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　基因工程的基本操作程序
课标要求 1．阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测与鉴定等步骤。 2．实验：利用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段并完成电泳鉴定，或运用软件进行虚拟PCR实验。
考情微观 基因工程的基本操作程序：2024·贵州卷T21，2024·贵州适应性测试T21，2025·贵州卷T18。
考点1　基因工程的基本操作程序
一、填空表述
1．(人教版选择性必修3 P77)PCR反应需要在一定的缓冲液中才能进行，需提供__________、________、4种__________和耐高温的____________。
2．(人教版选择性必修3 P77)真核细胞和细菌的____________都需要Mg2+激活。因此，PCR反应缓冲液中一般要添加Mg2+。引物是一小段________________，引物的作用是_______________。
3．(人教版选择性必修3 P80)基因表达载体的构建的目的：使目的基因______________________________________，同时，使目的基因能够______________。基因表达载体是载体的一种，除目的基因、________外，还必须含有______________等。启动子是____________识别和结合的部位，有了它才能驱动基因______________，最终表达出人类需要的______。
4．(人教版选择性必修3 P81)转化：__________________________________。
5．(人教版选择性必修3 P81～82)将目的基因导入植物细胞的方法是____________、____________；导入动物细胞的方法是__________；导入微生物细胞的方法是________处理法。
6．(人教版选择性必修3 P82)目的基因的检测与鉴定：首先是分子水平的检测，包括通过______等技术检测棉花的染色体DNA上是否插入了Bt基因或检测Bt基因是否转录出了mRNA；从转基因棉花中提取______，用相应的____进行______________，检测Bt基因是否翻译成Bt抗虫蛋白等。其次，还需要进行个体生物学水平的鉴定。例如，通过__________________________来确定Bt基因是否赋予了棉花抗虫特性以及抗性的程度。
7．(人教版选择性必修3 P82)在获取转基因产品的过程中，还可以通过构建________来获取目的基因。
8．农杆菌侵染植物细胞时，可将外源基因递送到植物细胞中的原因是________________________________________。
9．为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是___________________________。为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的______ (填“3′端”或“5′端”)。
二、概念检测
1．目的基因一定是编码蛋白质的基因。 (　　)
2．真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2+。 (　　)
3．基因表达载体中的启动子和终止子决定着翻译的开始与结束。 (　　)
4．为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体。 (　　)
5．检测目的基因是否导入受体细胞可用抗原—抗体杂交技术。 (　　)
(人教版选择性必修3 P76～82正文)白介素-10(IL-10)是一种多功能的细胞因子，主要参与机体的免疫调节和炎症反应，能抑制肿瘤生长和转移。科研人员利用大肠杆菌构建产IL-10的工程菌。
(1)为了获取目的基因，科研人员根据IL-10基因的部分序列设计了一对引物。图1这对引物设计______ __(填“合理”或“不合理”)，原因是_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
(2)图2显示了IL-10基因附近的限制酶切割位点、pET-44质粒的模式图及其相关的限制酶切割位点。已知LacZ基因的表达产物为半乳糖苷酶，该酶催化X-gal分解产生蓝色物质，进而使菌落呈现蓝色，否则菌落与大肠杆菌菌落一样表现为白色。要将IL-10基因整合到大肠杆菌pET-44质粒中，应选用的两种限制酶是______________ ____。不选另外两种酶的原因是______________________
_____________________________________________________________________。
转化后的宿主菌接种在含有__________的培养基上筛选，能产生IL-10的工程菌的菌落呈现___________________________________________________色。
PCR技术及应用
1．(链接人教版选择性必修3 P78图3-5)科研人员采用PCR技术扩增人胰岛素基因，并进行电泳鉴定。图示为某基因表达载体中目的基因结构及4种引物(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)的结合位点，箭头方向表示引物延伸的方向。下列叙述正确的是(　　)
A．体外扩增目的基因时，应选用的引物组合为引物Ⅰ与引物Ⅳ
B．体外扩增目的基因时，第三轮循环即可获得符合要求的目的基因
C．为确定目的基因是否成功插入质粒，应选择引物Ⅱ与引物Ⅲ进行PCR
D．凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置
2．(2025·江苏南通模拟)下图表示PCR过程中某个阶段反应体系的情况，①②③④表示相关物质，L、R表示方向。下列叙述正确的是(　　)
A．DNA体内复制与体外复制(PCR)所需能量均只来自dNTP
B．PCR过程中需要添加缓冲液，其中所含的Mg2+可用于激活DNA聚合酶
C．②链从L到R的方向为3′→5′，①②链均可作为子链合成的模板
D．引物③的5′端添加了某序列，至少需经3次循环才可获得该序列的双链产物
基因工程的操作程序
3．(链接人教版选择性必修3 P80正文及图3-6)FSHD是由于DUX4基因突变产生对骨骼肌有毒的DUX4蛋白而导致的神经肌肉疾病，研究者尝试将如下表达载体导入患病组织，从而达到抑制DUX4基因表达的目的。下列说法正确的是(　　)
A．利用PCR技术获取目的基因，需要DNA聚合酶和DNA连接酶
B．利用图中质粒和DUX4基因构建表达载体时，应选择的限制酶为BamHⅠ和HindⅢ
C．可采用农杆菌转化法将基因表达载体导入患病组织
D．获取受体细胞的mRNA经逆转录获得DNA后，利用DUX4基因序列制备的引物进行PCR可检测表达载体是否构建成功
4．(2025·陕晋青宁卷)马铃薯作为重要农作物，提高其冷耐受性可拓展优质马铃薯的种植区域。我国科研人员发现，野生马铃薯中S基因的表达与其冷耐受性调控有关，将该基因导入栽培马铃薯中可显著增强其抗寒能力。回答下列问题：
限制酶 识别序列及切割位点
Bgl Ⅱ 5′-ATCT-3′ 3′-TCTA-5′
