资源简介

第54讲　基因工程的基本工具和基本操作程序
课标 要求 1.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。 2.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测鉴定等步骤。 3.活动:DNA的提取和鉴定。 4.活动:利用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段并完成电泳鉴定,或运用软件进行虚拟PCR实验。
考情 分析 1.重组DNA技术的基本工具 2025·江苏卷,19;2024·江西卷,12;2023·新课标卷,6
2.基因工程的基本操作程序 2025·广东卷,7;2025·安徽卷,15、20;2025·陕晋青宁卷,21;2025·山东卷,25;2025·浙江1月选考,24;2025·甘肃卷,21;2024·广东卷,21;2024·重庆卷,19;2024·湖南卷,21;2024·甘肃卷,21;2024·安徽卷,20;2024·河北卷,22;2024·山东卷,25;2024·黑吉辽卷,25;2023·湖北卷,4;2023·广东卷,20
3.DNA的粗提取与鉴定 2024·安徽卷,14;2024·河北卷,13;2024·山东卷,13;2023·广东卷,11
4.DNA片段的扩增及电泳鉴定 2025·江苏卷,23;2025·全国卷,6;2024·浙江6月选考,20;2024·江西卷,19;2024·黑吉辽卷,7;2023·江苏卷,22
考点一　基因工程的基本工具
1.基因工程的概念
2.基因工程的基本工具
(1)限制性内切核酸酶(也称“限制酶”)。
1.(选择性必修3 P71正文拓展)将一个基因从DNA分子上切割下来需要切割两处,同时产生四个黏性末端或平末端。
2.(选择性必修3 P71正文拓展)限制酶主要来源于原核生物,不能切割自身的DNA分子的原因可能是限制酶具有特异性,即一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列,并在特定位点进行切割。原核生物DNA分子中不存在自身限制酶的识别序列,或其识别序列已被修饰。
(2)DNA连接酶。
3.(选择性必修3 P72正文拓展)DNA连接酶和DNA聚合酶功能的区别是DNA连接酶连接的是两个DNA片段,而DNA聚合酶是把单个的脱氧核苷酸连接到已有的DNA片段上;DNA聚合酶起作用时需要以一条DNA链为模板,而DNA连接酶不需要模板。
(3)载体。
【判断正误】
(1)(2024·贵州卷,13)使用不同的限制酶也能产生相同的黏性末端。(　　)
【答案】 √
(2)(2021·辽宁卷,3)基因工程中常用噬菌体转化植物细胞。(　　)
【答案】 ×
【提示】 基因工程中常用农杆菌转化植物细胞,农杆菌的特点是其细胞内的Ti质粒上的T-DNA片段能够转移至受体细胞,并整合到受体细胞的染色体DNA上,噬菌体一般用于细菌的转化。
(3)(经典高考题)一种限制性内切核酸酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列。(　　)
【答案】 √
(4)(经典高考题)限制性内切核酸酶能识别和切割RNA。(　　)
【答案】 ×
【提示】 限制性内切核酸酶只能识别和切割DNA,不能识别和切割RNA。
(5)(经典高考题)限制性内切核酸酶可从原核生物中提取。(　　)
【答案】 √
考向1　分析基因工程的基本工具,考查科学思维
1.(2024·湖南卷,5)某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时,发现DNA完全没有被酶切,分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是(　　)
A.限制酶失活,更换新的限制酶
B.酶切条件不合适,调整反应条件如温度和酶的用量等
C.质粒DNA突变导致酶识别位点缺失,更换正常质粒DNA
D.酶切位点被甲基化修饰,换用对DNA甲基化不敏感的限制酶
【答案】 B
【解析】 限制酶失活会使DNA完全不被酶切,此时应更换新的限制酶;酶切条件不合适可能使酶失活,无法发挥作用,应调整反应条件如温度和pH等,调整酶的用量没有作用;质粒DNA突变会导致限制酶识别位点缺失,进而造成限制酶无法进行切割,此时应更换为正常质粒DNA;质粒DNA上酶切位点被甲基化修饰,会导致对DNA甲基化敏感的限制酶无法进行酶切,此时应换用对DNA甲基化不敏感的限制酶。
2.(2025·湖北名校调研)如图是利用基因工程技术培育抗除草剂作物的部分过程,其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ为四种限制酶,且切割DNA分子后形成的末端均不同。下列说法正确的是(　　)
A.图示质粒分子在SmaⅠ切割前后分别含有0和1个游离的磷酸基团
B.培育抗除草剂作物的核心是将含bar基因的表达载体导入受体细胞
C.可选用PstⅠ和EcoRⅠ切割质粒和含bar基因的DNA片段,确保目的基因正确插入
D.利用PCR技术可从分子水平检测bar基因是否翻译出抗除草剂蛋白
【答案】 C
【解析】 质粒为环状DNA,切割前没有游离的磷酸基团,切割后形成线性DNA,含2个游离的磷酸基团;基因工程的核心是构建基因表达载体;用PstⅠ和EcoRⅠ切割可避免质粒自身环化及与目的基因反向连接;应用抗原—抗体杂交法来检测bar基因是否翻译出相应蛋白质。
考点二　基因工程的基本操作程序
1.目的基因的筛选与获取
(1)筛选合适的目的基因。
①目的基因:在基因工程的设计和操作中,用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。主要是指编码蛋白质的基因。
②筛选方法:从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。
(2)利用PCR获取和扩增目的基因。
①原理:DNA半保留复制。
②条件。
参与的组分 在DNA复制中的作用
解旋酶(体外 用高温代替) 打开DNA双链
DNA母链 提供DNA复制的模板
4种脱氧 核苷酸 合成DNA子链的原料
耐高温的 DNA聚合酶 催化合成DNA子链
引物 使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸
③过程。
④结果:上述三步反应完成后,一个DNA分子就变成了两个DNA分子,随着循环次数的增多,DNA分子以指数形式增加。
1.(选择性必修3 P78～79图3-5拓展)PCR反应过程中,引物非常关键。PCR技术需要引物是因为DNA聚合酶不能从头开始合成DNA,只能从DNA链的3′端延伸DNA链;利用PCR技术扩增目的基因时,需要两种引物的原因是目的基因的两条反向平行的链都作为模板,其碱基序列不同。
2.基因表达载体的构建——基因工程的核心
(1)构建基因表达载体的目的。
①使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且遗传给下一代。
②使目的基因能够表达和发挥作用。
(2)基因表达载体的组成。
提醒　启动子、终止子、起始密码子、终止密码子比较
项目 启动子 终止子 起始 密码子 终止 密码子
本质 DNA DNA mRNA mRNA
位置 目的基因 上游 目的基因 下游 mRNA 首端 mRNA 尾端
功能 RNA聚合酶识别和结合的部位,驱动基因转录出mRNA 使转录在所需要的地方停下来 翻译的起始信号(编码氨基酸) 翻译的结束信号(正常情况下,不编码氨基酸)
(3)基因表达载体的构建过程。
2.(选择性必修3 P80图3-6拓展)重组DNA分子中标记基因的作用是将含目的基因的细胞筛选出来。
3.(选择性必修3 P80图3-6拓展)在构建基因表达载体时,目的基因的序列中不能含有用到的限制酶的识别序列,原因是防止目的基因被限制酶破坏。
3.将目的基因导入受体细胞
提醒　农杆菌转化法中涉及的基因的两次拼接和两次导入:第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上,第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上;第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌,第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA导入受体细胞。
4.(选择性必修3 P81资料卡拓展)在用农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞的过程中,一定要将目的基因插入Ti质粒的T-DNA上的原因是Ti质粒上的T-DNA也称为可转移的DNA,可转移至受体细胞,并且整合到受体细胞染色体DNA上。
4.目的基因的检测与鉴定
【判断正误】
(1)(2025·河北卷,2)PCR过程中DNA双链的解旋需要酶的催化。(　　)
【答案】 ×
【提示】 PCR过程中DNA双链的解旋是通过高温实现的,不需要酶来解旋。
(2)(经典高考题)载体上的抗性基因有利于筛选含重组DNA的细胞和促进目的基因的表达。(　　)
【答案】 ×
【提示】 载体上的抗性基因有利于筛选含重组DNA的细胞,但不能促进目的基因的表达。
(3)(经典高考题)设计扩增目的基因的引物时不必考虑表达载体的序列。(　　)
【答案】 ×
【提示】 设计扩增目的基因的引物时要考虑表达载体相关序列,从而保证目的基因能与表达载体相连接及正常表达。
(4)(经典高考题)载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因。(　　)
【答案】 ×
【提示】 载体质粒通常采用抗生素抗性基因作为筛选标记基因。
(5)(经典高考题)抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体上也未必能正常表达。(　　)
【答案】 √
【情境·思维·深析】
胰岛素促进因子(PDX-1)能诱导干细胞分化为胰岛B细胞,为糖尿病的治疗提供了新的思路。科研人员欲构建PDX-1基因的克隆载体用于诱导干细胞分化。回答下列问题。
(1)cDNA的合成:从基因文库中检索小鼠PDX-1基因的mRNA序列,设计上下游引物并在引物的5′端分别添加HindⅢ和BamHⅠ限制酶切割序列。以提取的RNA为模板进行逆转录,为防止RNA被水解,需要在逆转录体系中加入RNA酶抑制剂。然后进行PCR扩增,取PCR产物进行凝胶电泳。
(2)克隆载体的构建:回收凝胶中目的基因片段,并进行纯化。选用的克隆载体结构如图所示,其中LacZ基因编码产生的酶可以分解培养基中的X-gal,产生蓝色物质,使菌落呈现蓝色,否则菌落为白色。用限制酶HindⅢ和BamHⅠ、DNA连接(或限制酶、DNA连接)酶将cDNA纯化物与该克隆载体连接形成重组DNA分子。重组的效率除了与温度、pH等外界环境因素有关,还与酶的浓度、载体和目的基因的浓度及比例(答出1点即可)等有关。将重组DNA分子导入用氯化钙处理过的感受态大肠杆菌中进行转化,将转化后的大肠杆菌接种于含氨苄青霉素和X-gal的固体培养基中,37 ℃恒温培养箱中培养24 h,其中白色菌落为阳性克隆。
(3)科研人员将含有PDX-1基因的腺病毒载体转染人的干细胞,使其分化为胰岛B细胞,该过程中胰岛素基因得到了表达。该细胞可用于治疗由胰岛素缺乏引起的糖尿病。
考向2　通过分析具体情境中PCR的条件及过程,考查科学思维
3.(2025·广东卷,7)Solexa测序是一种将PCR与荧光检测相结合的高通量测序技术。为了确保该PCR过程中,DNA聚合酶催化一个脱氧核苷酸单位完成聚合反应后,DNA链不继续延伸,应保护底物中脱氧核糖结构上的(　　)
A.1′-碱基 B.2′-氢
C.3′-羟基 D.5′-磷酸基团
【答案】 C
【解析】 DNA复制时,子链延伸的方向是从5′端到3′端,即下一个脱氧核糖核苷酸的
5′-磷酸基团与上一个脱氧核糖核苷酸的3′-羟基进行连接,故为了DNA聚合酶催化一个脱氧核苷酸单位完成聚合反应后,DNA链不继续延伸,应保护底物中脱氧核糖结构上的3′-羟基。
4.(2025·江苏如皋调研)如图表示PCR过程中某个阶段反应体系的情况,①②③④表示相关物质,L、R表示方向。下列叙述正确的是(　　)
A.DNA体内复制与体外复制(PCR)所需能量均只来自dNTP
B.PCR过程中需要添加缓冲液,其中所含的Mg2+可用于激活DNA聚合酶
C.②链从L到R的方向为3′→5′,①②链均可作为子链合成的模板
D.引物③的5′端添加了某序列,至少需经3次循环才可获得该序列的双链产物
【答案】 B
【解析】 体内DNA复制过程中解旋由ATP提供能量,体外DNA复制(PCR)过程中解旋加热提供能量;PCR过程中需要添加缓冲液,缓冲液中的Mg2+可用于激活耐高温的DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶);根据DNA两条链反向平行的特点,结合图中引物的方向可知,②链从L到R的方向为5′→3′;引物③的5′端添加了某序列,经过第1次循环,得到的1个DNA分子中有1条链含有该序列,经过第2次循环,得到的1个DNA分子的两条链均含有该序列,所以至少需经2次循环可获得该序列的双链产物。
PCR技术和体内DNA复制的比较
考向3　通过分析基因工程的基本操作,考查科学思维
5.(2025·福建卷,10)紫杉醇是红豆杉的代谢产物,会干扰纺锤体的正常功能。科研人员利用农杆菌将紫杉醇合成的相关基因导入烟草中,实现了紫杉醇前体物质的合成。下列叙述错误的是(　　)
A.农杆菌转化前应先使用Ca2+处理烟草细胞
B.紫杉醇合成的相关基因会整合到烟草染色体DNA上
C.紫杉醇因干扰肿瘤细胞的有丝分裂而具有抗癌作用
D.该技术的突破有利于红豆杉天然资源的保护
【答案】 A
【解析】 利用含重组Ti质粒的农杆菌转化烟草细胞前,不需要使用Ca2+处理烟草细胞;利用农杆菌转化植物细胞时,农杆菌中重组Ti质粒上的含紫杉醇合成相关基因的T-DNA能转移到烟草细胞中,并将相关基因整合到烟草细胞的染色体DNA上;由题干可知,紫杉醇会干扰纺锤体的正常功能,从而影响肿瘤细胞的有丝分裂,抑制肿瘤细胞增殖,起到抗癌作用;生产紫杉醇的传统方法是从红豆杉的树皮和树叶中提取,会破坏红豆杉植物资源,而利用转基因烟草合成紫杉醇的前体物质用于生产紫杉醇,有利于红豆杉天然资源的保护。
6.(2025·陕晋青宁卷,21)马铃薯作为重要农作物,提高其冷耐受性可拓展优质马铃薯的种植区域。我国科研人员发现,野生马铃薯中S基因的表达与
其冷耐受性调控有关,将该基因导入栽培马铃薯中可显著增强其抗寒能力。回答下列问题。
限制酶 识别序列及切割位点
BglⅡ
NdeⅠ
XhoⅠ
EcoRⅠ
BamHⅠ
SalⅠ
XbaⅠ
(1)PCR扩增目的基因时,需要模板DNA、引物、　　　　　　　　　、含Mg2+的缓冲液和耐高温的DNA聚合酶。DNA聚合酶在PCR的　　　　步骤中起作用。
(2)图中标识了载体和S基因中限制酶的切割位点。为将S基因正确插入载体,PCR扩增S基因时需在引物的　　　　(填“5′端”或“3′端”)添加限制酶识别序列,结合上表分析,上游引物应添加的碱基序列是5′-　　　　　　　　 -3′,切割载体时应选用的两种限制酶是　　　　　　　　　,PCR扩增产物和载体分别被限制酶切割后,经纯化和连接,获得含S基因的表达载体并导入农杆菌。
(3)用携带S基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织时,基因表达载体中T-DNA进入愈伤组织细胞,将S基因整合到　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　　,抗性基因
　　　　可用于筛选成功转化的愈伤组织。该愈伤组织经　　　　　形成芽、根,继续培育可获得抗寒能力显著增强的马铃薯植株。
【答案】 (1)4种脱氧核苷酸　延伸
(2)5′端　AGATCT　BamHⅠ、EcoRⅠ
