资源简介

　重组DNA技术的基本工具
课标要求 1．概述基因工程是在遗传学、微生物学、生物化学和分子生物学等学科的基础上发展起来的。 2．阐明重组DNA技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。 3．实验：DNA的粗提取和鉴定。
考情微观 1．基因工程的基本工具：2024·贵州卷T13。 2．实验：DNA的粗提取和鉴定：2024·贵州适应性测试T21。
考点1　重组DNA技术的基本工具
一、填空表述
1．(人教版选择性必修3 P67)基因工程：按照人们的愿望，通过______等技术，赋予生物新的________，创造出更符合人们需要的新的__________________。
2．(人教版选择性必修3 P71)限制酶能够识别______________________________，并且使每一条链中特定部位的__________断开，产生________________。
3．(人教版选择性必修3 P72)T4 DNA连接酶和E．coli DNA连接酶都能将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的__________，但_________________________连接具有平末端的DNA片段的效率要远远低于_________________。
4．(人教版选择性必修3 P72)质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的__________________。
5．(人教版选择性必修3 P72)载体必须具备的条件：(1)能在受体细胞中保存下来并能________；(2)具有一个或多个______________，以便与外源基因连接；(3)具有________。
6．(人教版选择性必修3 P72～73)在基因工程中使用的载体除质粒外，还有__________________等。它们的来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小上也有很大差别。
7．原核细胞中的限制酶不切割自身DNA的原因是________________________
___________________________________________________________________。(至少答2点)
8．不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，这在基因工程操作中的意义是
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
9．某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时，发现DNA完全没有被酶切，分析可能的原因有________________________________________________________。(至少答2点)
二、概念检测
1．基因工程是人工操作导致的染色体变异，变异是不定向的。 (　　)
2．DNA连接酶可以连接目的基因与载体的氢键，形成重组DNA。 (　　)
3．使用不同的限制酶也能产生相同的黏性末端。 (　　)
4．质粒通常采用抗生素合成基因作为标记基因。 (　　)
(人教版选择性必修3 P70～71图文信息)如图表示制备能合成乙肝病毒抗原蛋白的某细菌所用到的载体结构示意图。回答下列问题：
(1)根据图中载体的限制酶切割位点，需要选用________________对该质粒进行切割。
(2)已知抗原蛋白基因转录的模板链碱基序列5′-GATTCG… …CCATGC-3′，PCR过程中需要设计特定的引物(包含特定的酶切位点)，引物的碱基序列依次为____________________________________________，以便在扩增后能够与载体进行正确连接。
(3)构建重组质粒需要使用DNA连接酶。下列属于DNA连接酶底物的是________。
(2)5′-GAATTCGCATGG-3′、5′-GGATCCGATTCG-3′
(3)④
基因工程工具酶的应用
1．(链接人教版选择性必修3 P71图3-3及P72正文)图示人体正常基因A突变为致病基因a及HindⅢ切割位点。AluⅠ限制酶识别序列及切割位点为Ｋ，下列相关叙述正确的有(　　)
A．基因A与基因a互为等位基因，其突变不具有可逆性
B．两种限制酶酶切形成的末端类型相同
C．HindⅢ切割基因A时，催化磷酸二酯键和氢键的断裂
D．产前诊断时，该致病基因可选用HindⅢ限制酶开展酶切鉴定
限制酶的选择要求
(1)位置要求：限制酶的酶切位点不能位于启动子、终止子、复制原点、标记基因当中，所选酶切位点应位于启动子和终止子之间，若载体有多个标记基因，并非都不能破坏，要至少保留一个，用于重组DNA的鉴定和筛选。另外，目的基因上如果有该酶的酶切位点，不能选择。
(2)酶切要求
①单酶切：为使目的基因与载体形成的DNA片段末端能够连接，通常使用同一种限制酶将两者切割(如下图，选用XhoⅠ)，但单酶切会出现目的基因与质粒的自身环化和随意连接，还可造成目的基因的多拷贝插入。