Nde Ⅰ 5′-CATG-3′ 3′-GTAC-5′
Xho Ⅰ 5′-CGAG-3′ 3′-GAGC-5′
EcoR Ⅰ 5′-ATTC-3′ 3′-CTTA-5′
BamH Ⅰ 5′-ATCC-3′ 3′-CCTA-5′
Sal Ⅰ 5′-CGAC-3′ 3′-CAGC-5′
Xba Ⅰ 5′-TAGA-3′ 3′-AGAT-5′
(1)PCR扩增目的基因时，需要模板DNA、引物、________________、含Mg2+的缓冲液和耐高温的DNA聚合酶。DNA聚合酶在PCR的________步骤中起作用。
(2)图中标识了载体和S基因中限制酶的切割位点。为将S基因正确插入载体，PCR扩增S基因时需在引物的________(填“5′端”或“3′端”)添加限制酶识别序列，结合上表分析，上游引物应添加的碱基序列是5′-__________________-3′，切割载体时应选用的两种限制酶是__________________。PCR扩增产物和载体分别被限制酶切割后，经纯化和连接，获得含S基因的表达载体并导入农杆菌。
(3)用携带S基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织时，基因表达载体中T-DNA进入愈伤组织细胞，将S基因整合到____________________，抗性基因__________可用于筛选成功转化的愈伤组织。该愈伤组织经__________形成芽、根，继续培育可获得抗寒能力显著增强的马铃薯植株。
考点2　DNA片段的扩增及电泳鉴定
1．PCR原理：利用了__________________原理。
2．电泳：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷____的电极移动，这个过程就是电泳。
3．PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的__________等有关。
4．实验步骤
(1)DNA片段的扩增
(2)DNA片段的电泳鉴定
①根据待分离DNA片段的大小，用__________配制琼脂糖溶液，一般配制质量分数为0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在______或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的________混匀。
②将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。
③待凝胶溶液完全凝固后，小心拔出梳子，取出凝胶放入______内。
④将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶_______为宜。
⑤将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合，再用__________将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。
⑥接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5 V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。
⑦取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。
1．为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水等在使用前必须进行高压蒸汽灭菌处理。
2．缓冲液和酶应分装成小份，并在－20 ℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
3．在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
4．在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
1．(2025·全国卷)琼脂糖凝胶电泳常用于核酸样品的分析，样品1～4的电泳结果如图所示(“＋”“－”分别代表电泳槽的阳极和阴极)。已知样品1和2中的DNA分子分别是甲和乙，甲只有限制酶R的一个酶切位点，样品3和4中有一个样品是甲的酶切产物。下列叙述错误的是(　　)
A．配制琼脂糖凝胶时需选用适当的缓冲溶液
B．该实验条件下甲、乙两种DNA分子均带负电荷
C．甲、乙两种DNA分子所含碱基对的数量可能不同
D．据图推测样品3可能是甲被酶R完全酶切后的产物
2．(链接选择性必修3 P84～85探究·实践)琼脂糖凝胶电泳是用来鉴定PCR产物的常用方法。下列叙述错误的是(　　)
A．配制的琼脂糖溶液浓度较高时，大分子DNA片段不易分离
B．PCR扩增时，复性温度过低可导致电泳出现多条条带
C．指示剂(如溴酚蓝)通常存在于载样缓冲液中，可用于监测电泳进程
D．两条泳道中电泳条带的位置相同，则两个加样孔内加入的样品相同
第52讲　基因工程的基本操作程序
考点1
落实·必备知识
一、1．DNA模板　2种引物　脱氧核苷酸　DNA聚合酶
2．DNA聚合酶　能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸　使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸　3．在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代　表达和发挥作用　标记基因　启动子、终止子　RNA聚合酶　转录出mRNA　蛋白质　4．目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程　5．农杆菌转化法　花粉管通道法　显微注射法　Ca2+　6．PCR　蛋白质　抗体　抗原—抗体杂交　采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫　7．基因文库　8．Ti质粒中的T DNA能将外源基因递送到植物细胞中，并与植物细胞的染色体DNA整合到一起　9．能与P基因母链的一段碱基序列互补配对、短单链核酸　5′端
二、1．×　2．√　3．×　4．×　5．×　
达成·关键能力
略
评价·迁移应用
1．B　2．B　3．B
4．(1)四种脱氧核苷酸　延伸　(2)5′端　AGATCT　BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ　(3)马铃薯细胞的染色体DNA上　2　再分化
考点2
落实·实验基础
1．DNA的半保留复制　2．相反　3．大小和构象　4．(1)微量移液器　微量离心管　使反应液集中在管的底部　(2)电泳缓冲液　沸水浴　核酸染料　电泳槽　1 mm　微量移液器
评价·迁移应用
1．D　2．D　(共78张PPT)
第52讲　基因工程的基本操作程序
选择性必修3　生物技术与工程
第九单元　生物技术与工程
课标要求 1．阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测与鉴定等步骤。
2．实验：利用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段并完成电泳鉴定，或运用软件进行虚拟PCR实验。