(3)栽培马铃薯愈伤组织细胞的染色体DNA上　2　再分化
【解析】 (1)PCR扩增目的基因时,需要模板DNA、引物、4种脱氧核苷酸、含Mg2+的缓冲液和耐高温的DNA聚合酶。PCR一般分为变性、复性和延伸三步,其中DNA聚合酶在PCR的延伸步骤中起作用。
(2)为了使目的基因能够被限制酶切割,扩增目的基因时,需要在引物的5′端添加限制酶的识别序列。结合图表分析,在载体的启动子和终止子之间有BamHⅠ、EcoRⅠ和XbaⅠ的识别序列,而 S基因内部含有XbaⅠ、NdeⅠ和BamHⅠ的识别序列,要用BamHⅠ、EcoRⅠ或XbaⅠ切割载体,又不能用XbaⅠ、NdeⅠ或BamHⅠ切割S基因,再根据各种限制酶的识别序列及切割位点可知,需要用BamHⅠ、EcoRⅠ切割载体,用能与BamHⅠ产生相同黏性末端的BglⅡ和EcoRⅠ切割S基因,故PCR扩增S基因时需在上游引物添加的碱基序列是5′-AGATCT-3′。
(3)T-DNA属于可转移DNA,用携带S基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织时,基因表达载体中T-DNA进入愈伤组织细胞,将S基因整合到栽培马铃薯愈伤组织细胞的染色体DNA上,抗性基因1位于T-DNA外部,用于筛选含有重组载体的农杆菌,而抗性基因2位于T-DNA内部,可用于筛选成功转化的愈伤组织。该愈伤组织经再分化形成芽、根,继续培育可获得抗寒能力显著增强的马铃薯植株。
1.根据质粒的特点确定限制酶的种类
2.根据限制酶的切割位点选择Ti质粒
图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取,丙Ti质粒宜选取(设切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ),分析如下:
考点三　活动:DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定
1.DNA的粗提取与鉴定
(1)基本原理。
(2)操作流程。
1.(选择性必修3 P74～75探究·实践拓展)过滤研磨液用纱布不用滤纸的原因是DNA会吸附在滤纸上,影响提取DNA的量。
提醒　①加入酒精和用玻璃棒搅拌时,动作要轻缓,以免加剧DNA分子的断裂,导致DNA分子不能形成丝状沉淀。
②本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料,原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核(无DNA)。
2.DNA片段的扩增及电泳鉴定
(1)实验基础。
①PCR原理:利用了DNA的热变性原理,通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。
②电泳:DNA分子具有可解离的基团,在一定的pH下,这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下,这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动,这个过程就是电泳。
③PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。
(2)PCR实验操作步骤。
(3)DNA的电泳鉴定。
2.(选择性必修3 P84～85探究·实践拓展)如果电泳鉴定结果未出现扩增条带,可能的原因有模板DNA含有蛋白质杂质或Taq DNA聚合酶的抑制剂;Taq DNA聚合酶失活;引物出现质量问题,浓度不合适;Mg2+浓度过低;变性温度低,变性时间短等。
【判断正误】
(1)(2025·四川卷,5)土豆DNA溶于酒精后,与二苯胺试剂混合呈蓝色。(　　)
【答案】 ×
【提示】 DNA不溶于酒精,在沸水加热条件下,DNA与二苯胺试剂反应呈蓝色。
(2)(2025·湖南卷,2)DNA的粗提取与鉴定实验中,可用“猪成熟红细胞”替代“猪肝细胞”。(　　)
【答案】 ×
【提示】 猪是哺乳动物,猪成熟红细胞没有细胞核,几乎不含DNA,因此不能用“猪成熟红细胞”替代“猪肝细胞”进行DNA的粗提取与鉴定实验。
(3)(2024·河北卷,13)配制PCR反应体系时,加入等量的4种核糖核苷酸溶液作为扩增原料。(　　)
【答案】 ×
【提示】 PCR过程中,应加入4种脱氧核糖核苷酸作为PCR扩增原料。
(4)(2022·山东卷,13)粗提取DNA时的过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解。(　　)
【答案】 √
考向4　围绕实验基本操作及注意事项,考查科学探究
7.(2024·安徽卷,14)下列关于“DNA粗提取与鉴定”实验的叙述,错误的是(　　)
A.实验中如果将研磨液更换为蒸馏水,DNA提取的效率会降低
B.利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异,可初步分离DNA
C.DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同,该原理可用于纯化DNA粗提物
D.将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应,可检测溶液中是否含有蛋白质杂质
【答案】 D
【解析】 研磨液有利于DNA的溶解,更换为蒸馏水,DNA提取的效率会降低;DNA不溶于酒精溶液,但细胞中的某些蛋白质溶于酒精,利用这一原理可初步分离DNA;DNA在NaCl溶液中的溶解度随着NaCl浓度的变化而改变,该原理可用于纯化DNA粗提物;在沸水浴的条件下,DNA遇二苯胺会被染成蓝色,二苯胺试剂用于鉴定DNA。
8.(2025·全国卷,6)琼脂糖凝胶电泳常用于核酸样品的分析,样品1～4的电泳结果如图所示(“+”“-”分别代表电泳槽的阳极和阴极)。已知样品1和2中的DNA分子分别是甲和乙,甲只有限制酶R的一个酶切位点,样品3和4中有一个样品是甲的酶切产物。下列叙述错误的是(　　)
A.配制琼脂糖凝胶时需选用适当的缓冲溶液
B.该实验条件下甲、乙两种DNA分子均带负电荷
C.甲、乙两种DNA分子所含碱基对的数量可能不同
D.据图推测样品3可能是甲被酶R完全酶切后的产物
【答案】 D
【解析】 配制琼脂糖凝胶时需选用适当缓冲溶液,以维持电泳过程中体系的pH稳定,保证核酸分子正常移动;电泳时,甲、乙均向“+”极移动,说明在该实验条件下甲、乙两种DNA分子均带负电荷;电泳中,DNA分子的迁移速率与其分子大小、构象等有关,甲、乙电泳条带位置虽然相同,但碱基对的数量可能不同;甲只有限制酶R的一个酶切位点,已知样品3和4中有一个是甲的酶切产物,说明甲被酶R完全酶切后得到2种DNA片段(2个条带),这两个条带的碱基对比甲要少,电泳时移动速度更快,所以据图推测样品4才是甲被酶R完全酶切后的产物。
9.(2025·江苏卷,23节选)川金丝猴是我国特有的珍稀濒危物种,为了更好地保护这一物种,研究者开展了以下研究。请回答下列问题。
(1)研究者为了进一步研究川金丝猴的食性,采集其粪便样本,进行DNA提取、扩增,部分实验过程如下。请完成下表:
实验目的 简要操作步骤
释放DNA 在去杂后的样本中加入裂解液
析出DNA 离心后取①　　　　,加入乙醇
②　　　　　 在沉淀物中加入纯水
扩增DNA 将③　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　、引物、样本DNA、含有Mg2+缓冲液、超纯水等加入PCR管中,进行PCR
(2)为分析川金丝猴摄食的植物种类,研究者设计一对引物F和R,能同时扩增出不同种植物叶绿体中的rbcL基因片段,是因为引物F和R的碱基能与rbcL基因的保守序列的碱基　　　　　　。用引物F和R对4种植物样本甲～丁的叶绿体基因组DNA进行扩增测序,结果如下图所示。若对4个样本的扩增产物进行DNA电泳条带分析,能检出的样本是　　　　　　。研究者用引物F和R对川金丝猴粪便DNA进行扩增并测序,得到的序列有图中的3种序列,据此可确定川金丝猴摄食的植物有　　　　。若要更准确鉴定出川金丝猴摄食的植物,参照叶绿体基因库,还需选用　　　　　　　　　　　　　的保守序列设计引物,对川金丝猴粪便DNA进行扩增、测序分析。
注:“·”表示与植物甲对应位置上相同的碱基,“……”表示省略200个碱基。
【答案】 (1)上清液　溶解DNA　4种脱氧核苷酸(或dNTP)、耐高温的DNA聚合酶
(2)互补配对　植物丁　丙、丁　叶绿体基因组中其他DNA片段
【解析】 (1)研究者为了进一步研究川金丝猴的食性,采集其粪便样本,进行DNA提取、扩增,部分实验过程为释放DNA:在去杂后的样本中加入裂解液,细胞裂解,内容物释放→析出DNA:DNA呈溶解状态,离心后取上清液,再加入乙醇(DNA不溶于酒精)→溶解DNA:在沉淀物中加入纯水→扩增DNA:PCR扩增DNA,需要将4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶、引物、样本DNA、含有Mg2+缓冲液、超纯水等加入PCR管中,进行PCR。
(2)为分析川金丝猴摄食的植物种类,研究者设计一对引物F和R,能同时扩增出不同种植物叶绿体中的rbcL基因片段,是因为引物F和R的碱基能与rbcL基因的保守序列的碱基互补配对,从而在耐高温的DNA聚合酶的作用下延伸子链。用引物F和R对4种植物样本甲～丁的叶绿体基因组DNA进行扩增测序,结果如题图所示,因此能检出的样本是植物丁。研究者用引物F和R对川金丝猴粪便DNA进行扩增并测序,得到的序列有图中的3种序列,说明摄食的植物有3种,甲和乙的序列相同,不能确定,故据此可确定川金丝猴摄食的植物有丙和丁。选用叶绿体基因组中其他DNA片段的保守序列设计引物,对川金丝猴粪便DNA进行扩增、测序分析,能更准确鉴定出川金丝猴摄食的植物。
1.(2024·山东卷,13)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验,下列说法正确的是(　　)
A.整个提取过程中可以不使用离心机
B.研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后,应充分摇匀再倒入烧杯中
C.鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变
D.仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰
【答案】 A
【解析】 在DNA的粗提取与鉴定实验中,可将获得的研磨液用纱布过滤后,在4 ℃的冰箱中放置几分钟,再取上清液,也可以直接将研磨液用离心机进行离心后取上清液;研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后,DNA在上清液中,应取上清液倒入烧杯中;鉴定过程中用沸水浴加热,DNA双螺旋结构会发生改变;仅设置一个对照组即可以排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰。
2.(2024·黑吉辽卷,7)关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验,下列叙述正确的是(　　)
A.琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小
B.凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置
C.在同一电场作用下,DNA片段越长,向负极迁移速率越快
D.琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来
【答案】 A
【解析】 琼脂糖凝胶的浓度会影响DNA分子在凝胶中的迁移率和分辨率,琼脂糖凝胶的浓度通常是根据所需分离的DNA片段大小来选择的; 凝胶载样缓冲液指示剂通常是一种颜色较深的染料,可以作为电泳进度的指示分子,其不会与DNA结合,不能用于指示DNA分子的具体位置;在琼脂糖凝胶电泳中,当电场作用时,DNA片段实际上是向正极迁移的,而不是向负极迁移,同时,DNA片段的迁移速率与其大小成反比,即DNA片段越长,迁移速率越慢;琼脂糖凝胶中的DNA分子通过染色,可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。
3.(2025·福建卷,15)质粒P含有2个EcoRⅠ、1个SacⅠ和1个BamHⅠ的限制酶切割位点。已知BamHⅠ位点位于2个EcoRⅠ位点的正中间,用上述3种酶切割该质粒,酶切产物的凝胶电泳结果如图,其中泳道①条带是未酶切的质粒P,泳道②③④条带为3种单酶切产物,泳道⑤⑥⑦条带为双酶切产物。下列叙述正确的是(　　)
A.DNA分子在该凝胶的迁移方向是从电源正极到负极
B.可确认泳道②③条带分别是SacⅠ和EcoRⅠ的单酶切产物
C.泳道⑤条带是SacⅠ和EcoRⅠ的双酶切产物
D.泳道①②说明未酶切质粒的碱基数小于酶切后质粒的碱基数
【答案】 C
【解析】 DNA分子因含磷酸基团在电泳缓冲液中带负电荷,在电场作用下DNA分子由电源负极向电源正极移动;P质粒有2个EcoRⅠ限制酶的切割位点,单酶切后的产物最小,电泳时迁移速度较快,可推知泳道③条带是EcoRⅠ限制酶单酶切产物,而泳道③只有一条条带,由此可以推出EcoRⅠ的两个酶切位点大致平分质粒P,泳道②条带和泳道④条带位置一致,无法区分泳道②条带是SacⅠ还是BamHⅠ的单酶切产物;泳道⑤⑥⑦条带为双酶切产物,BamHⅠ位点位于2个EcoRⅠ位点的正中间,结合泳道③条带可推出,泳道⑦条带是EcoRⅠ和BamHⅠ的双酶切产物,泳道⑤条带是EcoRⅠ和SacⅠ的双酶切产物,泳道⑥条带为SacⅠ和BamHⅠ的双酶切产物;限制酶只水解磷酸二酯键,酶切后的质粒碱基数不会改变。
4.(2023·湖北卷,4)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒,构建基因表达载体(重组质粒),并转化到受体菌中。下列叙述错误的是(　　)
A.若用HindⅢ酶切,目的基因转录的产物可能不同
B.若用PvuⅠ酶切,在含Tet(四环素)培养基中生长的菌落,不一定含有目的基因
C.若用SphⅠ酶切,可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D.若用SphⅠ酶切,携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落
【答案】 D
【解析】 若用HindⅢ酶切质粒和含有目的基因的DNA片段,目的基因有正向连接和反向连接两种连接形式,因此转录的产物可能不同;若用PvuⅠ酶切,重组质粒和质粒中都有四环素抗性基因(TetR),因此在含Tet(四环素)培养基中生长的菌落,不一定含有目的基因;DNA凝胶电泳技术可以分离不同大小的DNA片段,重组质粒的大小与质粒不同,能够鉴定重组质粒构建成功与否;SphⅠ的酶切位点位于四环素抗性基因中,若用SphⅠ酶切,重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因(AmpR),因此携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)的培养基中能形成菌落,在含Tet的培养基中不能形成菌落。
5.(2025·广东卷,21)大肠杆菌是重要工业菌株之一,其培养过程可分为快速生长期和生长稳定期两个阶段。为了通过调节蛋白质合成与降解速率来动态调控代谢途径关键酶的蛋白量,使细胞适配不同阶段的生产需求,研究者设计了两种质粒,并以稳定性好的红色荧光蛋白mKate2为模式蛋白,测试质粒功能。回答下列问题。
(1)研究者首先构建质粒①(图a)用于在细胞内表达C-末端带SsrA短肽的mKate2,将质粒导入感受态细胞后,在添加抗生素的选择培养基上培养。根据培养基上菌落的生长状况,结合PCR及　　　　检测,筛选获得重组菌株W1。
