资源简介

微专题10　PCR相关问题归纳
题型一　利用PCR技术获取和扩增目的基因
1.利用PCR技术获取目的基因的过程图解(目的基因位于DNA片段中)
2.PCR中的数量关系
循环次数 1 2 3 n
DNA 分子数 2 4 8 2n
含引物A (或B)的 DNA 分子数 1 3 7 2n-1
续　表
循环次数 1 2 3 n
同时含引 物A、B的 DNA分 子数 0= 21-2 2= 22-2 6= 23-2 2n-2
共消耗的 引物数量 2= 21+1-2 6= 22+1-2 14= 23+1-2 2n+1-2
3.引物设计应注意的问题
(1)设计引物的依据:目的基因两端的核苷酸序列。
(2)引物设计时既要考虑目的基因序列,又要考虑载体序列,原因:为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接,需在引物的5′端加上限制酶的酶切位点。
(3)使用的一对引物的序列不相同,因为目的基因两端具有不同的核苷酸序列。
(4)引物设计的要求(或引物失效的原因):
①每种引物内部不能发生局部碱基互补配对,原因:防止引物自身折叠。
②两种引物之间不能在局部发生碱基互补配对,原因:防止引物之间配对,导致引物不能同模板链结合。
(5)两种引物都结合在DNA模板链的3′端;脱氧核苷酸连接在引物的3′端进行延伸。
1.(2025·黑吉辽内蒙古卷,25 )香树脂醇具有抗炎等功效,从植物中提取难度大、产率低。通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N,可高效生产香树脂醇。回答下列问题。
(1)可从　　　　　　中查询基因N的编码序列,设计特定引物。如图1所示,a链为转录模板链,为保证基因N与质粒pYL正确连接,需在引物1和引物2的5′端分别引入　　　　和
　　　　限制酶识别序列。PCR扩增基因N,特异性酶切后,利用　　　　　　连接DNA片段,构建重组质粒,大小约9.5 kb(kb为千碱基对),假设构建重组质粒前后,质粒pYL对应部分大小基本不变。
(2)进一步筛选构建的质粒,以1～4号菌株中提取的质粒为模板,使用引物1和引物2进行PCR扩增,电泳PCR产物,结果如图2。在第5组的PCR反应中,使用无菌水代替实验组的模板DNA,目的是检验PCR反应中是否有　　　　　　　的污染。初步判断实验组　　　　(从“1～4”中选填)的质粒中成功插入了基因N,理由是　 　。
(3)为提高香树脂醇合酶催化效率,将编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列,丙氨酸的密码子有GCA等。a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物(GCA为诱变序列),b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物,其配对模板与a的配对模板相同。据此分析,丙氨酸的密码子除GCA外,还有　　　　。
a:5′-…GCA/CCC/GAG/TTC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC…-3′
b:5′-…GAA/CTG/TGG/GAC/ACC/CTG/AAC/TAC/TTC/TCT/GAG…-3′
c:5′-…GCC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC/CCC/TAC/CAC…-3′
d:5′-…GAT/AAT/AAG/ATC/CGA/GAG/AAG/GCC/ATG/CGA/AAG…-3′
(4)进一步检测转基因酵母菌发酵得到的　　　　含量并进行比较,可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。
【答案】 (1)基因数据库/序列数据库　XhoⅠ　XbaⅠ　DNA连接酶
(2)外源DNA　1　目的基因N大小约为2.3 kb
(3)GCC
(4)香树脂醇
【解析】 (1)可从序列数据库或基因数据库中查询基因N的编码序列,设计特定引物。为保证基因N与质粒pYL正确连接,需要使用双酶切法,为了目的基因能正确表达,目的基因需要插入质粒的启动子和终止子之间,且质粒和目的基因需要使用相同的酶或能产生相同黏性末端的酶切割;分析图1可知,质粒pYL应该选用SpeⅠ和XhoⅠ酶切,由于目的基因N含有SpeⅠ识别序列,故基因N不能使用SpeⅠ酶切,XbaⅠ与SpeⅠ具有相同的黏性末端,基因N酶切时可以用XbaⅠ替换SpeⅠ,即基因N两端应该含有XbaⅠ和XhoⅠ识别序列;基因N a链为转录模板链,结合质粒pYL上的启动子和终止子方向,可知应该在引物2的5′端添加XbaⅠ识别序列、引物1的5′端添加XhoⅠ识别序列。PCR扩增基因N,特异性酶切后,利用DNA连接酶连接DNA片段,构建重组质粒。
(2)构建的重组质粒大小约9.5 kb(kb为千碱基对),假设构建重组质粒前后,质粒pYL对应部分大小基本不变,而质粒pYL本身大小为7.2 kb,可知目的基因N大小约为2.3 kb;分析电泳图,实验组1对应的条带符合要求,因此判断实验组1的质粒中成功插入了基因N。在第5组的PCR反应中,使用无菌水代替实验组的模板DNA,目的是检验PCR反应中是否有外源DNA污染。
(3)a是诱变第240位脯氨酸编码序列替换为丙氨酸编码序列的引物(GCA为诱变序列,与丙氨酸的密码子序列相同),b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸编码序列替换为丙氨酸编码序列的引物,其配对模板与a的配对模板相同,据此分析,除编码第243位苯丙氨酸的碱基序列TTC替换为诱变序列,与丙氨酸的密码子序列相同,其后的编码序列应该与a相同,为TGG/CTG/TTT……,所以该引物是c,其中GCC为第243位诱变序列,故丙氨酸的密码子还可以是GCC。
(4)研究目的是通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N,可高效生产香树脂醇,由此可知,进一步检测转基因酵母菌发酵得到的香树脂醇含量并进行比较,可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。
