致病基因来自2号而不是来自1号
D. 3号个体与一正常男性结婚，生育的男孩患病概率为1/4
6 [2024常州前黄中学检测]下列关于PCR扩增DNA片段及电泳鉴定的叙述，错误的是(　　)
A. PCR反应中，复性阶段不需要耐高温的DNA聚合酶
B. 在一定温度下，DNA遇上二苯胺试剂会呈现蓝色
C. 电泳时，DNA分子在凝胶中的迁移速率与DNA的大小和构象等有关
D. 电泳时，将PCR产物、核酸染料和电泳指示剂混合后注入凝胶加样孔
7 [2026云南昆明期中]关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA片段扩增产物的实验，下列叙述错误的是(　　)
A. 在一定的pH下DNA带上电荷，在电场中向着与它所带电荷相反的电极移动
B. 在凝胶中DNA分子的迁移速率与DNA分子的大小和构象等有关
C. 为避免外源DNA等因素的污染，微量离心管和枪头在使用前必须消毒
D. 凝胶中的DNA分子通过染色，可以在紫外灯下被检测出来
8 [2025扬州期末]科研人员利用两种限制酶(EcoRⅠ和NotⅠ)处理基因载体，进行电泳检测，结果如图所示。下列叙述错误的是(　　)
A. 该基因载体最可能是环状DNA分子
B. 电泳图谱中DNA片段越大，距离起点越近
C. 该DNA分子上有2个EcoRⅠ酶切位点
D. EcoRⅠ和NotⅠ的切点之间最长相距约9 kb
9 科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测。如图1表示该质粒的部分结构，其中J基因由某mRNA逆转录产生，V5编码序列表达标签短肽V5，图2表示对构建的重组质粒或质粒用不同的引物组合进行PCR后，电泳出现结果(其中结果1和结果2对应一组引物的PCR结果，结果3和结果4对应一组引物的PCR结果)。下列有关说法错误的是(　　)
图1 图2
A. 若用引物F2和R1进行PCR后，电泳出现结果2，则可能是J基因没有连接到质粒中
B. 若用引物F2和R2进行PCR后，电泳出现结果3，则可确定J基因正向连接到质粒中
C. 若b链是J基因转录的模板链，则可推知引物F1与J基因a链相应部分的序列相同
D. 重组质粒的J基因中不存在终止子序列和编码终止密码子的碱基序列
10 [2025重庆期末]研究人员根据疟原虫pfcrt基因的序列，设计了F1、F2、R1和R2等4种备选引物，用于扩增目的片段，如图1所示。为选出正确和有效的引物，以疟原虫基因组DNA为模板进行PCR，产物的电泳结果如图2所示。下列关于引物F1、F2、R1和R2的叙述，错误的是(　　)
图1 图2
A. R2引物可用于特异性地扩增目的片段
B. F2为无效引物，没有扩增功能，无法使用
C. F1R2引物不能用于特异性地扩增目的片段
D. F1R1引物可用于特异性地扩增目的片段
11 (多选)[2026江苏名校开学联考]某长度为5 000 bp的环状DNA分子，其上存在2个限制酶a和1个限制酶b的切割位点，单独使用两种酶处理后，进行琼脂糖凝胶电泳，结果如下图所示，则同时使用两种酶切且进行琼脂糖凝胶电泳后的结果可能为(　　)
A B C D
12 (多选)[2025连云港月考]琼脂糖凝胶电泳通常用于鉴定PCR产物，下图为电泳图谱。下列相关叙述正确的有(　　)
A. DNA分子所带电荷越多，在凝胶中的迁移速率越快
B. 电泳条带的宽度、亮度与PCR起始状态的模板DNA含量呈正相关
C. 样品组出现图示结果可能是因为退火温度过低，引物浓度过高造成的
D. 通过与Marker对比，可知待测样品的大小，其核苷酸组成要进一步测定
13 (多选)[2026无锡月考]琼脂糖凝胶电泳常用于核酸样品的分析，样品1～4的电泳结果如图所示(“＋”“－”分别代表电泳槽的阳极和阴极)。已知样品1和2中的DNA分子分别是甲和乙，甲只有限制酶R的一个酶切位点，样品3和4中有一个样品是甲的酶切产物。下列叙述正确的有(　　)
A. 配制琼脂糖凝胶时需选用适当的缓冲液
B. 该实验条件下甲、乙两种DNA分子均带负电荷
C. 甲、乙两种DNA分子所含碱基对的数量可能不同
D. 据图推测样品3可能是甲被酶R完全酶切后的产物
14 [2025广东模拟]木糖醇是一种天然低热量甜味剂，适用于糖尿病患者等人群，但植物体中含量很低，提取困难。木糖醇脱氢酶(XDH)可促进木糖醇的合成，研究人员以大肠杆菌质粒为基础构建木糖醇工程菌重组质粒(图1)，并通过在引物末端添加同源序列，分别对基因和质粒进行PCR扩增，再将得到的目的基因片段和线性质粒片段通过重组酶反应体系进行同源重组，构建表达载体(图2)。
图1 图2
请回答下列问题。
(1) 图1中的启动子是________识别和结合的部位，图2中的GFP基因起________作用。