(2)将W1在适宜条件下进行摇瓶培养,定时取样检测培养液中细胞密度,方法有　　　　　
　　　　　 　　(答一种)。接种前需检测液体培养基的荧光强度,其作用是　 　　　　　　　　　　 　 　。培养结果(图b)表明,进入生长稳定期后荧光强度快速下降,原因是 　。
(3)研究者选用启动子PX、X基因(编码阻遏蛋白X,阻遏PX开启转录),重新构建质粒②(图a),导入野生型大肠杆菌中获得重组菌株W2。在适宜条件下摇瓶培养,W2的生长趋势不变,培养期间荧光强度的变化趋势为 　。
(4)莽草酸是一种重要工业化学品,其胞内合成代谢途径见图c。由于野生型大肠杆菌胞内酶A活性弱,且莽草酸会被快速转化为细胞生长必需物,因此细胞中无法大量积累莽草酸。为了保证细胞正常生长,并在生长稳定期实现莽草酸的大量积累,利用上述两种质粒的调控功能,结合野生型菌株遗传物质的改造,提出重组生产菌株构建思路:
　。
【答案】 (1)荧光
(2)稀释涂布平板法、显微镜直接计数法　排除培养基本身荧光对实验结果的干扰　PGeo在生长稳定期停止基因转录,且C-末端带有SsrA短肽的mKate2被大肠杆菌内源蛋白酶系统特异性识别并降解
(3)快速生长期荧光强度较弱,生长稳定期快速增加后保持稳定
(4)将质粒①中的mKate2基因替换成酶B基因,将质粒②中的mKate2基因替换成酶A基因,并将上述两种质粒导入敲除酶B基因的野生型大肠杆菌中
【解析】 (1)在基因工程中,筛选重组菌株时,常用PCR检测目的基因是否导入受体细胞以及是否转录,由于目的基因能表达出红色荧光蛋白,故还可对菌落进行荧光检测以判断目的基因是否表达出相应的蛋白质。
(2)检测培养液中细胞密度常用的方法有稀释涂布平板法(通过统计平板上的菌落数来估算细胞数量,进而得到细胞密度)、显微镜直接计数法(利用血细胞计数板在显微镜下直接对细胞进行计数)。接种前检测液体培养基的荧光强度,是为了排除培养基本身荧光对实验结果的干扰。进入生长稳定期后,由于PGeo在生长稳定期停止基因转录,所以不再合成带有SsrA短肽的mKate2,且C-末端带有SsrA短肽的蛋白质可被大肠杆菌内源蛋白酶系统特异性识别并降解,导致荧光强度快速下降。
(3)在重组菌株W2中,启动子PX被阻遏蛋白X阻遏转录。在培养初期,细胞处于快速生长阶段,阻遏蛋白X的量相对充足,PX启动子受到较高程度的抑制,合成的mKate2较少,使荧光强度上升不明显;随着培养的进行,阻遏蛋白X的合成减少降解增多,对PX启动子的阻遏作用减弱,mKate2转录,荧光强度快速增加,并趋于稳定。
(4)为了保证细胞正常生长,并在生长稳定期实现莽草酸的大量积累,需满足以下条件。条件1:为了保证细胞正常生长,必须保证酶A和酶B在快速生长期都正常。条件2:为了在生长稳定期有大量莽草酸,需要使酶A增加、酶B减少。为满足条件2,野生型大肠杆菌应无法产生酶B,故敲除野生型大肠杆菌的酶B基因。为保证细胞生长,可以将质粒①中的mKate2基因替换成酶B基因,保障快速生长期酶B的供应,也能满足稳定生长期酶B减少的要求。将质粒②中的mKate2基因替换成酶A基因,使酶A基因在稳定生长期大量表达,这样能在生长稳定期实现莽草酸的大量积累。
(时间:30分钟)
1.(2025·河南联考)下列是几种限制酶的识别序列及切割位点(Y=C或T,R=A或G)。下列相关叙述正确的是(　　)
限制酶 识别序列及切割位点
HindⅡ 5′-GTY↓RAC-3′
AluⅠ 5′-AG↓CT-3′
BamHⅠ 5′-G↓GATCC-3′
Sau3AⅠ 5′-↓GATC-3′
A.限制酶切割一次需切断2个磷酸二酯键,增加2个游离的磷酸基团
B.一种限制酶只能识别一种核苷酸序列,并在特定位点切割
C.AluⅠ切割后的DNA片段可选用E.coliDNA连接酶连接
D.BamHⅠ和Sau3AⅠ切割形成的片段进行重组后,BamHⅠ和Sau3AⅠ均不能识别并切割
【答案】 A
【解析】 限制酶切割一次需切断2个磷酸二酯键,增加2个游离的磷酸基团;一种限制酶不一定只识别一种核苷酸序列,如HindⅡ;用AluⅠ切割得到的是平末端,E.coliDNA连接酶连接具有平末端的DNA片段的效率远低于T4 DNA连接酶,因此应用T4 DNA连接酶连接AluⅠ切割后的DNA片段;BamHⅠ和Sau3AⅠ切割形成的片段进行重组后,BamHⅠ不能识别并切割重组片段,而Sau3AⅠ仍可识别并切割重组片段。
2.(2026·四川内江一模)下列关于“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述,错误的是(　　)
A.可以选择新鲜洋葱、香蕉、菠菜或猪肝等作为实验材料
B.可利用DNA和蛋白质在酒精中溶解度差异初步分离DNA
C.本实验需要设置对照组来排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰
D.使用二苯胺试剂能有效测定不同提取液中DNA的纯度差别
【答案】 D
【解析】 可使用二苯胺试剂鉴定DNA的存在,但不能用于测定不同提取液中DNA的纯度差别。
3.(2025·山东青岛三模)在构建基因表达载体时,需要遵循一定的规则。同时面对实际问题,可利用分子生物学原理加以解决。下列说法正确的是(　　)
A.利用不同的限制酶对载体和目的基因进行剪切而形成的黏性末端无法再次连接
B.若要降低细胞中某基因的表达,可将该基因的编码序列反向连接到基因表达载体中
C.如果目的基因没有合适的酶切位点,可以在引物3′端末尾设计加入酶切位点
D.表达载体中标记基因不需要启动子,可以在受体细胞中持续表达
【答案】 B
【解析】 同尾酶识别的核苷酸序列不同,但是产生的黏性末端相同,因此用同尾酶切割载体和目的基因,可以产生相同的黏性末端而进行互补再次连接;要降低细胞中某基因的表达,可将该基因的编码序列反向连接到基因表达载体中,转录形成的mRNA可与原基因转录的mRNA碱基互补配对,抑制该基因的翻译过程,从而使该基因表达量下降;由于DNA子链延伸时总是从5′端到3′端,如果目的基因没有合适的酶切位点,可以在引物5′端末尾设计加入酶切位点;表达载体中标记基因和目的基因都需要合适的启动子才能表达。
4.(2025·广东佛山二模)某兴趣小组以香蕉为原材料进行DNA粗提取、扩增及电泳鉴定系列实验。下列叙述正确的是(　　)
A.提取DNA时,研磨后需用滤纸进行过滤
B.可利用DNA在酒精中溶解度大的特点来提取DNA
C.琼脂糖熔化前需将适量的核酸染料加入并进行混匀
D.若DNA带负电,则凝胶加样孔应位于电泳槽负极侧
【答案】 D
【解析】 研磨液需用纱布进行过滤,而不是用滤纸,以保证提取到更多的DNA;蛋白质可溶于酒精,而DNA不溶于酒精,所以在提取DNA时加入酒精,使溶于酒精的蛋白质等物质溶解,而让DNA析出;在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化,稍冷却后加入适量核酸染料混匀;靠近加样孔的一端为负极,接通电源,带负电的DNA分子向正极移动而使DNA逐渐分离。
5.(2025·湖北武汉模拟)油菜的绿叶对黄化叶为显性。与绿叶基因相比,黄化叶基因有一个碱基对发生了改变,从而出现一个限制酶B的酶切位点。为鉴定某绿叶油菜的基因型,提取其DNA进行了PCR和电泳。下列叙述正确的是(　　)
A.需设计能与目的基因结合的双链DNA作为PCR引物
B.应在PCR扩增体系中添加Mg2+,以激活DNA聚合酶
C.可适当降低复性的温度,以减少电泳中非特异性条带的产生
D.用限制酶B处理目的基因后进行电泳,若有2条电泳条带可判断为杂合子
【答案】 B
【解析】 PCR引物一般是单链DNA;DNA聚合酶都需要Mg2+激活,故PCR反应缓冲液中一般要添加Mg2+;复性温度过低会导致引物与模板链非特异性结合,会增加电泳中非特异性条带;若该绿叶油菜为杂合子,则其含绿叶基因和黄化叶基因,绿叶基因不能被限制酶B切割,黄化叶基因被限制酶B酶切后产生2个片段,故应出现3条电泳条带。
6.(2025·福建泉州期中)科研人员将寒带地区海鱼中的抗冻基因转入番茄细胞中,成功培育出抗冻番茄。如图为培育过程中使用的Ti质粒示意图,其中Vir区的基因活化能促进T-DNA的加工和转移,下列叙述正确的是(　　)
A.构建基因表达载体时,最好选择限制酶Ⅱ和限制酶Ⅲ来切割质粒
B.利用PCR扩增抗冻基因,需提前检测抗冻基因的全部碱基序列
C.Vir区的基因活化促进抗冻基因整合到番茄细胞的染色体DNA上
D.利用含卡那霉素的培养基可筛选出成功导入抗冻基因的番茄细胞
【答案】 C
【解析】 Vir区的基因活化能促进T-DNA的加工和转移,使用限制酶Ⅱ会破坏Vir区的基因,不能选限制酶Ⅱ;使用PCR技术扩增抗冻基因,只需要知道抗冻基因两端碱基序列,并据此设计引物;农杆菌侵染植物细胞后,Ti质粒上的T-DNA能转移到被侵染的细胞并整合到该细胞的染色体DNA上,所以Vir区基因活化可促进插入T-DNA中的抗冻基因整合到番茄细胞的染色体DNA上;卡那霉素抗性基因不在T-DNA序列中,为筛选成功导入抗冻基因的番茄细胞,最好在培养基中添加四环素,可以筛选成功导入抗冻基因的番茄细胞。
7.(2025·江西南昌联考)同尾酶指识别位点不同但能切出相同黏性末端的限制酶;同裂酶指具有相同识别序列的限制酶(切割位点相同或不同均可)。几种基因工程中常用的限制酶如下表所示。下列叙述错误的是(　　)
限制酶的名称 识别和切割位点
HinPⅡ 5′G↓CGC3′
GlaⅠ 5′GC↓GC3′
HhaⅠ 5′GCG↓C3′
HpaⅡ 5′C↓CGG3′
NarⅠ 5′GG↓CGCC3′
A.HinPⅡ和HhaⅠ为同裂酶,切出的黏性末端不同
B.HinPⅡ和HpaⅡ切割的产物连接后,其序列不能被GlaⅠ切割
C.HinPⅡ和NarⅠ为同尾酶,它们切割的产物连接后的序列不能被GlaⅠ切割
D.某质粒仅含1个GlaⅠ的识别位点,则该质粒能被NarⅠ切割的概率为1/16
【答案】 C
【解析】 同裂酶是指具有相同识别序列的限制酶,HinPⅡ识别和切割位点是
5′G↓CGC3′,HhaⅠ识别和切割位点是5′GCG↓C3′,二者识别序列相同,所以HinPⅡ和HhaⅠ为同裂酶,两者的切割位点不同,切出的黏性末端不同;HinPⅡ识别和切割位点是
5′G↓CGC3′,HpaⅡ识别和切割位点是5′C↓CGG3′,二者切割产物连接后的序列为
5′GCGG3′,GlaⅠ识别和切割位点是5′GC↓GC3′,说明连接后的5′GCGG3′序列不能被GlaⅠ识别和切割;HinPⅡ识别和切割位点是5′G↓CGC3′,NarⅠ识别和切割位点是
5′GG↓CGCC3′,HinPⅡ和NarⅠ切割产物连接后的序列为5′GCGCC3′,GlaⅠ识别和切割位点是5′GC↓GC3′,即该序列能被GlaⅠ识别和切割;GlaⅠ识别和切割位点是
5′GC↓GC3′,NarⅠ识别和切割位点是5′GG↓CGCC3′,在仅含1个GlaⅠ识别位点的情况下,该质粒能被NarⅠ切割的概率为1/16(因为在GlaⅠ识别位点基础上,前后各增加一个碱基,共16种可能情况,其中有一种是NarⅠ的识别位点)。
8.(2025·江西萍乡三模)水杨酸加氧酶可催化石油污染物降解,该酶由bphA2cA1c基因编码。从鞘氨醇单胞菌属的B1菌株中获取bphA2cA1c基因后,与大肠杆菌质粒结合可构建基因表达载体,在该过程中使用限制酶切割DNA时存在“单酶切法”和“双酶切法”(如图)。在只考虑产物两两结合的情况下,下列相关叙述正确的是(　　)
A.bphA2cA1c基因自连可能是“单酶切法”对应的最小产物
B.只有“双酶切法”才会使bphA2cA1c基因与质粒正确连接
C.“单酶切法”对应的产物种类少于“双酶切法”对应的产物种类
D.“双酶切法”后,bphA2cA1c基因就可表达出水杨酸加氧酶
【答案】 A
【解析】 使用“单酶切法”处理含bphA2cA1c基因的DNA片段和质粒,获得的DNA片段末端是相同的,因此其两两结合产物有:目的基因自身连接物、质粒自身连接物、目的基因与质粒正向连接物和目的基因与质粒的反向连接物,而使用“双酶切法”处理含bphA2cA1c基因的DNA片段和质粒,其两两结合产物通常只有目的基因与质粒的正向连接物。质粒的相对分子质量大于目的基因,因此bphA2cA1c基因自身连接可能是“单酶切法”对应的最小产物;将通过“双酶切法”得到的含bphA2cA1c基因的重组质粒导入受体菌,才可能表达出水杨酸加氧酶。
9.(2025·山东聊城联考)酵母菌转录激活因子GAL4的BD部分负责与基因上游的激活序列(UAS)结合,GAL4的AD部分负责激活UAS下游基因的转录过程。只有当BD与AD在空间上接近时才能发挥转录激活功能,其机制如图1。报告基因LacZ在酵母菌细胞内编码的酶可对无色底物Xgal进行切割并产生蓝色物质,使酵母菌菌落呈蓝色。将M基因与BD基因连接、N基因与AD基因连接,分别构建融合基因的表达载体(如图2)并导入酵母菌,可用于研究蛋白M和N的相互作用。下列分析正确的是(　　)
A.融合蛋白BDM或融合蛋白ADN可单独激活报告基因表达
B.受体酵母菌是BD基因缺陷型或AD基因缺陷型酵母菌
C.需要将两种融合基因的表达载体导入同一个酵母菌细胞内
D.若转基因酵母菌的菌落呈白色,则说明蛋白M和N相互结合
【答案】 C
【解析】 已知只有当BD与AD在空间上接近时才能发挥转录激活功能,融合蛋白BDM或融合蛋白ADN不能单独激活报告基因表达;受体酵母菌应是BD基因和AD基因共同缺陷型,若只有一种基因缺陷,则导入外源的BDM或ADN可能会驱动报告基因的表达,不能用于研究蛋白M和蛋白N的相互作用;需要将两种融合基因的表达载体导入同一个酵母菌细胞内,若蛋白M和N能够相互结合,则BD蛋白和AD蛋白可以接近,能驱动报告基因的表达而使酵母菌菌落呈蓝色,若蛋白M和N不能相互结合,则BD蛋白和AD蛋白无法接近,不能驱动报告基因的表达而使酵母菌菌落呈白色。
10.(2025·山东卷,25)种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti质粒的改造,利用农杆菌转化法将Ti质粒上的TDNA随机整合到小麦基因组中,筛选到2个种子休眠相关基因的插入失活纯合突变体。与野生型相比,突变体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息已知。
(1)Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为　　　　　　。选用图甲中的SmaⅠ对抗除草剂基因X进行完全酶切,再选择SmaⅠ和　　　　对Ti质粒进行完全酶切,将产生的黏性末端补平,补平时使用的酶是　　　　　　。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接,构建重组载体,转化大肠杆菌;经卡那霉素筛选并提取质粒后再选用限制酶　　　　　　　　　进行完全酶切并电泳检测,若电泳结果呈现一长一短2条带,较短的条带长度近似为　　　　bp,则一定为正向重组质粒。
(2)为证明这两个突变体是TDNA插入小麦基因组中同一基因导致的,提取基因组DNA,经酶切后产生含有TDNA的基因组片段(图乙)。在此酶切过程中,限于后续PCR难以扩增大片段DNA,最好使用识别序列为　　 　　(填“4”“6”或“8”)个碱基对的限制酶,且TDNA中应不含该酶的酶切位点。需首先将图乙的片段　　　,才能利用引物P1和P2成功扩增未知序列。PCR扩增出未知序列后,进行了一系列操作,其中可以判断出2条片段的未知序列是否属于同一个基因的操作为　　　　　　　　　　(填“琼脂糖凝胶电泳”或“测序和序列比对”)。
(3)通过农杆菌转化法将构建的含有野生型基因的表达载体转入突变植株,如果检测到野生型基因,　　　　(填“能”或“不能”)确定该植株的表型为野生型。
【答案】 (1)复制原点　XbaⅠ　DNA聚合酶　SmaⅠ和SpeⅠ　550
(2)4　环化　测序和序列比对
(3)不能