题型二　PCR技术的应用
1.利用PCR技术鉴定目的基因的连接方式
在实际操作中,PCR技术不仅可以精准地鉴定受体细胞是否转入目的基因,还可以通过引物的巧妙设计鉴定目的基因的连接方式。设计PCR的一对引物时,一个引物与质粒DNA互补结合,另一个引物与目的基因DNA互补结合,这样只有以重组DNA为模板才能获得扩增产物。
2.利用PCR技术引导基因定点突变
(1)重叠延伸PCR。
重叠延伸PCR需要设计两对引物:上游引物a、突变引物b以及下游引物d、突变引物c。其中突变引物b和c加入了突变碱基,且具有重叠区域,如图所示,引物中突变碱基处用“·”表示。第一、第二轮PCR时(即图中PCR1和PCR2)分别用引物a、b和引物c、d在两个PCR体系中扩增出突变碱基上游片段和下游片段。此时,上游片段和下游片段都携带突变碱基,但不具有完整的DNA长度。由于这两个片段具有重叠区域,将其置于一起时能局部配对并延伸,再通过上游引物a和下游引物d进行PCR可以扩增出大量含有突变碱基的DNA。
(2)大引物PCR。
需要用到三条引物进行两轮PCR,这三条引物分别是突变上游引物、常规上游引物和常规下游引物。第一轮PCR利用突变上游引物和常规下游引物进行扩增,得到不完整的含有突变位点的DNA片段;第二轮PCR利用第一轮扩增产物中的一条DNA链作为下游大引物,它与常规上游引物一起扩增得到完整的含有突变位点的DNA片段,再以此片段为模板,以常规上游引物进行扩增即得到一个双链都含有突变位点的DNA。该技术的流程如图
所示:
3.利用PCR扩增未知基因序列
当DNA的某些序列已知,而需要扩增已知序列两端的未知序列时,可采用反向PCR技术。原理是用限制酶切割该DNA,随后使用DNA连接酶将获得的酶切产物环化,这样就获得了已知序列两侧携带有未知序列的环状DNA分子。以该已知序列为模板设计一对相反方向的特异性引物,该对引物对已知序列反向,但对未知序列却是相向的,从而得以扩增出未知序列。原理如图。
4.利用PCR技术检测病毒核酸(实时荧光定量PCR技术)
实时荧光定量PCR扩增目的基因,需额外添加荧光标记探针(一小段单链DNA,可与目的基因中部序列特异性结合)。当探针完整时,不产生荧光。在PCR过程中,与目的基因结合的探针被耐高温的DNA聚合酶水解,R与Q分离后,R发出的荧光可被检测到(如图甲)。若待检测样品中存在相应病毒时,检测到的荧光强度变化如图乙,荧光到达预先设定阈值的循环数(Ct值)越小,说明病毒核酸浓度越高。
2.(2025·四川成都质检)反向PCR是一种通过已知序列设计引物对未知序列进行扩增的技术,其过程如下图所示。下列叙述正确的是(　　)
A.整个过程需用到限制酶、DNA连接酶、耐高温的DNA聚合酶及逆转录酶
B.环化阶段,可选E.coliDNA连接酶而不能选T4 DNA连接酶
C.PCR产物是包含所有已知序列和未知序列的环状DNA分子
D.应选择引物1和引物4进行PCR扩增
【答案】 D
【解析】 整个过程需用到限制酶、DNA连接酶和耐高温的DNA聚合酶,由于没有逆转录过程,因此不需要逆转录酶;T4 DNA连接酶既可以连接平末端也可以连接黏性末端,所以环化阶段,可选E.coliDNA连接酶,也可选T4 DNA连接酶;PCR产物是包含所有已知序列和未知序列的链状DNA分子;DNA子链合成的方向为5′端到3′端,因此要通过已知序列设计引物对未知序列进行扩增,应选择引物1和引物4进行PCR扩增。
3. (2025·新疆乌鲁木齐二模)下图表示用荧光PCR法检测目的DNA的过程。在PCR反应体系中,加入足量与目的DNA部分序列互补的探针,探针包含一段脱氧核苷酸单链和发光基团,在完整的探针中发光基团不发光。在PCR过程中,当子链延伸到探针处时,TaqDNA聚合酶催化探针水解并释放发光基团,此时发光基团能发光。下列叙述错误的是(　　)
A.PCR的每一次循环包含变性、复性和延伸三步
B.探针和引物在目的DNA单链上的结合位点不同
C.TaqDNA聚合酶沿着子链5′→3′的方向催化氢键的形成
D.经历相同的循环次数,起始目的DNA量越多荧光强度越强
【答案】 C
【解析】 PCR技术的基本过程包括变性、复性、延伸,每一次循环也都包含这三个步骤;由题可知,在PCR过程中,当子链延伸到探针处时探针被TaqDNA聚合酶催化水解,说明探针和引物在目的DNA单链上的结合位点不同;TaqDNA聚合酶沿着子链5′→3′的方向催化磷酸二酯键的形成;起始目的DNA量越多,探针与目标DNA结合就越多,经历相同的循环次数后,形成的游离的发光基团就越多,荧光强度越强。
4.(2026·湖北联考)某科研小组利用PCR定点突变技术培育抗冻蔬菜新品种。设计含有非特异性碱基配对的引物,将突变位点引入编码抗冻蛋白的基因中,获得抗冻能力更强的突变基因。下列叙述正确的是(　　)
A.过程②还需要四种核糖核苷酸和耐高温的DNA聚合酶
B.过程③至少需要两次循环才能得到两条链等长的DNA分子
C.过程④需要使用引物1和4才能获得目的基因
D.合成的DNA分子经混合、变性、杂交后发现通过引物2和3延伸形成的两条链杂交在一起,说明引物2和3的碱基序列相同
【答案】 B
【解析】 过程②是 PCR 扩增过程,PCR 需要四种脱氧核糖核苷酸(不是核糖核苷酸)和耐高温的 DNA 聚合酶;过程③是PCR扩增含有突变位点的DNA片段,由于引物与模板链的结合位置不同,至少需要两次循环才能得到两条链等长的DNA分子;过程④经混合、变性后,杂交的两条单链均可为DNA聚合酶提供3′端,无需引物即可获得目的基因;合成的DNA分子经混合、变性、杂交后,通过引物2和3延伸形成的两条链杂交在一起,说明引物2和3的碱基序列互补,而不是相同。
(时间:30分钟)
1.(2025·山西临汾二模)目的基因A含有100对碱基,其中腺嘌呤占30%,现利用目的基因A片段两侧的特异性序列设计引物Ⅰ、引物Ⅱ,用PCR技术扩增该目的基因,结构如下图所示。PCR扩增共循环50次。下列说法错误的是(　　)
A.PCR仪实质上是一台温度自动调控仪器,循环50次理论上复制50代
B.含目的基因A的DNA片段经PCR循环50次,需要两种引物共250个