(2) 利用设计的引物分别对XDH基因、GFP基因和质粒(长度为5251 bp)进行扩增，但对质粒扩增前需先利用________将其切割为线性DNA，至少经过________轮扩增可得到带有同源序列的DNA。图3为扩增后琼脂糖凝胶电泳检测结果，若成功构建高产木糖醇工程菌重组质粒，则其PCR产物条带位于________(填图3中的序号)。
图3
图4
(3) 将重组质粒导入大肠杆菌中，并接种到含有________的培养基进行筛选，筛选过程中会出现假阳性菌落，原因是____________________。课题组挑取了培养基上的5个菌落，根据XDH基因和GFP基因的融合基因两端特性序列设计引物进行PCR和电泳，结果如图4，则图4中________号样品为假阳性菌落。
(4) 与传统从植物中提取木糖醇相比，该方法的突出优势是_______________
_______。
第67讲　PCR产物鉴定——琼脂糖凝胶电泳技术
1 B　体积分数为70%的乙醇可使微生物的蛋白质变性，从而实现消毒目的，A错误；若受体细胞中具有重组质粒，则可以通过PCR扩增出目的基因并通过电泳来鉴定，若受体细胞中没有重组质粒，则无法扩增出目的基因，B正确；DNA电泳条带的数量与DNA的纯度无关，与DNA的大小有关，C错误；利用茎尖进行植物组织培养可获得无病毒的新品种，D错误。
2 C　
3 B　大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，少数为4个、5个或8个核苷酸，A正确；限制酶的作用是切割DNA双链中的磷酸二酯键，不涉及氢键断裂，解旋酶的作用是断裂DNA双链间的氢键，使DNA解旋，B错误；分析图1，限制酶XhoⅠ有两处切割位点，切割后产生3个DNA片段，图2泳道②有3个DNA片段，C正确；分析图1，限制酶XhoⅠ有两处切割位点，限制酶SalⅠ有三处切割位点，且两种酶的切割位点无重叠，根据酶切位点分布推断，两种酶同时处理可产生6种不同大小的片段，电泳后呈现6种条带，D正确。
4 A　引物在5′端添加EcoRⅠ识别序列(GAATTC)以便构建表达载体，3′端需与模板完全互补以确保延伸特异性，A正确；Taq DNA聚合酶的催化需要适宜条件，还需Mg2+激活，B错误；电泳时需设置合适的电压和电泳时间，主要目的是控制DNA片段的迁移距离，使目标产物位于凝胶可视范围内，防止小分子跑出而非大分子DNA片段跑出，C错误；在琼脂糖凝胶电泳中，DNA片段迁移速率与分子大小呈负相关，500 bp产物应位于750 bp条带下方，所以若c为750 bp，则产物500 bp应出现在d处，D错误。
5 D　从系谱图可知，1号和2号表现正常却生出患病儿子4号，说明该病为隐性遗传病，再结合电泳图，1号父亲正常且只含显性基因，2号母亲正常，4号儿子是患者，且只含致病基因，该基因只能来自2号母亲，因此母亲是携带者，可判断该病为伴X染色体隐性遗传病。伴X染色体隐性遗传病的特点就是患者中男性多于女性，A正确；3号个体的电泳图可知其为携带者，从系谱图可知，该病为伴X染色体隐性遗传病，母亲是携带者，因此2号个体的电泳图与3号个体的电泳图相同，B正确；该病为隐性遗传病，再结合电泳图，1号父亲正常且只含显性基因，2号母亲正常，4号儿子是患者，且只含致病基因，该基因只能来自2号母亲，C正确；3号个体的基因型XAXa，与正常男性(XAY)婚配，生育的男孩患病概率为1/2，D错误。
6 D　复性阶段是指引物与模板结合，无需耐高温的DNA聚合酶，A正确；在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，可利用此原理对DNA进行鉴定，B正确；PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定，在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关，DNA分子相对较小，迁移速度较快，C正确；核酸染料在制备凝胶时加入，将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内，D错误。
7 C　DNA分子在pH高于其等电点的溶液中会带上负电荷，在电场中向正极移动，A正确；DNA在凝胶中的迁移速率与其分子量(大小)成反比，且构象(如线状、环状、超螺旋)也会影响迁移速度，B正确；为避免外源DNA污染，实验中使用的微量离心管和枪头需进行灭菌处理，C错误；电泳后需用溴化乙锭(EB)等染色剂对DNA进行染色，紫外灯下可观察到荧光条带，D正确。