【解析】 (1)DNA复制的起点是复制原点,因此Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为复制原点。根据SmaⅠ限制酶识别序列可知,酶切形成的是平末端,若质粒仅用SmaⅠ酶切,抗除草剂基因和质粒可以正向连接也可以反向连接,且无法区分,为了确定是否为正向重组质粒,因此在构建重组质粒时需要用到另一种限制酶,抗除草剂基因需要插入启动子和终止子之间,因此不能选择BamHⅠ,因为该限制酶会破坏终止子,若选PstⅠ则无法补齐酶切后的黏性末端,因此只能选择XbaⅠ和SmaⅠ进行酶切,XbaⅠ酶切会形成黏性末端,需要用DNA聚合酶将产生的黏性末端补平。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接,构建重组载体,转化大肠杆菌。重组的TDNA片段上含有一个SmaⅠ酶切位点和一个SpeⅠ酶切位点,可以选择用SmaⅠ和SpeⅠ进行酶切,转录的方向是从模板的3′端→5′端,和质粒对应的方向相同,经过两种酶的酶切后电泳结果呈现一长一短2条带,若正向连接,较短的条带长度近似为550 bp,若反向连接,较短的条带长度近似为200 bp。
(2)由于后续PCR难以扩增大片段DNA,所以最好选择识别序列为4个碱基对的限制酶,原因是识别序列越短,其特异性越低,酶切位点越多,切割产生的片段可能越小,更有利于后续的PCR扩增。由于引物是根据已知序列设计的,但此时需要扩增未知序列,因此可以将图乙的片段环化,这样就可以利用现有引物扩增出未知序列。为了确定未知序列是否属于同一个基因,需要准确比对其上的碱基序列,因此需测序和序列比对。
(3)突变植株成功导入野生型基因,但野生型基因未必可以正常表达,因此不能确定该植株的表型为野生型。第54讲　基因工程的基本工具和基本操作程序
(时间:30分钟)
1.(2025·河南联考)下列是几种限制酶的识别序列及切割位点(Y=C或T,R=A或G)。下列相关叙述正确的是(　　)
限制酶 识别序列及切割位点
HindⅡ 5′GTY↓RAC3′
AluⅠ 5′AG↓CT3′
BamHⅠ 5′G↓GATCC3′
Sau3AⅠ 5′↓GATC3′
A.限制酶切割一次需切断2个磷酸二酯键,增加2个游离的磷酸基团
B.一种限制酶只能识别一种核苷酸序列,并在特定位点切割
C.AluⅠ切割后的DNA片段可选用E.coliDNA连接酶连接
D.BamHⅠ和Sau3AⅠ切割形成的片段进行重组后,BamHⅠ和Sau3AⅠ均不能识别并切割
2.(2026·四川内江一模)下列关于“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述,错误的是(　　)
A.可以选择新鲜洋葱、香蕉、菠菜或猪肝等作为实验材料
B.可利用DNA和蛋白质在酒精中溶解度差异初步分离DNA
C.本实验需要设置对照组来排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰
D.使用二苯胺试剂能有效测定不同提取液中DNA的纯度差别
3.(2025·山东青岛三模)在构建基因表达载体时,需要遵循一定的规则。同时面对实际问题,可利用分子生物学原理加以解决。下列说法正确的是(　　)
A.利用不同的限制酶对载体和目的基因进行剪切而形成的黏性末端无法再次连接
B.若要降低细胞中某基因的表达,可将该基因的编码序列反向连接到基因表达载体中
C.如果目的基因没有合适的酶切位点,可以在引物3′端末尾设计加入酶切位点
D.表达载体中标记基因不需要启动子,可以在受体细胞中持续表达
4.(2025·广东佛山二模)某兴趣小组以香蕉为原材料进行DNA粗提取、扩增及电泳鉴定系列实验。下列叙述正确的是(　　)
A.提取DNA时,研磨后需用滤纸进行过滤
B.可利用DNA在酒精中溶解度大的特点来提取DNA
C.琼脂糖熔化前需将适量的核酸染料加入并进行混匀
D.若DNA带负电,则凝胶加样孔应位于电泳槽负极侧
5.(2025·湖北武汉模拟)油菜的绿叶对黄化叶为显性。与绿叶基因相比,黄化叶基因有一个碱基对发生了改变,从而出现一个限制酶B的酶切位点。为鉴定某绿叶油菜的基因型,提取其DNA进行了PCR和电泳。下列叙述正确的是(　　)
A.需设计能与目的基因结合的双链DNA作为PCR引物
B.应在PCR扩增体系中添加Mg2+,以激活DNA聚合酶
C.可适当降低复性的温度,以减少电泳中非特异性条带的产生
D.用限制酶B处理目的基因后进行电泳,若有2条电泳条带可判断为杂合子
6.(2025·福建泉州期中)科研人员将寒带地区海鱼中的抗冻基因转入番茄细胞中,成功培育出抗冻番茄。如图为培育过程中使用的Ti质粒示意图,其中Vir区的基因活化能促进TDNA的加工和转移,下列叙述正确的是(　　)
A.构建基因表达载体时,最好选择限制酶Ⅱ和限制酶Ⅲ来切割质粒
B.利用PCR扩增抗冻基因,需提前检测抗冻基因的全部碱基序列
C.Vir区的基因活化促进抗冻基因整合到番茄细胞的染色体DNA上
D.利用含卡那霉素的培养基可筛选出成功导入抗冻基因的番茄细胞
7.(2025·江西南昌联考)同尾酶指识别位点不同但能切出相同黏性末端的限制酶;同裂酶指具有相同识别序列的限制酶(切割位点相同或不同均可)。几种基因工程中常用的限制酶如下表所示。下列叙述错误的是(　　)
限制酶的名称 识别和切割位点
HinPⅡ 5′G↓CGC3′
GlaⅠ 5′GC↓GC3′
HhaⅠ 5′GCG↓C3′
HpaⅡ 5′C↓CGG3′
NarⅠ 5′GG↓CGCC3′
A.HinPⅡ和HhaⅠ为同裂酶,切出的黏性末端不同
B.HinPⅡ和HpaⅡ切割的产物连接后,其序列不能被GlaⅠ切割
C.HinPⅡ和NarⅠ为同尾酶,它们切割的产物连接后的序列不能被GlaⅠ切割
D.某质粒仅含1个GlaⅠ的识别位点,则该质粒能被NarⅠ切割的概率为1/16
8.(2025·江西萍乡三模)水杨酸加氧酶可催化石油污染物降解,该酶由bphA2cA1c基因编码。从鞘氨醇单胞菌属的B1菌株中获取bphA2cA1c基因后,与大肠杆菌质粒结合可构建基因表达载体,在该过程中使用限制酶切割DNA时存在“单酶切法”和“双酶切法”(如图)。在只考虑产物两两结合的情况下,下列相关叙述正确的是(　　)
A.bphA2cA1c基因自连可能是“单酶切法”对应的最小产物
B.只有“双酶切法”才会使bphA2cA1c基因与质粒正确连接
C.“单酶切法”对应的产物种类少于“双酶切法”对应的产物种类
D.“双酶切法”后,bphA2cA1c基因就可表达出水杨酸加氧酶
9.(2025·山东聊城联考)酵母菌转录激活因子GAL4的BD部分负责与基因上游的激活序列(UAS)结合,GAL4的AD部分负责激活UAS下游基因的转录过程。只有当BD与AD在空间上接近时才能发挥转录激活功能,其机制如图1。报告基因LacZ在酵母菌细胞内编码的酶可对无色底物Xgal进行切割并产生蓝色物质,使酵母菌菌落呈蓝色。将M基因与BD基因连接、N基因与AD基因连接,分别构建融合基因的表达载体(如图2)并导入酵母菌,可用于研究蛋白M和N的相互作用。下列分析正确的是(　　)
A.融合蛋白BDM或融合蛋白ADN可单独激活报告基因表达
B.受体酵母菌是BD基因缺陷型或AD基因缺陷型酵母菌
C.需要将两种融合基因的表达载体导入同一个酵母菌细胞内
D.若转基因酵母菌的菌落呈白色,则说明蛋白M和N相互结合
10.(2025·山东卷,25)种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti质粒的改造,利用农杆菌转化法将Ti质粒上的TDNA随机整合到小麦基因组中,筛选到2个种子休眠相关基因的插入失活纯合突变体。与野生型相比,突变体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息已知。
(1)Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为　　　　　　。选用图甲中的SmaⅠ对抗除草剂基因X进行完全酶切,再选择SmaⅠ和　　　　对Ti质粒进行完全酶切,将产生的黏性末端补平,补平时使用的酶是　　　　　　。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接,构建重组载体,转化大肠杆菌;经卡那霉素筛选并提取质粒后再选用限制酶　　　　　　　　　进行完全酶切并电泳检测,若电泳结果呈现一长一短2条带,较短的条带长度近似为　　　　bp,则一定为正向重组质粒。
(2)为证明这两个突变体是TDNA插入小麦基因组中同一基因导致的,提取基因组DNA,经酶切后产生含有TDNA的基因组片段(图乙)。在此酶切过程中,限于后续PCR难以扩增大片段DNA,最好使用识别序列为　　　 　(填“4”“6”或“8”)个碱基对的限制酶,且TDNA中应不含该酶的酶切位点。需首先将图乙的片段　 　　,才能利用引物P1和P2成功扩增未知序列。PCR扩增出未知序列后,进行了一系列操作,其中可以判断出2条片段的未知序列是否属于同一个基因的操作为　　　　　　　 　　　(填“琼脂糖凝胶电泳”或“测序和序列比对”)。
(3)通过农杆菌转化法将构建的含有野生型基因的表达载体转入突变植株,如果检测到野生型基因,　　 　　(填“能”或“不能”)确定该植株的表型为野生型。 (共91张PPT)
第54讲　基因工程的基本工具和基本操作程序
课标 要求 1.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。
2.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测鉴定等步骤。
3.活动:DNA的提取和鉴定。
4.活动:利用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段并完成电泳鉴定,或运用软件进行虚拟PCR实验。
考情 分析 1.重组DNA技术的基本工具 2025·江苏卷,19;2024·江西卷,12;2023·新课标卷,6
2.基因工程的基本操作程序 2025·广东卷,7;2025·安徽卷,15、20;2025·陕晋青宁卷,21;
2025·山东卷,25;2025·浙江1月选考,24;2025·甘肃卷,21;
2024·广东卷,21;2024·重庆卷,19;2024·湖南卷,21;2024·甘肃卷,21;2024·安徽卷,20;2024·河北卷,22;2024·山东卷,
25;2024·黑吉辽卷,25;2023·湖北卷,4;2023·广东卷,20
3.DNA的粗提取与鉴定 2024·安徽卷,14;2024·河北卷,13;2024·山东卷,13;2023·广东卷,11
4.DNA片段的扩增及电泳鉴定 2025·江苏卷,23;2025·全国卷,6;2024·浙江6月选考,20;
2024·江西卷,19;2024·黑吉辽卷,7;2023·江苏卷,22
考点一
基因工程的基本工具
1.基因工程的概念
必备知识·梳理
落实概念·夯实基础
目的基因
基因重组
分子
2.基因工程的基本工具
(1)限制性内切核酸酶(也称“限制酶”)。
磷酸二酯键
黏性末端
1.(选择性必修3 P71正文拓展)将一个基因从DNA分子上切割下来需要切割 处,同时产生 个黏性末端或平末端。
2.(选择性必修3 P71正文拓展)限制酶主要来源于原核生物,不能切割自身的DNA分子的原因可能是
。
细读教材
两
四
限制酶具有特异性,即一种限制酶只能识别一种
特定的核苷酸序列,并在特定位点进行切割。原核生物DNA分子中不存在
自身限制酶的识别序列,或其识别序列已被修饰
(2)DNA连接酶。
磷酸二酯键
黏性末端
黏性末端
3.(选择性必修3 P72正文拓展)DNA连接酶和DNA聚合酶功能的区别是
。
细读教材
DNA连接酶连接的是两个DNA片段,而DNA聚合酶是把单个的脱氧核苷
酸连接到已有的DNA片段上;DNA聚合酶起作用时需要以一条DNA链为
模板,而DNA连接酶不需要模板
(3)载体。
质粒
限制酶切割位点
(1)(2024·贵州卷,13)使用不同的限制酶也能产生相同的黏性末端。(　　)
(2)(2021·辽宁卷,3)基因工程中常用噬菌体转化植物细胞。(　　)
【判断正误】
√
×
【提示】 基因工程中常用农杆菌转化植物细胞,农杆菌的特点是其细胞内的Ti质粒上的T-DNA片段能够转移至受体细胞,并整合到受体细胞的染色体DNA上,噬菌体一般用于细菌的转化。
(3)(经典高考题)一种限制性内切核酸酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列。(　　)
(4)(经典高考题)限制性内切核酸酶能识别和切割RNA。(　　)
√
×
【提示】 限制性内切核酸酶只能识别和切割DNA,不能识别和切割RNA。
(5)(经典高考题)限制性内切核酸酶可从原核生物中提取。(　　)
√
考向1　分析基因工程的基本工具,考查科学思维
1.(2024·湖南卷,5)某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时,发现DNA完全没有被酶切,分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是(　　)
A.限制酶失活,更换新的限制酶
B.酶切条件不合适,调整反应条件如温度和酶的用量等
C.质粒DNA突变导致酶识别位点缺失,更换正常质粒DNA
D.酶切位点被甲基化修饰,换用对DNA甲基化不敏感的限制酶
B
核心考向·突破
把握方向·训练到位
【解析】 限制酶失活会使DNA完全不被酶切,此时应更换新的限制酶;酶切条件不合适可能使酶失活,无法发挥作用,应调整反应条件如温度和pH等,调整酶的用量没有作用;质粒DNA突变会导致限制酶识别位点缺失,进而造成限制酶无法进行切割,此时应更换为正常质粒DNA;质粒DNA上酶切位点被甲基化修饰,会导致对DNA甲基化敏感的限制酶无法进行酶切,此时应换用对DNA甲基化不敏感的限制酶。
2.(2025·湖北名校调研)如图是利用基因工程技术培育抗除草剂作物的部分过程,其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ为四种限制酶,且切割DNA分子后形成的末端均不同。下列说法正确的是(　　)
A.图示质粒分子在SmaⅠ切割前后分别含有0和1个游离的磷酸基团
B.培育抗除草剂作物的核心是将含bar基因的表达载体导入受体细胞
C.可选用PstⅠ和EcoRⅠ切割质粒和含bar基因的DNA片段,确保目的基因正确插入
D.利用PCR技术可从分子水平检测bar基因是否翻译出抗除草剂蛋白
C
【解析】 质粒为环状DNA,切割前没有游离的磷酸基团,切割后形成线性DNA,含2个游离的磷酸基团;基因工程的核心是构建基因表达载体;用PstⅠ和EcoRⅠ切割可避免质粒自身环化及与目的基因反向连接;应用抗原—抗体杂交法来检测bar基因是否翻译出相应蛋白质。
考点二
基因工程的基本操作程序
1.目的基因的筛选与获取
(1)筛选合适的目的基因。
①目的基因:在基因工程的设计和操作中,用于改变 或获得
等的基因。主要是指 的基因。
②筛选方法:从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。
(2)利用PCR获取和扩增目的基因。
①原理: 。
必备知识·梳理
落实概念·夯实基础
受体细胞性状
预期表达产物
编码蛋白质
DNA半保留复制
②条件。
参与的组分 在DNA复制中的作用
解旋酶(体外用 代替) 打开DNA双链
DNA母链 提供DNA复制的模板
合成DNA子链的原料
耐高温的 催化合成DNA子链
引物 使DNA聚合酶能够从引物的 端开始连接脱氧核苷酸
高温
4种脱氧核苷酸
DNA聚合酶
3′
③过程。
两种引物
耐高温的DNA
聚合酶
④结果:上述三步反应完成后,一个DNA分子就变成了 个DNA分子,随着循环次数的增多,DNA分子以指数形式增加。
两
1.(选择性必修3 P78～79图3-5拓展)PCR反应过程中,引物非常关键。PCR技术需要引物是因为
;利用PCR技术扩增目的基因时,需要两种引物的原因是 。
细读教材
DNA聚合酶不能从头开始合成DNA,只能从DNA链
的3′端延伸DNA链
目的基因的两条反向平行的链都作为模板,其碱基序列不同
2.基因表达载体的构建——基因工程的核心
(1)构建基因表达载体的目的。
①使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且遗传给下一代。