C.PCR过程与体内DNA复制的方式相同,但是只需要一种酶的参与
D.若只考虑目的基因A,经PCR循环50次需要鸟嘌呤(250-1)×40个
【答案】 B
【解析】 PCR仪实质上是一台温度自动调控仪器,循环50次理论上复制50代;含目的基因A的DNA片段经PCR循环50次,产生250个子代DNA,每个DNA分子需要2个引物,亲本DNA除外,故需要两种引物共(251-2)个;PCR过程与体内DNA复制的方式相同,都是半保留复制,但是只需要耐高温的DNA聚合酶的参与;由题可知,目的基因A含有100对碱基,其中腺嘌呤占30%,则G占20%,为40个,若只考虑目的基因A,经PCR循环50次需要鸟嘌呤(250-1)×40个。
2.(2025·内蒙古包头二模)双脱氧测序法是在PCR反应体系中,分别再加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸(ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP),子链延伸时,双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补配对原则,以加入ddATP的体系为例:若配对的为ddATP,延伸终止;若配对的为脱氧腺苷三磷酸(dATP),继续延伸;PCR产物变性后电泳检测。通过该方法测得某个体的一段序列如图。下列叙述错误的是(　　)
A.上述PCR反应体系中只加入一种引物
B.电泳时产物的片段越小,迁移速率越快
C.测得该个体某段DNA序列为5′CTACCTGTGAT3′
D.子链延伸终止是由于双脱氧核苷三磷酸与模板链上的脱氧核苷酸配对时不能正常形成氢键
【答案】 D
【解析】 子链延伸终止的原因是,双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)与模板链配对后,因其3′端没有羟基,不能与下一个脱氧核苷酸形成磷酸二酯键,进而导致子链延伸终止,而非不能正常形成氢键。
3.(2025·天津河西三模)根据某基因上游和下游的碱基序列,设计合成了用于该基因PCR的两段引物(单链DNA)。引物与该基因变性DNA(单链DNA)结合的过程称为复性。下图是两引物的Tm值(引物熔解温度,即50%的引物与其互补序列形成双链DNA分子时的温度)测定结果,以下分析错误的是(　　)
A.PCR过程中,复性温度应高于引物的Tm值以提高PCR效率
B.两引物分别与DNA的两条互补单链结合,是子链延伸的起点
C.若两引物的脱氧核苷酸数相同,推测引物2的(G+C)含量较高
D.适当减少引物2的脱氧核苷酸数,可使其Tm值接近引物1
【答案】 A
【解析】 PCR过程中,复性温度应低于引物的Tm值以提高PCR效率;PCR过程是目的基因DNA受热变性后解链为单链,引物与单链互补结合,在耐高温的DNA聚合酶的作用下子链进行延伸,所以两引物分别与DNA的两条互补单链结合,是子链延伸的起点;DNA含有的氢键数越多,其热稳定性越高,而A和T碱基对间有两个氢键,C和G碱基对间有三个氢键,曲线图显示:引物2的Tm值高于引物1,若两引物的脱氧核苷酸数相同,推测引物2的(G+C)含量较高;适当减少引物2的脱氧核苷酸数,会降低引物2的热稳定性,可使其Tm值接近引物1。
4.(2025·陕西汉中联考)巢式PCR是特殊的PCR技术,使用两对PCR引物扩增完整的DNA片段。具体过程分为两个阶段:第一阶段使用一对引物进行第一次PCR扩增,获得中间产物;第二阶段以中间产物为模板,使用另一对引物进行第二次PCR扩增,具体过程如图所示。下列相关叙述正确的是(　　)
A.巢式PCR技术能降低扩增多个靶位点的可能性
B.第一次PCR扩增DNA分子应选用引物①和引物③
C.巢式PCR扩增的两个阶段应在同一试管中进行
D.PCR扩增DNA分子的过程中,复性阶段的温度最高
【答案】 A
【解析】 巢式PCR使用两对引物进行两轮扩增,其中第二轮扩增的引物是针对第一轮扩增的中间产物设计的,因此具有更高的特异性,这种特异性使得巢式PCR能够更准确地扩增目标DNA片段,降低了扩增多个靶位点的可能性;根据图示和巢式PCR的原理,第一次PCR扩增应该使用引物①和引物④,它们分别与目标DNA片段的两端互补,从而能够扩增出包含整个目标片段的中间产物,引物②和引物③则是用于第二轮扩增的,它们与中间产物的特定序列互补;巢式PCR的两个阶段通常不在同一试管中进行,因为第二阶段需要去除第一阶段的引物和未反应的DNA,以免干扰第二阶段的特异性扩增;PCR扩增DNA分子的过程中,变性阶段的温度最高。
5.(2025·安徽芜湖二模)不对称PCR是利用不等量的一对引物来产生大量单链DNA(ssDNA)的方法。加入的一对引物中含量较少的被称为限制性引物,含量较多的被称为非限制性引物。PCR反应最初的若干次循环中,其扩增产物主要是双链DNA(dsDNA),但当限制性引物消耗完后,就会产生大量的ssDNA。不对称PCR的简单过程如图所示。假设模板DNA分子初始数量为 a个,6次循环后开始扩增产生ssDNA。下列有关叙述错误的是(　　)
A.限制性引物和非限制性引物均可与模板DNA单链结合
B.不对称PCR循环6次需要消耗(26-1)a个限制性引物
C.最后获得的ssDNA中不含非限制性引物
D.子链的延伸都是从两种引物的3′端开始的
【答案】 C
【解析】 据图可知,限制性引物和非限制性引物均可与模板DNA单链结合;PCR扩增时引物是新子链的一部分,假设模板DNA分子初始数量为a个,6次循环后产生26a个DNA分子,因此该不对称PCR循环6次需要(26-1)a个限制性引物;据图可知,最终获得的ssDNA都是以乙链为模板合成的,因此,最终获得的ssDNA中都有非限制性引物;PCR技术的原理是DNA的半保留复制,DNA复制过程中,子链的延伸都是从引物的3′端开始的。
6.(2025·山东德州月考)反向PCR是利用已知序列设计引物对未知序列进行扩增的技术,其过程如图。下列叙述错误的是(　　)
A.过程①可用同种限制酶切割磷酸和脱氧核糖之间的磷酸二酯键
B.过程②需用DNA连接酶将酶切片段环化以实现对未知序列的扩增
C.过程③需添加引物1和引物3以便DNA聚合酶从引物的3′端延伸子链
D.过程③中将温度调至72 ℃的目的是使引物与模板链通过碱基互补配对结合