8 C　由题图可知，当仅用NotⅠ切割载体时，仅产生一种长度的DNA片段，因此该载体最有可能为环状DNA分子，A正确；在电泳中，DNA片段越大，迁移速度越慢，距离点样孔(起点)越近，B正确；该基因载体是环状DNA分子，由题图可知，当仅用EcoRⅠ切割载体时，产生2种长度的DNA片段：2 kb和6 kb，该载体DNA片段长10 kb，所以用EcoRⅠ切割载体应产生3个DNA片段：2个2 kb和1个6 kb，该DNA分子上有3个EcoRⅠ酶切位点，C错误；由题可知，两种限制酶同时切割时则产生6 kb、2 kb和1 kb 3种长度的DNA片段：1个6 kb、1个2 kb、2个1 kb，所以两种限制酶的酶切位点最长相距9 kb，D正确。
9 B　如果J基因没有连接到质粒中，用引物F2和R1进行PCR，不会有相关的产物出现，符合结果2，A正确；不管J基因是正向连接到质粒中，还是反向连接，用引物F2和R2进行PCR后，出现的条带是一样的，无法区分，B错误；已知J基因转录的模板链位于b链，由于转录的方向是从3′至5′，所以J基因b链左侧是3′端，脱氧核苷酸连接在引物的3′端，由此可知引物F1与b链互补，与图1中J基因的a链相应部分的序列相同，C正确；J基因由某mRNA逆转录产生，基因中的启动子和终止子不会转录形成mRNA，所以重组质粒中的J基因中不存在终止子序列，根据题干信息要最终获得J-V5融合蛋白，所以J基因不存在编码终止密码子的序列，否则翻译至终止密码子时，不能继续翻译V5蛋白，D正确。
10 A　根据图2显示可知，F1-R1引物只扩增出一条片段，F1-R2引物扩增条带为三条，说明R2引物无法特异性地扩增目的条带，A错误；根据图2信息可知，F1-R1能扩增目的1条带，F2-R1无法扩增目的条带，所以F2为无效引物，没有扩增功能，无法使用，B正确；根据图2信息可知，F1-R2引物扩增条带为三条，说明其不能用于特异性扩增目的片段，C正确；根据图2结果显示可知，F1-R1引物只扩增出一条片段，说明能够用于特异性扩增目的片段，D正确。
11 BC　某长度为5 000 bp的环状DNA分子，其上存在2个限制酶a和1个限制酶b的切割位点，结合图示可知，单独使用酶b切割后获得的DNA片段长度为5 000 bp，单独使用酶a切割后获得的DNA片段长度为2 500 bp，说明两个酶a的间隔为2 500 bp，则同时使用两种酶切获得的片段应该为三段，一个片段为2 500 bp，另外两个片段之和(1 250＋1 250或1 500＋1 000)应该为2 500 bp，B、C符合题意。
12 BCD　
13 ABC　配制琼脂糖凝胶时选用适当缓冲溶液，可维持电泳过程中体系的pH稳定，保证核酸分子正常泳动，A正确；电泳时，样品向“＋”极移动，说明在该实验条件下甲、乙两种DNA分子均带负电荷，符合核酸分子在电泳中的带电特性，B正确；电泳中，DNA分子的迁移速率与分子大小、电荷的多少等多种因素有关，甲、乙电泳条带位置虽然相同，但影响DNA分子的迁移速率的因素很多，所以碱基对的数量可能不同，C正确；甲只有限制酶R的一个酶切位点，若被酶R完全酶切，只会得到2种DNA片段(2个条带)，这两个条带的碱基数量比甲要少，电泳跑的距离要比甲更远，所以据图推测样品4才是甲被酶R完全酶切后的产物，D错误。
14 (1) RNA聚合酶　标记基因　(2) 限制酶　3　①　(3) 卡那霉素 空载体质粒也含有卡那霉素抗性基因　5　(4) 产量高(提取容易、不受外部气候的影响)
解析：(2) 切割DNA需要用到限制酶；对质粒扩增的引物两端带有同源序列，第一轮PCR时，引物结合到质粒线性DNA的模板链上，新合成的DNA链只有一端带有同源序列(与引物结合的一端)，另一端是质粒原有序列，第二轮PCR以第一轮的产物为模板时，新合成的DNA链中，部分产物会出现一端有同源序列、另一端为质粒序列的情况，仍未实现两端都带有同源序列，第三轮PCR以第二轮的产物为模板，此时模板链中已经存在“一端带同源序列”的DNA，引物结合后合成的新链，会使最终产物两端都带有设计的同源序列，所以PCR技术扩增出带有同源序列的DNA至少需要经过3轮扩增；重组质粒包括XDH基因(1 086 bp)、GFP基因(720 bp)和质粒(长度为5 251 bp)，其条带应该是大于5 000 bp，故选①。第67讲　PCR产物鉴定——琼脂糖凝胶电泳技术
学习目标　1. 概述琼脂糖凝胶电泳技术的原理及其过程。2. 掌握凝胶电泳技术鉴定PCR产物的应用。
核心体系
活动方案
活动一 概述琼脂糖凝胶电泳技术的原理及其操作过程
电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电或负电。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极方向移动。下图为DNA电泳实验操作步骤，请思考并回答下列有关问题。