②使目的基因能够 和发挥作用。
表达
(2)基因表达载体的组成。
RNA聚合酶
转录
提醒　启动子、终止子、起始密码子、终止密码子比较
项目 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子
本质 DNA DNA mRNA mRNA
位置 目的基因 上游 目的基因 下游 mRNA 首端 mRNA
尾端
功能 RNA聚合酶识别和结合的部位,驱动基因转录出mRNA 使转录在所需要的地方停下来 翻译的起始信号(编码氨基酸) 翻译的结束信号(正常情况下,不编码氨基酸)
(3)基因表达载体的构建过程。
同种
产生
相同末端
DNA连接酶
2.(选择性必修3 P80图3-6拓展)重组DNA分子中标记基因的作用是
。
3.(选择性必修3 P80图3-6拓展)在构建基因表达载体时,目的基因的序列中不能含有用到的限制酶的识别序列,原因是 。
细读教材
将含
目的基因的细胞筛选出来
防止目的基因被限制酶破坏
3.将目的基因导入受体细胞
T-DNA
受精卵
提醒　农杆菌转化法中涉及的基因的两次拼接和两次导入:第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上,第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上;第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌,第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA导入受体细胞。
4.(选择性必修3 P81资料卡拓展)在用农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞的过程中,一定要将目的基因插入Ti质粒的T-DNA上的原因是
。
细读教材
Ti质粒上的T-DNA也称为可转移的DNA,可转移至受体细胞,并且整合到
受体细胞染色体DNA上
4.目的基因的检测与鉴定
PCR
抗原—抗
体杂交
(1)(2025·河北卷,2)PCR过程中DNA双链的解旋需要酶的催化。(　　)
【判断正误】
×
【提示】 PCR过程中DNA双链的解旋是通过高温实现的,不需要酶来解旋。
(2)(经典高考题)载体上的抗性基因有利于筛选含重组DNA的细胞和促进目的基因的表达。(　　)
×
【提示】 载体上的抗性基因有利于筛选含重组DNA的细胞,但不能促进目的基因的表达。
(3)(经典高考题)设计扩增目的基因的引物时不必考虑表达载体的序列。
(　　)
×
【提示】 设计扩增目的基因的引物时要考虑表达载体相关序列,从而保证目的基因能与表达载体相连接及正常表达。
(4)(经典高考题)载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因。
(　　)
×
【提示】 载体质粒通常采用抗生素抗性基因作为筛选标记基因。
(5)(经典高考题)抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体上也未必能正常表达。(　　)
√
【情境·思维·深析】
胰岛素促进因子(PDX-1)能诱导干细胞分化为胰岛B细胞,为糖尿病的治疗提供了新的思路。科研人员欲构建PDX-1基因的克隆载体用于诱导干细胞分化。回答下列问题。
(1)cDNA的合成:从基因文库中检索小鼠PDX-1基因的mRNA序列,设计上下游引物并在引物的 端分别添加HindⅢ和BamHⅠ限制酶切割序列。以提取的RNA为模板进行逆转录,为防止RNA被水解,需要在逆转录体系中加入 。然后进行PCR扩增,取PCR产物进行凝胶电泳。
RNA酶抑制剂
5′
(2)克隆载体的构建:回收凝胶中目的基因片段,并进行纯化。选用的克隆载体结构如图所示,其中LacZ基因编码产生的酶可以分解培养基中的X-gal,产生蓝色物质,使菌落呈现蓝色,否则菌落为白色。用
酶将cDNA纯化物与该克隆载体连接形成重组DNA分子。重组的效率除了与温度、pH等外界环境因素有关,还与 (答出1点即可)等有关。将重组DNA分子导入用 处理过的感受态大肠杆菌中进行转化,将转化后的大肠杆菌接种于含 的固体培养基中,37 ℃恒温培养箱中培养24 h,其中 色菌落为阳性克隆。
限制酶HindⅢ和BamHⅠ、DNA连接(或限制酶、DNA连接)
酶的浓度、载体和目的基因的浓度及比例
氯化钙
氨苄青霉素和X-gal
白
(3)科研人员将含有PDX-1基因的腺病毒载体转染人的干细胞,使其分化为胰岛B细胞,该过程中 基因得到了表达。该细胞可用于治疗由
引起的糖尿病。
胰岛素
胰岛素缺乏
考向2　通过分析具体情境中PCR的条件及过程,考查科学思维
3.(2025·广东卷,7)Solexa测序是一种将PCR与荧光检测相结合的高通量测序技术。为了确保该PCR过程中,DNA聚合酶催化一个脱氧核苷酸单位完成聚合反应后,DNA链不继续延伸,应保护底物中脱氧核糖结构上的(　　)
A.1′-碱基 B.2′-氢
C.3′-羟基 D.5′-磷酸基团
核心考向·突破
把握方向·训练到位
C
【解析】 DNA复制时,子链延伸的方向是从5′端到3′端,即下一个脱氧核糖核苷酸的5′-磷酸基团与上一个脱氧核糖核苷酸的3′-羟基进行连接,故为了DNA聚合酶催化一个脱氧核苷酸单位完成聚合反应后,DNA链不继续延伸,应保护底物中脱氧核糖结构上的3′-羟基。
4.(2025·江苏如皋调研)如图表示PCR过程中某个阶段反应体系的情况,①②③④表示相关物质,L、R表示方向。下列叙述正确的是(　　)
A.DNA体内复制与体外复制(PCR)所需能量均只来自dNTP
B.PCR过程中需要添加缓冲液,其中所含的Mg2+可用于激活DNA聚合酶
C.②链从L到R的方向为3′→5′,①②链均可作为子链合成的模板
D.引物③的5′端添加了某序列,至少需经3次循环才可获得该序列的双链产物
B
【解析】 体内DNA复制过程中解旋由ATP提供能量,体外DNA复制(PCR)过程中解旋加热提供能量;PCR过程中需要添加缓冲液,缓冲液中的Mg2+可用于激活耐高温的DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶);根据DNA两条链反向平行的特点,结合图中引物的方向可知,②链从L到R的方向为5′→3′;引物③的5′端添加了某序列,经过第1次循环,得到的1个DNA分子中有1条链含有该序列,经过第2次循环,得到的1个DNA分子的两条链均含有该序列,所以至少需经2次循环可获得该序列的双链产物。
PCR技术和体内DNA复制的比较
归纳总结
考向3　通过分析基因工程的基本操作,考查科学思维
5.(2025·福建卷,10)紫杉醇是红豆杉的代谢产物,会干扰纺锤体的正常功能。科研人员利用农杆菌将紫杉醇合成的相关基因导入烟草中,实现了紫杉醇前体物质的合成。下列叙述错误的是(　　)
A.农杆菌转化前应先使用Ca2+处理烟草细胞
B.紫杉醇合成的相关基因会整合到烟草染色体DNA上
C.紫杉醇因干扰肿瘤细胞的有丝分裂而具有抗癌作用
D.该技术的突破有利于红豆杉天然资源的保护
A
【解析】 利用含重组Ti质粒的农杆菌转化烟草细胞前,不需要使用Ca2+处理烟草细胞;利用农杆菌转化植物细胞时,农杆菌中重组Ti质粒上的含紫杉醇合成相关基因的T-DNA能转移到烟草细胞中,并将相关基因整合到烟草细胞的染色体DNA上;由题干可知,紫杉醇会干扰纺锤体的正常功能,从而影响肿瘤细胞的有丝分裂,抑制肿瘤细胞增殖,起到抗癌作用;生产紫杉醇的传统方法是从红豆杉的树皮和树叶中提取,会破坏红豆杉植物资源,而利用转基因烟草合成紫杉醇的前体物质用于生产紫杉醇,有利于红豆杉天然资源的保护。
6.(2025·陕晋青宁卷,21)马铃薯作为重要农作物,提高其冷耐受性可拓展优质马铃薯的种植区域。我国科研人员发现,野生马铃薯中S基因的表达与其冷耐受性调控有关,将该基因导入栽培马铃薯中可显著增强其抗寒能力。回答下列问题。
EcoRⅠ
BamHⅠ
SalⅠ
XbaⅠ
(1)PCR扩增目的基因时,需要模板DNA、引物、　　　　　　　　　、含Mg2+的缓冲液和耐高温的DNA聚合酶。DNA聚合酶在PCR的　　　　步骤中起作用。
4种脱氧核苷酸
延伸
【解析】 (1)PCR扩增目的基因时,需要模板DNA、引物、4种脱氧核苷酸、含Mg2+的缓冲液和耐高温的DNA聚合酶。PCR一般分为变性、复性和延伸三步,其中DNA聚合酶在PCR的延伸步骤中起作用。
(2)图中标识了载体和S基因中限制酶的切割位点。为将S基因正确插入载体, PCR扩增S基因时需在引物的　　　　(填“5′端”或“3′端”)添加限制酶识别序列,结合上表分析,上游引物应添加的碱基序列是5′-　　　　　　　　 -3′,切割载体时应选用的两种限制酶是　　　 　　　　　　,PCR扩增产物和载体分别被限制酶切割后,经纯化和连接,获得含S基因的表达载体并导入农杆菌。
5′端
AGATCT
BamHⅠ、EcoRⅠ
【解析】 (2)为了使目的基因能够被限制酶切割,扩增目的基因时,需要在引物的5′端添加限制酶的识别序列。结合图表分析,在载体的启动子和终止子之间有BamHⅠ、EcoRⅠ和XbaⅠ的识别序列,而 S基因内部含有XbaⅠ、NdeⅠ和BamHⅠ的识别序列,要用BamHⅠ、EcoRⅠ或XbaⅠ切割载体,又不能用XbaⅠ、NdeⅠ或BamHⅠ切割S基因,再根据各种限制酶的识别序列及切割位点可知,需要用BamHⅠ、EcoRⅠ切割载体,用能与BamHⅠ产生相同黏性末端的BglⅡ和EcoRⅠ切割S基因,故PCR扩增S基因时需在上游引物添加的碱基序列是5′-AGATCT-3′。
(3)用携带S基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织时,基因表达载体中
T-DNA进入愈伤组织细胞,将S基因整合到
　　　　　　　　,抗性基因　　　　可用于筛选成功转化的愈伤组织。该愈伤组织经　　　　　形成芽、根,继续培育可获得抗寒能力显著增强的马铃薯植株。
栽培马铃薯愈伤组织细胞的
染色体DNA上
2
再分化
【解析】 (3)T-DNA属于可转移DNA,用携带S基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织时,基因表达载体中T-DNA进入愈伤组织细胞,将S基因整合到栽培马铃薯愈伤组织细胞的染色体DNA上,抗性基因1位于T-DNA外部,用于筛选含有重组载体的农杆菌,而抗性基因2位于T-DNA内部,可用于筛选成功转化的愈伤组织。该愈伤组织经再分化形成芽、根,继续培育可获得抗寒能力显著增强的马铃薯植株。
1.根据质粒的特点确定限制酶的种类
归纳总结
2.根据限制酶的切割位点选择Ti质粒
图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取,丙Ti质粒宜选取(设切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ),分析如下:
归纳总结
考点三
活动:DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定
1.DNA的粗提取与鉴定
(1)基本原理。
必备知识·梳理
落实概念·夯实基础
不溶于
2 mol/L
二苯胺
(2)操作流程。
体积相等的、预冷的体积
分数为95%
2 molL的NaCI
二苯胺
1.(选择性必修3 P74～75探究·实践拓展)过滤研磨液用纱布不用滤纸的原因是 。
细读教材
DNA会吸附在滤纸上,影响提取DNA的量
提醒　①加入酒精和用玻璃棒搅拌时,动作要轻缓,以免加剧DNA分子的断裂,导致DNA分子不能形成丝状沉淀。
②本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料,原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核(无DNA)。
2.DNA片段的扩增及电泳鉴定
(1)实验基础。
①PCR原理:利用了 原理,通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。
②电泳:DNA分子具有可解离的基团,在一定的pH下,这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下,这些带电分子会向着与它所带电荷 的电极移动,这个过程就是电泳。
③PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的 等有关。
DNA的热变性
相反
大小和构象
(2)PCR实验操作步骤。
微量移液器
底部
(3)DNA的电泳鉴定。
微量移液器
紫外灯
2.(选择性必修3 P84～85探究·实践拓展)如果电泳鉴定结果未出现扩增条带,可能的原因有
。
细读教材
模板DNA含有蛋白质杂质或Taq DNA聚合酶的抑制剂;
Taq DNA聚合酶失活;引物出现质量问题,浓度不合适;Mg2+浓度过低;变性
温度低,变性时间短等
(1)(2025·四川卷,5)土豆DNA溶于酒精后,与二苯胺试剂混合呈蓝色。(　　)
【判断正误】
×
【提示】 DNA不溶于酒精,在沸水加热条件下,DNA与二苯胺试剂反应呈
蓝色。
(2)(2025·湖南卷,2)DNA的粗提取与鉴定实验中,可用“猪成熟红细胞”替代“猪肝细胞”。(　　)
×
【提示】 猪是哺乳动物,猪成熟红细胞没有细胞核,几乎不含DNA,因此不能用“猪成熟红细胞”替代“猪肝细胞”进行DNA的粗提取与鉴定实验。
(3)(2024·河北卷,13)配制PCR反应体系时,加入等量的4种核糖核苷酸溶液作为扩增原料。(　　)
×
【提示】 PCR过程中,应加入4种脱氧核糖核苷酸作为PCR扩增原料。
(4)(2022·山东卷,13)粗提取DNA时的过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解。(　　)
√
考向4　围绕实验基本操作及注意事项,考查科学探究
7.(2024·安徽卷,14)下列关于“DNA粗提取与鉴定”实验的叙述,错误的是
(　　)
A.实验中如果将研磨液更换为蒸馏水,DNA提取的效率会降低
B.利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异,可初步分离DNA
C.DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同,该原理可用于纯化DNA粗提物
D.将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应,可检测溶液中是否含有蛋白质
杂质
核心考向·突破
把握方向·训练到位
D
【解析】 研磨液有利于DNA的溶解,更换为蒸馏水,DNA提取的效率会降低;DNA不溶于酒精溶液,但细胞中的某些蛋白质溶于酒精,利用这一原理可初步分离DNA;DNA在NaCl溶液中的溶解度随着NaCl浓度的变化而改变,该原理可用于纯化DNA粗提物;在沸水浴的条件下,DNA遇二苯胺会被染成蓝色,二苯胺试剂用于鉴定DNA。
8.(2025·全国卷,6)琼脂糖凝胶电泳常用于核酸样品的分析,样品1～4的电泳结果如图所示(“+”“-”分别代表电泳槽的阳极和阴极)。已知样品1和2中的DNA分子分别是甲和乙,甲只有限制酶R的一个酶切位点,样品3和4中有一个样品是甲的酶切产物。下列叙述错误的是(　　)
A.配制琼脂糖凝胶时需选用适当的缓冲溶液
B.该实验条件下甲、乙两种DNA分子均带负电荷
C.甲、乙两种DNA分子所含碱基对的数量可能不同
D.据图推测样品3可能是甲被酶R完全酶切后的产物
D
【解析】 配制琼脂糖凝胶时需选用适当缓冲溶液,以维持电泳过程中体系的pH稳定,保证核酸分子正常移动;电泳时,甲、乙均向“+”极移动,说明在该实验条件下甲、乙两种DNA分子均带负电荷;电泳中,DNA分子的迁移速率与其分子大小、构象等有关,甲、乙电泳条带位置虽然相同,但碱基对的数量可能不同;甲只有限制酶R的一个酶切位点,已知样品3和4中有一个是甲的酶切产物,说明甲被酶R完全酶切后得到2种DNA片段(2个条带),这两个条带的碱基对比甲要少,电泳时移动速度更快,所以据图推测样品4才是甲被酶R完全酶切后的产物。