考情微观 基因工程的基本操作程序：2024·贵州卷T21，2024·贵州适应性测试T21，2025·贵州卷T18。
考点1　基因工程的基本操作程序
一、填空表述
1．(人教版选择性必修3 P77)PCR反应需要在一定的缓冲液中才能进行，需提供__________、________、4种__________和耐高温的____________。
DNA模板
2种引物
脱氧核苷酸
DNA聚合酶
2．(人教版选择性必修3 P77)真核细胞和细菌的____________都需要Mg2+激活。因此，PCR反应缓冲液中一般要添加Mg2+。引物是一小段________________________________________________，引物的作用是__________________________________________________。
DNA聚合酶
能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸
使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸
3．(人教版选择性必修3 P80)基因表达载体的构建的目的：使目的基因______________________________________，同时，使目的基因能够______________。基因表达载体是载体的一种，除目的基因、________外，还必须含有______________等。启动子是____________识别和结合的部位，有了它才能驱动基因______________，最终表达出人类需要的______。
在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代
表达和发挥作用
标记基因
启动子、终止子
RNA聚合酶
转录出mRNA
蛋白质
4．(人教版选择性必修3 P81)转化：___________________________________________________________________。
5．(人教版选择性必修3 P81～82)将目的基因导入植物细胞的方法是____________、____________；导入动物细胞的方法是__________；导入微生物细胞的方法是________处理法。
目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程
农杆菌转化法
花粉管通道法
显微注射法
Ca2+
6．(人教版选择性必修3 P82)目的基因的检测与鉴定：首先是分子水平的检测，包括通过______等技术检测棉花的染色体DNA上是否插入了Bt基因或检测Bt基因是否转录出了mRNA；从转基因棉花中提取______，用相应的____进行______________，检测Bt基因是否翻译成Bt抗虫蛋白等。其次，还需要进行个体生物学水平的鉴定。例如，通过__________________________来确定Bt基因是否赋予了棉花抗虫特性以及抗性的程度。
PCR
蛋白质
抗体
抗原—抗体杂交
采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫
7．(人教版选择性必修3 P82)在获取转基因产品的过程中，还可以通过构建________来获取目的基因。
8．农杆菌侵染植物细胞时，可将外源基因递送到植物细胞中的原因是_________________________________________________________________________________________________________。
基因文库
Ti质粒中的T-DNA能将外源基因递送到植物细胞中，并与植物细胞的染色体DNA整合到一起
9．为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是_____________________________________________________。为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的______ (填“3′端”或“5′端”)。
能与P基因母链的一段碱基序列互补配对、短单链核酸
5′端
二、概念检测
1．目的基因一定是编码蛋白质的基因。 (　　)
提示：目的基因主要是指编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子。
2．真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2+。 (　　)
×
√
3．基因表达载体中的启动子和终止子决定着翻译的开始与结束。 (　　)
提示：启动子和终止子决定着转录的开始与结束。
4．为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体。 (　　)
提示：为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时能以受精卵为受体，也能以体细胞为受体。
×
×
5．检测目的基因是否导入受体细胞可用抗原—抗体杂交技术。 (　　)
提示：检测目的基因是否导入受体细胞的方法是PCR等技术，抗原—抗体杂交技术是用于检测目的基因是否翻译成蛋白质。
×
(人教版选择性必修3 P76～82正文)白介素-10(IL-10)是一种多功能的细胞因子，主要参与机体的免疫调节和炎症反应，能抑制肿瘤生长和转移。科研人员利用大肠杆菌构建产IL-10的工程菌。
(1)为了获取目的基因，科研人员根据IL-10基因的部分序列设计了一对引物。图1这对引物设计________(填“合理”或“不合理”)，原因是________________________________________________________________________________________________________________。
(2)图2显示了IL-10基因附近的限制酶切割位点、pET-44质粒的模式图及其相关的限制酶切割位点。已知LacZ基因的表达产物为半乳糖苷酶，该酶催化X-gal分解产生蓝色物质，进而使菌落呈现蓝色，否则菌落与大肠杆菌菌落一样表现为白色。要将IL-10基因整合到大肠杆菌pET-44质粒中，应选用的两种限制酶是__________________。不选另外两种酶的原因是_____________________________________。
转化后的宿主菌接种在含有__________的培养基上筛选，能产生IL-10的工程菌的菌落呈现___________________________________________________色。
提示：(1)不合理　引物1和引物2之间存在碱基互补配对，会导致引物失效
(2)XhoⅠ和NdeⅠ　选用它们会导致目的基因反向接入质粒，无法正常表达　氨苄青霉素和X-gal　白
考向1　PCR技术及应用
1．(链接人教版选择性必修3 P78图3-5)科研人员采用PCR技术扩增人胰岛素基因，并进行电泳鉴定。图示为某基因表达载体中目的基因结构及4种引物(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)的结合位点，箭头方向表示引物延伸的方向。下列叙述正确的是(　　)