(1) 常用的电泳方法有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。PCR的产物(DNA片段)一般通过哪种方法进行鉴定？
(2) DNA的电泳鉴定实验中，影响DNA分子迁移速率的因素有哪些？小片段样品和大片段样品的跑胶，该如何配制凝胶浓度？
(3) M泳道为标准对照组(Marker)，其实质是什么？不同泳道中，相同位置的条带不一定是同种DNA分子的原因是什么？如何确定是否为同种DNA分子？
(4) 核酸染料(如溴化乙锭)和指示剂(如溴酚蓝、二甲苯青FF)分别加入什么溶液？作用是什么？
(5) 若电泳缓冲液使DNA带负电荷，加样孔侧应连电极的哪一极？
(6) 利用PCR技术扩增的DNA片段是否成功，可以利用电泳的方法在紫外灯下直接观察到DNA条带，根据条带的分布及粗细程度来判断扩增的结果是否成功。正常扩增成功后进行电泳鉴定的结果应该是几条条带？若电泳结果未出现条带，请分析可能的原因有什么？
(7) 若下图为某同学PCR扩增DNA片段后进行电泳的结果，正常的DNA片段大小应为多少bp？出现图中异常的条带数，可能原因有哪些？
活动二 DNA片段电泳鉴定分析
下图为用限制性内切核酸酶EcoR Ⅰ、Not Ⅰ单独或联合剪切同一个DNA分子，获得的DNA片段的电泳结果，最左边为DNA Marker(1 kb＝1 000碱基对)。请回答下列问题。
(1) 该DNA分子的大小约为多少？该DNA分子为线性DNA还是环状DNA
(2) 该DNA分子是否含有Not Ⅰ酶切位点？其他酶切位点的情况是？
(3) Not Ⅰ单独剪切后的产物与该DNA分子电泳时的迁移速率相同吗？为什么？
(4) 可以确定该DNA分子上限制酶切割位点的相对位置吗？
名卷优选
[2026镇江期中]下列关于DNA的实验叙述，错误的是( )
A. 菜花、猪肝、酵母菌均可作为DNA粗提取的实验材料
B. 粗提取的DNA需溶于2 mol/L NaCl溶液后，再加入二苯胺试剂进行鉴定
C. 电泳操作中，PCR扩增产物与含溴酚蓝的凝胶载样缓冲液混合后注入加样孔
D. 待指示剂前沿迁移到凝胶边缘时停止电泳，将凝胶置于紫外灯下观察和照相
2. [2026南通如皋期初]琼脂糖凝胶电泳是用来鉴定PCR产物的常用方法。下列叙述错误的是(　　)
A. 配制的琼脂糖溶液浓度较高时，大分子DNA片段不易分离
B. PCR扩增时，退火温度过低可导致电泳出现多条条带
C. 指示剂(如溴酚蓝)通常存在于上样缓冲液中，可用于监测电泳进程
D. 两条泳道中电泳条带的位置相同，则两个加样孔内加入的样品相同
3. [2025盐城七校联考]用A和B两种限制酶同时或分别处理某DNA分子，酶切位点及酶切产物的电泳结果如下图所示。下列叙述错误的是(C)
图1 图2
A. 图1中X代表的碱基对数为4 500，Y是限制酶A的酶切位点
B. 图2中①代表酶A，②代表酶B
C. 图中DNA片段经酶A和酶B同时处理后，得到4个末端
D. 电泳鉴定DNA利用了DNA在电场中会向着与它所带电荷相反的电极移动的原理
4. (多选)[2026南通如皋期初]下列有关“DNA粗提取与鉴定”“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验的叙述，错误的有(　　)
A. 取洋葱研磨液的上清液，加入等体积的体积分数为95%的冷酒精可析出DNA
B. 提取到的白色丝状物与二苯胺试剂充分混匀，沸水浴加热后变蓝
C. 电泳过程中DNA分子越大，所带电荷数越多，迁移速率越快
D. 在琼脂糖凝固前加入指示剂，待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳
5. (多选)二倍体新疆野生油菜(P1)具有低芥酸、抗病虫等特性，为了改良二倍体甘蓝型油菜(P2)，研究人员将两种植物的体细胞进行融合获得了属间杂种F1，然后加入 1对引物进行PCR鉴定，电泳结果如下图所示。下列叙述正确的有(　　)
注：M为标准DNA参照；F1-1和F1-2为被检测植株
A. 杂种F1的形成依赖细胞膜的流动性和细胞的全能性
B. 杂种F1含4个染色体数组
C. 引物能与DNA上多个不同位点结合
D. 电泳结果表明F1-1具有P1、P2的全部遗传信息
6. [2026淮安期中]工业上常将胰岛素原基因导入酵母菌，使其表达胰岛素原，经提取、加工后获得胰岛素。部分流程如图1所示，图中E、K、N、X为酶切位点，括号内数字表示其在质粒上的位置。请据图回答下列问题。
图1 图2
(1) 除图中所示结构外，质粒P上还具有的元件有__________________。________(填“能”或“不能”)使用肝细胞替代图中胰岛B细胞，原因是_______
_____________________________________________。
(2) 为扩增胰岛素原基因并连入载体，引物上应具有_____________________