9.(2025·江苏卷,23节选)川金丝猴是我国特有的珍稀濒危物种,为了更好地保护这一物种,研究者开展了以下研究。请回答下列问题。
(1)研究者为了进一步研究川金丝猴的食性,采集其粪便样本,进行DNA提取、扩增,部分实验过程如下。请完成下表:
实验目的 简要操作步骤
释放DNA 在去杂后的样本中加入裂解液
析出DNA 离心后取①　　　　,加入乙醇
②　　　　　 在沉淀物中加入纯水
扩增DNA 将③　　　 　　　　　　　　　　　　　　　　　、引物、样本DNA、含有Mg2+缓冲液、超纯水等加入PCR管中,进行PCR
上清液
溶解DNA
4种脱氧核苷酸(或dNTP)、耐高温的DNA聚合酶
【解析】 (1)研究者为了进一步研究川金丝猴的食性,采集其粪便样本,进行DNA提取、扩增,部分实验过程为释放DNA:在去杂后的样本中加入裂解液,细胞裂解,内容物释放→析出DNA:DNA呈溶解状态,离心后取上清液,再加入乙醇(DNA不溶于酒精)→溶解DNA:在沉淀物中加入纯水→扩增DNA:PCR扩增DNA,需要将4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶、引物、样本DNA、含有Mg2+缓冲液、超纯水等加入PCR管中,进行PCR。
(2)为分析川金丝猴摄食的植物种类,研究者设计一对引物F和R,能同时扩增出不同种植物叶绿体中的rbcL基因片段,是因为引物F和R的碱基能与rbcL基因的保守序列的碱基
　　　　　　。用引物F和R对4种植物样本甲～丁的叶绿体基因组DNA进行扩增测序,结果如下图所示。若对4个样本的扩增产物进行DNA电泳条带分析,能检出的样本是
　　　　　　。研究者用引物F和R对川金丝猴粪便DNA进行扩增并测序,得到的序列有图中的3种序列,据此可确定川金丝猴摄食的植物有　　　　。若要更准确鉴定出川金丝猴摄食的植物,参照叶绿体基因库,还需选用　　　　　　　　　　 　　　的保守序列设计引物,对川金丝猴粪便DNA进行扩增、测序分析。
互补配对
植物丁
丙、丁
注:“·”表示与植物甲对应位置上相同的碱基,“……”表示省略200个碱基。
叶绿体基因组中其他DNA片段
【解析】 (2)为分析川金丝猴摄食的植物种类,研究者设计一对引物F和R,能同时扩增出不同种植物叶绿体中的rbcL基因片段,是因为引物F和R的碱基能与rbcL基因的保守序列的碱基互补配对,从而在耐高温的DNA聚合酶的作用下延伸子链。用引物F和R对4种植物样本甲～丁的叶绿体基因组DNA进行扩增测序,结果如题图所示,因此能检出的样本是植物丁。研究者用引物F和R对川金丝猴粪便DNA进行扩增并测序,得到的序列有图中的3种序列,说明摄食的植物有3种,甲和乙的序列相同,不能确定,故据此可确定川金丝猴摄食的植物有丙和丁。选用叶绿体基因组中其他DNA片段的保守序列设计引物,对川金丝猴粪便DNA进行扩增、测序分析,能更准确鉴定出川金丝猴摄食的植物。
演练真题·感悟高考
1.(2024·山东卷,13)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验,下列说法正确的是
(　　)
A.整个提取过程中可以不使用离心机
B.研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后,应充分摇匀再倒入烧杯中
C.鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变
D.仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰
A
【解析】 在DNA的粗提取与鉴定实验中,可将获得的研磨液用纱布过滤后,在4 ℃的冰箱中放置几分钟,再取上清液,也可以直接将研磨液用离心机进行离心后取上清液;研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后,DNA在上清液中,应取上清液倒入烧杯中;鉴定过程中用沸水浴加热,DNA双螺旋结构会发生改变;仅设置一个对照组即可以排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰。
2.(2024·黑吉辽卷,7)关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验,下列叙述正确的是(　　)
A.琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小
B.凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置
C.在同一电场作用下,DNA片段越长,向负极迁移速率越快
D.琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来
A
【解析】 琼脂糖凝胶的浓度会影响DNA分子在凝胶中的迁移率和分辨率,琼脂糖凝胶的浓度通常是根据所需分离的DNA片段大小来选择的; 凝胶载样缓冲液指示剂通常是一种颜色较深的染料,可以作为电泳进度的指示分子,其不会与DNA结合,不能用于指示DNA分子的具体位置;在琼脂糖凝胶电泳中,当电场作用时,DNA片段实际上是向正极迁移的,而不是向负极迁移,同时,DNA片段的迁移速率与其大小成反比,即DNA片段越长,迁移速率越慢;琼脂糖凝胶中的DNA分子通过染色,可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。
3.(2025·福建卷,15)质粒P含有2个EcoRⅠ、1个SacⅠ和1个BamHⅠ的限制酶切割位点。已知BamHⅠ位点位于2个EcoRⅠ位点的正中间,用上述3种酶切割该质粒,酶切产物的凝胶电泳结果如图,其中泳道①条带是未酶切的质粒P,泳道②③④条带为3种单酶切产物,泳道⑤⑥⑦条带为双酶切产物。下列叙述正确的是(　　)
A.DNA分子在该凝胶的迁移方向是从电源正极到负极
B.可确认泳道②③条带分别是SacⅠ和EcoRⅠ的单酶切产物
C.泳道⑤条带是SacⅠ和EcoRⅠ的双酶切产物
D.泳道①②说明未酶切质粒的碱基数小于酶切后质粒的碱基数
C
【解析】 DNA分子因含磷酸基团在电泳缓冲液中带负电荷,在电场作用下DNA分子由电源负极向电源正极移动;P质粒有2个EcoRⅠ限制酶的切割位点,单酶切后的产物最小,电泳时迁移速度较快,可推知泳道③条带是EcoRⅠ限制酶单酶切产物,而泳道③只有一条条带,由此可以推出EcoRⅠ的两个酶切位点大致平分质粒P,泳道②条带和泳道④条带位置一致,无法区分泳道②条带是SacⅠ还是BamHⅠ的单酶切产物;泳道⑤⑥⑦条带为双酶切产物,BamHⅠ位点位于2个EcoRⅠ位点的正中间,结合泳道③条带可推出,泳道⑦条带是EcoRⅠ和BamHⅠ的双酶切产物,泳道⑤条带是EcoRⅠ和SacⅠ的双酶切产物,泳道⑥条带为SacⅠ和BamHⅠ的双酶切产物;限制酶只水解磷酸二酯键,酶切后的质粒碱基数不会改变。
4.(2023·湖北卷,4)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒,构建基因表达载体(重组质粒),并转化到受体菌中。下列叙述错误的是(　　)
A.若用HindⅢ酶切,目的基因转录的产物可能不同
B.若用PvuⅠ酶切,在含Tet(四环素)培养基中生长的菌落,不一定含有目的基因
C.若用SphⅠ酶切,可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D.若用SphⅠ酶切,携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落
D
【解析】 若用HindⅢ酶切质粒和含有目的基因的DNA片段,目的基因有正向连接和反向连接两种连接形式,因此转录的产物可能不同;若用PvuⅠ酶切,重组质粒和质粒中都有四环素抗性基因(TetR),因此在含Tet(四环素)培养基中生长的菌落,不一定含有目的基因;DNA凝胶电泳技术可以分离不同大小的DNA片段,重组质粒的大小与质粒不同,能够鉴定重组质粒构建成功与否;SphⅠ的酶切位点位于四环素抗性基因中,若用SphⅠ酶切,重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因(AmpR),因此携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)的培养基中能形成菌落,在含Tet的培养基中不能形成菌落。
5.(2025·广东卷,21)大肠杆菌是重要工业菌株之一,其培养过程可分为快速生长期和生长稳定期两个阶段。为了通过调节蛋白质合成与降解速率来动态调控代谢途径关键酶的蛋白量,使细胞适配不同阶段的生产需求,研究者设计了两种质粒,并以稳定性好的红色荧光蛋白mKate2为模式蛋白,测试质粒功能。回答下列问题。
(1)研究者首先构建质粒①(图a)用于在细胞内表达C-末端带SsrA短肽的mKate2,将质粒导入感受态细胞后,在添加抗生素的选择培养基上培养。根据培养基上菌落的生长状况,结合PCR及　　　　检测,
筛选获得重组菌株W1。
荧光
【解析】 (1)在基因工程中,筛选重组菌株时,常用PCR检测目的基因是否导入受体细胞以及是否转录,由于目的基因能表达出红色荧光蛋白,故还可对菌落进行荧光检测以判断目的基因是否表达出相应的蛋白质。
(2)将W1在适宜条件下进行摇瓶培养,定时取样检测培养液中细胞密度,方法有　　　　 　　　　　　　　(答一种)。接种前需检测液体培养基的荧光强度,其作用是　 　　　　　　　　　　 　 　。培养结果(图b)表明,进入生长稳定期后荧光强度快速下降,原因是
　 。
稀释涂布平板法、显微镜直接计数法
排除培养基本身荧光对实验结果的干扰
PGeo在生长稳定期停止基因转录,且C-末端带有SsrA短肽的mKate2被大肠
杆菌内源蛋白酶系统特异性识别并降解
【解析】 (2)检测培养液中细胞密度常用的方法有稀释涂布平板法(通过统计平板上的菌落数来估算细胞数量,进而得到细胞密度)、显微镜直接计数法(利用血细胞计数板在显微镜下直接对细胞进行计数)。接种前检测液体培养基的荧光强度,是为了排除培养基本身荧光对实验结果的干扰。进入生长稳定期后,由于PGeo在生长稳定期停止基因转录,所以不再合成带有SsrA短肽的mKate2,且C-末端带有SsrA短肽的蛋白质可被大肠杆菌内源蛋白酶系统特异性识别并降解,导致荧光强度快速下降。
(3)研究者选用启动子PX、X基因(编码阻遏蛋白X,阻遏PX开启转录),重新构建质粒②(图a),导入野生型大肠杆菌中获得重组菌株W2。在适宜条件下摇瓶培养,W2的生长趋势不变,培养期间荧光强度的变化趋势为
　 。
快速生长期荧光强度较弱,生长稳定期快速增加后保持稳定
【解析】 (3)在重组菌株W2中,启动子PX被阻遏蛋白X阻遏转录。在培养初期,细胞处于快速生长阶段,阻遏蛋白X的量相对充足,PX启动子受到较高程度的抑制,合成的mKate2较少,使荧光强度上升不明显;随着培养的进行,阻遏蛋白X的合成减少降解增多,对PX启动子的阻遏作用减弱,mKate2转录,荧光强度快速增加,并趋于稳定。
(4)莽草酸是一种重要工业化学品,其胞内合成代谢途径见图c。由于野生型大肠杆菌胞内酶A活性弱,且莽草酸会被快速转化为细胞生长必需物,因此细胞中无法大量积累莽草酸。为了保证细胞正常生长,并在生长稳定期实现莽草酸的大量积累,利用上述两种质粒的调控功能,结合野生型菌株遗传物质的改造,提出重组生产菌株构建思路:
　。
将质粒①中的mKate2基因替换成酶B基因,将质粒②中的mKate2基因替换成
酶A基因,并将上述两种质粒导入敲除酶B基因的野生型大肠杆菌中
【解析】 (4)为了保证细胞正常生长,并在生长稳定期实现莽草酸的大量积累,需满足以下条件。条件1:为了保证细胞正常生长,必须保证酶A和酶B在快速生长期都正常。条件2:为了在生长稳定期有大量莽草酸,需要使酶A增加、酶B减少。为满足条件2,野生型大肠杆菌应无法产生酶B,故敲除野生型大肠杆菌的酶B基因。为保证细胞生长,可以将质粒①中的mKate2基因替换成酶B基因,保障快速生长期酶B的供应,也能满足稳定生长期酶B减少的要求。将质粒②中的mKate2基因替换成酶A基因,使酶A基因在稳定生长期大量表达,这样能在生长稳定期实现莽草酸的大量积累。
谢谢观赏第54讲　基因工程的基本工具和基本操作程序
(时间:30分钟)
1.(2025·河南联考)下列是几种限制酶的识别序列及切割位点(Y=C或T,R=A或G)。下列相关叙述正确的是(　　)
限制酶 识别序列及切割位点
HindⅡ 5′-GTY↓RAC-3′
AluⅠ 5′-AG↓CT-3′
BamHⅠ 5′-G↓GATCC-3′
Sau3AⅠ 5′-↓GATC-3′
A.限制酶切割一次需切断2个磷酸二酯键,增加2个游离的磷酸基团
B.一种限制酶只能识别一种核苷酸序列,并在特定位点切割
C.AluⅠ切割后的DNA片段可选用E.coliDNA连接酶连接
D.BamHⅠ和Sau3AⅠ切割形成的片段进行重组后,BamHⅠ和Sau3AⅠ均不能识别并切割
【答案】 A
【解析】 限制酶切割一次需切断2个磷酸二酯键,增加2个游离的磷酸基团;一种限制酶不一定只识别一种核苷酸序列,如HindⅡ;用AluⅠ切割得到的是平末端,E.coliDNA连接酶连接具有平末端的DNA片段的效率远低于T4 DNA连接酶,因此应用T4 DNA连接酶连接AluⅠ切割后的DNA片段;BamHⅠ和Sau3AⅠ切割形成的片段进行重组后,BamHⅠ不能识别并切割重组片段,而Sau3AⅠ仍可识别并切割重组片段。
2.(2026·四川内江一模)下列关于“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述,错误的是(　　)
A.可以选择新鲜洋葱、香蕉、菠菜或猪肝等作为实验材料
B.可利用DNA和蛋白质在酒精中溶解度差异初步分离DNA
C.本实验需要设置对照组来排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰
D.使用二苯胺试剂能有效测定不同提取液中DNA的纯度差别
【答案】 D
【解析】 可使用二苯胺试剂鉴定DNA的存在,但不能用于测定不同提取液中DNA的纯度差别。
3.(2025·山东青岛三模)在构建基因表达载体时,需要遵循一定的规则。同时面对实际问题,可利用分子生物学原理加以解决。下列说法正确的是(　　)
A.利用不同的限制酶对载体和目的基因进行剪切而形成的黏性末端无法再次连接
B.若要降低细胞中某基因的表达,可将该基因的编码序列反向连接到基因表达载体中
C.如果目的基因没有合适的酶切位点,可以在引物3′端末尾设计加入酶切位点
D.表达载体中标记基因不需要启动子,可以在受体细胞中持续表达
【答案】 B
【解析】 同尾酶识别的核苷酸序列不同,但是产生的黏性末端相同,因此用同尾酶切割载体和目的基因,可以产生相同的黏性末端而进行互补再次连接;要降低细胞中某基因的表达,可将该基因的编码序列反向连接到基因表达载体中,转录形成的mRNA可与原基因转录的mRNA碱基互补配对,抑制该基因的翻译过程,从而使该基因表达量下降;由于DNA子链延伸时总是从5′端到3′端,如果目的基因没有合适的酶切位点,可以在引物5′端末尾设计加入酶切位点;表达载体中标记基因和目的基因都需要合适的启动子才能表达。
4.(2025·广东佛山二模)某兴趣小组以香蕉为原材料进行DNA粗提取、扩增及电泳鉴定系列实验。下列叙述正确的是(　　)
A.提取DNA时,研磨后需用滤纸进行过滤
B.可利用DNA在酒精中溶解度大的特点来提取DNA
C.琼脂糖熔化前需将适量的核酸染料加入并进行混匀
D.若DNA带负电,则凝胶加样孔应位于电泳槽负极侧
【答案】 D
【解析】 研磨液需用纱布进行过滤,而不是用滤纸,以保证提取到更多的DNA;蛋白质可溶于酒精,而DNA不溶于酒精,所以在提取DNA时加入酒精,使溶于酒精的蛋白质等物质溶解,而让DNA析出;在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化,稍冷却后加入适量核酸染料混匀;靠近加样孔的一端为负极,接通电源,带负电的DNA分子向正极移动而使DNA逐渐分离。