A．体外扩增目的基因时，应选用的引物组合为引物Ⅰ与引物Ⅳ
B．体外扩增目的基因时，第三轮循环即可获得符合要求的目的基因
C．为确定目的基因是否成功插入质粒，应选择引物Ⅱ与引物Ⅲ进行PCR
D．凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置
√
B　[体外扩增目的基因时，应选用的引物组合为引物Ⅱ与引物Ⅲ，A错误；因目的基因位于表达载体中间，需要第三轮循环才能获得等长的符合要求的目的基因，B正确；为确定目的基因是否成功插入质粒，应选择引物Ⅰ与引物Ⅳ进行PCR，C错误；凝胶电泳中，凝胶载样缓冲液并不能指示DNA分子的具体位置，D错误。]
2．(2025·江苏南通模拟)下图表示PCR过程中某个阶段反应体系的情况，①②③④表示相关物质，L、R表示方向。下列叙述正确的是
(　　)
A．DNA体内复制与体外复制(PCR)所需能量均只来自dNTP
B．PCR过程中需要添加缓冲液，其中所含的Mg2+可用于激活DNA聚合酶
C．②链从L到R的方向为3′→5′，①②链均可作为子链合成的模板
D．引物③的5′端添加了某序列，至少需经3次循环才可获得该序列的双链产物
√
B　[体内DNA复制由ATP(解旋)、dNTP提供能量，体外DNA复制(PCR)由dNTP和加热提供能量，A错误。DNA聚合酶都需要Mg2+激活，因此PCR反应的缓冲液中一般要添加Mg2+，B正确。根据DNA分子中两条链的反向平行关系可判断，②链从L到R的方向为5′→3′，图中①②链均可作为子链合成的模板，C错误。引物③的5′端添加了某序列，经过第1次循环，得到的1个DNA分子中有1条链含有该序列；经过第2次循环，得到的1个DNA分子的两条链均含有该序列，所以至少需经2次循环就可获得该序列的双链产物，D错误。]
考向2　基因工程的操作程序
3．(链接人教版选择性必修3 P80正文及图3-6)FSHD是由于DUX4基因突变产生对骨骼肌有毒的DUX4蛋白而导致的神经肌肉疾病，研究者尝试将如下表达载体导入患病组织，
从而达到抑制DUX4基因表达的目的。下
列说法正确的是(　　)
A．利用PCR技术获取目的基因，需要DNA聚合酶和DNA连接酶
B．利用图中质粒和DUX4基因构建表达载体时，应选择的限制酶为BamHⅠ和HindⅢ
C．可采用农杆菌转化法将基因表达载体导入患病组织
D．获取受体细胞的mRNA经逆转录获得DNA后，利用DUX4基因序列制备的引物进行PCR可检测表达载体是否构建成功
√
B　[利用PCR技术获取目的基因，需要DNA聚合酶，不需要DNA连接酶，A错误；DUX4的反义基因与DUX4基因的碱基序列相同，但转录的模板链不同，因此DUX4的反义基因的模板链为DUX4基因的编码链，子链延伸的方向是5′→3′，因此DUX4基因右侧连接启动子，左侧连接终止子，构建DUX4反义基因表达载体，选用的限制酶为HindⅢ和BamHⅠ，B正确；当受体细胞为动物时应选用显微注射法，C错误；由于DUX4的反义基因与DUX4基因的碱基序列相同，两者转录的模板不同，但形成的mRNA序列互补，经逆转录获得的双链DNA相同，因此不能检测表达载体是否构建成功，D错误。]
4．(2025·陕晋青宁卷)马铃薯作为重要农作物，提高其冷耐受性可拓展优质马铃薯的种植区域。我国科研人员发现，野生马铃薯中S基因的表达与其冷耐受性调控有关，将
该基因导入栽培马铃薯中可显著增强其
抗寒能力。回答下列问题：
(1)PCR扩增目的基因时，需要模板DNA、引物、________________、含Mg2+的缓冲液和耐高温的DNA聚合酶。DNA聚合酶在PCR的________步骤中起作用。
(2)图中标识了载体和S基因中限制酶的切割位点。为将S基因正确插入载体，PCR扩增S基因时需在引物的________(填“5′端”或“3′端”)添加限制酶识别序列，结合上表分析，上游引物应添加的碱基序列是5′-_____________-3′，切割载体时应选用的两种限制酶是__________________。PCR扩增产物和载体分别被限制酶切割后，经纯化和连接，获得含S基因的表达载体并导入农杆菌。
四种脱氧核苷酸
延伸
5′端
AGATCT
BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ
(3)用携带S基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织时，基因表达载体中T-DNA进入愈伤组织细胞，将S基因整合到____________________________，抗性基因__________可用于筛选成功转化的愈伤组织。该愈伤组织经__________形成芽、根，继续培育可获得抗寒能力显著增强的马铃薯植株。
马铃薯细胞的染色体DNA上
2
再分化
[解析]　(1)DNA复制所需的基本条件如下。
参与的组分 在DNA复制中的作用
解旋酶(体外用高温代替) 打开DNA双链
DNA母链 提供DNA复制的模板
4种脱氧核苷酸 合成DNA子链的原料
DNA聚合酶 催化合成DNA子链
引物 使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸
PCR过程分变性、复性和延伸三步，在延伸阶段，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。(2)DNA复制时，子链的延伸方向为5′端→3′端，故通过PCR扩增S基因时，zb需在引物的5′端添加相应的限制酶识别序列。结合质粒上限制酶的切割位点以及S基因上的切割位点分析，可用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ切割载体，又因BamH Ⅰ和Bgl Ⅱ为同尾酶(能切割产生相同的黏性末端)，因此需在S基因上游引物中添加Bgl Ⅱ的识别序列，即5′-AGATCT-3′。(3)农杆菌细胞内含有Ti质粒，当
它侵染栽培马铃薯愈伤组织时，能将Ti质粒上的T-DNA(可转移的DNA)转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。分析载体结构可知，抗性基因2位于T-DNA内部，上、下游含有启动子和终止子，该基因可以正常表达，而抗性基因1位于T-DNA外部，故抗性基因2可用于筛选成功转化的愈伤组织。愈伤组织能重新分化成芽、根等器官，该过程称为再分化。
1．PCR原理：利用了__________________原理。
2．电泳：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷____的电极移动，这个过程就是电泳。
3．PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的__________等有关。
考点2　DNA片段的扩增及电泳鉴定
DNA的半保留复制
相反
大小和构象
4．实验步骤
(1)DNA片段的扩增
(2)DNA片段的电泳鉴定
①根据待分离DNA片段的大小，用__________配制琼脂糖溶液，一般配制质量分数为0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在______或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的________混匀。
②将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。