【答案】 D
【解析】 由图可知,过程①即酶切后,该片段能环化,说明两端的黏性末端相同,故过程①可用同一种限制酶对未知序列两端进行切割;过程②即环化,将DNA片段连接起来,该过程中使用DNA连接酶催化相邻核苷酸之间形成磷酸二酯键;过程③为扩增,需添加引物1和引物3以便DNA聚合酶从引物的3′端以未知序列为模板延伸子链;过程③中将温度调至72 ℃的目的是使DNA子链在耐高温的DNA聚合酶的作用下延伸。
7.(2025·福建厦门二模)实时荧光定量PCR是指在PCR反应体系中加入携带荧光基团的探针,利用荧光信号积累实时监测PCR反应进程的技术,可用于检测RNA病毒。提取病毒RNA,经逆转录形成cDNA,然后进行PCR,反应原理如下图所示。CT值表示PCR过程中荧光信号达到设定标准所需的循环次数。
下列叙述错误的是(　　)
A.探针与cDNA单链的结合遵循碱基互补配对原则
B.耐高温的DNA聚合酶具有催化探针水解的作用
C.CT值越小,意味着提取到的病毒RNA含量越低
D.若病毒发生单个碱基的突变,可能不会影响检测结果
【答案】 C
【解析】 CT值表示PCR过程中荧光信号达到设定标准所需的循环次数,CT值越小,说明达到设定标准需要的循环次数越少,因而意味着提取到的病毒RNA含量越高。
8.(2025·山东潍坊三模)融合PCR技术采用具有互补末端的引物,形成具有重叠链的PCR产物,通过PCR产物重叠链的延伸,从而将不同来源的任意DNA片段连接起来(如图)。下列说法错误的是(　　)
A.基因甲至少经3个循环才能获得含引物P2的双链等长DNA
B.不能为提高扩增效率把四种引物同时加入一个扩增体系
C.图中融合PCR第一步的两条链重叠部位可互相作为另一条链的引物
D.由融合基因经PCR扩增获得64个融合基因至少消耗63个引物P4
【答案】 A
【解析】 基因甲至少经2个循环才能获得含引物P2的双链等长DNA;在融合PCR 技术里,甲基因扩增依赖引物 P1、P2,乙基因扩增依赖引物 P3、P4,若加入同一扩增体系中,引物间易相互干扰(P2和P3存在互补序列),无法精准、高效完成甲、乙基因各自扩增,所以不能为提高扩增效率把四种引物同时加入一个扩增体系;由图可知,融合PCR的第一步两条链重叠部位互补配对,可互为另一条链的引物;由融合基因经PCR扩增获得64个融合基因,消耗引物数目和新合成的子链数目相同,即该过程消耗了64×2-2=126(个)引物,该过程消耗了126÷2=63(个)引物P4。
9.(2025·河北衡水模拟)科学家斯万特·帕博凭借对已灭绝古人类基因组和人类进化的发现荣获2022年诺贝尔生理学或医学奖。他在研究过程中使用了大引物PCR构建定点突变,其过程如图。下列相关叙述正确的是(　　)
A.进行PCR扩增需要的酶有解旋酶和耐高温的DNA聚合酶
B.与第一轮PCR相比,第二轮PCR的复性温度需要适当降低
C.第二轮PCR所用的引物为第一轮PCR所产生的DNA的两条链
D.要完成两处位点的突变,至少需要设计4种引物
【答案】 D
【解析】 进行PCR扩增需要的酶是耐高温的DNA聚合酶,不需要解旋酶;由图可知,第一轮PCR所用引物为常规引物和诱变引物,第二轮PCR所用的引物中一个是第一轮PCR所产生的DNA的一条链(大引物),另一个是常规引物,由于大引物的长度大于常规引物和诱变引物,因此与第一轮PCR相比,第二轮PCR的复性温度需要适当提高;由图可知,完成一处位点的突变需要两种常规引物和一种诱变引物,如果要完成两处位点的突变,则至少需要两种常规引物和两种诱变引物,即至少需要设计4种引物。
10.(2023·山东卷,25)科研人员构建了可表达JV5融合蛋白的重组质粒并进行了检测,该质粒的部分结构如图甲所示,其中V5编码序列表达标签短肽V5。
(1)与图甲中启动子结合的酶是　　　　　　　。除图甲中标出的结构外,作为载体,质粒还需具备的结构有　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　(答出2个结构即可)。
(2)构建重组质粒后,为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确,需进行PCR检测,若仅用一对引物,应选择图甲中的引物　　　　　　　　　　　　　　　。已知J基因转录的模板链位于b链,由此可知引物F1与图甲中J基因的　　　　　(填“a链”或“b链”)相应部分的序列相同。
(3)重组质粒在受体细胞内正确表达后,用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平,结果如图乙所示。其中,出现条带1证明细胞内表达了　　　　　
　　　　　,条带2所检出的蛋白　　　　　(填“是”或“不是”)由重组质粒上的J基因表达的。
【答案】 (1)RNA聚合酶　限制酶切割位点、标记基因、复制原点等
(2)F2和R1或F1和R2　a链
(3)JV5融合蛋白　不是
【解析】 (1)启动子位于基因的上游,能驱动基因转录出mRNA,是RNA聚合酶识别和结合的部位。作为载体,质粒必须具备的条件有①要具有限制酶的切割位点;②要有标记基因(如抗性基因),以便于重组后重组质粒的筛选;③能在宿主细胞中稳定存在并复制;④是安全的,对受体细胞无害,而且要易从供体细胞分离出来,图甲中有启动子和终止子等,因此质粒还需具备的结构有限制酶的切割位点、标记基因、复制原点等。
(2)据图甲可知,引物F2与R1或F1与R2结合部位包含J基因的碱基序列和部分连接序列,因此推测为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确,进行PCR检测时,若仅用一对引物,应选择图甲中的引物F2和R1或F1和R2。b是模板链,而根据图上启动子和终止子的位置可知转录方向是从左向右,对应的模板链方向应该是3′→5′,非模板链(也就是a链)是5′→3′;图中F1是前引物,在左侧,所以其配对的单链是3′→5′的b链,故其序列应该与a链相应部分的序列相同。
(3)据图乙可知,用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测,均出现条带1,说明条带1是JV5融合蛋白。抗J蛋白抗体检测出现条带2,抗V5抗体检测不出现条带2,说明条带2所检出的蛋白不是由重组质粒上的J基因表达的。(共30张PPT)
