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第50讲　微生物的培养技术及应用
(时间:15分钟)
1.(2025·辽宁本溪一模)防止杂菌污染,获得纯净的微生物培养物是研究和应用微生物的前提,也是发酵工程的重要基础。下列相关说法正确的是(　　)
A.只有在固体培养基表面才能生长出微生物菌落
B.固体培养基在高压蒸汽灭菌后应迅速倒平板,以防止凝固
C.为了涂布均匀,涂布时可转动培养皿,涂布后立刻将培养皿倒置,放入培养箱中培养
D.耐高温和需要保持干燥的物品,可以采用干热灭菌法,如玻璃器皿
【答案】 D
【解析】 微生物在固体培养基或半固体培养基表面或内部生长,可以形成肉眼可见的菌落;灭菌后,待培养基冷却至50 ℃左右时再倒平板;应待涂布的菌液被培养基吸收后,再将平板倒置;耐高温和需要保持干燥的物品,如玻璃器皿、金属用具等,可以采用干热灭菌法。
2.(2025·江苏南通调研)平板划线法和稀释涂布平板法是分离、纯化微生物的常用方法,下列相关叙述错误的是(　　)
A.两种方法都能将菌体分散到培养基上,培养获得单菌落
B.涂布器和接种环均可采用干热灭菌和灼烧灭菌
C.完成划线和涂布后,都要等菌液被培养基吸收后再倒置培养
D.两种方法获得的菌落都是由单个微生物繁殖形成的
【答案】 D
【解析】 平板划线法和稀释涂布平板法都能获得由单个细胞繁殖而成的单菌落;玻璃器皿(如吸管、培养皿等)、金属用具等可以采用干热灭菌,涂布器、接种环、接种针或其他金属用具可采用灼烧灭菌,可见涂布器和接种环均可采用干热灭菌和灼烧灭菌;采用平板划线法划线或稀释涂布平板法涂布后,都要等菌液被培养基吸收后再倒置培养;由于两个或多个细胞连在一起时肉眼观察到的只是一个菌落,故平板划线法和稀释涂布平板法两种方法获得的单菌落不一定是由单个微生物繁殖形成的。
3.(2026·甘肃庆阳模拟)滤膜法是检测水样中大肠杆菌的常用方法。100 mL待测水样经滤膜后,将滤膜贴于伊红—亚甲蓝琼脂培养基上(主要成分含蛋白胨、乳糖),长出5个菌落。下列叙述正确的是(　　)
A.1 L 待测水样中的大肠杆菌数目为50个
B.蛋白胨主要为大肠杆菌提供氮源和维生素
C.用该方法统计菌落数目时,不需要设置对照组
D.将完成过滤之后的滤膜贴于培养基上的过程称为接种
【答案】 D
【解析】 将100 mL待测水样经滤膜后,将滤膜贴于伊红—亚甲蓝琼脂培养基上(主要成分含蛋白胨、乳糖),水样中的各种细菌都可以在该培养基上生长,因此长出5个菌落无法判断其中有多少个菌落是大肠杆菌的,故无法计算出大肠杆菌数目;蛋白胨可以为大肠杆菌提供氮源、碳源和维生素;用该方法统计菌落数目时,为了检测培养基是否被污染等情况,需要设置对照组;过滤后水样中的细菌留在滤膜上,因此完成过滤之后的滤膜紧贴在培养基上,这属于微生物培养中的接种。
4.(2025·河北沧州三模)增塑剂DEHP(化学式为C24H38O4)在塑料制品方面使用广泛,但残留于土壤中的DEHP不易被降解。科研人员已从土壤中筛选出能降解DEHP的细菌。下列叙述错误的是(　　)
A.培养基的pH一般调至中性或弱碱性
B.筛选培养基中以DEHP为唯一的碳源
C.接种环和培养皿等均可采用灼烧灭菌法灭菌
D.对筛选出的降解菌可用液体培养基扩大培养
【答案】 C
【解析】 细菌培养通常需要中性或弱碱性的环境,因此培养基的pH一般调至中性或弱碱性;筛选培养基需以DEHP为唯一碳源,仅允许能分解DEHP的细菌生长,从而实现选择培养;接种环可通过灼烧灭菌法灭菌,但培养皿需用干热灭菌法灭菌;液体培养基可为菌种生长繁殖提供充足的营养,能快速扩大菌种数量,便于后续实验或保存,因此可用液体培养基扩大培养降解菌。
5.(2024·湖南卷,6)微生物平板划线和培养的具体操作如图所示,下列操作正确的是(　　)
A.①②⑤⑥ B.③④⑥⑦
C.①②⑦⑧ D.①③④⑤
【答案】 D
【解析】 由题图可知,②中拔出棉塞后应握住棉塞上部;⑥中划线时不能将培养皿的皿盖完全打开,应只打开一条缝隙;⑦中划线时第5次的划线不能与第1次的划线相连;⑧中平板应倒置培养。
6.(2025·贵州贵阳一模)鸡蛋表面附着的细菌会逐渐侵入蛋内,缩短鸡蛋保质期。对某养鸡场不同季节及不同养殖模式下生产的鸡蛋取样,按每克鸡蛋用1 mL无菌生理盐水清洗鸡蛋表面,收集清洗液,用稀释涂布平板法接种、培养后计数结果如下表。下列相关叙述正确的是(　　)
季节 菌落数/(个·g-1)
半封闭式养殖模式 全封闭式养殖模式
夏季 3.92×104 7.24×103
冬季 7.60×104 1.24×104
A.可用煮沸消毒法清理鸡蛋表面的细菌
B.若接种菌液体积为0.1 mL,则表中数据是对清洗液稀释1×102倍后获得的
C.比较两种养殖模式可知鸡蛋表面的细菌主要来自环境
D.稀释涂布平板法所得活菌数比实际结果要小,可用显微镜计数法直接测活菌数
【答案】 C
【解析】 本实验需要研究不同季节不同养殖模式下鸡蛋表面的细菌数量,若用煮沸消毒法清理鸡蛋表面的细菌,则无法得出实验数据;稀释涂布平板法涂布的菌液体积为0.1 mL,菌落数为30～300的平板适于计数,根据题表中数据分析,半封闭式养殖模式对清洗液稀释1×102倍后涂布,全封闭式养殖模式对清洗液稀释1×101倍后涂布;半封闭式养殖模式下的鸡蛋表面菌落数明显高于全封闭式养殖模式,这说明环境中的细菌更容易污染鸡蛋表面;由于两个或多个细胞可能聚集在一起形成一个菌落,因此稀释涂布平板法得到的鸡蛋表面菌落数比实际数略少,用显微镜计数法直接测定时测定的是死菌和活菌的总数,要想测活菌数需要进行一定的处理,如染色。
7.(2025·江西南昌三模)细菌X合成的tcel蛋白和tcil蛋白使其在与其他细菌的竞争中占优势,其中tcel蛋白是一种有毒性的分泌蛋白。研究人员利用野生型细菌X及其不同突变体进行了如下实验:在固体培养基表面放置一张能隔离细菌的滤膜,将一种菌(下层菌)滴加在滤膜上后再放置第二张滤膜,滴加等量的另一种菌(上层菌),共同培养后,对上、下层菌计数得到的结果如图所示。下列叙述正确的是(　　)
A.实验中的培养皿、固体培养基和滤膜均需要进行消毒处理
B.研究上、下层菌竞争指数可以用显微镜计数法对收集的滤膜菌体直接计数
C.由甲、乙、丙三组结果可推测tcil蛋白能够中和tcel蛋白的毒性
D.野生型细菌X在与tceltcil双突变体和tcel突变体的竞争中均占优势
【答案】 C
【解析】 为避免杂菌的污染,实验中的滤膜、培养皿、固体培养基等均需灭菌处理;对活菌进行计数的方法是稀释涂布平板法,不能用显微镜直接计数法,因为显微镜直接计数不能区分死菌与活菌,无法研究上、下层菌竞争指数;tcel蛋白是一种有毒性的分泌蛋白,乙组中野生型可产生tcel蛋白作用于tceltcil双突变体,后者无法产生tcil蛋白中和tcel蛋白的毒性,使野生型细菌在竞争中占据优势,而在丙组中,野生型可产生tcel蛋白作用于tcel突变体,后者可以产生tcil蛋白中和tcel蛋白的毒性,使野生型的生长受到抑制,由此推测,tcil蛋白能够中和tcel蛋白的毒性;由甲组、乙组实验结果可知,野生型细菌X在与tceltcil双突变体的竞争中占优势,由甲组、丙组实验结果可知,野生型细菌X在与tcel突变体的竞争中不占优势。
8.(2025·辽宁沈阳三模)为提高作物产量,种植业常施用大量的氮肥,既增加了生产成本,又易造成环境污染。固氮菌能固定氮气,为植物生长提供充足的氮元素,常见的固氮菌有根瘤菌和圆褐固氮菌等。科研人员进行了土壤中自生固氮菌的分离和固氮能力测定的研究,部分实验流程如下图所示。以下叙述正确的是(　　)
A.根瘤菌与豆科植物共生后才能固氮,其合成固氮酶所需的核糖体和氨基酸均来源于植物细胞
B.圆褐固氮菌能在不加氮源的培养基中生长,说明圆褐固氮菌为自养生物
C.将土壤悬浮液用无菌水梯度稀释后涂布到含青霉素的选择培养基上,进行多次纯化
培养
D.若④统计的菌落数分别是132、136、128,则每克土壤中含有的固氮菌约为1.32×107个
【答案】 D
【解析】 固氮酶是根瘤菌自身合成的,其合成所需的核糖体和氨基酸来源于根瘤菌自身;自养生物是指能利用无机碳源(如CO2)合成有机物的生物,而异养生物需要现成的有机物,圆褐固氮菌的碳源是现成的有机物(如葡萄糖),说明圆褐固氮菌为异养生物;将土壤悬浮液用无菌水梯度稀释后涂布到不含氮素的培养基上,可以起到纯化圆褐固氮菌、抑制其他微生物生长的作用;若④统计的菌落数分别是132、136、128,根据计算公式(C÷V×M),④的稀释倍数为104,则每克土壤中含固氮菌约为(132+136+128)÷3÷0.1×104=1.32×107(个)。(共71张PPT)
第50讲　微生物的培养技术及应用
课标 要求 1.阐明在发酵工程中灭菌是获得纯净的微生物培养物的前提。
2.阐明无菌技术是在操作过程中,保持无菌物品与无菌区域不被微生物污染的技术。
3.举例说明通过调整培养基的配方可有目的地培养某种微生物。
4.概述平板划线法和稀释涂布平板法是实验室中进行微生物分离和纯化的常用方法。
5.概述稀释涂布平板法和显微镜计数法是测定微生物数量的常用方法。
考情 分析 1.微生物的基本培养技术 2025·江苏卷,11;2024·湖南卷,6;2023·河北卷,12
2.微生物的选择培养和计数 2025·四川卷,8;2025·湖南卷,5;2025·山东卷,15;
2025·黑吉辽内蒙古卷,4;2025·河北卷,18;2024·江西卷,17;2024·黑吉辽卷,19;2024·重庆卷,13;
2024·全国甲卷,37;2023·山东卷,15;2023·广东卷,10;2023·北京卷,16;2023·辽宁卷,9
考点一
微生物的基本培养技术
1.培养基的配制