电泳缓冲液
沸水浴
核酸染料
③待凝胶溶液完全凝固后，小心拔出梳子，取出凝胶放入______内。
④将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶_______为宜。
⑤将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合，再用__________将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。
⑥接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5 V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。
⑦取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。
电泳槽
1 mm
微量移液器
1．为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水等在使用前必须进行高压蒸汽灭菌处理。
2．缓冲液和酶应分装成小份，并在－20 ℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
3．在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
4．在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
1．(2025·全国卷)琼脂糖凝胶电泳常用于核酸样品的分析，样品1～4的电泳结果如图所示(“＋”“－”分别代表电泳槽的阳极和阴极)。已知样品1和2中的DNA分子分别是甲和乙，甲只有限制酶R的一个酶切位点，样品3和4中有一个样
品是甲的酶切产物。下列叙述错误的
是(　　)
A．配制琼脂糖凝胶时需选用适当的缓冲溶液
B．该实验条件下甲、乙两种DNA分子均带负电荷
C．甲、乙两种DNA分子所含碱基对的数量可能不同
D．据图推测样品3可能是甲被酶R完全酶切后的产物
√
D　[配制琼脂糖凝胶时选用适当的缓冲溶液，可维持电泳过程中体系的pH稳定，保证核酸分子正常泳动，A正确。电泳时，样品向阳极移动，说明在该实验条件下甲、乙两种 DNA 分子均带负电荷，符合核酸分子在电泳中的带电特性，B正确。电泳中，DNA分子的迁移速率与分子大小、构象等多种因素有关。甲、乙电泳条带位置虽然相同，但影响DNA分子的迁移速率的因素很多，所以碱基对的数量可能不同，C正确。甲只有限制酶R的一个酶切位点，若被酶R完全酶切，只会得到2种DNA片段(2个条带)，这两个条带的碱基数量比甲要少，样品移动的距离要比甲更远，所以据图推测样品4才是甲被酶R完全酶切后的产物，D 错误。]
2．(链接选择性必修3 P84～85探究·实践)琼脂糖凝胶电泳是用来鉴定PCR产物的常用方法。下列叙述错误的是(　　)
A．配制的琼脂糖溶液浓度较高时，大分子DNA片段不易分离
B．PCR扩增时，复性温度过低可导致电泳出现多条条带
C．指示剂(如溴酚蓝)通常存在于载样缓冲液中，可用于监测电泳进程
D．两条泳道中电泳条带的位置相同，则两个加样孔内加入的样品相同
√
D　[琼脂糖溶液浓度较高时，凝胶孔径较小，大分子DNA片段迁移阻力大，难以有效分离，A正确；PCR复性的目的是使两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，若复性温度过低会导致引物与非特异性位点结合，从而产生非特异性扩增带，导致电泳结果中出现多条条带，B正确；溴酚蓝等指示剂加入载样缓冲液，可直观显示电泳进程，便于判断何时终止电泳，C正确；电泳条带位置仅反映DNA片段大小，不同DNA片段若大小相同，则条带位置一致，无法确定样品是否相同，D错误。]
课后分层作业(五十二) 　基因工程的基本操作程序
1．(2025·辽宁营口期中)研究发现，某种土壤杆菌的基因会通过T-DNA进入甜菜细胞，这些基因的表达产物可调控甜菜根部的糖分积累，使其含糖量显著提高。下列相关叙述错误的是(　　)
A．土壤杆菌的基因在甜菜细胞中的遗传可遵循孟德尔遗传规律
B．土壤杆菌和甜菜的基因均遵循碱基互补配对原则
C．糖的含量属于甜菜的性状，该性状是甜菜和大肠杆菌基因作用的结果
D．上述现象说明土壤杆菌和甜菜共用一套遗传密码
√
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
10
C　[土壤杆菌的基因通过T-DNA整合到甜菜染色体后，在甜菜有性生殖时可能随染色体分离和自由组合传递，遵循孟德尔遗传规律，A正确；所有生物的基因在复制(DNA→DNA)和表达(DNA→RNA→蛋白质)过程中均涉及碱基互补配对，B正确；题干中调控糖分积累的基因来自土壤杆菌，而非大肠杆菌，C错误；遗传密码具有通用性，所有生物共用同一套密码子，D正确。]
题号
1
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10
2．(2025·江苏无锡期中)增强型绿色荧光蛋白(eGFP)在自然光下显示绿色。某实验室使用细菌质粒构建含eGFP基因的表达载体，然后将基因表达载体转入细菌，涂布平板后培养。下列叙述错误的是(　　)
A．通过PCR方法获得eGFP目的片段需要先设计一对特异性引物
B．PCR延伸阶段设置72 ℃既能保证Taq酶高活性又能防止新合成的产物变性
C．质粒中含有多个不同的限制酶酶切位点不利于eGFP基因与质粒连接
D．若在平板上观察到多个绿色单菌落则说明eGFP基因表达载体构建成功
√
题号
1
3
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7
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10
C　[PCR扩增目的基因需要根据目的基因两端的序列设计一对特异性引物，以引导Taq酶进行扩增，A正确；PCR延伸阶段的温度设置为
72 ℃，这是Taq DNA聚合酶的最适活性温度，既能保证酶的高效催化，又不会使新合成的DNA链变性(DNA高温变性通常在90℃以上)，B正确；质粒中含多个不同的限制酶酶切位点(多克隆位点)可提供多种酶切选择，便于目的基因与质粒的连接，C错误；若平板上出现绿色单菌落，说明eGFP基因在细菌中成功表达，表明表达载体构建成功(未成功构建的细菌无法表达eGFP，不会显绿色)，D正确。]
题号
1
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10
3．(2025·江西抚州模拟)下图表示培育转基因抗病毒农作物的过程图，正确的是(　　)
题号
1
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10
A．过程a需要限制酶和DNA聚合酶的参与
B．过程b需要用CaCl2处理，以提高农作物细胞壁的通透性
C．抗病毒基因一旦整合到农作物细胞的染色体上，就能正常表达
D．转基因抗病毒农作物是否培育成功可通过接种特定病毒进行鉴定
√
题号
1
3
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2