微专题10　PCR相关
问题归纳
题型一
利用PCR技术获取和
扩增目的基因
1.利用PCR技术获取目的基因的过程图解(目的基因位于DNA片段中)
专题聚焦
2.PCR中的数量关系
循环次数 1 2 3 n
DNA 分子数 2 4 8 2n
含引物A (或B)的 DNA 分子数 1 3 7 2n-1
同时含引 物A、B的 DNA分 子数 0= 21-2 2= 22-2 6= 23-2 2n-2
共消耗的 引物数量 2= 21+1-2 6= 22+1-2 14= 23+1-2 2n+1-2
3.引物设计应注意的问题
(1)设计引物的依据:目的基因两端的核苷酸序列。
(2)引物设计时既要考虑目的基因序列,又要考虑载体序列,原因:为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接,需在引物的5′端加上限制酶的酶切位点。
(3)使用的一对引物的序列不相同,因为目的基因两端具有不同的核苷酸
序列。
(4)引物设计的要求(或引物失效的原因):
①每种引物内部不能发生局部碱基互补配对,原因:防止引物自身折叠。
②两种引物之间不能在局部发生碱基互补配对,原因:防止引物之间配对,导致引物不能同模板链结合。
(5)两种引物都结合在DNA模板链的3′端;脱氧核苷酸连接在引物的3′端进行延伸。
1.(2025·黑吉辽内蒙古卷,25 )香树脂醇具有抗炎等功效,从植物中提取难度大、产率低。通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N,可高效生产香树脂醇。回答下列问题。
考题精练
(1)可从　　 　　　　中查询基因N的编码序列,设计特定引物。如图1所示,a链为转录模板链,为保证基因N与质粒pYL正确连接,需在引物1和引物2的5′端分别引入　　　　和　　　　限制酶识别序列。PCR扩增基因N,特异性酶切后,利用　　　　　 　连接DNA片段,构建重组质粒,大小约9.5 kb(kb为千碱基对),假设构建重组质粒前后,
质粒pYL对应部分大小基本不变。
基因数据库/序列数据库
XhoⅠ
XbaⅠ
DNA连接酶
【解析】 (1)可从序列数据库或基因数据库中查询基因N的编码序列,设计特定引物。为保证基因N与质粒pYL正确连接,需要使用双酶切法,为了目的基因能正确表达,目的基因需要插入质粒的启动子和终止子之间,且质粒和目的基因需要使用相同的酶或能产生相同黏性末端的酶切割;分析图1可知,质粒pYL应该选用SpeⅠ和XhoⅠ酶切,由于目的基因N含有SpeⅠ识别序列,故基因N不能使用SpeⅠ酶切, XbaⅠ与SpeⅠ具有相同的黏性末端,基因N酶切时可以用XbaⅠ替换SpeⅠ,即基因N两端应该含有XbaⅠ和XhoⅠ识别序列;基因N a链为转录模板链,结合质粒pYL上的启动子和终止子方向,可知应该在引物2的5′端添加XbaⅠ识别序列、引物1的5′端添加XhoⅠ识别序列。PCR扩增基因N,特异性酶切后,利用DNA连接酶连接DNA片段,构建重组质粒。
(2)进一步筛选构建的质粒,以1～4号菌株中提取的质粒为模板,使用引物1和引物2进行PCR扩增,电泳PCR产物,结果如图2。在第5组的PCR反应中,使用无菌水代替实验组的模板DNA,目的是检验PCR反应中是否有　　　　　　　的污染。初步判断实验组　　　　(从“1～4”中选填)的质粒中成功插入了基因N,理由是　 　。
外源DNA
1
目的基因N大小约为2.3 kb
【解析】 (2)构建的重组质粒大小约9.5 kb(kb为千碱基对),假设构建重组质粒前后,质粒pYL对应部分大小基本不变,而质粒pYL本身大小为7.2 kb,可知目的基因N大小约为2.3 kb;分析电泳图,实验组1对应的条带符合要求,因此判断实验组1的质粒中成功插入了基因N。在第5组的PCR反应中,使用无菌水代替实验组的模板DNA,目的是检验PCR反应中是否有外源DNA污染。
(3)为提高香树脂醇合酶催化效率,将编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列,丙氨酸的密码子有GCA等。a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物(GCA为诱变序列),b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物,其配对模板与a的配对模板相同。据此分析,丙氨酸的密码子除GCA外,还有　　　　。
a:5′-…GCA/CCC/GAG/TTC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC…-3′
b:5′-…GAA/CTG/TGG/GAC/ACC/CTG/AAC/TAC/TTC/TCT/GAG…-3′
c:5′-…GCC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC/CCC/TAC/CAC…-3′
d:5′-…GAT/AAT/AAG/ATC/CGA/GAG/AAG/GCC/ATG/CGA/AAG…-3′
GCC
【解析】 (3)a是诱变第240位脯氨酸编码序列替换为丙氨酸编码序列的引物(GCA为诱变序列,与丙氨酸的密码子序列相同),b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸编码序列替换为丙氨酸编码序列的引物,其配对模板与a的配对模板相同,据此分析,除编码第243位苯丙氨酸的碱基序列TTC替换为诱变序列,与丙氨酸的密码子序列相同,其后的编码序列应该与a相同,为TGG/CTG/TTT……,所以该引物是c,其中GCC为第243位诱变序列,故丙氨酸的密码子还可以是GCC。
(4)进一步检测转基因酵母菌发酵得到的　　　 　含量并进行比较,可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。
香树脂醇