(1)培养基的概念、种类和用途。
必备知识·梳理
落实概念·夯实基础
营养物质
生长繁殖
液体
分离
选择
积累
其代谢物
(2)培养基的配方。
①主要营养物质:水、 、氮源、 。
②其他条件:pH、 和氧气。
无机盐
碳源
特殊营养物质
微生物 乳酸杆菌 霉菌 细菌 厌氧微
生物
特殊 需求 添加 pH调 至 pH调至 无氧
维生素
酸性
中性或
弱碱性
提醒　固体培养基常用于微生物的分离与鉴定、活菌计数、保藏菌种;液体培养基常用于工业生产、微生物的扩大培养。
2.无菌技术
杂菌污染
所
有的微生物
巴氏消毒法
湿热灭菌
提醒　选择无菌技术的原则:一要考虑无菌技术的效果,灭菌的效果比消毒要好;二要考虑操作对象的承受能力,活体生物材料、操作者的手等只能采用消毒,而不能用灭菌。
3.微生物的纯培养
(1)概念辨析。
固体培养基
一定形态结构
(2)酵母菌纯培养的操作步骤。
湿热灭菌
干热灭菌
平板划线法
倒置
未接种
提醒　培养基冷却凝固后平板要倒置,既可避免培养基表面的水分过快地挥发,又可防止皿盖上的水珠落入培养基,造成污染。
(3)平板划线法的具体操作。
火焰
试管口
打
开一条缝隙
从第一
次划线的末端
与第一
次的划线相连
1.(选择性必修3 P10旁栏思考)培养基中加入氮源的原因是
。
2.(选择性必修3 P10相关信息)生物消毒法是指利用 除去环境中的部分微生物的方法。
细读教材
培养基中的氮元
素是微生物合成蛋白质、核酸等物质所必需的
生物或其代谢物
(1)(2025·四川卷,5)利用土豆匀浆制备的培养基,可用于酵母菌的培养。
(　　)
(2)(2024·河北卷,13)将配制的酵母培养基煮沸并冷却后,在酒精灯火焰旁倒平板。(　　)
【判断正误】
√
×
【提示】 将配制的酵母培养基高压灭菌并冷却到不烫手(50 ℃左右)后,在酒精灯火焰旁倒平板。
(3)(2024·河北卷,13)将接种环烧红,迅速蘸取酵母菌液在培养基上划线培养,获得单菌落。(　　)
×
【提示】 将接种环烧红,待冷却后(避免菌种被烫死),蘸取酵母菌液在培养基上划线培养,获得单菌落。
(4)(2023·山东卷,15)不含氮源的平板不能用于微生物培养。(　　)
×
【提示】 不含氮源的平板可用来选择培养固氮菌。
(5)(2023·山东卷,15)平板涂布时涂布器使用前必须进行消毒。(　　)
×
【提示】 平板涂布时涂布器使用前必须进行灭菌处理,以防止外来杂菌的
污染。
(6)(2022·湖北卷,4)微生物、动物细胞培养基中需添加一定量的抗生素以防止污染。(　　)
×
【提示】 动物细胞培养基中需添加一定量的抗生素以防止污染,保证无菌环境,而微生物的培养通常不能加入抗生素。
考向1　围绕培养基的配制及无菌技术,培养理解能力
1.(2025·江苏南通一模)解钾菌通过生物降解作用可将土壤中难溶性钾盐转化为可溶态钾素。如下表所示为科研团队基于厨余垃圾发酵液特性研发的专用培养基组成,该配方旨在高效分离筛选具有解钾功能的优势菌株。
核心考向·突破
把握方向·训练到位
成分 钾长石粉 蔗糖 Na2HPO4 CaCO3
含量/(g·L-1) 10 10 2 1
成分 (NH4)2SO4 NaCl 酵母膏 MgSO4·7H2O
含量/(g·L-1) 1 0.1 0.5 0.5
下列相关叙述正确的是(　　)
A.培养基中的钾长石粉属于可溶性钾,为目的菌提供无机盐
B.按表中配方配制好的培养基应先灭菌再将pH调至弱碱性
C.厨余垃圾发酵液梯度稀释后涂布于选择培养基表面倒置培养
D.应选择透明圈直径与菌落直径比值较小的菌落进一步进行纯化
C
【解析】 解钾菌能将土壤中难溶性含钾化合物分解,转变为可溶性化合物,据此推测,培养基中的钾长石粉属于难溶性钾,钾长石粉为唯一钾源,目的是筛选出解钾菌;为防止培养基二次污染,按表中配方配制好的培养基应先将pH调至弱碱性再灭菌;为防止培养基中水分过快挥发及皿盖上的水珠落入培养基,厨余垃圾发酵液梯度稀释后涂布于选择培养基表面要倒置培养;应选择透明圈直径与菌落直径比值较大的菌落进一步进行纯化,比值较大,解钾菌分解能力强。
几种微生物的营养和能量来源
归纳总结
2.(2025·陕西渭南三模)无菌技术是微生物培养获得纯净培养物的关键。为避免杂菌污染,常采用高压蒸汽灭菌法等对培养基进行灭菌。接种、倒平板等环节也都要防止杂菌的污染。下列相关叙述正确的是(　　)
A.某些微生物能以无机物作为碳源,也能以无机物作为能源
B.消毒和灭菌都是指用强烈的理化方法杀死物体内外所有微生物
C.将要培养的微生物接种至培养基后,应立即放入高压蒸汽灭菌锅中
D.为保证超净工作台无菌,接种操作时应打开紫外灯
A
【解析】 硝化细菌可利用氨或铵态盐作为能量来源,以二氧化碳为碳源合成自身所需的有机物;消毒是指使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部的部分微生物(不包括芽孢和孢子),灭菌是指用强烈的理化方法杀死物体内外所有微生物;培养基要先进行高压蒸汽灭菌再接种;紫外线对人体有伤害,接种操作时应关闭紫外灯。
常见物品的消毒或灭菌方法
(1)消毒方法及适用对象。
归纳总结
(2)灭菌方法及适用对象。
归纳总结
考向2　围绕微生物的纯培养方法及应用,考查综合运用能力
3.(2025·江苏卷,11)从种植草莓的土壤中分离致病菌,简易流程如下:制备土壤悬液、分离、纯化、鉴定。下列相关叙述正确的是(　　)
A.制备的培养基可用紫外线照射进行灭菌
B.将土样加入无菌水混匀,梯度稀释后取悬液加入平板并涂布
C.连续划线时,接上次划线的起始端开始划线
D.鉴定后的致病菌,可接种在斜面培养基上,并在室温下长期保存
B
【解析】 制备的培养基需用高压蒸汽灭菌法灭菌,紫外线仅用于表面或空气消毒,无法灭菌;将土样加入无菌水制成悬液,经梯度稀释后,取各稀释度菌液涂布于培养基表面,分离并计数;连续划线时,每次应从上次划线的末端开始,以逐步稀释菌体,若从起始端开始无法有效分离菌体,得到单菌落;斜面培养基保存菌种需置于4 ℃左右的冰箱中短期保存,长期保存应使用甘油管藏法(-20 ℃),室温下无法长期保存。
平板划线操作中灼烧接种环的目的
归纳总结
第一次划 线前灼烧 每次划线前灼烧 (第二次及以后) 划线结束
后灼烧
避免接种环上可能存在的微生物污染培养物 杀死上一次划线结束后接种环上残留的菌种,使每次划线的菌种均来自上一次划线的末端 杀死接种环上残留的菌种,避免菌种污染环境和感染操作者
4.(2025·广东汕头模拟)生食海鲜易引发副溶血性弧菌食物中毒。为开发天然抑菌剂,研究者先制备海鲜样液,在某培养基中划线接种得到该菌(图中蓝绿色菌落)。下列叙述正确的是(　　)
A.海鲜样液需多次稀释后才能划线接种
B.划线接种时,接种环使用前须进行消毒
C.只有第一次划线前需要蘸取海鲜样液
D.结果显示单菌落太多不能达到纯培养目的
C
【解析】 平板划线接种时,不需要稀释;划线接种时,接种环使用前须进行灼烧灭菌;只有第一次划线前需要蘸取海鲜样液,后面每次划线都是从上一次划线的末端开始;图中出现蓝绿色单菌落即达到了菌种纯化的目的。
考点二
微生物的选择培养和计数
1.选择培养基
必备知识·梳理
落实概念·夯实基础
抑制或阻止
尿素
高温
提醒　缺少氮源的培养基可以筛选能利用大气中N2的微生物;无有机碳源的培养基可筛选出自养微生物。
2.稀释涂布平板法
(1)系列稀释操作。
取1 mL菌液加入盛有9 mL无菌水的试管中,依次等比稀释。
(2)涂布平板操作。
培养基
酒精
涂布器
火焰
冷却
3.微生物的数量测定
项目 稀释涂布平板法(间接计数法) 显微镜直接计数法
原理 当样品的 ,培养基表面生长的一个单菌落,来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的 ,就能推测出样品中大约含有多少活菌 利用特定的
,在显微镜下观察、计数,然后再计算一定体积的样品中微生物的数量
稀释度足够高时
菌落数
细菌计数板或血细
胞计数板
计算 方法 在同一稀释度下,应至少对3个平板进行重复计数,然后求出 ,则每克样品中的菌落数=(C÷V)×M,C:某稀释度下平板上生长的平均菌落数,V:涂布平板时所用的稀释液的体积(mL),M:稀释倍数 每毫升原液所含细菌数=每小格内平均细菌数×400×104×稀释倍数
缺点 当两个或多个细胞连在一起时,平板上观察到的只是 不能区分
结果 比实际值偏 比实际值偏
平均值
一个菌落
细胞死活
小
大
提醒　显微镜直接计数法本身不能区分细菌的死活,但是通过一定的辅助处理,可以实现活菌计数,如在计数前用台盼蓝染液进行染色,可以通过统计无色细胞的个数来对活菌进行计数。
1.(选择性必修3 P18相关信息)血细胞计数板和细菌计数板的主要区别是
。
细读教材
前者常用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数;后者可对细菌等
较小的细胞进行观察和计数
4.土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
(1)实验原理。
脲酶
尿素
(2)操作步骤。
30~
300
稀释涂布平板
温度
时间
稳定
(3)实验结果分析与评价。
30~300
2.(选择性必修3 P18～19探究·实践拓展)利用稀释涂布平板法纯化分解尿素的细菌时,经培养后发现培养基上出现多种菌落,可能的原因有
。
细读教材
培养基
制备过程中被杂菌污染;接种过程中,无菌操作不符合要求;系列稀释时,无
菌操作不符合要求等
(1)(2024·天津卷,8)根据菌落外表特征可以判断在尿素为唯一氮源的培养基上生长的尿素降解菌是否有不同种类。(　　)
(2)(2024·浙江6月选考,14)产脲酶细菌可在以NH4Cl为唯一氮源的培养基上生长繁殖。(　　)