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9
10
D　[图中过程a为构建基因表达载体，需要用到限制酶和DNA连接酶，A错误；CaCl2处理能提高农杆菌细胞细胞壁的通透性，B错误；抗病毒基因整合到农作物细胞的染色体上，不一定就能正常表达，因为基因表达受到多种因素的调控，比如染色体的结构、基因的启动子等调控元件是否正常，以及细胞内的环境等，C错误；转基因抗病毒农作物是否培育成功可通过接种特定病毒，观察农作物是否被感染的实验进行鉴定，D正确。]
题号
1
3
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10
4．(2025·江苏南通一模)下列关于PCR技术的叙述，错误的是
(　　)
A．引物过短、过长以及循环次数过多均可能导致PCR特异性差
B．不同反应体系PCR的温度差别主要表现为复性温度的差异
C．利用高温解旋DNA，延伸时需要ATP与dNTP提供能量
D．含a个DNA分子进行扩增，第n次循环共需要引物a·2n个
√
题号
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C　[引物过短易导致非特异性结合，过长可能影响复性温度，循环次数过多会增加非特异性产物，均影响特异性，A正确；不同PCR体系因引物不同，复性温度需调整，而变性、延伸温度相对固定，B正确；PCR延伸时由dNTP的高能磷酸键供能，无需额外ATP，C错误；第n次循环需合成a·2n-1个新DNA分子，每个DNA分子需2个引物，故需a·2n个引物，D正确。]
题号
1
3
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10
5．(2025·贵州遵义模拟)为确定某目的基因是否导入大肠杆菌，可利用PCR扩增受体菌的DNA，并通过琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。下列相关叙述错误的是(　　)
A．筛选导入目的基因的大肠杆菌需要选择培养基
B．大肠杆菌培养和PCR扩增均需要进行无菌操作
C．PCR所需引物应分别与目的基因模板链的5′端互补
D．通过凝胶电泳条带可初步判断PCR扩增是否成功
√
题号
1
3
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10
C　[筛选导入目的基因的大肠杆菌需要选择培养基，筛选出含目的基因的大肠杆菌，淘汰未转入目的基因的大肠杆菌，A正确；大肠杆菌培养和PCR扩增均需要进行无菌操作，以避免杂菌污染，B正确；PCR所需引物应分别与目的基因模板链的3′端互补，C错误；若PCR成功，则通过凝胶电泳可出现相应的条带，D正确。]
题号
1
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10
6．(2025·云南昆明期中)关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA片段扩增产物的实验，下列叙述错误的是(　　)
A．在一定的pH下DNA带上电荷，在电场中向着与它所带电荷相反的电极移动
B．在凝胶中DNA分子的迁移速率与DNA分子的大小和构象等有关
C．为避免外源DNA等因素的污染，微量离心管和枪头在使用前必须消毒
D．凝胶中的DNA分子通过染色，可以在紫外灯下被检测出来
√
题号
1
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8
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10
C　[DNA分子在pH高于其等电点的溶液中会带上负电荷，在电场中向正极移动。此描述符合电泳原理，A正确。DNA在凝胶中的迁移速率与其分子量(大小)成反比，且构象也会影响迁移速度，B正确。为避免外源DNA污染，实验中使用的微量离心管和枪头需进行灭菌处理(如高压蒸汽灭菌)，而非仅消毒。消毒无法彻底灭活所有微生物，C错误。电泳后需用溴化乙锭(EB)等染色剂对DNA进行染色，紫外灯下可观察到荧光条带，D正确。]
题号
1
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10
7．(2025·江西卷)为了获得抗白叶枯病的水稻品种，研究人员构建了含有抗病基因D的重组Ti质粒(如图)，通过农杆菌转化法将D基因导入水稻种子诱导的愈伤组织，最终获得抗病植株。下列叙述正确的是(　　)
题号
1
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10
A．水稻愈伤组织细胞中RNA聚合酶无法识别U6启动子
B．在含重组Ti质粒的农杆菌中U6启动子不能驱动卡那霉素抗性基因表达
C．农杆菌侵染愈伤组织后所用的筛选培养基中需加入卡那霉素
D．愈伤组织再分化获得的含有D基因的幼苗属于抗病植株
√
题号
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B　[将T-DNA整合到水稻愈伤组织的染色体DNA后，若要使D基因表达并使水稻植株表现出抗病性状。那么D基因上游的U6启动子需被水稻愈伤组织细胞中RNA聚合酶识别， A错误。启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，并能够驱动基因转录出mRNA，最终表达出蛋白质。由图得出，重组Ti质粒中的U6启动子并非位于卡那霉素抗性基因的上游，因而不能驱动卡那霉素抗性基因的表达，B正确。愈伤组织多指将植物体的某一组织、器官置于特定培养基中培养，诱导产生
题号
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10
的无定形的组织团块，当农杆菌侵染愈伤组织后，T-DNA整合到水稻细胞染色体的DNA中，通常情况下，若D基因能表达，那么T-DNA上的潮霉素抗性基因也能表达，从而使得导入T-DNA的水稻愈伤组织具有潮霉素的抗性；卡那霉素抗性基因不位于T-DNA上，不会发生上述生理过程。因此，在农杆菌侵染愈伤组织后所用的筛选培养基中需加入潮霉素， C错误。检测是否成功获得转基因品种一般需要经历两个阶段，首先是分子水平的检测，包括检测目的基因是否导入宿主细胞、检测在宿主细胞中目的基因是否转录出mRNA或最终表达出蛋白质，其次，还需要进行个体生物学水平的鉴定。因此愈伤组织再分化获得的含有D基因的幼苗不一定是抗病植株， D错误。]
题号
1
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8．(2025·内蒙古锡林郭勒盟模拟)某基因表达载体部分结构如图所示，F1、F2、R1、R2表示不同的引物。下列相关叙述错误的是
(　　)
题号
1
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10
A．启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点
B．该基因表达载体至少还包含复制原点和标记基因
C．PCR检测目的基因插入方向是否正确时，引物可选择F2和R2
D．若引物F1与a链相应部位序列相同，则b链为转录的模板链
√
题号
1
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10
