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选择性必修3
第3章 基因工程
基因工程：
是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫重组DNA技术。
操作环境：
原理：
操作对象：
操作水平：
结果：
意义：
体外环境
基因重组
基因
分子水平
赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品
定向改造生物性状；克服远缘杂交不亲和障碍
基因工程发展历程
1944年艾弗里等人通过肺炎链球菌的转化实验，不仅证明了遗传物质是DNA，还证明了DNA可以在同种生物个体间转移。
1953年沃森和克里克建立了DNA双螺旋结构模型并提出了遗传物质自我复制的假说。
1961年尼伦伯格和马太破译了第一个编码氨基酸的密码子。截至19666年，64个密码子均被破译成功。
1967年，科学家发现，在细菌拟核DNA之外的质粒有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移。
1970年科学家在细菌中发现了第一个限制性核酸内切酶（简称限制酶）
20世纪70年代初，多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶被相继发现。这些发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。
1972年，伯格首先在体外进行了DNA的改造，成功构建了第一个体外重组DNA分子。
1973年，科学家证明了质粒可以作为基因工程的载体，并实现了物种间的基因交流。至此，基因工程正式问世。
1982年，第一个基因工程药物-重组人胰岛素被批准上市。基因工程药物成为世界各国研究和投资开发的热点。
1985年，穆里斯等人发明PCR,为获取目的基因提供了有效手段。
本节聚焦:
重组DNA技术所需的三种基本工具是什么？它们的作用是什么？
基因工程载体需要具备什么条件？
选择性必修3/第3章/基因工程/
第1节 重组DNA技术的基本工具
发病番木瓜植株（左）和转基因“华农1号”植株（右）
番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵袭。当番木瓜被这种病毒感染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计，用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。DNA双螺旋的直径只有2nm,对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。解决培育番木瓜的关键步骤需要哪些分子工具呢？这些“分子工具”各具有什么特征呢？
工具
分子手术刀
分子缝合针
分子运输车
限制性内切核酸酶(准确切割DNA分子)
DNA连接酶(将DNA片段连接起来)
载体(将体外重组好的DNA分子导入受体细胞)
“分子手术刀”
(准确切割DNA分子)
限制酶
“分子缝合针”
(将DNA片段连接起来)
DNA连接酶
“分子运输车”
(将重组DNA分子导入受体细胞)
载体
一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
限制性内切核酸酶：切割DNA分子的工具，简称限制酶
主要从原核生物中分离纯化出来
1.来源：
2.种类：
迄今分离的限制酶有数千种
（如：EcoR I和Sma I限制酶）
根据你所掌握的知识你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么？
主要起到切割外源DNA使之失效，从而达到保护自身的目的。
例如：流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)d菌株中先后分离到3种限制酶，则分别命名为:
Hind I
Hind II
Hind III
命名：用生物属名的头一个字母与种加词的头两个字母，组成了3个字母的略语，以此来表示这个酶是从哪种生物中分离出来的。例如，一种限制酶是从大肠杆菌( Escherichia coli)的R型菌株分离来的，就用字母EcoR表示；如果它是从大肠杆菌R型菌株中分离出来的第一种限制酶，则进一步表示成EcoR I。
一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
3.作用：
识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开
一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
限制酶所识别的序列特点：
特点1：大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成；少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。
EcoRⅠ
SamⅠ
特点2：中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的 ，称为回文序列。
一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
限制酶所识别的序列特点：
特点3：限制酶识别过程具有方向性，都是从5’→3’开始读。
例如，EcoRⅠ限制酶的识别序列为GAATTC。
从5’→3’方向的识别序列均为GAATTC，并切断G和A之间的磷酸二酯键。
5’
3’
5’
3’
中轴线
一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
4.切割结果:
EcoR I：只能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。
黏性末端
5'
5'
3'
3'
被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对。
黏性末端：
Sma I：只能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切开。
一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
4.切割结果:
5'
5'
3'
3'
平末端
DNA两条单链的切口，是平整的。
平末端：
将双链 DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 。
二、DNA连接酶——“分子缝合针”
磷酸二酯键
2.作用部位:
1. 作用：
3.种类：
种类 E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶
来源 T4噬菌体
功能 特性 只能将具有互补____________的DNA片段连接起来 “缝合”______末端，但连接_________之间的效率相对较低
相同点 都恢复被限制酶切开的_______________。 大肠杆菌
黏性末端
两种
平末端
磷酸二酯键
二、DNA连接酶——“分子缝合针”
连接黏性末端：
二、DNA连接酶——“分子缝合针”
连接平末端：
DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？
二、DNA连接酶——“分子缝合针”
几种相关酶的比较
名称 作用部位 作用结果
限制酶
DNA(水解)酶
DNA连接酶
DNA聚合酶
解旋酶
磷酸二酯键
碱基对之间的氢键
将DNA切成两个片段
磷酸二酯键
将两个DNA片段连接为一个DNA分子
磷酸二酯键
将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端
磷酸二酯键
将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
将双链DNA分子局部解旋为单链
三、基因进入细胞的载体——“分子运输车”
质粒、动植物病毒、噬菌体
将外源基因送入受体细胞, 在受体细胞内对目的基因进行大量复制.