②双酶切：双酶切可以确保目的基因的正确插入，要求两个酶切位点位于目的基因的两侧，如下图可选择PstⅠ和BamHⅠ，但也要注意酶切位点个数和相对位置，如：不能选择XhoⅠ和BamHⅠ进行双酶切。另外，不同的限制酶所产生的末端相同，两端也可连接，因MunⅠ和EcoRⅠ酶切后产生的末端相同，可选择XhoⅠ和MunⅠ酶切目的基因，用XhoⅠ和EcoRⅠ酶切质粒。
(3)数量要求：如果所选限制酶的切割位点不止一个，如选择SmaⅠ进行酶切，则切割重组后会丢失复制原点，那么载体进入受体细胞后不能自主复制，所选限制酶在载体上最好只有一个酶切位点。
(4)特殊要求：例如根据Ti质粒的T-DNA片段选择限制酶，假设切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ，则甲、乙、丁质粒均不宜选取，丙质粒宜选取。
基因工程载体的应用
2．(2025·吉林长春模拟)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶切质粒，构建基因表达载体，并导入受体菌中。下列叙述正确的是(　　)
A．若用ScaⅠ酶切质粒，所得产物经凝胶电泳可形成1 个条带
B．若用HindⅢ和ScaⅠ酶切，可防止目的基因与质粒的反向连接
C．若用PvuⅠ酶切，并用含四环素的培养基筛选，存活受体菌中不一定含有目的基因
D．若用SphⅠ酶切，筛选时应先将转化处理的菌液涂布到含四环素的培养基中长成菌落，再影印接种到含氨苄青霉素的培养基中
考点2　(探究·实践)DNA的粗提取与鉴定
1．实验原理
2．实验步骤
1．本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核和线粒体(无DNA)。可选用鸡血细胞作材料。
2．加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫。加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。
3．二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。
4．提取植物细胞的DNA时，加入的洗涤剂能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；加入食盐(主要成分是NaCl)的目的是溶解DNA。
5．在DNA进一步提纯时，选用冷却的体积分数为95%的酒精溶液的作用是溶解杂质和析出DNA。
1．(2025·贵州黔东南模拟)某生物学实验小组同学利用洋葱进行“DNA粗提取与鉴定”实验。下列操作错误的是(　　)
A．用二苯胺对DNA进行鉴定时需在常温下进行，以保持DNA结构的稳定
B．向粗提取的DNA中加入2 mol·L-1的NaCl溶液可溶解DNA
C．在上清液中加入体积分数为95%的冷却酒精可使DNA沉淀析出
D．为使洋葱细胞更快裂解，可在研磨过程中加入纤维素酶
2．(2025·安徽蚌埠模拟)科研人员对花菜DNA的粗提取与鉴定实验进行改进，加酒精后用不同的去杂质方法纯化DNA，并进行相关检测，结果如表所示；再对提取的DNA用二苯胺试剂鉴定。下列说法错误的是(　　)
加酒精后去杂质
去杂质方式 沉淀质量/g OD260/OD280
离心 0.0680 1.53
4 ℃冰箱静置 0.1028 1.41
(注：纯DNA的OD260/OD280为1.8，这一比值会随蛋白质的含量的增加而逐渐降低。)
A．在鉴定过程中DNA的双螺旋结构会发生改变
B．研磨液在4℃冰箱中放置后，应充分摇匀再倒入烧杯
C．与4℃冰箱静置相比，离心法获得的DNA纯度更高
D．向DNA溶液中加入二苯胺试剂后沸水浴加热，冷却后可观察到蓝色
第51讲　重组DNA技术的基本工具
考点1
落实·必备知识
一、1．转基因　遗传特性　生物类型和生物产品　2．双链DNA分子的特定核苷酸序列　磷酸二酯键　黏性末端或平末端　3．磷酸二酯键　E．coli DNA连接酶　T4 DNA连接酶　4．环状双链DNA分子　5．(1)自我复制　(2)限制酶切割位点　(3)标记基因　6．噬菌体、动植物病毒　7．含有某种限制酶的细胞的DNA分子不具备这种限制酶的识别序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开　8．用不同的限制酶切割，若产生相同的黏性末端，把两个DNA片段连接后，原来的酶切位点将不存在，不能被原来的限制酶所识别，有利于保持重组DNA分子的稳定性
9．限制酶失活；质粒DNA突变导致酶识别位点缺失；酶切位点被甲基化修饰
二、1．×　2．×　3．√　4．×
达成·关键能力
略
评价·迁移应用
1．D　2．C
考点2
落实·实验基础
1．酒精　2 mol/L　蓝色　2．白色丝状物　二苯胺
评价·迁移应用
1．A　2．B　(共62张PPT)
第51讲　重组DNA技术的基本工具
选择性必修3　生物技术与工程
第九单元　生物技术与工程
课标要求 1．概述基因工程是在遗传学、微生物学、生物化学和分子生物学等学科的基础上发展起来的。
2．阐明重组DNA技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。
3．实验：DNA的粗提取和鉴定。
考情微观 1．基因工程的基本工具：2024·贵州卷T13。