C　[启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，A正确；图中有启动子和终止子等，因此质粒还需具备的结构有限制酶的切割位点、标记基因、复制原点等，B正确；引物F2与R1或F1与R2结合部位包含目的基因的碱基序列，因此推测为了确定目的基因连接到质粒中且插入方向正确，进行PCR检测时，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物F2和R1或F1与R2，C错误；若引物F1与a链相应部位序列相同，根据转录时碱基互补配对原则，则b链的左侧为3′，右侧为5′，根据启动子在左侧，那么b链为转录的模板链，D正确。]
题号
1
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9．(2025·福建卷)质粒P含有2个EcoRⅠ、1个SacⅠ和1个BamHⅠ的限制酶切割位点。已知BamHⅠ位点位于2个EcoRⅠ位点的正中间，用上述3种酶切割该质粒，酶切产物的凝胶电泳结果如图，其中泳道①条带是未酶切的质粒P，泳道②③④
条带为3种单酶切产物，泳道⑤⑥⑦条带为双
酶切产物。下列叙述正确的是(　　)
题号
1
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10
A．DNA分子在该凝胶的迁移方向是从电源正极到负极
B．可确认泳道②③条带分别是SacⅠ和EcoRⅠ的单酶切产物
C．泳道⑤条带是SacⅠ和EcoRⅠ的双酶切产物
D．泳道①②说明未酶切质粒的碱基数小于酶切后质粒的碱基数
√
题号
1
3
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2
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7
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10
C　[因为DNA分子带负电，在凝胶中会向电源正极迁移，所以其迁移方向是从电源负极到正极，并非从电源正极到负极，A错误。P质粒有两个EcoRⅠ限制酶的切割位点，单酶切后的产物最小，电泳时迁移速度较快，可推知泳道③条带可能是EcoRⅠ的单酶切产物(单酶切产生2个片段大小相同)，泳道②条带和泳道④条带位置一致，无法区分泳道②条带是SacⅠ还是BamHⅠ的单酶切产物，B错误。EcoRⅠ有2个酶切位点，单酶切会产生2个片段，SacⅠ有1个酶切位点，单酶切会产生1个线性片段。SacⅠ和EcoRⅠ双酶切，会产生3
题号
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个片段，观察电泳图谱，泳道⑤有3个条带，可推测泳道⑤条带为SacⅠ和EcoRⅠ的双酶切产物，C正确。酶切只是将质粒的环状结构切开，变成线性等结构，碱基总数不会改变，D错误。]
题号
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10．(2025·贵州遵义模拟)研究者利用图中质粒构建重组DNA分子并导入大肠杆菌，获得生产胰岛素的工程菌，从而解决了胰岛素药源不足的问题。回答下列问题：
题号
1
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注：图中几种限制酶识别序列和切割位点分别为BamHⅠ：
，EcoRⅠ： ，SmaⅠ： ，
SalⅠ： 。LacZ基因能编码产生β-半乳糖苷酶，可催化无色物质X-gal产生蓝色物质使菌落呈蓝色，否则为白色，以颜色不同为依据直接筛选含重组DNA分子菌体的方法称为“蓝白斑”法。
题号
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(1)提取胰岛B细胞中的总RNA，通过一定方法分离纯化出mRNA，经___________得到cDNA，然后设计引物利用PCR扩增胰岛素基因。选择胰岛B细胞提取RNA的原因是____________________________。
题号
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逆(反)转录
胰岛B细胞表达胰岛素基因
(2)已知胰岛素基因的α链为编码链，据图1分析，利用PCR扩增胰岛素基因时，需对引物①～④进行特殊处理。PCR所需的引物组合是________，在引物②的________(填“3′端”或“5′端”)添加BamHⅠ识别序列和强启动子，该片段扩增4次循环，需要消耗引物________个。
题号
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②③
5′端
30
(3)为确保目的基因正确插入图2的载体中，需要选择的限制酶组合是_________________。已知胰岛素基因α链的碱基序列为5′-TTTAAAGGG……3′，强启动子的碱基序列为5′-GCTG-CATG-3′，写出胰岛素基因上游引物的18个碱基序列：5′-_____________________________-3′。
题号
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BamHⅠ和SalⅠ
GGATCCGCTGCATGTTTA
(4)“蓝白斑”法是基因工程中常用的筛选方法。简述将目的基因导入大肠杆菌并筛选工程菌的过程： __________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
题号
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经钙离子处理的大肠杆菌与重组质粒混合培养一段时间后，再将大肠杆菌接种到添加了氨苄青霉素和X-gal的培养基上筛选出白色的菌落即为工程菌
[解析]　(1)从胰岛素基因的mRNA得到cDNA的过程是逆(反)转录过程，选择胰岛B细胞提取RNA是因为胰岛素基因在胰岛B细胞中才能表达，在胰岛B细胞中胰岛素基因转录产生的mRNA含量高。(2)PCR扩增目的基因时，引物需要与模板链的3′端结合，根据图1中基因的方向，引物组合应该是②③，构建基因表达载体时，强启动子应位于目的基因的上游，由于α链是编码链，则β链为模板链，故应在图中胰岛素基因的左侧引入强启功子，所以要在引物②的5′端添加BamHⅠ识别序列和强启动子。PCR技术大量扩增目的基因
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时，DNA分子复制n次消耗的引物数为2n+1－2，当n＝4时，消耗引物数为24+1－2＝30个。(3)为确保胰岛素基因正确插入图2的载体中，根据图1中强启动子和胰岛素基因两侧的酶切位点，需选择的限制酶组合是BamHⅠ和SalⅠ。已知胰岛素基因α链的碱基序列为5′-TTTAAAGGG…-3′，强启动子的碱基序列为5′-GCTGCATG-3′，由于引物要与模板链互补配对，且上游引物与编码链序列相似，还需要添加BamHⅠ的识别序列，所以胰岛素基因上游引物的18个碱基序列为5′-GGATCCGCTGCATGTTTA-3′。(4)将胰岛素基因导入