1.作用：
2.种类：
质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
①有一个至多个限制酶切割位点(供外源基因插入其中)；
②在受体细胞中稳定存在并能自我复制或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制 (使外源基因在受体细胞中稳定存在并复制，以扩增外源基因的数量)；
③具有特殊的标记基因：如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等(便于重组DNA分子的筛选(用于鉴别含有目的基因的受体细胞)；
④无毒害作用(避免受体细胞受到损伤)。
真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。
质粒：
运载体需具备的条件：
重组DNA分子
请在两张纸上分别写上下面两段DNA序列；找到两条片段上EcoRI的识别序列和切割位点。然后用剪刀进行“切剪”。待切割位点全部切开后，将从下面那条DNA链上切下的片段重组到上面那条DNA链的切口处，并用透明胶条将切口处连起来。
讨论
1.剪刀和透明胶条分别代表哪种“分子工具”？
分别代表“限制酶”和“DNA连接酶”。
2.你制作的黏性末端的碱基能不能互补配对？如果不能，可能是什么原因造成？
3.你插入的DNA片段能称得上一个基因吗？
不能。因为基因的长度一般在100个碱基对以上。
如果制作的黏性末端的碱基不能互补配对，可能是剪切位点或连接位点选得不对，也可能是其他原因。
重组DNA分子
…TATCGTACGATAGGTACTTAA
…ATAGCATGCTATCCATG
AATTCGGCATAC…
GCCGTATG…
…TCCTAG
…AGGATCTTAA
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
AATTCCATAC…
GGTATG…
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
5′
3′
5′
3′
5′
3′
5′
3′
过程演示：
重组DNA分子
DNA的基本组成单位相同（四种脱氧核苷酸）；都遵循碱基互补配对原则；DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构。
基因是控制生物性状的结构与功能单位；遗传信息的传递都遵循中心法则；生物界几乎共用一套遗传密码。
重组DNA分子
思考：
1.为什么不同生物的DNA分子能拼接起来？
2.为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达？
DNA的粗提取与鉴定
1.实验原理
DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法对它们进行提取。
DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精
初步分离DNA和蛋白质
溶解DNA
鉴定DNA
0
0.14
NaCI浓度(mol/L)
DNA溶解度
DNA能溶于物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液
在一定温度下（沸水浴），DNA被二苯胺试剂染成蓝色
DNA的粗提取与鉴定
2.材料用具
DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等。
研磨液：
体积分数为95%的冷酒精：
2mol/L的NaCl溶液：
蒸馏水：
二苯胺试剂：
析出DNA（即粗提取DNA）。
溶解DNA（并去除部分杂质蛋白）
滴入NaCl溶液中，使其浓度逐渐下降至0.14mol/L,从而析出DNA
破坏细胞，释放出细胞内的物质。
鉴定DNA（要现配现用，用棕色瓶保存）
DNA的粗提取与鉴定
3.方法步骤
称取洋葱，切碎，放入研钵，倒入研磨液，充分研磨。
（1）破碎细胞：
破坏细胞壁，裂解细胞，释放DNA。
（2）去除杂质：
在漏斗中垫上纱布过滤研磨液，4℃冰箱中静置后取上清液；或将研磨液倒入塑料离心管中离心，取上清液。
（3）DNA的析出：
在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液,静置2～3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。
析出DNA
用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物；或将溶液倒入塑料离心管中离心，取沉淀物晾干。
DNA的粗提取与鉴定
3.方法步骤
（4）DNA的鉴定：
将丝状物或沉淀物溶于2mol/L的NaCl溶液中，加入二苯胺试剂，混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min
在等体积的NaCl溶液中加入二苯胺试剂，将试管置于同等沸水浴中加热5min。
思考1：如何评价结果？
看提取物颜色
看与二苯胺反应颜色的深浅
DNA纯度：
DNA的量：
思考2：是否需要空白对照组？
水浴加热
实验组
对照组
DNA的粗提取与鉴定
4.进一步探究
本实验只是对DNA进行了粗提取，请在阅资料，了解实验室提取纯度较高的DNA的一种方法，并与本实验中所使用的方法进行比较，总结两种方法的异同。