2．实验：DNA的粗提取和鉴定：2024·贵州适应性测试T21。
考点1　重组DNA技术的基本工具
一、填空表述
1．(人教版选择性必修3 P67)基因工程：按照人们的愿望，通过______等技术，赋予生物新的________，创造出更符合人们需要的新的__________________。
转基因
遗传特性
生物类型和生物产品
2．(人教版选择性必修3 P71)限制酶能够识别______________________________，并且使每一条链中特定部位的__________断开，产生________________。
3．(人教版选择性必修3 P72)T4 DNA连接酶和E．coli DNA连接酶都能将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的__________，但_________________________连接具有平末端的DNA片段的效率要远远低于_________________。
双链DNA分子的特定
核苷酸序列
磷酸二酯键
黏性末端或平末端
磷酸二酯键
E．coli DNA连接酶
T4 DNA连接酶
4．(人教版选择性必修3 P72)质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的__________________。
5．(人教版选择性必修3 P72)载体必须具备的条件：(1)能在受体细胞中保存下来并能________；(2)具有一个或多个______________，以便与外源基因连接；(3)具有________。
环状双链DNA分子
自我复制
限制酶切割位点
标记基因
6．(人教版选择性必修3 P72～73)在基因工程中使用的载体除质粒外，还有__________________等。它们的来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小上也有很大差别。
7．原核细胞中的限制酶不切割自身DNA的原因是___________________________________________________________________________________________________________________________________________________。(至少答2点)
噬菌体、动植物病毒
含有某种限制酶的细胞的DNA分子不具备这种限制酶的识别序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开
8．不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，这在基因工程操作中的意义是________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
9．某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时，发现DNA完全没有被酶切，分析可能的原因有___________________________________________________________________________________。(至少答2点)
用不同的限制酶切割，若产生相同的黏性末端，把两个DNA片段连接后，原来的酶切位点将不存在，不能被原来的限制酶所识别，有利于保持重组DNA分子的稳定性
限制酶失活；质粒DNA突变导致酶识别位点缺失；酶切位点被甲基化修饰
二、概念检测
1．基因工程是人工操作导致的染色体变异，变异是不定向的。 (　　)
提示：基因工程是人工操作导致的基因重组，变异是定向的。
2．DNA连接酶可以连接目的基因与载体的氢键，形成重组DNA。 (　　)
提示：DNA连接酶可以将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。
×
×
3．使用不同的限制酶也能产生相同的黏性末端。 (　　)
4．质粒通常采用抗生素合成基因作为标记基因。 (　　)
提示：质粒上的抗生素抗性基因常作为标记基因，便于重组DNA分子的筛选。
√
×
(人教版选择性必修3 P70～71图文信息)如图表示制备能合成乙肝病毒抗原蛋白的某细菌所用到的载体结构示意图。回答下列问题：
(1)根据图中载体的限制酶切割位点，需要选用________________对该质粒进行切割。
(2)已知抗原蛋白基因转录的模板链碱基序列5′-GATTCG… …CCATGC-3′，PCR过程中需要设计特定的引物(包含特定的酶切位点)，引物的碱基序列依次为_______________________________________，以便在扩增后能够与载体进行正确连接。
(3)构建重组质粒需要使用DNA连接酶。下列属于DNA连接酶底物的是________。
提示：(1)EcoRⅠ、BamHⅠ
(2)5′-GAATTCGCATGG-3′、5′-GGATCCGATTCG-3′
(3)④
考向1　基因工程工具酶的应用
1．(链接人教版选择性必修3 P71图3-3及P72正文)图示人体正常基因A突变为致病基因a及HindⅢ切割位点。AluⅠ限制酶识别序列及切割位点为 ，下列相关叙述正确的有(　　)