【解析】 (4)研究目的是通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N,可高效生产香树脂醇,由此可知,进一步检测转基因酵母菌发酵得到的香树脂醇含量并进行比较,可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。
题型二
PCR技术的应用
1.利用PCR技术鉴定目的基因的连接方式
在实际操作中,PCR技术不仅可以精准地鉴定受体细胞是否转入目的基因,还可以通过引物的巧妙设计鉴定目的基因的连接方式。设计PCR的一对引物时,一个引物与质粒DNA互补结合,另一个引物与目的基因DNA互补结合,这样只有以重组DNA为模板才能获得扩增产物。
专题聚焦
2.利用PCR技术引导基因定点突变
(1)重叠延伸PCR。
重叠延伸PCR需要设计两对引物:上游引物a、突变引物b以及下游引物d、突变引物c。其中突变引物b和c加入了突变碱基,且具有重叠区域,如图所示,引物中突变碱基处用“·”表示。第一、第二轮PCR时(即图中PCR1和PCR2)分别用引物a、b和引物c、d在两个PCR体系中扩增出突变碱基上游片段和下游片段。此时,上游片段和下游片段都携带突变碱基,但不具有完整的DNA长度。由于这两个片段具有重叠区域,将其置于一起时能局部配对并延伸,再通过上游引物a和下游引物d进行PCR可以扩增出大量含有突变碱基的DNA。
(2)大引物PCR。
需要用到三条引物进行两轮PCR,这三条引物分别是突变上游引物、常规上游引物和常规下游引物。第一轮PCR利用突变上游引物和常规下游引物进行扩增,得到不完整的含有突变位点的DNA片段;第二轮PCR利用第一轮扩增产物中的一条DNA链作为下游大引物,它与常规上游引物一起扩增得到完整的含有突变位点的DNA片段,再以此片段为模板,以常规上游引物进行扩增即得到一个双链都含有突变位点的DNA。该技术的流程如图所示:
3.利用PCR扩增未知基因序列
当DNA的某些序列已知,而需要扩增已知序列两端的未知序列时,可采用反向PCR技术。原理是用限制酶切割该DNA,随后使用DNA连接酶将获得的酶切产物环化,这样就获得了已知序列两侧携带有未知序列的环状DNA分子。以该已知序列为模板设计一对相反方向的特异性引物,该对引物对已知序列反向,但对未知序列却是相向的,从而得以扩增出未知序列。
原理如图。
4.利用PCR技术检测病毒核酸(实时荧光定量PCR技术)
实时荧光定量PCR扩增目的基因,需额外添加荧光标记探针(一小段单链DNA,可与目的基因中部序列特异性结合)。当探针完整时,不产生荧光。在PCR过程中,与目的基因结合的探针被耐高温的DNA聚合酶水解,R与Q分离后,R发出的荧光可被检测到(如图甲)。若待检测样品中存在相应病毒时,检测到的荧光强度变化如图乙,荧光到达预先设定阈值的循环数(Ct值)越小,说明病毒核酸浓度越高。
2.(2025·四川成都质检)反向PCR是一种通过已知序列设计引物对未知序列进行扩增的技术,其过程如下图所示。
考题精练
下列叙述正确的是(　　)
A.整个过程需用到限制酶、DNA连接酶、耐高温的DNA聚合酶及逆转录酶
B.环化阶段,可选E.coliDNA连接酶而不能选T4 DNA连接酶
C.PCR产物是包含所有已知序列和未知序列的环状DNA分子
D.应选择引物1和引物4进行PCR扩增
D
【解析】 整个过程需用到限制酶、DNA连接酶和耐高温的DNA聚合酶,由于没有逆转录过程,因此不需要逆转录酶;T4 DNA连接酶既可以连接平末端也可以连接黏性末端,所以环化阶段,可选E.coliDNA连接酶,也可选T4 DNA连接酶;PCR产物是包含所有已知序列和未知序列的链状DNA分子;DNA子链合成的方向为5′端到3′端,因此要通过已知序列设计引物对未知序列进行扩增,应选择引物1和引物4进行PCR扩增。
3. (2025·新疆乌鲁木齐二模)下图表示用荧光PCR法检测目的DNA的过程。在PCR反应体系中,加入足量与目的DNA部分序列互补的探针,探针包含一段脱氧核苷酸单链和发光基团,在完整的探针中发光基团不发光。在PCR过程中,当子链延伸到探针处时,TaqDNA聚合酶催化探针水解并释放发光基团,此时发光基团能发光。下列叙述错误的是(　　)
A.PCR的每一次循环包含变性、复性和延伸三步
B.探针和引物在目的DNA单链上的结合位点不同
C.TaqDNA聚合酶沿着子链5′→3′的方向催化氢键的形成
D.经历相同的循环次数,起始目的DNA量越多荧光强度越强
C
【解析】 PCR技术的基本过程包括变性、复性、延伸,每一次循环也都包含这三个步骤;由题可知,在PCR过程中,当子链延伸到探针处时探针被TaqDNA聚合酶催化水解,说明探针和引物在目的DNA单链上的结合位点不同;TaqDNA聚合酶沿着子链5′→3′的方向催化磷酸二酯键的形成;起始目的DNA量越多,探针与目标DNA结合就越多,经历相同的循环次数后,形成的游离的发光基团就越多,荧光强度越强。
4.(2026·湖北联考)某科研小组利用PCR定点突变技术培育抗冻蔬菜新品种。设计含有非特异性碱基配对的引物,将突变位点引入编码抗冻蛋白的基因中,获得抗冻能力更强的突变基因。下列叙述正确的是(　　)
A.过程②还需要四种核糖核苷酸和耐高温的DNA聚合酶
B.过程③至少需要两次循环才能得到两条链等长的DNA分子
C.过程④需要使用引物1和4才能获得目的基因
D.合成的DNA分子经混合、变性、杂交后发现通过引物2和3延伸形成的两条链杂交在一起,说明引物2和3的碱基序列相同
B
【解析】 过程②是 PCR 扩增过程,PCR 需要四种脱氧核糖核苷酸(不是核糖核苷酸)和耐高温的 DNA 聚合酶;过程③是PCR扩增含有突变位点的DNA片段,由于引物与模板链的结合位置不同,至少需要两次循环才能得到两条链等长的DNA分子;过程④经混合、变性后,杂交的两条单链均可为DNA聚合酶提供3′端,无需引物即可获得目的基因;合成的DNA分子经混合、变性、杂交后,通过引物2和3延伸形成的两条链杂交在一起,说明引物2和3的碱基序列互补,而不是相同。
谢谢观赏微专题10　PCR相关问题归纳
(时间:30分钟)
1.(2025·山西临汾二模)目的基因A含有100对碱基,其中腺嘌呤占30%,现利用目的基因A片段两侧的特异性序列设计引物Ⅰ、引物Ⅱ,用PCR技术扩增该目的基因,结构如下图所示。PCR扩增共循环50次。下列说法错误的是(　　)
A.PCR仪实质上是一台温度自动调控仪器,循环50次理论上复制50代