(3)(2023·江苏卷,7)血细胞计数板既可用于酵母菌的数量测定,也可用于细菌的数量测定。(　　)
【判断正误】
√
√
×
【提示】 血细胞计数板不适用于微小的细菌计数。
(4)(2022·江苏卷,3)某同学欲分离高产脲酶菌,可用尿素作为唯一氮源的选择培养基获得。(　　)
(5)(2021·浙江6月选考,17)稀释涂布平板法和平板划线法均能得到单菌落,都可用于细菌计数。(　　)
√
×
【提示】 平板划线法只能用于细菌分离,不能用于细菌计数。
(6)(2020·浙江7月选考,19)利用尿素固体培养基可迅速杀死其他微生物,而保留利用尿素的微生物。(　　)
×
【提示】 尿素固体培养基属于选择培养基,以尿素为唯一氮源,不能利用尿素的微生物因缺乏可利用的氮源而不能在此培养基上生存,故尿素固体培养基的作用并不是迅速杀死其他微生物。
考向3　围绕微生物的选择培养,考查科学探究
5.(2025·黑吉辽内蒙古卷,4)科研人员通过稀释涂布平板法筛选出高耐受且降解金霉素(C22H23ClN2O8)能力强的菌株,旨在解决金霉素过量使用所导致的环境污染问题。下列叙述错误的是(　　)
A.以金霉素为唯一碳源可制备选择培养基
B.逐步提高培养基中金霉素的浓度有助于获得高耐受的菌株
C.配制选择培养基时,需确保pH满足实验要求
D.用接种环将菌液均匀地涂布在培养基表面
核心考向·突破
把握方向·训练到位
D
【解析】 以金霉素为唯一碳源的选择培养基,仅允许能利用金霉素的微生物生长(其他无法利用金霉素的微生物被抑制),符合选择培养基的设计原理;逐步提高培养基中金霉素的浓度可模拟环境胁迫,筛选出高耐受的菌株;培养基的pH需根据目标微生物的生长需求进行调整;稀释涂布平板法需用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面,而接种环用于平板划线法。
6.(2025·湖北襄阳模拟)高温淀粉酶在大规模工业生产中有很大的实用性。研究者从热泉中筛选高效产生高温淀粉酶的嗜热菌,其筛选过程如图1所示。将得到的菌悬液转接于同时含有葡萄糖和淀粉作碳源的固体培养基上培养,得到若干菌落后用碘液进行显色处理,看到如图2所示情况。下列选项错误的是(　　)
A.过程①②合称为稀释涂布平板法
B.甲乙试管中的液体均为选择培养基
C.Ⅱ号培养基上的接种方法为平板划线法
D.图2中周围不显蓝色的菌落含有所需菌种
B
【解析】 根据Ⅰ号培养基上菌落分布均匀,可知①②过程为稀释涂布平板法;甲乙试管中的液体是用于样品稀释,应为无菌水;由Ⅱ号培养基上的划线区域可知,从Ⅰ号培养基上挑选的菌落进行接种的方法是平板划线法;淀粉与碘液反应呈蓝色,如果淀粉分解菌中的淀粉酶将淀粉水解后就不能呈蓝色,因此周围不显蓝色的菌落含有所需菌种。
考向4　围绕微生物的分离与计数,考查科学思维和科学探究
7.(2025·四川卷,8)微塑料由塑料废弃物风化形成,难以降解,会危害生态环境和人体健康。有人分离到X和Y两种微塑料降解菌,将总菌量相同的X、Y、X+Y(X∶Y=1∶1)分别接种于含有等量微塑料的蛋白胨液体培养基中,培养一段时间后测定微塑料的残留率(残留率=剩余量/添加量×100%),结果如下图。下列叙述正确的是(　　)
A.用平板划线法能测定X菌组中的活菌数
B.Y菌组微塑料残留率较高,故菌浓度也高
C.混合菌种对微塑料的降解能力高于单一菌种
D.能在该培养基中生长繁殖的微生物都能降解微塑料
C
【解析】 平板划线法主要用于微生物的分离和纯化,不能用于测定活菌数,测定活菌数常用稀释涂布平板法;Y菌组微塑料残留率较高,说明Y菌对微塑料的降解能力相对较弱,而不是菌浓度高;由图可知,X+Y混合菌种组的微塑料残留率低于X菌组和Y菌组,说明混合菌种对微塑料的降解能力高于单一菌种;该培养基中含有蛋白胨,能在该培养基中生长繁殖的微生物可能利用蛋白胨作为碳源和氮源等,但不一定都能降解微塑料。
8.(2025·山东济宁三模)我国科学家采集了某深海冷泉附近的沉积物样品,从中筛选出能在无氧环境中降解藻类多糖(纤维素、淀粉、木聚糖等)的拟杆菌菌株,进一步筛选获得了高耐受藻类多糖的菌株,并进行了计数,主要过程如图所示。下列叙述错误的是(　　)
A.转接后需在低温无氧条件下培养
B.②中需加入适量琼脂等凝固剂
C.③中藻类多糖的含量明显高于②
D.③中拟杆菌密度为2.2×106个·mL-1
D
【解析】 该实验需要模拟深海冷泉附近的环境,所以转接后需在低温无氧条件下培养;②到③的过程挑取了单菌落,说明该培养基是固体培养基,所以其中需加入适量琼脂等凝固剂;该实验的目的是筛选高耐受藻类多糖的菌株,所以题图中应提高③中藻类多糖含量,即③中藻类多糖的含量明显高于②;应选择菌落数在30～300的平板进行计数,故③中拟杆菌密度为(220+212+198)÷3÷0.1×103=2.1×106(个·mL-1)。
理解计数时设置对照和重复的目的
归纳总结
比较项目 对照 重复
目的 排除非测试因素对实验结果的影响 排除偶然因素对实验结果的影响
实例 空白对照:确定培养基制作是否合格 同一稀释度涂布至少3个平板
演练真题·感悟高考
1.(2025·湖南卷,5)采集果园土壤进行微生物分离或计数。下列叙述正确的是(　　)
A.稀释涂布平板法和平板划线法都能用于尿素分解菌的分离和计数
B.完成平板划线后,培养时需增加一个未接种的平板作为对照
C.土壤中分离得到的醋酸菌能在无氧条件下将葡萄糖分解成乙酸
D.用于筛选尿素分解菌的培养基含有蛋白胨、尿素和无机盐等营养物质
B
【解析】 平板划线法只能用于分离纯化菌种,不能用于计数;平板划线法操作后需设置未接种的平板作为空白对照,以验证培养基灭菌是否彻底;醋酸菌为好氧菌,需在有氧条件下将葡萄糖分解成乙酸;筛选尿素分解菌的培养基应以尿素为唯一氮源,不能添加蛋白胨等其他氮源。
2.(2025·河北卷,18改编)隐甲藻是一种好氧的异养真核微藻,多在海水中腐烂的植物叶片上生长繁殖,是工业生产DHA(一种功能性脂肪酸)的藻类之一。从海洋中筛选获得的高产油脂隐甲藻,可用于DHA的发酵生产。下列叙述错误的是(　　)
A.隐甲藻可从腐烂的叶片获得生长必需的碳源
B.采集海水中腐烂的叶片,湿热灭菌后接种到固体培养基,以获得隐甲藻
C.选择培养基中可加入抑制细菌生长的抗生素,以减少杂菌生长
D.适当提高发酵时的通气量和搅拌速率均可增加溶氧量,以提高DHA产量
B
【解析】 根据题目信息“隐甲藻是一种好氧的异养真核微藻,多在海水中腐烂的植物叶片上生长繁殖”可知,隐甲藻可从腐烂的叶片获得生长必需的碳源;采集海水中腐烂的叶片进行湿热灭菌后,会杀死所有的微生物,此时接种到固体培养基上无法获得隐甲藻;由题可知,隐甲藻为真核生物,抗生素可通过抑制细菌细胞壁合成或影响代谢过程来抑制细菌生长,不会影响真核生物的生命活动,因此在筛选或培养隐甲藻时,加入抗生素可有效抑制细菌等杂菌,提高隐甲藻的纯度和生长效率;由题可知,隐甲藻为好氧生物,因此利用隐甲藻进行DHA发酵生产时,适当提高发酵时的通气量和搅拌速率均可增加溶氧量,可以提高DHA产量。
3.(2025·山东卷,15)深海淤泥中含有某种能降解纤维素的细菌。探究不同压强下,该细菌在以纤维素或淀粉为唯一碳源的培养基上的生长情况。其他条件相同且适宜,实验处理及结果如下表所示。
组别 压强 纤维素 淀粉 菌落
① 常压 - + -
② 常压 + - -
③ 高压 - + -
④ 高压 + - +
注:“+”表示有;“-”表示无。
下列说法正确的是(　　)
A.可用平板划线法对该菌计数
B.制备培养基的过程中,应先倒平板再进行高压蒸汽灭菌
C.由②④组可知,在以纤维素为唯一碳源的培养基上,该菌可在常压下生长
D.由③④组可知,高压下该菌不能在以淀粉为唯一碳源的培养基上生长
D
【解析】 平板划线法是用来分离和纯化微生物的技术,稀释涂布平板法可用于活菌的计数;制备固体培养基(琼脂平板)时的正确顺序是先进行高压蒸汽灭菌,再倒平板;组②为常压+纤维素,结果是无菌落,而组④为高压+纤维素,结果是有菌落,对比说明,在以纤维素为唯一碳源的条件下,该菌不能在常压下生长,而能在高压下生长;③④组形成对照,自变量是碳源,实验结果表明,在高压条件下,该菌能在以纤维素为唯一碳源的培养基上生长(组④),但不能在以淀粉为唯一碳源的培养基上生长(组③)。
4.(2025·贵州卷,15)金龟子绿僵菌(Ma)是一种昆虫病原真菌,可以侵染某些农林害虫。Ma寄生时其孢子(单细胞后代)萌发后侵入昆虫体内大量增殖并产生毒素,导致寄主僵化、死亡。下列叙述错误的是(　　)
A.可利用Ma开发成微生物杀虫剂
B.为分离Ma可从研磨的僵虫组织中取样
C.稀释涂布平板法可用于分离样品中的Ma
D.接种培养Ma时使用的器具需消毒
D
【解析】 微生物培养中,接种环等直接接触菌种的器具需严格灭菌(如灼烧灭菌),而非仅消毒,消毒无法彻底杀灭微生物的芽孢或孢子。
5.(2024·全国甲卷,37节选)合理使用消毒液有助于减少传染病的传播。某同学比较了3款消毒液A、B、C杀灭细菌的效果,结果如图所示。回答下列问题。
(1)该同学采用显微镜直接计数法和菌落计数法分别测定同一样品的细菌数量,发现测得的细菌数量前者大于后者,其原因是
　。
前者微生物分散的活菌和死菌一起计数,后者存在两个或多个活菌连在一起形成一个菌落的情况且只计数活菌
【解析】 (1)显微镜直接计数法把死菌和活菌一起计数。菌落计数法只计数活菌数,还可能存在两个或多个活菌形成一个菌落的情况,故前者的数量大于后者。
(2)该同学从100 mL细菌原液中取1 mL加入无菌水中得到10 mL稀释菌液,再从稀释菌液中取200 μL涂布平板,菌落计数的结果为100,据此推算细菌原液中细菌浓度为　　　　　个/mL。