A．基因A与基因a互为等位基因，其突变不具有可逆性
B．两种限制酶酶切形成的末端类型相同
C．HindⅢ切割基因A时，催化磷酸二酯键和氢键的断裂
D．产前诊断时，该致病基因可选用HindⅢ限制酶开展酶切鉴定
√
D　[基因突变具有可逆性，A错误；HindⅢ限制酶切割DNA形成的是黏性末端，而AluⅠ限制酶切割DNA形成的是平末端，B错误；HindⅢ切割基因A时，只破坏磷酸二酯键，C错误；因为正常基因A和致病基因a的HindⅢ切割位点数量不同，所以产前诊断时，该致病基因可选用HindⅢ限制酶开展酶切鉴定，D正确。]
归纳提升
限制酶的选择要求
(1)位置要求：限制酶的酶切位点不能位于启动子、终止子、复制原点、标记基因当中，所选酶切位点应位于启动子和终止子之间，若载体有多个标记基因，并非都不能破坏，要至少保留一个，用于重组DNA的鉴定和筛选。另外，目的基因上如果有该酶的酶切位点，不能选择。
(2)酶切要求
①单酶切：为使目的基因与载体形成的DNA片段末端能够连接，通常使用同一种限制酶将两者切割(如下图，选用XhoⅠ)，但单酶切会出现目的基因与质粒的自身环化和随意连接，还可造成目的基因的多拷贝插入。
②双酶切：双酶切可以确保目的基因的正确插入，要求两个酶切位点位于目的基因的两侧，如下图可选择PstⅠ和BamHⅠ，但也要注意酶切位点个数和相对位置，如：不能选择XhoⅠ和BamHⅠ进行双酶切。另外，不同的限制酶所产生的末端相同，两端也可连接，因MunⅠ和EcoRⅠ酶切后产生的末端相同，可选择XhoⅠ和MunⅠ酶切目的基因，用XhoⅠ和EcoRⅠ酶切质粒。
(3)数量要求：如果所选限制酶的切割位点不止一个，如选择SmaⅠ进行酶切，则切割重组后会丢失复制原点，那么载体进入受体细胞后不能自主复制，所选限制酶在载体上最好只有一个酶切位点。
(4)特殊要求：例如根据Ti质粒的T-DNA片段选择限制酶，假设切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ，则甲、乙、丁质粒均不宜选取，丙质粒宜选取。
考向2　基因工程载体的应用
2．(2025·吉林长春模拟)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶切质粒，构建基因表达载体，并导入受体菌中。下列叙述正确的是(　　)
A．若用ScaⅠ酶切质粒，所得产物经凝胶电泳可形成1 个条带
B．若用HindⅢ和ScaⅠ酶切，可防止目的基因与质粒的反向连接
C．若用PvuⅠ酶切，并用含四环素的培养基筛选，存活受体菌中不一定含有目的基因
D．若用SphⅠ酶切，筛选时应先将转化处理的菌液涂布到含四环素的培养基中长成菌落，再影印接种到含氨苄青霉素的培养基中
√
C　[由于图示质粒中有两个ScaⅠ酶的酶切位点，所以用ScaⅠ酶切质粒，能得到2种DNA片段，所得产物经凝胶电泳可形成2个条带，A错误。若用HindⅢ和ScaⅠ酶切质粒，由于质粒中有两个ScaⅠ酶的切割位点，因而不一定能防止目的基因与质粒的反向连接，且用ScaⅠ酶切，标记基因都会被破坏，B错误。由于PvuⅠ的酶切位点位于氨苄青霉素抗性基因之中，若用PvuⅠ酶切质粒，则会破坏氨苄青霉素抗性基因，故重组质粒中只有四环素抗性基因未被破坏。因此成功导入重组质粒的受体细胞具有对四环素的抗性，若导入的
是空质粒，则受体细胞也具有对四环素的抗性，进而可推测，在含四环素培养基中形成的菌落，不一定含有目的基因，C正确。若用SphⅠ酶切，则会破坏四环素抗性基因(TetR)，氨苄青霉素抗性基因(AmpR)不受影响，因此携带目的基因的受体菌在含氨苄青霉素的培养基中能形成菌落，在含四环素的培养基中不能形成菌落，因此，筛选时应先将转化处理的菌液涂布到含氨苄青霉素的培养基中长成菌落，再影印接种到含四环素的培养基中，只在含氨苄青霉素的培养基上生长的菌落即为目的菌，D错误。]
1．实验原理
考点2　(探究·实践)DNA的粗提取与鉴定
2．实验步骤
1．本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核和线粒体(无DNA)。可选用鸡血细胞作材料。
2．加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫。加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。
3．二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。
4．提取植物细胞的DNA时，加入的洗涤剂能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；加入食盐(主要成分是NaCl)的目的是溶解DNA。
5．在DNA进一步提纯时，选用冷却的体积分数为95%的酒精溶液的作用是溶解杂质和析出DNA。
1．(2025·贵州黔东南模拟)某生物学实验小组同学利用洋葱进行“DNA粗提取与鉴定”实验。下列操作错误的是(　　)
A．用二苯胺对DNA进行鉴定时需在常温下进行，以保持DNA结构的稳定
B．向粗提取的DNA中加入2 mol·L-1的NaCl溶液可溶解DNA
C．在上清液中加入体积分数为95%的冷却酒精可使DNA沉淀析出
D．为使洋葱细胞更快裂解，可在研磨过程中加入纤维素酶
√