_______________________序列。PCR过程中，模板链解旋和子链延伸所需的能量分别来源于________和________。
(3) 某兴趣小组对构建成功的表达载体进行酶切电泳分析：第1组未加限制酶，第2～7组分别用不同限制酶组合切割。电泳结果如图2所示。第1组未酶切质粒的迁移速率大于等长的线性DNA，表明DNA的________是影响电泳迁移速率的因素之一。据图2推断，构建表达载体时选用的酶切位点是________。
(4) 在胰岛素原加工时需断裂________获得胰岛素。科研人员曾尝试利用大肠杆菌表达胰岛素原，加工后所得胰岛素活性较低，从细胞结构角度分析原因是______________________________________________________________________。
第67讲　PCR产物鉴定——琼脂糖凝胶电泳技术
【活动方案】
活动一
(1) 琼脂糖凝胶电泳。
(2) 凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等。小片段用高浓度凝胶，大片段用低浓度凝胶。
(3) 已知大小的不同长度的DNA片段混合物。DNA分子大小、构象等一致，碱基序列不一定一致。可通过将条带从凝胶上切下，纯化回收后进行测序。
(4) 核酸染料加入琼脂糖溶液中，作用是嵌入DNA双链的碱基对之间，在紫外光激发下，会发出荧光。指示剂加入凝胶载样缓冲液中，作用是可视化地监控电泳进程。
(5) 负极。
(6) 1条。未出现条带可能的原因：漏加了PCR反应成分、各反应成分的用量不当、PCR程序设置不当等。
(7) 500。出现的条带数比正常电泳结果的条带数多可能的原因：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；复性温度过低；DNA聚合酶质量不好等。
活动二
(1) 10 kb。环状。
(2) 含有。还含有两个EcoR Ⅰ酶切位点
(3) 不相同。线性DNA和环状DNA构象不同，在凝胶中的迁移速率存在差异。
(4) 不能，限制酶切割位点的相对位置不止一种。
【名卷优选】
1 D　凝胶电泳操作中，PCR扩增产物需与含溴酚蓝(指示染料)的凝胶载样缓冲液混合，混合后注入加样孔以进行电泳分离，溴酚蓝用于指示电泳迁移位置，C正确；电泳缓冲液加入电泳槽，待指示剂前沿迁移至接近凝胶边缘时停止电泳，以防止样品流失到缓冲液中，之后取出凝胶置于紫外灯下观察和照相，D错误。
2 D　琼脂糖浓度较高时，凝胶孔径较小，大分子DNA片段迁移阻力大，难以有效分离，A正确；PCR退火的目的是使两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，若退火温度过低会导致引物与非特异性位点结合，从而产生非特异性扩增带，导致电泳结果中出现多条条带，B正确；溴酚蓝等指示剂加入上样缓冲液，可直观显示电泳进程，便于判断何时终止电泳，C正确；电泳条带位置仅反映DNA片段大小，不同DNA片段若大小相同，则条带位置一致，无法确定样品是否相同，D错误。
3 C　分析图2可知，该DNA分子总共有10 000个碱基对，所以图1中X代表的碱基对数为10 000－3 500－1 500－500＝4 500，结合图1和图2分析可知，限制酶B酶切后两条带的长度为8 000 bp和2 000 bp，所以图1中Y表示限制酶A的酶切位点，经限制酶A酶切后得到6 000 bp、3 500 bp和500 bp三个片段，即图2中的①代表酶A，②代表酶B，A、B正确；图中DNA片段经酶A和酶B同时处理后，共有3个酶切位点，每个酶切位点得到2个末端，所以得到6个末端，C错误；电泳鉴定DNA利用了DNA在电场中会向着与它所带电荷相反的电极移动的原理，D正确。
4 BCD　DNA不溶于酒精，而蛋白质等杂质可溶于酒精，冷酒精能有效分离DNA与杂质，②低温(冷酒精)可降低DNA的溶解度，进一步促进DNA析出，形成白色丝状物，A正确；丝状物应先溶于2 mol/L的5 mL的NaCl溶液中，然后向试管中加入4 mL的二苯胺试剂，沸水浴加热5 min，试管冷却后溶液呈现蓝色，B错误；电泳中DNA迁移速率与分子大小成反比，大分子阻力大迁移慢，电荷数虽多但质量影响更大，C错误；指示剂(如溴酚蓝)应加入样品中，而非凝固前的凝胶中，D错误。
5 ABC　植物体细胞杂交，原生质体的融合依赖于细胞膜的流动性，最终生长为杂种植株依赖于植物细胞的全能性，A正确；因杂种F1是二倍体新疆野生油菜(2个染色体组)和二倍体甘蓝型油菜(2个染色体组)的杂交体，故其含有4个染色体组，B正确；研究人员将P1、P2两种植物的体细胞进行融合获得了杂种植物F1，然后加入一对引物进行PCR鉴定，结果出来多种DNA片段，可见引物能与DNA上多个不同位点结合，C正确；通过图片中电泳结果看出，F1 1具有P1、P2的部分遗传信息，D错误。