5 000
【解析】 (2)从100 mL细菌原液中取1 mL加入无菌水中得到10 mL稀释菌液,即稀释了10倍,细菌原液中细菌浓度=(菌落数÷菌液体积)×稀释倍数=
(100÷0.2)×10=5 000(个/mL)。
(3)菌落计数过程中,涂布器应先在酒精灯上灼烧,冷却后再涂布。灼烧的目的是 　 ,冷却的目的是
　。
杀死涂布器上可能存在的微生物,防止污染
防止温度过高杀死菌种
【解析】 (3)菌落计数过程中,涂布器应先在酒精灯上灼烧,冷却后再涂布。灼烧的目的是杀死涂布器上可能存在的微生物,防止污染,冷却的目的是防止温度过高杀死菌种。
(4)据图可知杀菌效果最好的消毒液是　　 ,判断依据是　
　(答出两点即可)。
A
A消毒液活菌
数减少量最多,且减少得最快,效率最高
【解析】 (4)A消毒液活菌数减少量最多,且减少得最快,效率最高,因此A消毒液杀菌效果最好。
谢谢观赏第50讲　微生物的培养技术及应用
课标 要求 1.阐明在发酵工程中灭菌是获得纯净的微生物培养物的前提。 2.阐明无菌技术是在操作过程中,保持无菌物品与无菌区域不被微生物污染的技术。 3.举例说明通过调整培养基的配方可有目的地培养某种微生物。 4.概述平板划线法和稀释涂布平板法是实验室中进行微生物分离和纯化的常用方法。 5.概述稀释涂布平板法和显微镜计数法是测定微生物数量的常用方法。
考情 分析 1.微生物的基本培养技术 2025·江苏卷,11;2024·湖南卷,6;2023·河北卷,12
2.微生物的选择培养和计数 2025·四川卷,8;2025·湖南卷,5;2025·山东卷,15;2025·黑吉辽内蒙古卷,4;2025·河北卷,18;2024·江西卷,17;2024·黑吉辽卷,19;2024·重庆卷,13;2024·全国甲卷,37;2023·山东卷,15;2023·广东卷,10;2023·北京卷,16;2023·辽宁卷,9
考点一　微生物的基本培养技术
1.培养基的配制
(1)培养基的概念、种类和用途。
(2)培养基的配方。
①主要营养物质:水、无机盐、氮源、碳源。
②其他条件:pH、特殊营养物质和氧气。
微生物 乳酸杆菌 霉菌 细菌 厌氧微 生物
特殊 需求 添加 维生素 pH调 至酸性 pH调至 中性或 弱碱性 无氧
提醒　固体培养基常用于微生物的分离与鉴定、活菌计数、保藏菌种;液体培养基常用于工业生产、微生物的扩大培养。
2.无菌技术
提醒　选择无菌技术的原则:一要考虑无菌技术的效果,灭菌的效果比消毒要好;二要考虑操作对象的承受能力,活体生物材料、操作者的手等只能采用消毒,而不能用灭菌。
3.微生物的纯培养
(1)概念辨析。
(2)酵母菌纯培养的操作步骤。
提醒　培养基冷却凝固后平板要倒置,既可避免培养基表面的水分过快地挥发,又可防止皿盖上的水珠落入培养基,造成污染。
(3)平板划线法的具体操作。
1.(选择性必修3 P10旁栏思考)培养基中加入氮源的原因是培养基中的氮元素是微生物合成蛋白质、核酸等物质所必需的。
2.(选择性必修3 P10相关信息)生物消毒法是指利用生物或其代谢物除去环境中的部分微生物的方法。
【判断正误】
(1)(2025·四川卷,5)利用土豆匀浆制备的培养基,可用于酵母菌的培养。(　　)
【答案】 √
(2)(2024·河北卷,13)将配制的酵母培养基煮沸并冷却后,在酒精灯火焰旁倒平板。(　　)
【答案】 ×
【提示】 将配制的酵母培养基高压灭菌并冷却到不烫手(50 ℃左右)后,在酒精灯火焰旁倒平板。
(3)(2024·河北卷,13)将接种环烧红,迅速蘸取酵母菌液在培养基上划线培养,获得单菌落。(　　)
【答案】 ×
【提示】 将接种环烧红,待冷却后(避免菌种被烫死),蘸取酵母菌液在培养基上划线培养,获得单菌落。
(4)(2023·山东卷,15)不含氮源的平板不能用于微生物培养。(　　)
【答案】 ×
【提示】 不含氮源的平板可用来选择培养固氮菌。
(5)(2023·山东卷,15)平板涂布时涂布器使用前必须进行消毒。(　　)
【答案】 ×
【提示】 平板涂布时涂布器使用前必须进行灭菌处理,以防止外来杂菌的污染。
(6)(2022·湖北卷,4)微生物、动物细胞培养基中需添加一定量的抗生素以防止污染。(　　)
【答案】 ×
【提示】 动物细胞培养基中需添加一定量的抗生素以防止污染,保证无菌环境,而微生物的培养通常不能加入抗生素。
考向1　围绕培养基的配制及无菌技术,培养理解能力
1.(2025·江苏南通一模)解钾菌通过生物降解作用可将土壤中难溶性钾盐转化为可溶态钾素。如下表所示为科研团队基于厨余垃圾发酵液特性研发的专用培养基组成,该配方旨在高效分离筛选具有解钾功能的优势菌株。下列相关叙述正确的是(　　)
成分 钾长石粉 蔗糖 Na2HPO4 CaCO3
含量/ (g·L-1) 10 10 2 1
成分 (NH4)2SO4 NaCl 酵母膏 MgSO4·7H2O
含量/ (g·L-1) 1 0.1 0.5 0.5
A.培养基中的钾长石粉属于可溶性钾,为目的菌提供无机盐
B.按表中配方配制好的培养基应先灭菌再将pH调至弱碱性
C.厨余垃圾发酵液梯度稀释后涂布于选择培养基表面倒置培养
D.应选择透明圈直径与菌落直径比值较小的菌落进一步进行纯化
【答案】 C
【解析】 解钾菌能将土壤中难溶性含钾化合物分解,转变为可溶性化合物,据此推测,培养基中的钾长石粉属于难溶性钾,钾长石粉为唯一钾源,目的是筛选出解钾菌;为防止培养基二次污染,按表中配方配制好的培养基应先将pH调至弱碱性再灭菌;为防止培养基中水分过快挥发及皿盖上的水珠落入培养基,厨余垃圾发酵液梯度稀释后涂布于选择培养基表面要倒置培养;应选择透明圈直径与菌落直径比值较大的菌落进一步进行纯化,比值较大,解钾菌分解能力强。
几种微生物的营养和能量来源
微生物 碳源 氮源 能源
蓝细菌 CO2 N、 N等 光能
硝化细菌 CO2 NH3 NH3的氧化
根瘤菌 糖类等 有机物 N2 有机物
酵母菌 糖类、蛋白 质等有机物 蛋白质等 有机物
2.(2025·陕西渭南三模)无菌技术是微生物培养获得纯净培养物的关键。为避免杂菌污染,常采用高压蒸汽灭菌法等对培养基进行灭菌。接种、倒平板等环节也都要防止杂菌的污染。下列相关叙述正确的是(　　)
A.某些微生物能以无机物作为碳源,也能以无机物作为能源
B.消毒和灭菌都是指用强烈的理化方法杀死物体内外所有微生物
C.将要培养的微生物接种至培养基后,应立即放入高压蒸汽灭菌锅中
D.为保证超净工作台无菌,接种操作时应打开紫外灯
【答案】 A
【解析】 硝化细菌可利用氨或铵态盐作为能量来源,以二氧化碳为碳源合成自身所需的有机物;消毒是指使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部的部分微生物(不包括芽孢和孢子),灭菌是指用强烈的理化方法杀死物体内外所有微生物;培养基要先进行高压蒸汽灭菌再接种;紫外线对人体有伤害,接种操作时应关闭紫外灯。
常见物品的消毒或灭菌方法
(1)消毒方法及适用对象。
(2)灭菌方法及适用对象。
考向2　围绕微生物的纯培养方法及应用,考查综合运用能力
3.(2025·江苏卷,11)从种植草莓的土壤中分离致病菌,简易流程如下:制备土壤悬液、分离、纯化、鉴定。下列相关叙述正确的是(　　)
A.制备的培养基可用紫外线照射进行灭菌
B.将土样加入无菌水混匀,梯度稀释后取悬液加入平板并涂布
C.连续划线时,接上次划线的起始端开始划线
D.鉴定后的致病菌,可接种在斜面培养基上,并在室温下长期保存
【答案】 B
【解析】 制备的培养基需用高压蒸汽灭菌法灭菌,紫外线仅用于表面或空气消毒,无法灭菌;将土样加入无菌水制成悬液,经梯度稀释后,取各稀释度菌液涂布于培养基表面,分离并计数;连续划线时,每次应从上次划线的末端开始,以逐步稀释菌体,若从起始端开始无法有效分离菌体,得到单菌落;斜面培养基保存菌种需置于4 ℃左右的冰箱中短期保存,长期保存应使用甘油管藏法(-20 ℃),室温下无法长期保存。
平板划线操作中灼烧接种环的目的
第一次划 线前灼烧 每次划线前灼烧 (第二次及以后) 划线结束 后灼烧
避免接种环上可能存在的微生物污染培养物 杀死上一次划线结束后接种环上残留的菌种,使每次划线的菌种均来自上一次划线的末端 杀死接种环上残留的菌种,避免菌种污染环境和感染操作者
4.(2025·广东汕头模拟)生食海鲜易引发副溶血性弧菌食物中毒。为开发天然抑菌剂,研究者先制备海鲜样液,在某培养基中划线接种得到该菌(图中蓝绿色菌落)。下列叙述正确的是(　　)
A.海鲜样液需多次稀释后才能划线接种
B.划线接种时,接种环使用前须进行消毒
C.只有第一次划线前需要蘸取海鲜样液
D.结果显示单菌落太多不能达到纯培养目的
【答案】 C
【解析】 平板划线接种时,不需要稀释;划线接种时,接种环使用前须进行灼烧灭菌;只有第一次划线前需要蘸取海鲜样液,后面每次划线都是从上一次划线的末端开始;图中出现蓝绿色单菌落即达到了菌种纯化的目的。
考点二　微生物的选择培养和计数
1.选择培养基
提醒　缺少氮源的培养基可以筛选能利用大气中N2的微生物;无有机碳源的培养基可筛选出自养微生物。
2.稀释涂布平板法
(1)系列稀释操作。
取1 mL菌液加入盛有9 mL无菌水的试管中,依次等比稀释。
(2)涂布平板操作。
3.微生物的数量测定
项目 稀释涂布平板法(间接计数法) 显微镜直接计数法
原理 当样品的稀释度足够高时,培养基表面生长的一个单菌落,来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数,就能推测出样品中大约含有多少活菌 利用特定的细菌计数板或血细胞计数板,在显微镜下观察、计数,然后再计算一定体积的样品中微生物的数量
续　表
项目 稀释涂布平板法(间接计数法) 显微镜直接计数法