B.含目的基因A的DNA片段经PCR循环50次,需要两种引物共250个
C.PCR过程与体内DNA复制的方式相同,但是只需要一种酶的参与
D.若只考虑目的基因A,经PCR循环50次需要鸟嘌呤(250-1)×40个
2.(2025·内蒙古包头二模)双脱氧测序法是在PCR反应体系中,分别再加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸(ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP),子链延伸时,双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补配对原则,以加入ddATP的体系为例:若配对的为ddATP,延伸终止;若配对的为脱氧腺苷三磷酸(dATP),继续延伸;PCR产物变性后电泳检测。通过该方法测得某个体的一段序列如图。下列叙述错误的是(　　)
A.上述PCR反应体系中只加入一种引物
B.电泳时产物的片段越小,迁移速率越快
C.测得该个体某段DNA序列为
5′CTACCTGTGAT3′
D.子链延伸终止是由于双脱氧核苷三磷酸与模板链上的脱氧核苷酸配对时不能正常形成
氢键
3.(2025·天津河西三模)根据某基因上游和下游的碱基序列,设计合成了用于该基因PCR的两段引物(单链DNA)。引物与该基因变性DNA(单链DNA)结合的过程称为复性。下图是两引物的Tm值(引物熔解温度,即50%的引物与其互补序列形成双链DNA分子时的温度)测定结果,以下分析错误的是(　　)
A.PCR过程中,复性温度应高于引物的Tm值以提高PCR效率
B.两引物分别与DNA的两条互补单链结合,是子链延伸的起点
C.若两引物的脱氧核苷酸数相同,推测引物2的(G+C)含量较高
D.适当减少引物2的脱氧核苷酸数,可使其Tm值接近引物1
4.(2025·陕西汉中联考)巢式PCR是特殊的PCR技术,使用两对PCR引物扩增完整的DNA片段。具体过程分为两个阶段:第一阶段使用一对引物进行第一次PCR扩增,获得中间产物;第二阶段以中间产物为模板,使用另一对引物进行第二次PCR扩增,具体过程如图所示。下列相关叙述正确的是(　　)
A.巢式PCR技术能降低扩增多个靶位点的可能性
B.第一次PCR扩增DNA分子应选用引物①和引物③
C.巢式PCR扩增的两个阶段应在同一试管中进行
D.PCR扩增DNA分子的过程中,复性阶段的温度最高
5.(2025·安徽芜湖二模)不对称PCR是利用不等量的一对引物来产生大量单链DNA(ssDNA)的方法。加入的一对引物中含量较少的被称为限制性引物,含量较多的被称为非限制性引物。PCR反应最初的若干次循环中,其扩增产物主要是双链DNA(dsDNA),但当限制性引物消耗完后,就会产生大量的ssDNA。不对称PCR的简单过程如图所示。假设模板DNA分子初始数量为a个,6次循环后开始扩增产生ssDNA。下列有关叙述错误的是(　　)
A.限制性引物和非限制性引物均可与模板DNA单链结合
B.不对称PCR循环6次需要消耗(26-1)a个限制性引物
C.最后获得的ssDNA中不含非限制性引物
D.子链的延伸都是从两种引物的3′端开始的
6.(2025·山东德州月考)反向PCR是利用已知序列设计引物对未知序列进行扩增的技术,其过程如图。下列叙述错误的是(　　)
A.过程①可用同种限制酶切割磷酸和脱氧核糖之间的磷酸二酯键
B.过程②需用DNA连接酶将酶切片段环化以实现对未知序列的扩增
C.过程③需添加引物1和引物3以便DNA聚合酶从引物的3′端延伸子链
D.过程③中将温度调至72 ℃的目的是使引物与模板链通过碱基互补配对结合
7.(2025·福建厦门二模)实时荧光定量PCR是指在PCR反应体系中加入携带荧光基团的探针,利用荧光信号积累实时监测PCR反应进程的技术,可用于检测RNA病毒。提取病毒RNA,经逆转录形成cDNA,然后进行PCR,反应原理如下图所示。CT值表示PCR过程中荧光信号达到设定标准所需的循环次数。
下列叙述错误的是(　　)
A.探针与cDNA单链的结合遵循碱基互补配对原则
B.耐高温的DNA聚合酶具有催化探针水解的作用
C.CT值越小,意味着提取到的病毒RNA含量越低
D.若病毒发生单个碱基的突变,可能不会影响检测结果
8.(2025·山东潍坊三模)融合PCR技术采用具有互补末端的引物,形成具有重叠链的PCR产物,通过PCR产物重叠链的延伸,从而将不同来源的任意DNA片段连接起来(如图)。下列说法错误的是(　　)
A.基因甲至少经3个循环才能获得含引物P2的双链等长DNA
B.不能为提高扩增效率把四种引物同时加入一个扩增体系
C.图中融合PCR第一步的两条链重叠部位可互相作为另一条链的引物
D.由融合基因经PCR扩增获得64个融合基因至少消耗63个引物P4
9.(2025·河北衡水模拟)科学家斯万特·帕博凭借对已灭绝古人类基因组和人类进化的发现荣获2022年诺贝尔生理学或医学奖。他在研究过程中使用了大引物PCR构建定点突变,其过程如图。下列相关叙述正确的是(　　)
A.进行PCR扩增需要的酶有解旋酶和耐高温的DNA聚合酶
B.与第一轮PCR相比,第二轮PCR的复性温度需要适当降低
C.第二轮PCR所用的引物为第一轮PCR所产生的DNA的两条链
D.要完成两处位点的突变,至少需要设计4种引物
10.(2023·山东卷,25)科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测,该质粒的部分结构如图甲所示,其中V5编码序列表达标签短肽V5。
(1)与图甲中启动子结合的酶是　 。除图甲中标出的结构外,作为载体,质粒还需具备的结构有　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　　　　　(答出2个结构即可)。
(2)构建重组质粒后,为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确,需进行PCR检测,若仅用一对引物,应选择图甲中的引物　　　　　　　　　　　　　　　。已知J基因转录的模板链位于b链,由此可知引物F1与图甲中J基因的　　　　　(填“a链”或“b链”)相应部分的序列相同。