A　[用二苯胺对DNA进行鉴定时需要沸水浴加热，而不是在常温下进行。在沸水浴条件下，DNA与二苯胺反应呈现蓝色，常温下该反应无法有效进行，A错误。DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，在2 mol·L-1的NaCl溶液中DNA的溶解度较大，所以向粗提取的DNA中加入2 mol·L-1的NaCl溶液可溶解DNA，B正确。DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精，所以在上清液中加入体积分数为95%的冷却酒精可使DNA沉淀析出，C正确。植物细胞壁的主要成分是纤维素和果胶，纤维素酶可以分解细胞壁中的纤维素，使细胞壁破坏，从而使洋葱细胞更快裂解，D正确。]
2．(2025·安徽蚌埠模拟)科研人员对花菜DNA的粗提取与鉴定实验进行改进，加酒精后用不同的去杂质方法纯化DNA，并进行相关检测，结果如表所示；再对提取的DNA用二苯胺试剂鉴定。下列说法错误的是(　　)
加酒精后去杂质 去杂质方式 沉淀质量/g OD260/OD280
离心 0.0680 1.53
4 ℃冰箱静置 0.1028 1.41
(注：纯DNA的OD260/OD280为1.8，这一比值会随蛋白质的含量的增加而逐渐降低。)
A．在鉴定过程中DNA的双螺旋结构会发生改变
B．研磨液在4℃冰箱中放置后，应充分摇匀再倒入烧杯
C．与4℃冰箱静置相比，离心法获得的DNA纯度更高
D．向DNA溶液中加入二苯胺试剂后沸水浴加热，冷却后可观察到蓝色
√
B　[在鉴定过程中，DNA与二苯胺试剂需沸水浴加热，高温会导致DNA双螺旋结构解旋(变性)，因此结构发生改变，A正确；研磨液在4℃冰箱静置后，DNA在上清液，此时若摇匀会混入杂质，正确操作应为直接吸取上清液放入烧杯中，B错误；离心法的OD260/OD280比值为1.53，更接近纯DNA的1.8，说明离心法获得的DNA中蛋白质含量更少，纯度更高，C正确；二苯胺试剂鉴定DNA需沸水浴加热，冷却后观察蓝色，D正确。]
课后分层作业(五十一) 　重组DNA技术的基本工具
1．(2025·广东茂名联考)生物化学、分子生物学和微生物学等学科的基础理论和相关技术的发展催生了基因工程。下列叙述正确的是(　　)
A．艾弗里的肺炎链球菌转化实验为DNA在不同种生物个体之间转移提供了证据
B．构建重组DNA导入原核细胞并使外源基因成功表达标志着基因工程正式问世
√
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
C．用PCR扩增DNA是获取目的基因的唯一方法，为获取目的基因提供了有效手段
D．从细菌、噬菌体等微生物中分离出DNA连接酶为DNA的切割和连接创造了条件
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
B　[艾弗里的肺炎链球菌转化实验为DNA在同种生物不同个体之间转移提供了证据，A错误；构建重组DNA导入原核细胞并使外源基因成功表达标志着基因工程正式问世，B正确；获取目的基因有多种方法，用PCR扩增目的基因不是唯一的方法，C错误；DNA连接酶不能切割DNA，D错误。]
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
2．(2025·山西临汾模拟)下图所示甲乙丙三个黏性末端，有关叙述正确的是(　　)

A．T4 DNA连接酶只能连接具有互补黏性末端的DNA片段
B．图中甲片段和丙片段可以用E．coli DNA连接酶连接起来
C．解旋酶的作用位点在a处，DNA连接酶的作用位点在b处
D．限制酶在识别序列的中心轴线两侧切割DNA分子产生黏性末端
√
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
D　[T4 DNA连接酶既能连接黏性末端，又能连接平末端，A错误；甲、丙切割后形成的黏性末端分别是5′-AATT-3′、5′-TTAA-3′，黏性末端不同，不可用E．coli DNA连接酶将甲、丙连接起来，B错误；解旋酶的作用位点在b处，断裂氢键，DNA连接酶的作用位点在a处，形成磷酸二酯键，C错误；限制酶在识别序列的中心轴线两侧切割DNA分子产生黏性末端，D正确。]
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
3．(2025·湖南怀化模拟)链状DNA分子经限制酶切割产生的黏性末端如图所示。下列叙述正确的是(　　)
A．限制酶切断的是同一条链上两个特定
相邻碱基间的氢键
B．图中同一条链上两个相邻碱基N间有脱氧核糖、磷酸基团各2个
C．每条链5′端、3′端的C原子分别与羟基、磷酸基团相连接
D．理论上，图示黏性末端最多可能有256种
√
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
D　[DNA分子有两条链，限制酶切断的是DNA分子两条链上两个特定相邻脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键，A错误；图中同一条链上两个相邻碱基N间有脱氧核糖2个、磷酸基团1个，B错误；图中每条链5′端、3′端的碳原子分别与磷酸基团、羟基相连接，C错误；图中黏性末端含有4个碱基，因此，理论上，图示黏性末端最多可能有44＝256种，D正确。]