计算 方法 在同一稀释度下,应至少对3个平板进行重复计数,然后求出平均值,则每克样品中的菌落数=(C÷V)×M,C:某稀释度下平板上生长的平均菌落数,V:涂布平板时所用的稀释液的体积(mL),M:稀释倍数 每毫升原液所含细菌数=每小格内平均细菌数×400×104×稀释倍数
缺点 当两个或多个细胞连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落 不能区分细胞死活
结果 比实际值偏小 比实际值偏大
提醒　显微镜直接计数法本身不能区分细菌的死活,但是通过一定的辅助处理,可以实现活菌计数,如在计数前用台盼蓝染液进行染色,可以通过统计无色细胞的个数来对活菌进行计数。
1.(选择性必修3 P18相关信息)血细胞计数板和细菌计数板的主要区别是前者常用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数;后者可对细菌等较小的细胞进行观察和计数。
4.土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
(1)实验原理。
(2)操作步骤。
(3)实验结果分析与评价。
2.(选择性必修3 P18～19探究·实践拓展)利用稀释涂布平板法纯化分解尿素的细菌时,经培养后发现培养基上出现多种菌落,可能的原因有培养基制备过程中被杂菌污染;接种过程中,无菌操作不符合要求;系列稀释时,无菌操作不符合要求等。
【判断正误】
(1)(2024·天津卷,8)根据菌落外表特征可以判断在尿素为唯一氮源的培养基上生长的尿素降解菌是否有不同种类。(　　)
【答案】 √
(2)(2024·浙江6月选考,14)产脲酶细菌可在以NH4Cl为唯一氮源的培养基上生长繁殖。(　　)
【答案】 √
(3)(2023·江苏卷,7)血细胞计数板既可用于酵母菌的数量测定,也可用于细菌的数量测定。(　　)
【答案】 ×
【提示】 血细胞计数板不适用于微小的细菌计数。
(4)(2022·江苏卷,3)某同学欲分离高产脲酶菌,可用尿素作为唯一氮源的选择培养基获得。(　　)
【答案】 √
(5)(2021·浙江6月选考,17)稀释涂布平板法和平板划线法均能得到单菌落,都可用于细菌计数。(　　)
【答案】 ×
【提示】 平板划线法只能用于细菌分离,不能用于细菌计数。
(6)(2020·浙江7月选考,19)利用尿素固体培养基可迅速杀死其他微生物,而保留利用尿素的微生物。(　　)
【答案】 ×
【提示】 尿素固体培养基属于选择培养基,以尿素为唯一氮源,不能利用尿素的微生物因缺乏可利用的氮源而不能在此培养基上生存,故尿素固体培养基的作用并不是迅速杀死其他微生物。
考向3　围绕微生物的选择培养,考查科学探究
5.(2025·黑吉辽内蒙古卷,4)科研人员通过稀释涂布平板法筛选出高耐受且降解金霉素(C22H23ClN2O8)能力强的菌株,旨在解决金霉素过量使用所导致的环境污染问题。下列叙述错误的是(　　)
A.以金霉素为唯一碳源可制备选择培养基
B.逐步提高培养基中金霉素的浓度有助于获得高耐受的菌株
C.配制选择培养基时,需确保pH满足实验要求
D.用接种环将菌液均匀地涂布在培养基表面
【答案】 D
【解析】 以金霉素为唯一碳源的选择培养基,仅允许能利用金霉素的微生物生长(其他无法利用金霉素的微生物被抑制),符合选择培养基的设计原理;逐步提高培养基中金霉素的浓度可模拟环境胁迫,筛选出高耐受的菌株;培养基的pH需根据目标微生物的生长需求进行调整;稀释涂布平板法需用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面,而接种环用于平板划线法。
6.(2025·湖北襄阳模拟)高温淀粉酶在大规模工业生产中有很大的实用性。研究者从热泉中筛选高效产生高温淀粉酶的嗜热菌,其筛选过程如图1所示。将得到的菌悬液转接于同时含有葡萄糖和淀粉作碳源的固体培养基上培养,得到若干菌落后用碘液进行显色处理,看到如图2所示情况。下列选项错误的是(　　)
A.过程①②合称为稀释涂布平板法
B.甲乙试管中的液体均为选择培养基
C.Ⅱ号培养基上的接种方法为平板划线法
D.图2中周围不显蓝色的菌落含有所需菌种
【答案】 B
【解析】 根据Ⅰ号培养基上菌落分布均匀,可知①②过程为稀释涂布平板法;甲乙试管中的液体是用于样品稀释,应为无菌水;由Ⅱ号培养基上的划线区域可知,从Ⅰ号培养基上挑选的菌落进行接种的方法是平板划线法;淀粉与碘液反应呈蓝色,如果淀粉分解菌中的淀粉酶将淀粉水解后就不能呈蓝色,因此周围不显蓝色的菌落含有所需菌种。
考向4　围绕微生物的分离与计数,考查科学思维和科学探究
7.(2025·四川卷,8)微塑料由塑料废弃物风化形成,难以降解,会危害生态环境和人体健康。有人分离到X和Y两种微塑料降解菌,将总菌量相同的X、Y、X+Y(X∶Y=1∶1)分别接种于含有等量微塑料的蛋白胨液体培养基中,培养一段时间后测定微塑料的残留率(残留率=剩余量/添加量×100%),结果如下图。下列叙述正确的是(　　)
A.用平板划线法能测定X菌组中的活菌数
B.Y菌组微塑料残留率较高,故菌浓度也高
C.混合菌种对微塑料的降解能力高于单一菌种
D.能在该培养基中生长繁殖的微生物都能降解微塑料
【答案】 C
【解析】 平板划线法主要用于微生物的分离和纯化,不能用于测定活菌数,测定活菌数常用稀释涂布平板法;Y菌组微塑料残留率较高,说明Y菌对微塑料的降解能力相对较弱,而不是菌浓度高;由图可知,X+Y混合菌种组的微塑料残留率低于X菌组和Y菌组,说明混合菌种对微塑料的降解能力高于单一菌种;该培养基中含有蛋白胨,能在该培养基中生长繁殖的微生物可能利用蛋白胨作为碳源和氮源等,但不一定都能降解微塑料。
8.(2025·山东济宁三模)我国科学家采集了某深海冷泉附近的沉积物样品,从中筛选出能在无氧环境中降解藻类多糖(纤维素、淀粉、木聚糖等)的拟杆菌菌株,进一步筛选获得了高耐受藻类多糖的菌株,并进行了计数,主要过程如图所示。下列叙述错误的是(　　)
A.转接后需在低温无氧条件下培养
B.②中需加入适量琼脂等凝固剂
C.③中藻类多糖的含量明显高于②
D.③中拟杆菌密度为2.2×106个·mL-1
【答案】 D
【解析】 该实验需要模拟深海冷泉附近的环境,所以转接后需在低温无氧条件下培养;②到③的过程挑取了单菌落,说明该培养基是固体培养基,所以其中需加入适量琼脂等凝固剂;该实验的目的是筛选高耐受藻类多糖的菌株,所以题图中应提高③中藻类多糖含量,即③中藻类多糖的含量明显高于②;应选择菌落数在30～300的平板进行计数,故③中拟杆菌密度为(220+212+198)÷3÷0.1×103=2.1×106(个·mL-1)。
理解计数时设置对照和重复的目的
比较 项目 对照 重复
目的 排除非测试因素对实验结果的影响 排除偶然因素对实验结果的影响
实例 空白对照:确定培养基制作是否合格 同一稀释度涂布至少3个平板
1.(2025·湖南卷,5)采集果园土壤进行微生物分离或计数。下列叙述正确的是(　　)
A.稀释涂布平板法和平板划线法都能用于尿素分解菌的分离和计数
B.完成平板划线后,培养时需增加一个未接种的平板作为对照
C.土壤中分离得到的醋酸菌能在无氧条件下将葡萄糖分解成乙酸
D.用于筛选尿素分解菌的培养基含有蛋白胨、尿素和无机盐等营养物质
【答案】 B
【解析】 平板划线法只能用于分离纯化菌种,不能用于计数;平板划线法操作后需设置未接种的平板作为空白对照,以验证培养基灭菌是否彻底;醋酸菌为好氧菌,需在有氧条件下将葡萄糖分解成乙酸;筛选尿素分解菌的培养基应以尿素为唯一氮源,不能添加蛋白胨等其他氮源。
2.(2025·河北卷,18改编)隐甲藻是一种好氧的异养真核微藻,多在海水中腐烂的植物叶片上生长繁殖,是工业生产DHA(一种功能性脂肪酸)的藻类之一。从海洋中筛选获得的高产油脂隐甲藻,可用于DHA的发酵生产。下列叙述错误的是(　　)
A.隐甲藻可从腐烂的叶片获得生长必需的碳源
B.采集海水中腐烂的叶片,湿热灭菌后接种到固体培养基,以获得隐甲藻
C.选择培养基中可加入抑制细菌生长的抗生素,以减少杂菌生长
D.适当提高发酵时的通气量和搅拌速率均可增加溶氧量,以提高DHA产量
【答案】 B
【解析】 根据题目信息“隐甲藻是一种好氧的异养真核微藻,多在海水中腐烂的植物叶片上生长繁殖”可知,隐甲藻可从腐烂的叶片获得生长必需的碳源;采集海水中腐烂的叶片进行湿热灭菌后,会杀死所有的微生物,此时接种到固体培养基上无法获得隐甲藻;由题可知,隐甲藻为真核生物,抗生素可通过抑制细菌细胞壁合成或影响代谢过程来抑制细菌生长,不会影响真核生物的生命活动,因此在筛选或培养隐甲藻时,加入抗生素可有效抑制细菌等杂菌,提高隐甲藻的纯度和生长效率;由题可知,隐甲藻为好氧生物,因此利用隐甲藻进行DHA发酵生产时,适当提高发酵时的通气量和搅拌速率均可增加溶氧量,可以提高DHA产量。
3.(2025·山东卷,15)深海淤泥中含有某种能降解纤维素的细菌。探究不同压强下,该细菌在以纤维素或淀粉为唯一碳源的培养基上的生长情况。其他条件相同且适宜,实验处理及结果如下表所示。下列说法正确的是(　　)
组别 压强 纤维素 淀粉 菌落
① 常压 - + -
② 常压 + - -
③ 高压 - + -
④ 高压 + - +
注:“+”表示有;“-”表示无。
A.可用平板划线法对该菌计数
B.制备培养基的过程中,应先倒平板再进行高压蒸汽灭菌
C.由②④组可知,在以纤维素为唯一碳源的培养基上,该菌可在常压下生长
D.由③④组可知,高压下该菌不能在以淀粉为唯一碳源的培养基上生长
【答案】 D