6 (1) 终止子、复制原点　不能　由于基因的选择性表达，肝脏细胞不表达胰岛素基因
(2) 限制酶识别(或限制酶)和目的基因部分(两端)　高温　dNTP
(3) 空间结构　E、N
(4) 肽键　大肠杆菌不含内质网、高尔基体，不能对胰岛素原进行加工
解析：(1) 不能使用肝细胞代替胰岛B细胞，原因是基因的选择性表达，肝细胞中没有胰岛素原的mRNA。(2) 引物上应具有限制酶识别序列和目的基因互补序列。PCR过程中解旋的能量来源于高温，延伸的能量来源于dNTP。(3) 由题意可知，DNA的形状也影响了迁移速率。由图2可知E、N和E、X组合均切出了目的基因。若选择的是E、X，则构建好的质粒上不包含K、N酶切位点，因此选择K、N酶切时不能将构建好的质粒切开，与条带一位置相同。而图中选择K、N酶切位点能够将构建好的质粒切开，因此选择的酶切位点是E、N。(共34张PPT)
第11单元
生物技术与工程
第67讲　PCR产物鉴定——琼脂糖凝胶电泳技术
内容索引
核心体系
学习目标
活动方案
名卷优选
学 习 目 标
1. 概述琼脂糖凝胶电泳技术的原理及其过程。2. 掌握凝胶电泳技术鉴定PCR产物的应用。
核 心 体 系
活 动 方 案
电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电或负电。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极方向移动。下图为DNA电泳实验操作步骤，请思考并回答下列有关问题。
活动一　概述琼脂糖凝胶电泳技术的原理及其操作过程
(1) 常用的电泳方法有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。PCR的产物(DNA片段)一般通过哪种方法进行鉴定？
【答案】 琼脂糖凝胶电泳。
(2) DNA的电泳鉴定实验中，影响DNA分子迁移速率的因素有哪些？小片段样品和大片段样品的跑胶，该如何配制凝胶浓度？
【答案】 凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等。小片段用高浓度凝胶，大片段用低浓度凝胶。
(3) M泳道为标准对照组(Marker)，其实质是什么？不同泳道中，相同位置的条带不一定是同种DNA分子的原因是什么？如何确定是否为同种DNA分子？
【答案】 已知大小的不同长度的DNA片段混合物。DNA分子大小、构象等一致，碱基序列不一定一致。可通过将条带从凝胶上切下，纯化回收后进行测序。
(4) 核酸染料(如溴化乙锭)和指示剂(如溴酚蓝、二甲苯青FF)分别加入什么溶液？作用是什么？
【答案】 核酸染料加入琼脂糖溶液中，作用是嵌入DNA双链的碱基对之间，在紫外光激发下，会发出荧光。指示剂加入凝胶载样缓冲液中，作用是可视化地监控电泳进程。
(5) 若电泳缓冲液使DNA带负电荷，加样孔侧应连电极的哪一极？
【答案】 负极。
(6) 利用PCR技术扩增的DNA片段是否成功，可以利用电泳的方法在紫外灯下直接观察到DNA条带，根据条带的分布及粗细程度来判断扩增的结果是否成功。正常扩增成功后进行电泳鉴定的结果应该是几条条带？若电泳结果未出现条带，请分析可能的原因有什么？
【答案】 1条。未出现条带可能的原因：漏加了PCR反应成分、各反应成分的用量不当、PCR程序设置不当等。
(7) 若下图为某同学PCR扩增DNA片段后进行电泳的结果，正常的DNA片段大小应为多少bp？出现图中异常的条带数，可能原因有哪些？
【答案】 500。出现的条带数比正常电泳结果的条带数多可能的原因：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；复性温度过低；DNA聚合酶质量不好等。
下图为用限制性内切核酸酶EcoR Ⅰ、Not Ⅰ单独或联合剪切同一个DNA分子，获得的DNA片段的电泳结果，最左边为DNA Marker(1 kb＝1 000碱基对)。请回答下列问题。
活动二　DNA片段电泳鉴定分析
(1) 该DNA分子的大小约为多少？该DNA分子为线性DNA还是环状DNA
【答案】 10 kb。环状。
(2) 该DNA分子是否含有Not Ⅰ酶切位点？其他酶切位点的情况是？
【答案】 含有。还含有两个EcoR Ⅰ酶切位点
(3) Not Ⅰ单独剪切后的产物与该DNA分子电泳时的迁移速率相同吗？为什么？
【答案】 不相同。线性DNA和环状DNA构象不同，在凝胶中的迁移速率存在差异。
(4) 可以确定该DNA分子上限制酶切割位点的相对位置吗？
【答案】 不能，限制酶切割位点的相对位置不止一种。