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
4．(2025·安徽模拟预测)CRISPR/Cas9技术是一种革命性的基因编辑工具，具有深远的意义。它使得通过操纵DNA来提供所需的基因或让致病性的基因失去功能成为可能，极大地推动了科学研究、医疗和农业等领域的发展。CRISPR/Cas9基因编辑工作原理如图所示。下列说法正确的是(　　)
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
A．sgRNA通过碱基互补配对原则识别目标DNA分子
B．由图可知，Cas9蛋白的功能与DNA连接酶相似
C．Cas9-sgRNA复合物与限制酶均可断开特定部位的氢键
D．人工设计的sgRNA可作为翻译的模板合成Cas9蛋白
√
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
A　[从题图中可以看出，sgRNA与目标DNA分子之间存在结合，而RNA与DNA结合是通过碱基互补配对原则实现的，A正确。Cas9蛋白的作用是切断DNA，而DNA连接酶的作用是连接DNA片段，二者功能不同，B错误。限制酶切断的是特定部位的磷酸二酯键，而不是氢键；由题图可知Cas9-sgRNA复合物切断的也是DNA的磷酸二酯键，C错误。翻译的模板是mRNA，而不是人工设计的sgRNA，D错误。]
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
5．(2025·贵州毕节模拟)“DNA粗提取与鉴定”的基本过程是：裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是(　　)
A．实验材料可选择洋葱、香蕉、菜花、猪肝等
B．将研磨液过滤到烧杯中后取上清液进行后续实验
C．用冷却的酒精(体积分数为95%)可以析出DNA
D．二苯胺鉴定DNA的过程中，DNA的结构不发生改变
√
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
D　[洋葱、香蕉、菜花、猪肝等细胞中都含有DNA，都可以作为“DNA粗提取与鉴定”的实验材料，A正确；将研磨液过滤到烧杯中后，DNA溶解在上清液中，所以取上清液进行后续实验，B正确；DNA不溶于冷却的酒精(体积分数为95%)，而杂质可以溶于酒精，因此用冷却的酒精可以析出DNA，C正确；二苯胺鉴定DNA的过程中需要进行沸水浴加热，在高温下DNA的结构会发生改变，解旋为单链，D错误。]
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
6．(2025·湖北黄冈模拟)通过调节溶液pH使DNA先变性再复性，拟核DNA分子因为无法复性与其他较大的分子沉淀下来，质粒这种较小的DNA因为可以复性而溶于溶液中，这种方法常用于细菌质粒的提取。下列说法错误的是(　　)
A．提取液中应加入适量的RNA酶
B．变性的DNA因无法充分形成氢键而沉淀下来
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
C．提取液中加入冷的无水乙醇，析出物可再溶于2 mol/L的NaCl溶液中
D．通过电泳分离质粒时，若质粒越大，则需配制的琼脂糖溶液浓度越高
√
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
D　[提取质粒时，提取液中加入适量RNA酶是为了降解提取液中的RNA，防止RNA对后续实验产生干扰，A正确；当调节pH使DNA变性后再复性时，拟核DNA分子因结构复杂等原因无法充分复性形成双链，不能复性的单链DNA会与其他较大分子沉淀下来，B正确；DNA不溶于冷的95%的乙醇，加入冷的95%的乙醇可使DNA沉淀析出，而析出的DNA可再溶于2 mol/L的NaCl溶液中，C正确；通过电泳分离质粒时，若待分离的质粒越大，应该配置浓度越低的琼脂糖溶液，因为大的DNA分子在高浓度的琼脂糖凝胶中迁移速度慢，难以分离，在低浓度凝胶中更有利于它们的分离，D错误。]
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
限制酶 HindⅡ AluⅠ BamHⅠ Sau3AⅠ
识别序 列及切 割位点
7．(2025·河南模拟预测)下表是几种限制酶的识别序列及切割位点(Y＝C或T，R＝A或G)。下列相关叙述正确的是(　　)
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
A．限制酶切割一次需切断2个磷酸二酯键，增加2个游离的磷酸基团
B．一种限制酶只能识别一种核苷酸序列，并在特定位点切割
C．AluⅠ切割后的DNA片段只可用E．coli DNA连接酶连接
D．BamHⅠ和Sau3AⅠ切割形成的片段进行重组后，BamHⅠ和Sau3AⅠ均不能识别并切割
√
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