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大肠杆菌并筛选工程菌的过程为：将构建好的基因表达载体与用Ca2+处理后的处于感受态的大肠杆菌混合培养，使基因表达载体进入大肠杆菌，将混合液接种在含有氨苄青霉素和X-gal的培养基上，在适宜条件下培养，由于含有重组质粒的大肠杆菌中LacZ基因被破坏，不能产生β-半乳糖苷酶，菌落为白色，而含有普通质粒的大肠杆菌菌落为蓝色，所以挑选白色菌落即为含有胰岛素基因的工程菌。
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谢 谢 ！　基因工程的基本操作程序
1．(2025·辽宁营口期中)研究发现，某种土壤杆菌的基因会通过T-DNA进入甜菜细胞，这些基因的表达产物可调控甜菜根部的糖分积累，使其含糖量显著提高。下列相关叙述错误的是(　　)
A．土壤杆菌的基因在甜菜细胞中的遗传可遵循孟德尔遗传规律
B．土壤杆菌和甜菜的基因均遵循碱基互补配对原则
C．糖的含量属于甜菜的性状，该性状是甜菜和大肠杆菌基因作用的结果
D．上述现象说明土壤杆菌和甜菜共用一套遗传密码
2．(2025·江苏无锡期中)增强型绿色荧光蛋白(eGFP)在自然光下显示绿色。某实验室使用细菌质粒构建含eGFP基因的表达载体，然后将基因表达载体转入细菌，涂布平板后培养。下列叙述错误的是(　　)
A．通过PCR方法获得eGFP目的片段需要先设计一对特异性引物
B．PCR延伸阶段设置72 ℃既能保证Taq酶高活性又能防止新合成的产物变性
C．质粒中含有多个不同的限制酶酶切位点不利于eGFP基因与质粒连接
D．若在平板上观察到多个绿色单菌落则说明eGFP基因表达载体构建成功
3．(2025·江西抚州模拟)下图表示培育转基因抗病毒农作物的过程图，正确的是(　　)
A．过程a需要限制酶和DNA聚合酶的参与
B．过程b需要用CaCl2处理，以提高农作物细胞壁的通透性
C．抗病毒基因一旦整合到农作物细胞的染色体上，就能正常表达
D．转基因抗病毒农作物是否培育成功可通过接种特定病毒进行鉴定
4．(2025·江苏南通一模)下列关于PCR技术的叙述，错误的是(　　)
A．引物过短、过长以及循环次数过多均可能导致PCR特异性差
B．不同反应体系PCR的温度差别主要表现为复性温度的差异
C．利用高温解旋DNA，延伸时需要ATP与dNTP提供能量
D．含a个DNA分子进行扩增，第n次循环共需要引物a·2n个
5．(2025·贵州遵义模拟)为确定某目的基因是否导入大肠杆菌，可利用PCR扩增受体菌的DNA，并通过琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。下列相关叙述错误的是(　　)
A．筛选导入目的基因的大肠杆菌需要选择培养基
B．大肠杆菌培养和PCR扩增均需要进行无菌操作
C．PCR所需引物应分别与目的基因模板链的5′端互补
D．通过凝胶电泳条带可初步判断PCR扩增是否成功
6．(2025·云南昆明期中)关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA片段扩增产物的实验，下列叙述错误的是(　　)
A．在一定的pH下DNA带上电荷，在电场中向着与它所带电荷相反的电极移动
B．在凝胶中DNA分子的迁移速率与DNA分子的大小和构象等有关
C．为避免外源DNA等因素的污染，微量离心管和枪头在使用前必须消毒
D．凝胶中的DNA分子通过染色，可以在紫外灯下被检测出来
7．(2025·江西卷)为了获得抗白叶枯病的水稻品种，研究人员构建了含有抗病基因D的重组Ti质粒(如图)，通过农杆菌转化法将D基因导入水稻种子诱导的愈伤组织，最终获得抗病植株。下列叙述正确的是(　　)
A．水稻愈伤组织细胞中RNA聚合酶无法识别U6启动子
B．在含重组Ti质粒的农杆菌中U6启动子不能驱动卡那霉素抗性基因表达
C．农杆菌侵染愈伤组织后所用的筛选培养基中需加入卡那霉素
D．愈伤组织再分化获得的含有D基因的幼苗属于抗病植株
8．(2025·内蒙古锡林郭勒盟模拟)某基因表达载体部分结构如图所示，F1、F2、R1、R2表示不同的引物。下列相关叙述错误的是(　　)
A．启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点
B．该基因表达载体至少还包含复制原点和标记基因
C．PCR检测目的基因插入方向是否正确时，引物可选择F2和R2
D．若引物F1与a链相应部位序列相同，则b链为转录的模板链
9．(2025·福建卷)质粒P含有2个EcoRⅠ、1个SacⅠ和1个BamHⅠ的限制酶切割位点。已知BamHⅠ位点位于2个EcoRⅠ位点的正中间，用上述3种酶切割该质粒，酶切产物的凝胶电泳结果如图，其中泳道①条带是未酶切的质粒P，泳道②③④条带为3种单酶切产物，泳道⑤⑥⑦条带为双酶切产物。下列叙述正确的是(　　)
A．DNA分子在该凝胶的迁移方向是从电源正极到负极
B．可确认泳道②③条带分别是SacⅠ和EcoRⅠ的单酶切产物
C．泳道⑤条带是SacⅠ和EcoRⅠ的双酶切产物
D．泳道①②说明未酶切质粒的碱基数小于酶切后质粒的碱基数
10．(2025·贵州遵义模拟)研究者利用图中质粒构建重组DNA分子并导入大肠杆菌，获得生产胰岛素的工程菌，从而解决了胰岛素药源不足的问题。回答下列问题：
注：图中几种限制酶识别序列和切割位点分别为BamHⅠ：，EcoRⅠ：，SmaⅠ：，SalⅠ：。LacZ基因能编码产生β-半乳糖苷酶，可催化无色物质X-gal产生蓝色物质使菌落呈蓝色，否则为白色，以颜色不同为依据直接筛选含重组DNA分子菌体的方法称为“蓝白斑”法。
(1)提取胰岛B细胞中的总RNA，通过一定方法分离纯化出mRNA，经________得到cDNA，然后设计引物利用PCR扩增胰岛素基因。选择胰岛B细胞提取RNA的原因是_____________________________________________。
(2)已知胰岛素基因的α链为编码链，据图1分析，利用PCR扩增胰岛素基因时，需对引物①～④进行特殊处理。PCR所需的引物组合是________，在引物②的________(填“3′端”或“5′端”)添加BamHⅠ识别序列和强启动子，该片段扩增4次循环，需要消耗引物________个。
(3)为确保目的基因正确插入图2的载体中，需要选择的限制酶组合是________。已知胰岛素基因α链的碱基序列为5′-TTTAAAGGG……3′，强启动子的碱基序列为5′-GCTG-CATG-3′，写出胰岛素基因上游引物的18个碱基序列：5′-________________-3′。
(4)“蓝白斑”法是基因工程中常用的筛选方法。简述将目的基因导入大肠杆菌并筛选工程菌的过程： _________________________________________________
_____________________________________________________________________。
课后分层作业(五十二)
1．C　2．C　3．D　4．C　5．C　6．C　7．B　8．C　9．C　
10．(1)逆(反)转录　胰岛B细胞表达胰岛素基因　(2)②③　5′端　30　(3)BamHⅠ和SalⅠ　GGATCCGCTGCATGTTTA　(4)经钙离子处理的大肠杆菌与重组质粒混合培养一段时间后，再将大肠杆菌接种到添加了氨苄青霉素和Xgal的培养基上筛选出白色的菌落即为工程菌

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