名 卷 优 选
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1. [2026镇江期中]下列关于DNA的实验叙述，错误的是( )
A. 菜花、猪肝、酵母菌均可作为DNA粗提取的实验材料
B. 粗提取的DNA需溶于2 mol/L NaCl溶液后，再加入二苯胺试剂进行鉴定
C. 电泳操作中，PCR扩增产物与含溴酚蓝的凝胶载样缓冲液混合后注入加样孔
D. 待指示剂前沿迁移到凝胶边缘时停止电泳，将凝胶置于紫外灯下观察和照相
D
【解析】凝胶电泳操作中，PCR扩增产物需与含溴酚蓝(指示染料)的凝胶载样缓冲液混合，混合后注入加样孔以进行电泳分离，溴酚蓝用于指示电泳迁移位置，C正确；电泳缓冲液加入电泳槽，待指示剂前沿迁移至接近凝胶边缘时停止电泳，以防止样品流失到缓冲液中，之后取出凝胶置于紫外灯下观察和照相，D错误。
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2. [2026南通如皋期初]琼脂糖凝胶电泳是用来鉴定PCR产物的常用方法。下列叙述错误的是(　　)
A. 配制的琼脂糖溶液浓度较高时，大分子DNA片段不易分离
B. PCR扩增时，退火温度过低可导致电泳出现多条条带
C. 指示剂(如溴酚蓝)通常存在于上样缓冲液中，可用于监测电泳进程
D. 两条泳道中电泳条带的位置相同，则两个加样孔内加入的样品相同
D
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【解析】 琼脂糖浓度较高时，凝胶孔径较小，大分子DNA片段迁移阻力大，难以有效分离，A正确；PCR退火的目的是使两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，若退火温度过低会导致引物与非特异性位点结合，从而产生非特异性扩增带，导致电泳结果中出现多条条带，B正确；溴酚蓝等指示剂加入上样缓冲液，可直观显示电泳进程，便于判断何时终止电泳，C正确；电泳条带位置仅反映DNA片段大小，不同DNA片段若大小相同，则条带位置一致，无法确定样品是否相同，D错误。
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3. [2025盐城七校联考]用A和B两种限制酶同时或分别处理某DNA分子，酶切位点及酶切产物的电泳结果如下图所示。下列叙述错误的是( )
1
C
A. 图1中X代表的碱基对数为4 500，Y是限制酶A的酶切位点
B. 图2中①代表酶A，②代表酶B
C. 图中DNA片段经酶A和酶B同时处理后，得到4个末端
D. 电泳鉴定DNA利用了DNA在电场中会向着与它所带电荷相反的电极移动的原理
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【解析】分析图2可知，该DNA分子总共有10 000个碱基对，所以图1中X代表的碱基对数为10 000－3 500－1 500－500＝4 500，结合图1和图2分析可知，限制酶B酶切后两条带的长度为8 000 bp和 2 000 bp，所以图1中Y表示限制酶A的酶切位点，经限制酶A酶切后得到6 000 bp、3 500 bp和500 bp三个片段，即图2中的①代表酶A，②代表酶B，A、B正确；图中DNA片段经酶A和酶B同时处理后，共有3个酶切位点，每个酶切位点得到2个末端，所以得到6个末端，C错误；电泳鉴定DNA利用了DNA在电场中会向着与它所带电荷相反的电极移动的原理，D正确。
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4. (多选)[2026南通如皋期初]下列有关“DNA粗提取与鉴定”“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验的叙述，错误的有( )
A. 取洋葱研磨液的上清液，加入等体积的体积分数为95%的冷酒精可析出DNA
B. 提取到的白色丝状物与二苯胺试剂充分混匀，沸水浴加热后变蓝
C. 电泳过程中DNA分子越大，所带电荷数越多，迁移速率越快
D. 在琼脂糖凝固前加入指示剂，待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳
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BCD