A　[限制酶切割一次需切断2个磷酸二酯键，形成2个新的游离的磷酸基团，A正确；一种限制酶不一定只识别一种核苷酸序列，如HindⅡ，B错误；用AluⅠ切割得到的是平末端，可用T4 DNA连接酶连接起来，C错误；BamHⅠ和Sau3AⅠ切割形成的片段进行重组后，BamHⅠ不能识别并切割重组片段，而Sau3AⅠ可识别并切割重组片段，D错误。]
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
8．(2025·黑龙江模拟)阿斯巴甜是一种新型高效的甜味剂，应用广泛。研究人员将来源于蜡样芽孢杆菌的蛋白酶基因(图1)与质粒pET-20b连接，构建重组质粒，转化大肠杆菌bl21得到重组大肠杆菌，从而构建全细胞催化剂(图2)，以此菌株高效转化苄氧羰基天冬氨酸和苯丙氨酸甲酯生产阿斯巴甜。此项技术解决了工业上化学合成法生产阿斯巴甜高成本、低得率、污染严重的问题。请回答下列问题：
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
(1)限制性内切核酸酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的_______________断开。结合图1和图2分析，实验中应该选择________________(填限制酶名称)切割质粒
pET-20b，以实现目的基因与质粒的定向连接，不选择KpnⅠ的原因是_________________________________________________________。
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
磷酸二酯键
BamHⅠ和PstⅠ
KpnⅠ的识别序列不在启动子和终止子之间且会破坏目的基因
(2)已知蛋白酶基因两侧没有上述限制酶的识别序列和酶切位点，所以PCR技术扩增蛋白酶基因时，需要在引物两端增加相应的限制酶的识别序列，图1表示蛋白酶基因上一条链的碱基序列，箭头表示转录方向，则目的基因转录的模板链是________链。结合表中各种限制酶的识别序列，复性时与此链相结合的引物上的碱基序列是5′-________________________-3′(写出10个碱基)。
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
甲
GGATCCTCTG
(3)已知图2中的70 bp和80 bp代表两种限制酶之间的碱基数，图3是限制酶HindⅢ切割重组质粒和质粒pET-20b后的电泳图谱，据此推测蛋白酶基因上有_______________个HindⅢ的识别序列，判断依据是________________________________________________________________________________________________________，同时也可以推理出目的基因的长度是______bp。
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
2/两
质粒pET-20b原有的2个HindⅢ切割位点被目的基因置换走1个后，得到环状的重组质粒仍然能被HindⅢ切割成3段
350
[解析]　(1)限制性内切核酸酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。结合图1和图2分析，HindⅢ会破坏复制原点，故实验中应选择BamHⅠ和PstⅠ切割质粒pET-20b，以实现目的基因与质粒的定向连接。不选择KpnⅠ的原因是KpnⅠ的识别序列不在启动子和终止子之间且会破坏目的基因。(2)图1表示蛋白酶基因上一条链的碱基序列，箭头表示转录方向，转录是mRNA由5′→3′，则目的基因转录的模板链是甲链。由于用BamHⅠ和PstⅠ切割质粒pET-20b，复性时与此链
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
相结合的引物的5′端添加BamHⅠ的识别序列，因此该引物的碱基序列为5′-GGATCCTCTG-3′。(3)质粒pET-20b原有的2个HindⅢ切割位点被目的基因置换走1个后，得到环状的重组质粒仍然能被HindⅢ切割成3段，推测蛋白酶基因上有2个HindⅢ的识别序列，同时也可以推理出目的基因的长度是350 bp。
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
谢 谢 ！　重组DNA技术的基本工具
1．(2025·广东茂名联考)生物化学、分子生物学和微生物学等学科的基础理论和相关技术的发展催生了基因工程。下列叙述正确的是(　　)
A．艾弗里的肺炎链球菌转化实验为DNA在不同种生物个体之间转移提供了证据
B．构建重组DNA导入原核细胞并使外源基因成功表达标志着基因工程正式问世
C．用PCR扩增DNA是获取目的基因的唯一方法，为获取目的基因提供了有效手段
D．从细菌、噬菌体等微生物中分离出DNA连接酶为DNA的切割和连接创造了条件
2．(2025·山西临汾模拟)下图所示甲乙丙三个黏性末端，有关叙述正确的是(　　)
A．T4 DNA连接酶只能连接具有互补黏性末端的DNA片段
B．图中甲片段和丙片段可以用E．coli DNA连接酶连接起来
C．解旋酶的作用位点在a处，DNA连接酶的作用位点在b处