【解析】 平板划线法是用来分离和纯化微生物的技术,稀释涂布平板法可用于活菌的计数;制备固体培养基(琼脂平板)时的正确顺序是先进行高压蒸汽灭菌,再倒平板;组②为常压+纤维素,结果是无菌落,而组④为高压+纤维素,结果是有菌落,对比说明,在以纤维素为唯一碳源的条件下,该菌不能在常压下生长,而能在高压下生长;③④组形成对照,自变量是碳源,实验结果表明,在高压条件下,该菌能在以纤维素为唯一碳源的培养基上生长(组④),但不能在以淀粉为唯一碳源的培养基上生长(组③)。
4.(2025·贵州卷,15)金龟子绿僵菌(Ma)是一种昆虫病原真菌,可以侵染某些农林害虫。Ma寄生时其孢子(单细胞后代)萌发后侵入昆虫体内大量增殖并产生毒素,导致寄主僵化、死亡。下列叙述错误的是(　　)
A.可利用Ma开发成微生物杀虫剂
B.为分离Ma可从研磨的僵虫组织中取样
C.稀释涂布平板法可用于分离样品中的Ma
D.接种培养Ma时使用的器具需消毒
【答案】 D
【解析】 微生物培养中,接种环等直接接触菌种的器具需严格灭菌(如灼烧灭菌),而非仅消毒,消毒无法彻底杀灭微生物的芽孢或孢子。
5.(2024·全国甲卷,37节选)合理使用消毒液有助于减少传染病的传播。某同学比较了3款消毒液A、B、C杀灭细菌的效果,结果如图所示。回答下列问题。
(1)该同学采用显微镜直接计数法和菌落计数法分别测定同一样品的细菌数量,发现测得的细菌数量前者大于后者,其原因是 　。
(2)该同学从100 mL细菌原液中取1 mL加入无菌水中得到10 mL稀释菌液,再从稀释菌液中取200 μL涂布平板,菌落计数的结果为100,据此推算细菌原液中细菌浓度为
　　　　　个/mL。
(3)菌落计数过程中,涂布器应先在酒精灯上灼烧,冷却后再涂布。灼烧的目的是
　 , 冷却的目的是　 。
(4)据图可知杀菌效果最好的消毒液是　　　　,判断依据是　
　(答出两点即可)。
【答案】 (1)前者微生物分散的活菌和死菌一起计数,后者存在两个或多个活菌连在一起形成一个菌落的情况且只计数活菌
(2)5 000
(3)杀死涂布器上可能存在的微生物,防止污染　防止温度过高杀死菌种
(4)A　A消毒液活菌数减少量最多,且减少得最快,效率最高
【解析】 (1)显微镜直接计数法把死菌和活菌一起计数。菌落计数法只计数活菌数,还可能存在两个或多个活菌形成一个菌落的情况,故前者的数量大于后者。
(2)从100 mL细菌原液中取1 mL加入无菌水中得到10 mL稀释菌液,即稀释了10倍,细菌原液中细菌浓度=(菌落数÷菌液体积)×稀释倍数=(100÷0.2)×10=5 000(个/mL)。
(3)菌落计数过程中,涂布器应先在酒精灯上灼烧,冷却后再涂布。灼烧的目的是杀死涂布器上可能存在的微生物,防止污染,冷却的目的是防止温度过高杀死菌种。
(4)A消毒液活菌数减少量最多,且减少得最快,效率最高,因此A消毒液杀菌效果最好。
(时间:15分钟)
1.(2025·辽宁本溪一模)防止杂菌污染,获得纯净的微生物培养物是研究和应用微生物的前提,也是发酵工程的重要基础。下列相关说法正确的是(　　)
A.只有在固体培养基表面才能生长出微生物菌落
B.固体培养基在高压蒸汽灭菌后应迅速倒平板,以防止凝固
C.为了涂布均匀,涂布时可转动培养皿,涂布后立刻将培养皿倒置,放入培养箱中培养
D.耐高温和需要保持干燥的物品,可以采用干热灭菌法,如玻璃器皿
【答案】 D
【解析】 微生物在固体培养基或半固体培养基表面或内部生长,可以形成肉眼可见的菌落;灭菌后,待培养基冷却至50 ℃左右时再倒平板;应待涂布的菌液被培养基吸收后,再将平板倒置;耐高温和需要保持干燥的物品,如玻璃器皿、金属用具等,可以采用干热灭菌法。
2.(2025·江苏南通调研)平板划线法和稀释涂布平板法是分离、纯化微生物的常用方法,下列相关叙述错误的是(　　)
A.两种方法都能将菌体分散到培养基上,培养获得单菌落
B.涂布器和接种环均可采用干热灭菌和灼烧灭菌
C.完成划线和涂布后,都要等菌液被培养基吸收后再倒置培养
D.两种方法获得的菌落都是由单个微生物繁殖形成的
【答案】 D
【解析】 平板划线法和稀释涂布平板法都能获得由单个细胞繁殖而成的单菌落;玻璃器皿(如吸管、培养皿等)、金属用具等可以采用干热灭菌,涂布器、接种环、接种针或其他金属用具可采用灼烧灭菌,可见涂布器和接种环均可采用干热灭菌和灼烧灭菌;采用平板划线法划线或稀释涂布平板法涂布后,都要等菌液被培养基吸收后再倒置培养;由于两个或多个细胞连在一起时肉眼观察到的只是一个菌落,故平板划线法和稀释涂布平板法两种方法获得的单菌落不一定是由单个微生物繁殖形成的。
3.(2026·甘肃庆阳模拟)滤膜法是检测水样中大肠杆菌的常用方法。100 mL待测水样经滤膜后,将滤膜贴于伊红—亚甲蓝琼脂培养基上(主要成分含蛋白胨、乳糖),长出5个菌落。下列叙述正确的是(　　)
A.1 L 待测水样中的大肠杆菌数目为50个
B.蛋白胨主要为大肠杆菌提供氮源和维生素
C.用该方法统计菌落数目时,不需要设置对照组
D.将完成过滤之后的滤膜贴于培养基上的过程称为接种
【答案】 D
【解析】 将100 mL待测水样经滤膜后,将滤膜贴于伊红—亚甲蓝琼脂培养基上(主要成分含蛋白胨、乳糖),水样中的各种细菌都可以在该培养基上生长,因此长出5个菌落无法判断其中有多少个菌落是大肠杆菌的,故无法计算出大肠杆菌数目;蛋白胨可以为大肠杆菌提供氮源、碳源和维生素;用该方法统计菌落数目时,为了检测培养基是否被污染等情况,需要设置对照组;过滤后水样中的细菌留在滤膜上,因此完成过滤之后的滤膜紧贴在培养基上,这属于微生物培养中的接种。
4.(2025·河北沧州三模)增塑剂DEHP(化学式为C24H38O4)在塑料制品方面使用广泛,但残留于土壤中的DEHP不易被降解。科研人员已从土壤中筛选出能降解DEHP的细菌。下列叙述错误的是(　　)
A.培养基的pH一般调至中性或弱碱性
B.筛选培养基中以DEHP为唯一的碳源
C.接种环和培养皿等均可采用灼烧灭菌法灭菌
D.对筛选出的降解菌可用液体培养基扩大培养
【答案】 C
【解析】 细菌培养通常需要中性或弱碱性的环境,因此培养基的pH一般调至中性或弱碱性;筛选培养基需以DEHP为唯一碳源,仅允许能分解DEHP的细菌生长,从而实现选择培养;接种环可通过灼烧灭菌法灭菌,但培养皿需用干热灭菌法灭菌;液体培养基可为菌种生长繁殖提供充足的营养,能快速扩大菌种数量,便于后续实验或保存,因此可用液体培养基扩大培养降解菌。
5.(2024·湖南卷,6)微生物平板划线和培养的具体操作如图所示,下列操作正确的是(　　)
A.①②⑤⑥ B.③④⑥⑦
C.①②⑦⑧ D.①③④⑤
【答案】 D
【解析】 由题图可知,②中拔出棉塞后应握住棉塞上部;⑥中划线时不能将培养皿的皿盖完全打开,应只打开一条缝隙;⑦中划线时第5次的划线不能与第1次的划线相连;⑧中平板应倒置培养。
6.(2025·贵州贵阳一模)鸡蛋表面附着的细菌会逐渐侵入蛋内,缩短鸡蛋保质期。对某养鸡场不同季节及不同养殖模式下生产的鸡蛋取样,按每克鸡蛋用1 mL无菌生理盐水清洗鸡蛋表面,收集清洗液,用稀释涂布平板法接种、培养后计数结果如下表。下列相关叙述正确的是(　　)
季节 菌落数/(个·g-1)
半封闭式养殖模式 全封闭式养殖模式
夏季 3.92×104 7.24×103
冬季 7.60×104 1.24×104
A.可用煮沸消毒法清理鸡蛋表面的细菌
B.若接种菌液体积为0.1 mL,则表中数据是对清洗液稀释1×102倍后获得的
C.比较两种养殖模式可知鸡蛋表面的细菌主要来自环境
D.稀释涂布平板法所得活菌数比实际结果要小,可用显微镜计数法直接测活菌数
【答案】 C
【解析】 本实验需要研究不同季节不同养殖模式下鸡蛋表面的细菌数量,若用煮沸消毒法清理鸡蛋表面的细菌,则无法得出实验数据;稀释涂布平板法涂布的菌液体积为0.1 mL,菌落数为30～300的平板适于计数,根据题表中数据分析,半封闭式养殖模式对清洗液稀释1×102倍后涂布,全封闭式养殖模式对清洗液稀释1×101倍后涂布;半封闭式养殖模式下的鸡蛋表面菌落数明显高于全封闭式养殖模式,这说明环境中的细菌更容易污染鸡蛋表面;由于两个或多个细胞可能聚集在一起形成一个菌落,因此稀释涂布平板法得到的鸡蛋表面菌落数比实际数略少,用显微镜计数法直接测定时测定的是死菌和活菌的总数,要想测活菌数需要进行一定的处理,如染色。
7.(2025·江西南昌三模)细菌X合成的tcel蛋白和tcil蛋白使其在与其他细菌的竞争中占优势,其中tcel蛋白是一种有毒性的分泌蛋白。研究人员利用野生型细菌X及其不同突变体进行了如下实验:在固体培养基表面放置一张能隔离细菌的滤膜,将一种菌(下层菌)滴加在滤膜上后再放置第二张滤膜,滴加等量的另一种菌(上层菌),共同培养后,对上、下层菌计数得到的结果如图所示。下列叙述正确的是(　　)
A.实验中的培养皿、固体培养基和滤膜均需要进行消毒处理
B.研究上、下层菌竞争指数可以用显微镜计数法对收集的滤膜菌体直接计数
C.由甲、乙、丙三组结果可推测tcil蛋白能够中和tcel蛋白的毒性
D.野生型细菌X在与tceltcil双突变体和tcel突变体的竞争中均占优势
【答案】 C
【解析】 为避免杂菌的污染,实验中的滤膜、培养皿、固体培养基等均需灭菌处理;对活菌进行计数的方法是稀释涂布平板法,不能用显微镜直接计数法,因为显微镜直接计数不能区分死菌与活菌,无法研究上、下层菌竞争指数;tcel蛋白是一种有毒性的分泌蛋白,乙组中野生型可产生tcel蛋白作用于tceltcil双突变体,后者无法产生tcil蛋白中和tcel蛋白的毒性,使野生型细菌在竞争中占据优势,而在丙组中,野生型可产生tcel蛋白作用于tcel突变体,后者可以产生tcil蛋白中和tcel蛋白的毒性,使野生型的生长受到抑制,由此推测,tcil蛋白能够中和tcel蛋白的毒性;由甲组、乙组实验结果可知,野生型细菌X在与tceltcil双突变体的竞争中占优势,由甲组、丙组实验结果可知,野生型细菌X在与tcel突变体的竞争中不占优势。