5.(2025·湖北武汉模拟)油菜的绿叶对黄化叶为显性。与绿叶基因相比,黄化叶基因有一个碱基对发生了改变,从而出现一个限制酶B的酶切位点。为鉴定某绿叶油菜的基因型,提取其DNA进行了PCR和电泳。下列叙述正确的是(　　)
A.需设计能与目的基因结合的双链DNA作为PCR引物
B.应在PCR扩增体系中添加Mg2+,以激活DNA聚合酶
C.可适当降低复性的温度,以减少电泳中非特异性条带的产生
D.用限制酶B处理目的基因后进行电泳,若有2条电泳条带可判断为杂合子
【答案】 B
【解析】 PCR引物一般是单链DNA;DNA聚合酶都需要Mg2+激活,故PCR反应缓冲液中一般要添加Mg2+;复性温度过低会导致引物与模板链非特异性结合,会增加电泳中非特异性条带;若该绿叶油菜为杂合子,则其含绿叶基因和黄化叶基因,绿叶基因不能被限制酶B切割,黄化叶基因被限制酶B酶切后产生2个片段,故应出现3条电泳条带。
6.(2025·福建泉州期中)科研人员将寒带地区海鱼中的抗冻基因转入番茄细胞中,成功培育出抗冻番茄。如图为培育过程中使用的Ti质粒示意图,其中Vir区的基因活化能促进T-DNA的加工和转移,下列叙述正确的是(　　)
A.构建基因表达载体时,最好选择限制酶Ⅱ和限制酶Ⅲ来切割质粒
B.利用PCR扩增抗冻基因,需提前检测抗冻基因的全部碱基序列
C.Vir区的基因活化促进抗冻基因整合到番茄细胞的染色体DNA上
D.利用含卡那霉素的培养基可筛选出成功导入抗冻基因的番茄细胞
【答案】 C
【解析】 Vir区的基因活化能促进T-DNA的加工和转移,使用限制酶Ⅱ会破坏Vir区的基因,不能选限制酶Ⅱ;使用PCR技术扩增抗冻基因,只需要知道抗冻基因两端碱基序列,并据此设计引物;农杆菌侵染植物细胞后,Ti质粒上的T-DNA能转移到被侵染的细胞并整合到该细胞的染色体DNA上,所以Vir区基因活化可促进插入T-DNA中的抗冻基因整合到番茄细胞的染色体DNA上;卡那霉素抗性基因不在T-DNA序列中,为筛选成功导入抗冻基因的番茄细胞,最好在培养基中添加四环素,可以筛选成功导入抗冻基因的番茄细胞。
7.(2025·江西南昌联考)同尾酶指识别位点不同但能切出相同黏性末端的限制酶;同裂酶指具有相同识别序列的限制酶(切割位点相同或不同均可)。几种基因工程中常用的限制酶如下表所示。下列叙述错误的是(　　)
限制酶的名称 识别和切割位点
HinPⅡ 5′G↓CGC3′
GlaⅠ 5′GC↓GC3′
HhaⅠ 5′GCG↓C3′
HpaⅡ 5′C↓CGG3′
NarⅠ 5′GG↓CGCC3′
A.HinPⅡ和HhaⅠ为同裂酶,切出的黏性末端不同
B.HinPⅡ和HpaⅡ切割的产物连接后,其序列不能被GlaⅠ切割
C.HinPⅡ和NarⅠ为同尾酶,它们切割的产物连接后的序列不能被GlaⅠ切割
D.某质粒仅含1个GlaⅠ的识别位点,则该质粒能被NarⅠ切割的概率为1/16
【答案】 C
【解析】 同裂酶是指具有相同识别序列的限制酶,HinPⅡ识别和切割位点是
5′G↓CGC3′,HhaⅠ识别和切割位点是5′GCG↓C3′,二者识别序列相同,所以HinPⅡ和HhaⅠ为同裂酶,两者的切割位点不同,切出的黏性末端不同;HinPⅡ识别和切割位点是
5′G↓CGC3′,HpaⅡ识别和切割位点是5′C↓CGG3′,二者切割产物连接后的序列为
5′GCGG3′,GlaⅠ识别和切割位点是5′GC↓GC3′,说明连接后的5′GCGG3′序列不能被GlaⅠ识别和切割;HinPⅡ识别和切割位点是5′G↓CGC3′,NarⅠ识别和切割位点是
5′GG↓CGCC3′,HinPⅡ和NarⅠ切割产物连接后的序列为5′GCGCC3′,GlaⅠ识别和切割位点是5′GC↓GC3′,即该序列能被GlaⅠ识别和切割;GlaⅠ识别和切割位点是
5′GC↓GC3′,NarⅠ识别和切割位点是5′GG↓CGCC3′,在仅含1个GlaⅠ识别位点的情况下,该质粒能被NarⅠ切割的概率为1/16(因为在GlaⅠ识别位点基础上,前后各增加一个碱基,共16种可能情况,其中有一种是NarⅠ的识别位点)。
8.(2025·江西萍乡三模)水杨酸加氧酶可催化石油污染物降解,该酶由bphA2cA1c基因编码。从鞘氨醇单胞菌属的B1菌株中获取bphA2cA1c基因后,与大肠杆菌质粒结合可构建基因表达载体,在该过程中使用限制酶切割DNA时存在“单酶切法”和“双酶切法”(如图)。在只考虑产物两两结合的情况下,下列相关叙述正确的是(　　)
A.bphA2cA1c基因自连可能是“单酶切法”对应的最小产物
B.只有“双酶切法”才会使bphA2cA1c基因与质粒正确连接
C.“单酶切法”对应的产物种类少于“双酶切法”对应的产物种类
D.“双酶切法”后,bphA2cA1c基因就可表达出水杨酸加氧酶
【答案】 A
【解析】 使用“单酶切法”处理含bphA2cA1c基因的DNA片段和质粒,获得的DNA片段末端是相同的,因此其两两结合产物有:目的基因自身连接物、质粒自身连接物、目的基因与质粒正向连接物和目的基因与质粒的反向连接物,而使用“双酶切法”处理含bphA2cA1c基因的DNA片段和质粒,其两两结合产物通常只有目的基因与质粒的正向连接物。质粒的相对分子质量大于目的基因,因此bphA2cA1c基因自身连接可能是“单酶切法”对应的最小产物;将通过“双酶切法”得到的含bphA2cA1c基因的重组质粒导入受体菌,才可能表达出水杨酸加氧酶。
9.(2025·山东聊城联考)酵母菌转录激活因子GAL4的BD部分负责与基因上游的激活序列(UAS)结合,GAL4的AD部分负责激活UAS下游基因的转录过程。只有当BD与AD在空间上接近时才能发挥转录激活功能,其机制如图1。报告基因LacZ在酵母菌细胞内编码的酶可对无色底物Xgal进行切割并产生蓝色物质,使酵母菌菌落呈蓝色。将M基因与BD基因连接、N基因与AD基因连接,分别构建融合基因的表达载体(如图2)并导入酵母菌,可用于研究蛋白M和N的相互作用。下列分析正确的是(　　)
A.融合蛋白BDM或融合蛋白ADN可单独激活报告基因表达
B.受体酵母菌是BD基因缺陷型或AD基因缺陷型酵母菌
C.需要将两种融合基因的表达载体导入同一个酵母菌细胞内
D.若转基因酵母菌的菌落呈白色,则说明蛋白M和N相互结合
【答案】 C
【解析】 已知只有当BD与AD在空间上接近时才能发挥转录激活功能,融合蛋白BDM或融合蛋白ADN不能单独激活报告基因表达;受体酵母菌应是BD基因和AD基因共同缺陷型,若只有一种基因缺陷,则导入外源的BDM或ADN可能会驱动报告基因的表达,不能用于研究蛋白M和蛋白N的相互作用;需要将两种融合基因的表达载体导入同一个酵母菌细胞内,若蛋白M和N能够相互结合,则BD蛋白和AD蛋白可以接近,能驱动报告基因的表达而使酵母菌菌落呈蓝色,若蛋白M和N不能相互结合,则BD蛋白和AD蛋白无法接近,不能驱动报告基因的表达而使酵母菌菌落呈白色。
10.(2025·山东卷,25)种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti质粒的改造,利用农杆菌转化法将Ti质粒上的TDNA随机整合到小麦基因组中,筛选到2个种子休眠相关基因的插入失活纯合突变体。与野生型相比,突变体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息已知。
(1)Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为　　　　　　。选用图甲中的SmaⅠ对抗除草剂基因X进行完全酶切,再选择SmaⅠ和　　　　对Ti质粒进行完全酶切,将产生的黏性末端补平,补平时使用的酶是　　　　　　。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接,构建重组载体,转化大肠杆菌;经卡那霉素筛选并提取质粒后再选用限制酶　　　　　　　　　进行完全酶切并电泳检测,若电泳结果呈现一长一短2条带,较短的条带长度近似为　　　　bp,则一定为正向重组质粒。
(2)为证明这两个突变体是TDNA插入小麦基因组中同一基因导致的,提取基因组DNA,经酶切后产生含有TDNA的基因组片段(图乙)。在此酶切过程中,限于后续PCR难以扩增大片段DNA,最好使用识别序列为　　 　　(填“4”“6”或“8”)个碱基对的限制酶,且TDNA中应不含该酶的酶切位点。需首先将图乙的片段　　　,才能利用引物P1和P2成功扩增未知序列。PCR扩增出未知序列后,进行了一系列操作,其中可以判断出2条片段的未知序列是否属于同一个基因的操作为　　　　　　　　　　(填“琼脂糖凝胶电泳”或“测序和序列比对”)。
(3)通过农杆菌转化法将构建的含有野生型基因的表达载体转入突变植株,如果检测到野生型基因,　　　　(填“能”或“不能”)确定该植株的表型为野生型。
【答案】 (1)复制原点　XbaⅠ　DNA聚合酶　SmaⅠ和SpeⅠ　550
(2)4　环化　测序和序列比对
(3)不能
【解析】 (1)DNA复制的起点是复制原点,因此Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为复制原点。根据SmaⅠ限制酶识别序列可知,酶切形成的是平末端,若质粒仅用SmaⅠ酶切,抗除草剂基因和质粒可以正向连接也可以反向连接,且无法区分,为了确定是否为正向重组质粒,因此在构建重组质粒时需要用到另一种限制酶,抗除草剂基因需要插入启动子和终止子之间,因此不能选择BamHⅠ,因为该限制酶会破坏终止子,若选PstⅠ则无法补齐酶切后的黏性末端,因此只能选择XbaⅠ和SmaⅠ进行酶切,XbaⅠ酶切会形成黏性末端,需要用DNA聚合酶将产生的黏性末端补平。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接,构建重组载体,转化大肠杆菌。重组的TDNA片段上含有一个SmaⅠ酶切位点和一个SpeⅠ酶切位点,可以选择用SmaⅠ和SpeⅠ进行酶切,转录的方向是从模板的3′端→5′端,和质粒对应的方向相同,经过两种酶的酶切后电泳结果呈现一长一短2条带,若正向连接,较短的条带长度近似为550 bp,若反向连接,较短的条带长度近似为200 bp。
(2)由于后续PCR难以扩增大片段DNA,所以最好选择识别序列为4个碱基对的限制酶,原因是识别序列越短,其特异性越低,酶切位点越多,切割产生的片段可能越小,更有利于后续的PCR扩增。由于引物是根据已知序列设计的,但此时需要扩增未知序列,因此可以将图乙的片段环化,这样就可以利用现有引物扩增出未知序列。为了确定未知序列是否属于同一个基因,需要准确比对其上的碱基序列,因此需测序和序列比对。
(3)突变植株成功导入野生型基因,但野生型基因未必可以正常表达,因此不能确定该植株的表型为野生型。第54讲　基因工程的基本工具和基本操作程序
课标 要求 1.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。 2.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测鉴定等步骤。 3.活动:DNA的提取和鉴定。 4.活动:利用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段并完成电泳鉴定,或运用软件进行虚拟PCR实验。
考情 分析 1.重组DNA技术的基本工具 2025·江苏卷,19;2024·江西卷,12;2023·新课标卷,6
2.基因工程的基本操作程序 2025·广东卷,7;2025·安徽卷,15、20;2025·陕晋青宁卷,21;2025·山东卷,25;2025·浙江1月选考,24;2025·甘肃卷,21;2024·广东卷,21;2024·重庆卷,19;2024·湖南卷,21;2024·甘肃卷,21;2024·安徽卷,20;2024·河北卷,22;2024·山东卷,25;2024·黑吉辽卷,25;2023·湖北卷,4;2023·广东卷,20
3.DNA的粗提取与鉴定 2024·安徽卷,14;2024·河北卷,13;2024·山东卷,13;2023·广东卷,11
4.DNA片段的扩增及电泳鉴定 2025·江苏卷,23;2025·全国卷,6;2024·浙江6月选考,20;2024·江西卷,19;2024·黑吉辽卷,7;2023·江苏卷,22
考点一　基因工程的基本工具
1.基因工程的概念
2.基因工程的基本工具
(1)限制性内切核酸酶(也称“限制酶”)。
1.(选择性必修3 P71正文拓展)将一个基因从DNA分子上切割下来需要切割　 　处,同时产生　　 个黏性末端或平末端。
2.(选择性必修3 P71正文拓展)限制酶主要来源于原核生物,不能切割自身的DNA分子的原因可能是
　。
(2)DNA连接酶。
3.(选择性必修3 P72正文拓展)DNA连接酶和DNA聚合酶功能的区别是
　。
(3)载体。
【判断正误】
(1)(2024·贵州卷,13)使用不同的限制酶也能产生相同的黏性末端。(　　)
(2)(2021·辽宁卷,3)基因工程中常用噬菌体转化植物细胞。(　　)
(3)(经典高考题)一种限制性内切核酸酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列。(　　)
(4)(经典高考题)限制性内切核酸酶能识别和切割RNA。(　　)
(5)(经典高考题)限制性内切核酸酶可从原核生物中提取。(　　)
考向1　分析基因工程的基本工具,考查科学思维
1.(2024·湖南卷,5)某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时,发现DNA完全没有被酶切,分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是(　　)
A.限制酶失活,更换新的限制酶
B.酶切条件不合适,调整反应条件如温度和酶的用量等
C.质粒DNA突变导致酶识别位点缺失,更换正常质粒DNA
D.酶切位点被甲基化修饰,换用对DNA甲基化不敏感的限制酶
2.(2025·湖北名校调研)如图是利用基因工程技术培育抗除草剂作物的部分过程,其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ为四种限制酶,且切割DNA分子后形成的末端均不同。下列说法正确的是(　　)
A.图示质粒分子在SmaⅠ切割前后分别含有0和1个游离的磷酸基团
B.培育抗除草剂作物的核心是将含bar基因的表达载体导入受体细胞
C.可选用PstⅠ和EcoRⅠ切割质粒和含bar基因的DNA片段,确保目的基因正确插入
D.利用PCR技术可从分子水平检测bar基因是否翻译出抗除草剂蛋白
考点二　基因工程的基本操作程序
1.目的基因的筛选与获取
(1)筛选合适的目的基因。
①目的基因:在基因工程的设计和操作中,用于改变　　　　　　　　或获得　　　　　　　
等的基因。主要是指　　　　　　　　　的基因。
②筛选方法:从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。
(2)利用PCR获取和扩增目的基因。
①原理:　　　　　　　　　　　。
②条件。
参与的组分 在DNA复制中的作用
解旋酶(体外 用　　　代替) 打开DNA双链
DNA母链 提供DNA复制的模板
　　　　　 　　　　　 合成DNA子链的原料
耐高温的 　　　 催化合成DNA子链
引物 使DNA聚合酶能够从引物的　　端开始连接脱氧核苷酸
③过程。
④结果:上述三步反应完成后,一个DNA分子就变成了　 　个DNA分子,随着循环次数的增多,DNA分子以指数形式增加。
1.(选择性必修3 P78~79图35拓展)PCR反应过程中,引物非常关键。PCR技术需要引物是因为 　;
利用PCR技术扩增目的基因时,需要两种引物的原因是
　。
2.基因表达载体的构建——基因工程的核心
(1)构建基因表达载体的目的。
①使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且遗传给下一代。
②使目的基因能够　　　　和发挥作用。
(2)基因表达载体的组成。
提醒　启动子、终止子、起始密码子、终止密码子比较