D．限制酶在识别序列的中心轴线两侧切割DNA分子产生黏性末端
3．(2025·湖南怀化模拟)链状DNA分子经限制酶切割产生的黏性末端如图所示。下列叙述正确的是(　　)
A．限制酶切断的是同一条链上两个特定相邻碱基间的氢键
B．图中同一条链上两个相邻碱基N间有脱氧核糖、磷酸基团各2个
C．每条链5′端、3′端的C原子分别与羟基、磷酸基团相连接
D．理论上，图示黏性末端最多可能有256种
4．(2025·安徽模拟预测)CRISPR/Cas9技术是一种革命性的基因编辑工具，具有深远的意义。它使得通过操纵DNA来提供所需的基因或让致病性的基因失去功能成为可能，极大地推动了科学研究、医疗和农业等领域的发展。CRISPR/Cas9基因编辑工作原理如图所示。下列说法正确的是(　　)
A．sgRNA通过碱基互补配对原则识别目标DNA分子
B．由图可知，Cas9蛋白的功能与DNA连接酶相似
C．Cas9-sgRNA复合物与限制酶均可断开特定部位的氢键
D．人工设计的sgRNA可作为翻译的模板合成Cas9蛋白
5．(2025·贵州毕节模拟)“DNA粗提取与鉴定”的基本过程是：裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是(　　)
A．实验材料可选择洋葱、香蕉、菜花、猪肝等
B．将研磨液过滤到烧杯中后取上清液进行后续实验
C．用冷却的酒精(体积分数为95%)可以析出DNA
D．二苯胺鉴定DNA的过程中，DNA的结构不发生改变
6．(2025·湖北黄冈模拟)通过调节溶液pH使DNA先变性再复性，拟核DNA分子因为无法复性与其他较大的分子沉淀下来，质粒这种较小的DNA因为可以复性而溶于溶液中，这种方法常用于细菌质粒的提取。下列说法错误的是(　　)
A．提取液中应加入适量的RNA酶
B．变性的DNA因无法充分形成氢键而沉淀下来
C．提取液中加入冷的无水乙醇，析出物可再溶于2 mol/L的NaCl溶液中
D．通过电泳分离质粒时，若质粒越大，则需配制的琼脂糖溶液浓度越高
7．(2025·河南模拟预测)下表是几种限制酶的识别序列及切割位点(Y＝C或T，R＝A或G)。下列相关叙述正确的是(　　)
限制酶 HindⅡ AluⅠ BamHⅠ Sau3AⅠ
识别序 列及切 割位点 Ｋ Ｋ Ｋ Ｋ
A．限制酶切割一次需切断2个磷酸二酯键，增加2个游离的磷酸基团
B．一种限制酶只能识别一种核苷酸序列，并在特定位点切割
C．AluⅠ切割后的DNA片段只可用E．coli DNA连接酶连接
D．BamHⅠ和Sau3AⅠ切割形成的片段进行重组后，BamHⅠ和Sau3AⅠ均不能识别并切割
8．(2025·黑龙江模拟)阿斯巴甜是一种新型高效的甜味剂，应用广泛。研究人员将来源于蜡样芽孢杆菌的蛋白酶基因(图1)与质粒pET-20b连接，构建重组质粒，转化大肠杆菌bl21得到重组大肠杆菌，从而构建全细胞催化剂(图2)，以此菌株高效转化苄氧羰基天冬氨酸和苯丙氨酸甲酯生产阿斯巴甜。此项技术解决了工业上化学合成法生产阿斯巴甜高成本、低得率、污染严重的问题。请回答下列问题：
限制酶 识别序列
HindⅢ ↓ AAGCTT
KpnⅠ ↓ GGTACC
PstⅠ ↓ CTGCAG
BamHⅠ ↓ GGATCC
(1)限制性内切核酸酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的_______________断开。结合图1和图2分析，实验中应该选择________________(填限制酶名称)切割质粒pET-20b，以实现目的基因与质粒的定向连接，不选择KpnⅠ的原因是______________________________________
_____________________________________________________________________。
(2)已知蛋白酶基因两侧没有上述限制酶的识别序列和酶切位点，所以PCR技术扩增蛋白酶基因时，需要在引物两端增加相应的限制酶的识别序列，图1表示蛋白酶基因上一条链的碱基序列，箭头表示转录方向，则目的基因转录的模板链是______________链。结合表中各种限制酶的识别序列，复性时与此链相结合的引物上的碱基序列是5′-________________________-3′(写出10个碱基)。
(3)已知图2中的70 bp和80 bp代表两种限制酶之间的碱基数，图3是限制酶HindⅢ切割重组质粒和质粒pET-20b后的电泳图谱，据此推测蛋白酶基因上有_______________个HindⅢ的识别序列，判断依据是_______________________
____________________________________________________________，同时也可以推理出目的基因的长度是______bp。
课后分层作业(五十一)
1．B　2．D　3．D　4．A　5．D　6．D　7．A
8．(1)磷酸二酯键　BamHⅠ和PstⅠ　KpnⅠ的识别序列不在启动子和终止子之间且会破坏目的基因　(2)甲　GGATCCTCTG　(3)2/两　质粒pET20b原有的2个HindⅢ切割位点被目的基因置换走1个后，得到环状的重组质粒仍然能被HindⅢ切割成3段　350

展开更多......

收起↑