8.(2025·辽宁沈阳三模)为提高作物产量,种植业常施用大量的氮肥,既增加了生产成本,又易造成环境污染。固氮菌能固定氮气,为植物生长提供充足的氮元素,常见的固氮菌有根瘤菌和圆褐固氮菌等。科研人员进行了土壤中自生固氮菌的分离和固氮能力测定的研究,部分实验流程如下图所示。以下叙述正确的是(　　)
A.根瘤菌与豆科植物共生后才能固氮,其合成固氮酶所需的核糖体和氨基酸均来源于植物细胞
B.圆褐固氮菌能在不加氮源的培养基中生长,说明圆褐固氮菌为自养生物
C.将土壤悬浮液用无菌水梯度稀释后涂布到含青霉素的选择培养基上,进行多次纯化
培养
D.若④统计的菌落数分别是132、136、128,则每克土壤中含有的固氮菌约为1.32×107个
【答案】 D
【解析】 固氮酶是根瘤菌自身合成的,其合成所需的核糖体和氨基酸来源于根瘤菌自身;自养生物是指能利用无机碳源(如CO2)合成有机物的生物,而异养生物需要现成的有机物,圆褐固氮菌的碳源是现成的有机物(如葡萄糖),说明圆褐固氮菌为异养生物;将土壤悬浮液用无菌水梯度稀释后涂布到不含氮素的培养基上,可以起到纯化圆褐固氮菌、抑制其他微生物生长的作用;若④统计的菌落数分别是132、136、128,根据计算公式(C÷V×M),④的稀释倍数为104,则每克土壤中含固氮菌约为(132+136+128)÷3÷0.1×104=1.32×107(个)。第50讲　微生物的培养技术及应用
(时间:15分钟)
1.(2025·辽宁本溪一模)防止杂菌污染,获得纯净的微生物培养物是研究和应用微生物的前提,也是发酵工程的重要基础。下列相关说法正确的是(　　)
A.只有在固体培养基表面才能生长出微生物菌落
B.固体培养基在高压蒸汽灭菌后应迅速倒平板,以防止凝固
C.为了涂布均匀,涂布时可转动培养皿,涂布后立刻将培养皿倒置,放入培养箱中培养
D.耐高温和需要保持干燥的物品,可以采用干热灭菌法,如玻璃器皿
2.(2025·江苏南通调研)平板划线法和稀释涂布平板法是分离、纯化微生物的常用方法,下列相关叙述错误的是(　　)
A.两种方法都能将菌体分散到培养基上,培养获得单菌落
B.涂布器和接种环均可采用干热灭菌和灼烧灭菌
C.完成划线和涂布后,都需等菌液被培养基吸收后再倒置培养
D.两种方法获得的菌落都是由单个微生物繁殖形成的
3.(2026·甘肃庆阳模拟)滤膜法是检测水样中大肠杆菌的常用方法。100 mL待测水样经滤膜后,将滤膜贴于伊红—亚甲蓝琼脂培养基上(主要成分含蛋白胨、乳糖),长出5个菌落。下列叙述正确的是(　　)
A.1 L 待测水样中的大肠杆菌数目为50个
B.蛋白胨主要为大肠杆菌提供氮源和维生素
C.用该方法统计菌落数目时,不需要设置对照组
D.将完成过滤之后的滤膜贴于培养基上的过程称为接种
4.(2025·河北沧州三模)增塑剂DEHP(化学式为C24H38O4)在塑料制品方面使用广泛,但残留于土壤中的DEHP不易被降解。科研人员已从土壤中筛选出能降解DEHP的细菌。下列叙述错误的是(　　)
A.培养基的pH一般调至中性或弱碱性
B.筛选培养基中以DEHP为唯一的碳源
C.接种环和培养皿等均可采用灼烧灭菌法灭菌
D.对筛选出的降解菌可用液体培养基扩大培养
5.(2024·湖南卷,6)微生物平板划线和培养的具体操作如图所示,下列操作正确的是(　　)
A.①②⑤⑥ B.③④⑥⑦
C.①②⑦⑧ D.①③④⑤
6.(2025·贵州贵阳一模)鸡蛋表面附着的细菌会逐渐侵入蛋内,缩短鸡蛋保质期。对某养鸡场不同季节及不同养殖模式下生产的鸡蛋取样,按每克鸡蛋用1 mL无菌生理盐水清洗鸡蛋表面,收集清洗液,用稀释涂布平板法接种、培养后计数结果如下表。下列相关叙述正确的是(　　)
季节 菌落数/(个·g-1)
半封闭式养殖模式 全封闭式养殖模式
夏季 3.92×104 7.24×103
冬季 7.60×104 1.24×104
A.可用煮沸消毒法清理鸡蛋表面的细菌
B.若接种菌液体积为0.1 mL,则表中数据是对清洗液稀释1×102倍后获得的
C.比较两种养殖模式可知鸡蛋表面的细菌主要来自环境
D.稀释涂布平板法所得活菌数比实际结果要小,可用显微镜计数法直接测活菌数
7.(2025·江西南昌三模)细菌X合成的tcel蛋白和tcil蛋白使其在与其他细菌的竞争中占优势,其中tcel蛋白是一种有毒性的分泌蛋白。研究人员利用野生型细菌X及其不同突变体进行了如下实验:在固体培养基表面放置一张能隔离细菌的滤膜,将一种菌(下层菌)滴加在滤膜上后再放置第二张滤膜,滴加等量的另一种菌(上层菌),共同培养后,对上、下层菌计数得到的结果如图所示。下列叙述正确的是(　　)
A.实验中的培养皿、固体培养基和滤膜均需要进行消毒处理
B.研究上、下层菌竞争指数可以用显微镜计数法对收集的滤膜菌体直接计数
C.由甲、乙、丙三组结果可推测tcil蛋白能够中和tcel蛋白的毒性
D.野生型细菌X在与tceltcil双突变体和tcel突变体的竞争中均占优势
8.(2025·辽宁沈阳三模)为提高作物产量,种植业常施用大量的氮肥,既增加了生产成本,又易造成环境污染。固氮菌能固定氮气,为植物生长提供充足的氮元素,常见的固氮菌有根瘤菌和圆褐固氮菌等。科研人员进行了土壤中自生固氮菌的分离和固氮能力测定的研究,部分实验流程如下图所示。以下叙述正确的是(　　)
A.根瘤菌与豆科植物共生后才能固氮,其合成固氮酶所需的核糖体和氨基酸均来源于植物
细胞
B.圆褐固氮菌能在不加氮源的培养基中生长,说明圆褐固氮菌为自养生物
C.将土壤悬浮液用无菌水梯度稀释后涂布到含青霉素的选择培养基上,进行多次纯化培养
D.若④统计的菌落数分别是132、136、128,则每克土壤中含有的固氮菌约为1.32×107个第50讲　微生物的培养技术及应用
课标 要求 1.阐明在发酵工程中灭菌是获得纯净的微生物培养物的前提。 2.阐明无菌技术是在操作过程中,保持无菌物品与无菌区域不被微生物污染的技术。 3.举例说明通过调整培养基的配方可有目的地培养某种微生物。 4.概述平板划线法和稀释涂布平板法是实验室中进行微生物分离和纯化的常用方法。 5.概述稀释涂布平板法和显微镜计数法是测定微生物数量的常用方法。
考情 分析 1.微生物的基本培养技术 2025·江苏卷,11;2024·湖南卷,6;2023·河北卷,12
2.微生物的选择培养和计数 2025·四川卷,8;2025·湖南卷,5;2025·山东卷,15;2025·黑吉辽内蒙古卷,4;2025·河北卷,18;2024·江西卷,17;2024·黑吉辽卷,19;2024·重庆卷,13;2024·全国甲卷,37;2023·山东卷,15;2023·广东卷,10;2023·北京卷,16;2023·辽宁卷,9
考点一　微生物的基本培养技术
1.培养基的配制
(1)培养基的概念、种类和用途。
(2)培养基的配方。
①主要营养物质:水、　　　　、氮源、　 。
②其他条件:pH、　　　　 　　　　和氧气。
微生物 乳酸杆菌 霉菌 细菌 厌氧微 生物
特殊 需求 添加 　　 pH调 至　 pH调至 　　　 　　　 无氧
提醒　固体培养基常用于微生物的分离与鉴定、活菌计数、保藏菌种;液体培养基常用于工业生产、微生物的扩大培养。
2.无菌技术
提醒　选择无菌技术的原则:一要考虑无菌技术的效果,灭菌的效果比消毒要好;二要考虑操作对象的承受能力,活体生物材料、操作者的手等只能采用消毒,而不能用灭菌。
3.微生物的纯培养
(1)概念辨析。
(2)酵母菌纯培养的操作步骤。
提醒　培养基冷却凝固后平板要倒置,既可避免培养基表面的水分过快地挥发,又可防止皿盖上的水珠落入培养基,造成污染。
(3)平板划线法的具体操作。
1.(选择性必修3 P10旁栏思考)培养基中加入氮源的原因是 　。
2.(选择性必修3 P10相关信息)生物消毒法是指利用　　　　　　　　　　除去环境中的部分微生物的方法。
【判断正误】
(1)(2025·四川卷,5)利用土豆匀浆制备的培养基,可用于酵母菌的培养。(　　)
(2)(2024·河北卷,13)将配制的酵母培养基煮沸并冷却后,在酒精灯火焰旁倒平板。(　　)
(3)(2024·河北卷,13)将接种环烧红,迅速蘸取酵母菌液在培养基上划线培养,获得单菌落。(　　)
(4)(2023·山东卷,15)不含氮源的平板不能用于微生物培养。(　　)
(5)(2023·山东卷,15)平板涂布时涂布器使用前必须进行消毒。(　　)
(6)(2022·湖北卷,4)微生物、动物细胞培养基中需添加一定量的抗生素以防止污染。(　　)
考向1　围绕培养基的配制及无菌技术,培养理解能力
1.(2025·江苏南通一模)解钾菌通过生物降解作用可将土壤中难溶性钾盐转化为可溶态钾素。如下表所示为科研团队基于厨余垃圾发酵液特性研发的专用培养基组成,该配方旨在高效分离筛选具有解钾功能的优势菌株。下列相关叙述正确的是(　　)
成分 钾长石粉 蔗糖 Na2HPO4 CaCO3
含量/(g·L-1) 10 10 2 1
成分 (NH4)2SO4 NaCl 酵母膏 MgSO4·7H2O
含量/(g·L-1) 1 0.1 0.5 0.5
A.培养基中的钾长石粉属于可溶性钾,为目的菌提供无机盐
B.按表中配方配制好的培养基应先灭菌再将pH调至弱碱性
C.厨余垃圾发酵液梯度稀释后涂布于选择培养基表面倒置培养
D.应选择透明圈直径与菌落直径比值较小的菌落进一步进行纯化
几种微生物的营养和能量来源
微生物 碳源 氮源 能源
蓝细菌 CO2 N、N等 光能
硝化细菌 CO2 NH3 NH3的氧化
根瘤菌 糖类等有机物 N2 有机物
酵母菌 糖类、蛋白质等有机物 蛋白质等 有机物