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【解析】 DNA不溶于酒精，而蛋白质等杂质可溶于酒精，冷酒精能有效分离DNA与杂质，②低温(冷酒精)可降低DNA的溶解度，进一步促进DNA析出，形成白色丝状物，A正确；丝状物应先溶于2 mol/L的 5 mL的NaCl溶液中，然后向试管中加入4 mL的二苯胺试剂，沸水浴加热5 min，试管冷却后溶液呈现蓝色，B错误；电泳中DNA迁移速率与分子大小成反比，大分子阻力大迁移慢，电荷数虽多但质量影响更大，C错误；指示剂(如溴酚蓝)应加入样品中，而非凝固前的凝胶中，D错误。
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5. (多选)二倍体新疆野生油菜(P1)具有低芥酸、抗病虫等特性，为了改良二倍体甘蓝型油菜(P2)，研究人员将两种植物的体细胞进行融合获得了属间杂种F1，然后加入 1对引物进行PCR鉴定，电泳结果如下图所示。下列叙述正确的有( )
1
ABC
注：M为标准DNA参照；F1－1和F1－2为被检测植株
A. 杂种F1的形成依赖细胞膜的流动性和细胞的全能性
B. 杂种F1含4个染色体数组
C. 引物能与DNA上多个不同位点结合
D. 电泳结果表明F1－1具有P1、P2的全部遗传信息
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【解析】 植物体细胞杂交，原生质体的融合依赖于细胞膜的流动性，最终生长为杂种植株依赖于植物细胞的全能性，A正确；因杂种F1是二倍体新疆野生油菜(2个染色体组)和二倍体甘蓝型油菜(2个染色体组)的杂交体，故其含有4个染色体组，B正确；研究人员将P1、P2两种植物的体细胞进行融合获得了杂种植物F1，然后加入一对引物进行PCR鉴定，结果出来多种DNA片段，可见引物能与DNA上多个不同位点结合，C正确；通过图片中电泳结果看出，F1-1具有P1、P2的部分遗传信息，D错误。
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6. [2026淮安期中]工业上常将胰岛素原基因导入酵母菌，使其表达胰岛素原，经提取、加工后获得胰岛素。部分流程如图1所示，图中E、K、N、X为酶切位点，括号内数字表示其在质粒上的位置。请据图回答下列问题。
1
图1
图2
2
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6
(1) 除图中所示结构外，质粒P上还具有的元件有_________________ ___。________(填“能”或“不能”)使用肝细胞替代图中胰岛B细胞，原因是__________________________________________________。
(2) 为扩增胰岛素原基因并连入载体，引物上应具有______________ ____________________________序列。PCR过程中，模板链解旋和子链延伸所需的能量分别来源于________和_______。
1
终止子、复制原
点
不能
由于基因的选择性表达，肝脏细胞不表达胰岛素基因
限制酶识别(或
限制酶)和目的基因部分(两端)
高温
dNTP
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6
(3) 某兴趣小组对构建成功的表达载体进行酶切电泳分析：第1组未加限制酶，第2～7组分别用不同限制酶组合切割。电泳结果如图2所示。第1组未酶切质粒的迁移速率大于等长的线性DNA，表明DNA的____________是影响电泳迁移速率的因素之一。据图2推断，构建表达载体时选用的酶切位点是__________。
(4) 在胰岛素原加工时需断裂______获得胰岛素。科研人员曾尝试利用大肠杆菌表达胰岛素原，加工后所得胰岛素活性较低，从细胞结构角度分析原因是___________________________________________________ _____。
1
空间结构
E、N
肽键
大肠杆菌不含内质网、高尔基体，不能对胰岛素原进行加工
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1
【解析】 (1) 不能使用肝细胞代替胰岛B细胞，原因是基因的选择性表达，肝细胞中没有胰岛素原的mRNA。(2) 引物上应具有限制酶识别序列和目的基因互补序列。PCR过程中解旋的能量来源于高温，延伸的能量来源于dNTP。(3) 由题意可知，DNA的形状也影响了迁移速率。由图2可知E、N和E、X组合均切出了目的基因。若选择的是E、X，则构建好的质粒上不包含K、N酶切位点，因此选择K、N酶切时不能将构建好的质粒切开，与条带一位置相同。而图中选择K、N酶切位点能够将构建好的质粒切开，因此选择的酶切位点是E、N。
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