实验室提取纯度较高的DNA的方法有不少。例如，可以先添加质量分数为25%的SDS溶液，使蛋白质变性后与DNA分开；随后，加入氯仿一异丙醇混合液(体积比为24:1)，通过离心将蛋白质及其他杂质除去，取上清液；可重复上述操作几次，直至上清液变成透明的黏稠液体。此外由于苯酚可以迅速使蛋白质变性，抑制核酸酶的活性，因此还可以先用苯酚处理，然后离心分层，这时DNA溶于上层水相，蛋白质变性后存在于酚层中，用吸管、微量移液器等实验用具就可以将两者分开。
DNA的粗提取与鉴定
1.实验材料的选择：
(1)以血液为实验材料时，每100mL血液中需要加入3g柠檬酸钠，防止血液凝固。
(2)利用动物细胞提取DNA时动物细胞无细胞壁，可使其吸水涨破。
(3)不能选用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞
无细胞核。
操作提示：
2.本实验有三次过滤：
第一次过滤获得DNA的滤液：
第二次过获得DNA粘稠物：
第三次过滤获得DNA的滤液：
获得含DNA的滤液
获取DNA粘稠物
得到含DNA的滤液
3.本实验两次析出DNA：
第1次：用0.14mol/L的NaCI溶液析出DNA，目的是除去溶液中的杂质。
第2次：用冷却的95％的酒精，获得含杂质较少的DNA丝状物。
4.本实验两次用蒸馏水:
第1次：加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA。
第2次：调节NaCl溶液物质的量浓度为0.14mol/L，使DNA黏稠物析出。
DNA的粗提取与鉴定
操作提示：
DNA的粗提取与鉴定
(2)用玻璃棒沿一个方向搅拌的原因是什么？
减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子。
(1)在4℃冰箱中放置几分钟的作用？
抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解。(抑制分子运动，使DNA易形成沉淀析出；低温有利于增加DNA分子的柔韧性，减少其断裂)
关键点拨:
课堂小结
限制酶
DNA连接酶
①对受体细胞无害；
②有一个至多个限制酶切割位点；
③有特殊的标记基因；
④能自我复制或能整合到宿主DNA上。
作为载体的条件
载体
种类：质粒、噬菌体 、动植物病毒
磷酸二酯键
来源：
主要来源于原核生物
特点：
作用部位：
具有专一性
结果：
形成黏性末端或平末端
连接部位：磷酸二酯键
种类：E.coli DNA连接酶、T4 DNA连接酶
作用：把两条双链DNA片段拼接起来
基因工程的基本工具
练习与应用
一、概念检测
1.DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是( )
A.能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键
B.能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键
C.能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键
D.只能连接双链DNA片段互补的黏性末端，不能连接双链DNA片段的平末端
C
练习与应用
一、概念检测
2.在重组DNA技术中，将外源基因送入受体细胞的载体可以是( )
A.大肠杆菌的质粒
B.切割DNA分子的酶
C. DNA片段的黏性末端
D.用来识别特定基因的DNA探针
A
练习与应用
二.拓展应用
1.想一想，为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？
迄今为止，在基因工程操作中使用的限制酶绝大部分都是从细菌或霉菌中提取出来的，它们可以识别DNA上特定的碱基序列并使特定部位的磷酸二酯键断开。微生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，可以将外源入侵的DNA降解。细菌中限制酶之所以不切割自身的DNA，是因为含有某种限制酶的细胞的DNA分子或者不具备这种限制酶的识别序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样,尽管细菌中含有某种限制酶，也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA入侵。
练习与应用
二.拓展应用
2.有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶切speⅠ进行切割，B片段分别用限制酶HindⅢ,XbaⅠ、EcoRⅤ和XhoⅠ进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。
（1）哪种限制酶切割B片段产生的DNA片段能与限制酶Spel切割A片段产生的DNA片段相连接？为什么？
xbaⅠ。
因为XbaⅠ与Spe Ⅰ切割产生了相同的黏性末端
练习与应用
二.拓展应用
（2）不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，这在基因工程操作中有什么意义？
识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。同尾酶使构建载体时，切割位点的选择范围扩大。
例如,我们选择了用某种限制酶切割载体，如果目的基因的核苷酸序列中恰好含有该限制酶的识别序列，那么用该限制酶切割含有目的基因的DNA片段时，目的基因就很可能被切断；这时可以考虑用合适的同尾酶（目的基因的核苷酸序列中不能有它的识别序列）来获取目的基因。
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