项目 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子
本质 DNA DNA mRNA mRNA
位置 目的基因上游 目的基因下游 mRNA首端 mRNA尾端
功能 RNA聚合酶识别和结合的部位,驱动基因转录出mRNA 使转录在所需要的地方停下来 翻译的起始信号(编码氨基酸) 翻译的结束信号(正常情况下,不编码氨基酸)
(3)基因表达载体的构建过程。
2.(选择性必修3 P80图36拓展)重组DNA分子中标记基因的作用是　　　 　　
　　　　　　　　　　　　　　　　。
3.(选择性必修3 P80图36拓展)在构建基因表达载体时,目的基因的序列中不能含有用到的限制酶的识别序列,原因是　　　　　　 　　　　　　　　　　　　　　。
3.将目的基因导入受体细胞
提醒　农杆菌转化法中涉及的基因的两次拼接和两次导入:第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的TDNA上,第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的TDNA拼接到受体细胞的染色体DNA上;第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌,第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的TDNA导入受体细胞。
4.(选择性必修3 P81资料卡拓展)在用农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞的过程中,一定要将目的基因插入Ti质粒的TDNA上的原因是
　。
4.目的基因的检测与鉴定
【判断正误】
(1)(2025·河北卷,2)PCR过程中DNA双链的解旋需要酶的催化。(　　)
(2)(经典高考题)载体上的抗性基因有利于筛选含重组DNA的细胞和促进目的基因的表达。(　　)
(3)(经典高考题)设计扩增目的基因的引物时不必考虑表达载体的序列。(　　)
(4)(经典高考题)载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因。(　　)
(5)(经典高考题)抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体上也未必能正常表达。(　　)
【情境·思维·深析】
　胰岛素促进因子(PDX1)能诱导干细胞分化为胰岛B细胞,为糖尿病的治疗提供了新的思路。科研人员欲构建PDX1基因的克隆载体用于诱导干细胞分化。回答下列问题。
(1)cDNA的合成:从基因文库中检索小鼠PDX1基因的mRNA序列,设计上下游引物并在引物的　　　端分别添加HindⅢ和BamHⅠ限制酶切割序列。以提取的RNA为模板进行逆转录,为防止RNA被水解,需要在逆转录体系中加入　 。
然后进行PCR扩增,取PCR产物进行凝胶电泳。
(2)克隆载体的构建:回收凝胶中目的基因片段,并进行纯化。选用的克隆载体结构如图所示,其中LacZ基因编码产生的酶可以分解培养基中的Xgal,产生蓝色物质,使菌落呈现蓝色,否则菌落为白色。用 酶将cDNA纯化物与该克隆载体连接形成重组DNA分子。重组的效率除了与温度、pH等外界环境因素有关,还与　　　　　　　　　　　　　(答出1点即可)等有关。将重组DNA分子导入用　　　　处理过的感受态大肠杆菌中进行转化,将转化后的大肠杆菌接种于含　　　　　　　　　　　　　　的固体培养基中,37 ℃恒温培养箱中培养24 h,其中　 　色菌落为阳性克隆。
(3)科研人员将含有PDX1基因的腺病毒载体转染人的干细胞,使其分化为胰岛B细胞,该过程中　　　　基因得到了表达。该细胞可用于治疗由　　　　　　引起的糖尿病。
考向2　通过分析具体情境中PCR的条件及过程,考查科学思维
3.(2025·广东卷,7)Solexa测序是一种将PCR与荧光检测相结合的高通量测序技术。为了确保该PCR过程中,DNA聚合酶催化一个脱氧核苷酸单位完成聚合反应后,DNA链不继续延伸,应保护底物中脱氧核糖结构上的(　　)
A.1′碱基 B.2′氢
C.3′羟基 D.5′磷酸基团
4.(2025·江苏如皋调研)如图表示PCR过程中某个阶段反应体系的情况,①②③④表示相关物质,L、R表示方向。下列叙述正确的是(　　)
A.DNA体内复制与体外复制(PCR)所需能量均只来自dNTP
B.PCR过程中需要添加缓冲液,其中所含的Mg2+可用于激活DNA聚合酶
C.②链从L到R的方向为3′→5′,①②链均可作为子链合成的模板
D.引物③的5′端添加了某序列,至少需经3次循环才可获得该序列的双链产物
PCR技术和体内DNA复制的比较
考向3　通过分析基因工程的基本操作,考查科学思维
5.(2025·福建卷,10)紫杉醇是红豆杉的代谢产物,会干扰纺锤体的正常功能。科研人员利用农杆菌将紫杉醇合成的相关基因导入烟草中,实现了紫杉醇前体物质的合成。下列叙述错误的是(　　)
A.农杆菌转化前应先使用Ca2+处理烟草细胞
B.紫杉醇合成的相关基因会整合到烟草染色体DNA上
C.紫杉醇因干扰肿瘤细胞的有丝分裂而具有抗癌作用
D.该技术的突破有利于红豆杉天然资源的保护
6.(2025·陕晋青宁卷,21)马铃薯作为重要农作物,提高其冷耐受性可拓展优质马铃薯的种植区域。我国科研人员发现,野生马铃薯中S基因的表达与其冷耐受性调控有关,将该基因导入栽培马铃薯中可显著增强其抗寒能力。回答下列问题。
限制酶 识别序列及切割位点
BglⅡ
NdeⅠ
XhoⅠ
EcoRⅠ
BamHⅠ
SalⅠ
XbaⅠ
(1)PCR扩增目的基因时,需要模板DNA、引物、　　　　　　　　　、含Mg2+的缓冲液和耐高温的DNA聚合酶。DNA聚合酶在PCR的　　　　步骤中起作用。
(2)图中标识了载体和S基因中限制酶的切割位点。为将S基因正确插入载体,PCR扩增S基因时需在引物的　　　　(填“5′端”或“3′端”)添加限制酶识别序列,结合上表分析,上游引物应添加的碱基序列是5′　　　　　　　 3′,切割载体时应选用的两种限制酶是　　 　,
PCR扩增产物和载体分别被限制酶切割后,经纯化和连接,获得含S基因的表达载体并导入农杆菌。
(3)用携带S基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织时,基因表达载体中TDNA进入愈伤组织细胞,将S基因整合到　　　　　　　　　　　　　　　,抗性基因　　　可用于筛选成功转化的愈伤组织。该愈伤组织经　　　　　形成芽、根,继续培育可获得抗寒能力显著增强的马铃薯植株。
1.根据质粒的特点确定限制酶的种类
2.根据限制酶的切割位点选择Ti质粒
图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取,丙Ti质粒宜选取(设切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ),分析如下:
考点三　活动:DNA的粗提取与鉴定、
DNA片段的扩增及电泳鉴定
1.DNA的粗提取与鉴定
(1)基本原理。
(2)操作流程。
1.(选择性必修3 P74~75探究·实践拓展)过滤研磨液用纱布不用滤纸的原因是
　。
提醒　①加入酒精和用玻璃棒搅拌时,动作要轻缓,以免加剧DNA分子的断裂,导致DNA分子不能形成丝状沉淀。
②本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料,原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核(无DNA)。
2.DNA片段的扩增及电泳鉴定
(1)实验基础。
①PCR原理:利用了 原理,通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。
②电泳:DNA分子具有可解离的基团,在一定的pH下,这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下,这些带电分子会向着与它所带电荷　　　 　的电极移动,这个过程就是电泳。
③PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的　 等有关。
(2)PCR实验操作步骤。
(3)DNA的电泳鉴定。
2.(选择性必修3 P84~85探究·实践拓展)如果电泳鉴定结果未出现扩增条带,可能的原因有
　。
【判断正误】
(1)(2025·四川卷,5)土豆DNA溶于酒精后,与二苯胺试剂混合呈蓝色。(　　)
(2)(2025·湖南卷,2)DNA的粗提取与鉴定实验中,可用“猪成熟红细胞”替代“猪肝细胞”。(　　)
(3)(2024·河北卷,13)配制PCR反应体系时,加入等量的4种核糖核苷酸溶液作为扩增原料。(　　)
(4)(2022·山东卷,13)粗提取DNA时的过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解。(　　)
考向4　围绕实验基本操作及注意事项,考查科学探究
7.(2024·安徽卷,14)下列关于“DNA粗提取与鉴定”实验的叙述,错误的是(　　)
A.实验中如果将研磨液更换为蒸馏水,DNA提取的效率会降低
B.利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异,可初步分离DNA
C.DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同,该原理可用于纯化DNA粗提物
D.将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应,可检测溶液中是否含有蛋白质杂质
8.(2025·全国卷,6)琼脂糖凝胶电泳常用于核酸样品的分析,样品1~4的电泳结果如图所示(“+”“-”分别代表电泳槽的阳极和阴极)。已知样品1和2中的DNA分子分别是甲和乙,甲只有限制酶R的一个酶切位点,样品3和4中有一个样品是甲的酶切产物。下列叙述错误的是(　　)
A.配制琼脂糖凝胶时需选用适当的缓冲溶液
B.该实验条件下甲、乙两种DNA分子均带负电荷
C.甲、乙两种DNA分子所含碱基对的数量可能不同
D.据图推测样品3可能是甲被酶R完全酶切后的产物
9.(2025·江苏卷,23节选)川金丝猴是我国特有的珍稀濒危物种,为了更好地保护这一物种,研究者开展了以下研究。请回答下列问题。
(1)研究者为了进一步研究川金丝猴的食性,采集其粪便样本,进行DNA提取、扩增,部分实验过程如下。请完成下表:
实验目的 简要操作步骤
释放DNA 在去杂后的样本中加入裂解液
析出DNA 离心后取①　　　　,加入乙醇
②　　　　　 在沉淀物中加入纯水
扩增DNA 将③　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　、引物、样本DNA、含有Mg2+缓冲液、超纯水等加入PCR管中,进行PCR
(2)为分析川金丝猴摄食的植物种类,研究者设计一对引物F和R,能同时扩增出不同种植物叶绿体中的rbcL基因片段,是因为引物F和R的碱基能与rbcL基因的保守序列的碱基
　　　　　　。用引物F和R对4种植物样本甲~丁的叶绿体基因组DNA进行扩增测序,结果如下图所示。若对4个样本的扩增产物进行DNA电泳条带分析,能检出的样本是
　　　　　　　。研究者用引物F和R对川金丝猴粪便DNA进行扩增并测序,得到的序列有图中的3种序列,据此可确定川金丝猴摄食的植物有　　　　　　。若要更准确鉴定出川金丝猴摄食的植物,参照叶绿体基因库,还需选用　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　的保守序列设计引物,对川金丝猴粪便DNA进行扩增、测序分析。
注:“·”表示与植物甲对应位置上相同的碱基,“……”表示省略200个碱基。
1.(2024·山东卷,13)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验,下列说法正确的是(　　)
A.整个提取过程中可以不使用离心机
B.研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后,应充分摇匀再倒入烧杯中
C.鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变
D.仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰
2.(2024·黑吉辽卷,7)关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验,下列叙述正确的是(　　)
A.琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小
B.凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置
C.在同一电场作用下,DNA片段越长,向负极迁移速率越快
D.琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来
3.(2025·福建卷,15)质粒P含有2个EcoRⅠ、1个SacⅠ和1个BamHⅠ的限制酶切割位点。已知BamHⅠ位点位于2个EcoRⅠ位点的正中间,用上述3种酶切割该质粒,酶切产物的凝胶电泳结果如图,其中泳道①条带是未酶切的质粒P,泳道②③④条带为3种单酶切产物,泳道⑤⑥⑦条带为双酶切产物。下列叙述正确的是(　　)
A.DNA分子在该凝胶的迁移方向是从电源正极到负极
B.可确认泳道②③条带分别是SacⅠ和EcoRⅠ的单酶切产物
C.泳道⑤条带是SacⅠ和EcoRⅠ的双酶切产物
D.泳道①②说明未酶切质粒的碱基数小于酶切后质粒的碱基数
4.(2023·湖北卷,4)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒,构建基因表达载体(重组质粒),并转化到受体菌中。下列叙述错误的是(　　)
A.若用HindⅢ酶切,目的基因转录的产物可能不同
B.若用PvuⅠ酶切,在含Tet(四环素)培养基中生长的菌落,不一定含有目的基因
C.若用SphⅠ酶切,可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D.若用SphⅠ酶切,携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成
菌落
5.(2025·广东卷,21)大肠杆菌是重要工业菌株之一,其培养过程可分为快速生长期和生长稳定期两个阶段。为了通过调节蛋白质合成与降解速率来动态调控代谢途径关键酶的蛋白量,使细胞适配不同阶段的生产需求,研究者设计了两种质粒,并以稳定性好的红色荧光蛋白mKate2为模式蛋白,测试质粒功能。回答下列问题。
(1)研究者首先构建质粒①(图a)用于在细胞内表达C末端带SsrA短肽的mKate2,将质粒导入感受态细胞后,在添加抗生素的选择培养基上培养。根据培养基上菌落的生长状况,结合PCR及　　 　　检测,筛选获得重组菌株W1。
(2)将W1在适宜条件下进行摇瓶培养,定时取样检测培养液中细胞密度,方法有　　　　　　
　　　　 　　(答一种)。接种前需检测液体培养基的荧光强度,其作用是　 　。
培养结果(图b)表明,进入生长稳定期后荧光强度快速下降,原因是
　。
(3)研究者选用启动子PX、X基因(编码阻遏蛋白X,阻遏PX开启转录),重新构建质粒②(图a),导入野生型大肠杆菌中获得重组菌株W2。在适宜条件下摇瓶培养,W2的生长趋势不变,培养期间荧光强度的变化趋势为 　。
(4)莽草酸是一种重要工业化学品,其胞内合成代谢途径见图c。由于野生型大肠杆菌胞内酶A活性弱,且莽草酸会被快速转化为细胞生长必需物,因此细胞中无法大量积累莽草酸。为了保证细胞正常生长,并在生长稳定期实现莽草酸的大量积累,利用上述两种质粒的调控功能,结合野生型菌株遗传物质的改造,提出重组生产菌株构建思路:

　。

展开更多......

收起↑