2.(2025·陕西渭南三模)无菌技术是微生物培养获得纯净培养物的关键。为避免杂菌污染,常采用高压蒸汽灭菌法等对培养基进行灭菌。接种、倒平板等环节也都要防止杂菌的污染。下列相关叙述正确的是(　　)
A.某些微生物能以无机物作为碳源,也能以无机物作为能源
B.消毒和灭菌都是指用强烈的理化方法杀死物体内外所有微生物
C.将要培养的微生物接种至培养基后,应立即放入高压蒸汽灭菌锅中
D.为保证超净工作台无菌,接种操作时应打开紫外灯
常见物品的消毒或灭菌方法
(1)消毒方法及适用对象。
(2)灭菌方法及适用对象。
考向2　围绕微生物的纯培养方法及应用,考查综合运用能力
3.(2025·江苏卷,11)从种植草莓的土壤中分离致病菌,简易流程如下:制备土壤悬液、分离、纯化、鉴定。下列相关叙述正确的是(　　)
A.制备的培养基可用紫外线照射进行灭菌
B.将土样加入无菌水混匀,梯度稀释后取悬液加入平板并涂布
C.连续划线时,接上次划线的起始端开始划线
D.鉴定后的致病菌,可接种在斜面培养基上,并在室温下长期保存
平板划线操作中灼烧接种环的目的
第一次划线前灼烧 每次划线前灼烧(第二次及以后) 划线结束后灼烧
避免接种环上可能存在的微生物污染培养物 杀死上一次划线结束后接种环上残留的菌种,使每次划线的菌种均来自上一次划线的末端 杀死接种环上残留的菌种,避免菌种污染环境和感染操作者
4.(2025·广东汕头模拟)生食海鲜易引发副溶血性弧菌食物中毒。为开发天然抑菌剂,研究者先制备海鲜样液,在某培养基中划线接种得到该菌(图中蓝绿色菌落)。下列叙述正确的是(　　)
A.海鲜样液需多次稀释后才能划线接种
B.划线接种时,接种环使用前须进行消毒
C.只有第一次划线前需要蘸取海鲜样液
D.结果显示单菌落太多不能达到纯培养目的
考点二　微生物的选择培养和计数
1.选择培养基
提醒　缺少氮源的培养基可以筛选能利用大气中N2的微生物;无有机碳源的培养基可筛选出自养微生物。
2.稀释涂布平板法
(1)系列稀释操作。
取1 mL菌液加入盛有9 mL无菌水的试管中,依次等比稀释。
(2)涂布平板操作。
3.微生物的数量测定
项目 稀释涂布平板法(间接计数法) 显微镜直接计数法
原理 当样品的　　　　　　　　　　,培养基表面生长的一个单菌落,来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的　　 　,就能推测出样品中大约含有多少活菌 利用特定的　　　　　　　　　　,在显微镜下观察、计数,然后再计算一定体积的样品中微生物的数量
计算 方法 在同一稀释度下,应至少对3个平板进行重复计数,然后求出　　　　,则每克样品中的菌落数= (C÷V)×M,C:某稀释度下平板上生长的平均菌落数,V:涂布平板时所用的稀释液的体积(mL), M:稀释倍数 每毫升原液所含细菌数=每小格内平均细菌数×400×104×稀释倍数
缺点 当两个或多个细胞连在一起时,平板上观察到的只是　　　　　 不能区分　　　　　　　
结果 比实际值偏　 比实际值偏　　
提醒　显微镜直接计数法本身不能区分细菌的死活,但是通过一定的辅助处理,可以实现活菌计数,如在计数前用台盼蓝染液进行染色,可以通过统计无色细胞的个数来对活菌进行计数。
1.(选择性必修3 P18相关信息)血细胞计数板和细菌计数板的主要区别是
　 。
4.土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
(1)实验原理。
(2)操作步骤。
(3)实验结果分析与评价。
2.(选择性必修3 P18~19探究·实践拓展)利用稀释涂布平板法纯化分解尿素的细菌时,经培养后发现培养基上出现多种菌落,可能的原因有
　。
【判断正误】
(1)(2024·天津卷,8)根据菌落外表特征可以判断在尿素为唯一氮源的培养基上生长的尿素降解菌是否有不同种类。(　　)
(2)(2024·浙江6月选考,14)产脲酶细菌可在以NH4Cl为唯一氮源的培养基上生长繁殖。(　　)
(3)(2023·江苏卷,7)血细胞计数板既可用于酵母菌的数量测定,也可用于细菌的数量测定。(　　)
(4)(2022·江苏卷,3)某同学欲分离高产脲酶菌,可用尿素作为唯一氮源的选择培养基获得。(　　)
(5)(2021·浙江6月选考,17)稀释涂布平板法和平板划线法均能得到单菌落,都可用于细菌计数。(　　)
(6)(2020·浙江7月选考,19)利用尿素固体培养基可迅速杀死其他微生物,而保留利用尿素的微生物。(　　)
考向3　围绕微生物的选择培养,考查科学探究
5.(2025·黑吉辽内蒙古卷,4)科研人员通过稀释涂布平板法筛选出高耐受且降解金霉素(C22H23ClN2O8)能力强的菌株,旨在解决金霉素过量使用所导致的环境污染问题。下列叙述错误的是(　　)
A.以金霉素为唯一碳源可制备选择培养基
B.逐步提高培养基中金霉素的浓度有助于获得高耐受的菌株
C.配制选择培养基时,需确保pH满足实验要求
D.用接种环将菌液均匀地涂布在培养基表面
6.(2025·湖北襄阳模拟)高温淀粉酶在大规模工业生产中有很大的实用性。研究者从热泉中筛选高效产生高温淀粉酶的嗜热菌,其筛选过程如图1所示。将得到的菌悬液转接于同时含有葡萄糖和淀粉作碳源的固体培养基上培养,得到若干菌落后用碘液进行显色处理,看到如图2所示情况。下列选项错误的是(　　)
A.过程①②合称为稀释涂布平板法
B.甲乙试管中的液体均为选择培养基
C.Ⅱ号培养基上的接种方法为平板划线法
D.图2中周围不显蓝色的菌落含有所需菌种
考向4　围绕微生物的分离与计数,考查科学思维和科学探究
7.(2025·四川卷,8)微塑料由塑料废弃物风化形成,难以降解,会危害生态环境和人体健康。有人分离到X和Y两种微塑料降解菌,将总菌量相同的X、Y、X+Y(X∶Y=1∶1)分别接种于含有等量微塑料的蛋白胨液体培养基中,培养一段时间后测定微塑料的残留率(残留率=剩余量/添加量×100%),结果如下图。下列叙述正确的是(　　)
A.用平板划线法能测定X菌组中的活菌数
B.Y菌组微塑料残留率较高,故菌浓度也高
C.混合菌种对微塑料的降解能力高于单一菌种
D.能在该培养基中生长繁殖的微生物都能降解微塑料
8.(2025·山东济宁三模)我国科学家采集了某深海冷泉附近的沉积物样品,从中筛选出能在无氧环境中降解藻类多糖(纤维素、淀粉、木聚糖等)的拟杆菌菌株,进一步筛选获得了高耐受藻类多糖的菌株,并进行了计数,主要过程如图所示。下列叙述错误的是(　　)
A.转接后需在低温无氧条件下培养
B.②中需加入适量琼脂等凝固剂
C.③中藻类多糖的含量明显高于②
D.③中拟杆菌密度为2.2×106个·mL-1
理解计数时设置对照和重复的目的
比较 项目 对照 重复
目的 排除非测试因素对实验结果的影响 排除偶然因素对实验结果的影响
实例 空白对照:确定培养基制作是否合格 同一稀释度涂布至少3个平板
1.(2025·湖南卷,5)采集果园土壤进行微生物分离或计数。下列叙述正确的是(　　)
A.稀释涂布平板法和平板划线法都能用于尿素分解菌的分离和计数
B.完成平板划线后,培养时需增加一个未接种的平板作为对照
C.土壤中分离得到的醋酸菌能在无氧条件下将葡萄糖分解成乙酸
D.用于筛选尿素分解菌的培养基含有蛋白胨、尿素和无机盐等营养物质
2.(2025·河北卷,18改编)隐甲藻是一种好氧的异养真核微藻,多在海水中腐烂的植物叶片上生长繁殖,是工业生产DHA(一种功能性脂肪酸)的藻类之一。从海洋中筛选获得的高产油脂隐甲藻,可用于DHA的发酵生产。下列叙述错误的是(　　)
A.隐甲藻可从腐烂的叶片获得生长必需的碳源
B.采集海水中腐烂的叶片,湿热灭菌后接种到固体培养基,以获得隐甲藻
C.选择培养基中可加入抑制细菌生长的抗生素,以减少杂菌生长
D.适当提高发酵时的通气量和搅拌速率均可增加溶氧量,以提高DHA产量
3.(2025·山东卷,15)深海淤泥中含有某种能降解纤维素的细菌。探究不同压强下,该细菌在以纤维素或淀粉为唯一碳源的培养基上的生长情况。其他条件相同且适宜,实验处理及结果如下表所示。下列说法正确的是(　　)
组别 压强 纤维素 淀粉 菌落
① 常压 - + -
② 常压 + - -
③ 高压 - + -
④ 高压 + - +
注:“+”表示有;“-”表示无。
A.可用平板划线法对该菌计数
B.制备培养基的过程中,应先倒平板再进行高压蒸汽灭菌
C.由②④组可知,在以纤维素为唯一碳源的培养基上,该菌可在常压下生长
D.由③④组可知,高压下该菌不能在以淀粉为唯一碳源的培养基上生长
4.(2025·贵州卷,15)金龟子绿僵菌(Ma)是一种昆虫病原真菌,可以侵染某些农林害虫。Ma寄生时其孢子(单细胞后代)萌发后侵入昆虫体内大量增殖并产生毒素,导致寄主僵化、死亡。下列叙述错误的是(　　)
A.可利用Ma开发成微生物杀虫剂
B.为分离Ma可从研磨的僵虫组织中取样
C.稀释涂布平板法可用于分离样品中的Ma
D.接种培养Ma时使用的器具需消毒
5.(2024·全国甲卷,37节选)合理使用消毒液有助于减少传染病的传播。某同学比较了3款消毒液A、B、C杀灭细菌的效果,结果如图所示。回答下列问题。
(1)该同学采用显微镜直接计数法和菌落计数法分别测定同一样品的细菌数量,发现测得的细菌数量前者大于后者,其原因是
　。
(2)该同学从100 mL细菌原液中取1 mL加入无菌水中得到10 mL稀释菌液,再从稀释菌液中取200 μL涂布平板,菌落计数的结果为100,据此推算细菌原液中细菌浓度为　　　　个/mL。
(3)菌落计数过程中,涂布器应先在酒精灯上灼烧,冷却后再涂布。灼烧的目的是
　,
冷却的目的是　 。
(4)据图可知杀菌效果最好的消毒液是　　　　,判断依据是　
　(答出两点即可)。

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