(3)重组质粒在受体细胞内正确表达后,用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平,结果如图乙所示。其中,出现条带1证明细胞内表达了　　　　 　　　,条带2所检出的蛋白　　　　 　(填“是”或“不是”)由重组质粒上的J基因表达的。 微专题10　PCR相关问题归纳
(时间:30分钟)
1.(2025·山西临汾二模)目的基因A含有100对碱基,其中腺嘌呤占30%,现利用目的基因A片段两侧的特异性序列设计引物Ⅰ、引物Ⅱ,用PCR技术扩增该目的基因,结构如下图所示。PCR扩增共循环50次。下列说法错误的是(　　)
A.PCR仪实质上是一台温度自动调控仪器,循环50次理论上复制50代
B.含目的基因A的DNA片段经PCR循环50次,需要两种引物共250个
C.PCR过程与体内DNA复制的方式相同,但是只需要一种酶的参与
D.若只考虑目的基因A,经PCR循环50次需要鸟嘌呤(250-1)×40个
【答案】 B
【解析】 PCR仪实质上是一台温度自动调控仪器,循环50次理论上复制50代;含目的基因A的DNA片段经PCR循环50次,产生250个子代DNA,每个DNA分子需要2个引物,亲本DNA除外,故需要两种引物共(251-2)个;PCR过程与体内DNA复制的方式相同,都是半保留复制,但是只需要耐高温的DNA聚合酶的参与;由题可知,目的基因A含有100对碱基,其中腺嘌呤占30%,则G占20%,为40个,若只考虑目的基因A,经PCR循环50次需要鸟嘌呤(250-1)×40个。
2.(2025·内蒙古包头二模)双脱氧测序法是在PCR反应体系中,分别再加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸(ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP),子链延伸时,双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补配对原则,以加入ddATP的体系为例:若配对的为ddATP,延伸终止;若配对的为脱氧腺苷三磷酸(dATP),继续延伸;PCR产物变性后电泳检测。通过该方法测得某个体的一段序列如图。下列叙述错误的是(　　)
A.上述PCR反应体系中只加入一种引物
B.电泳时产物的片段越小,迁移速率越快
C.测得该个体某段DNA序列为5′CTACCTGTGAT3′
D.子链延伸终止是由于双脱氧核苷三磷酸与模板链上的脱氧核苷酸配对时不能正常形成氢键
【答案】 D
【解析】 子链延伸终止的原因是,双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)与模板链配对后,因其3′端没有羟基,不能与下一个脱氧核苷酸形成磷酸二酯键,进而导致子链延伸终止,而非不能正常形成氢键。
3.(2025·天津河西三模)根据某基因上游和下游的碱基序列,设计合成了用于该基因PCR的两段引物(单链DNA)。引物与该基因变性DNA(单链DNA)结合的过程称为复性。下图是两引物的Tm值(引物熔解温度,即50%的引物与其互补序列形成双链DNA分子时的温度)测定结果,以下分析错误的是(　　)
A.PCR过程中,复性温度应高于引物的Tm值以提高PCR效率
B.两引物分别与DNA的两条互补单链结合,是子链延伸的起点
C.若两引物的脱氧核苷酸数相同,推测引物2的(G+C)含量较高
D.适当减少引物2的脱氧核苷酸数,可使其Tm值接近引物1
【答案】 A
【解析】 PCR过程中,复性温度应低于引物的Tm值以提高PCR效率;PCR过程是目的基因DNA受热变性后解链为单链,引物与单链互补结合,在耐高温的DNA聚合酶的作用下子链进行延伸,所以两引物分别与DNA的两条互补单链结合,是子链延伸的起点;DNA含有的氢键数越多,其热稳定性越高,而A和T碱基对间有两个氢键,C和G碱基对间有三个氢键,曲线图显示:引物2的Tm值高于引物1,若两引物的脱氧核苷酸数相同,推测引物2的(G+C)含量较高;适当减少引物2的脱氧核苷酸数,会降低引物2的热稳定性,可使其Tm值接近引物1。
4.(2025·陕西汉中联考)巢式PCR是特殊的PCR技术,使用两对PCR引物扩增完整的DNA片段。具体过程分为两个阶段:第一阶段使用一对引物进行第一次PCR扩增,获得中间产物;第二阶段以中间产物为模板,使用另一对引物进行第二次PCR扩增,具体过程如图所示。下列相关叙述正确的是(　　)
A.巢式PCR技术能降低扩增多个靶位点的可能性
B.第一次PCR扩增DNA分子应选用引物①和引物③
C.巢式PCR扩增的两个阶段应在同一试管中进行
D.PCR扩增DNA分子的过程中,复性阶段的温度最高
【答案】 A
【解析】 巢式PCR使用两对引物进行两轮扩增,其中第二轮扩增的引物是针对第一轮扩增的中间产物设计的,因此具有更高的特异性,这种特异性使得巢式PCR能够更准确地扩增目标DNA片段,降低了扩增多个靶位点的可能性;根据图示和巢式PCR的原理,第一次PCR扩增应该使用引物①和引物④,它们分别与目标DNA片段的两端互补,从而能够扩增出包含整个目标片段的中间产物,引物②和引物③则是用于第二轮扩增的,它们与中间产物的特定序列互补;巢式PCR的两个阶段通常不在同一试管中进行,因为第二阶段需要去除第一阶段的引物和未反应的DNA,以免干扰第二阶段的特异性扩增;PCR扩增DNA分子的过程中,变性阶段的温度最高。
5.(2025·安徽芜湖二模)不对称PCR是利用不等量的一对引物来产生大量单链DNA(ssDNA)的方法。加入的一对引物中含量较少的被称为限制性引物,含量较多的被称为非限制性引物。PCR反应最初的若干次循环中,其扩增产物主要是双链DNA(dsDNA),但当限制性引物消耗完后,就会产生大量的ssDNA。不对称PCR的简单过程如图所示。假设模板DNA分子初始数量为 a个,6次循环后开始扩增产生ssDNA。下列有关叙述错误的是(　　)
A.限制性引物和非限制性引物均可与模板DNA单链结合
B.不对称PCR循环6次需要消耗(26-1)a个限制性引物
C.最后获得的ssDNA中不含非限制性引物
D.子链的延伸都是从两种引物的3′端开始的
【答案】 C
【解析】 据图可知,限制性引物和非限制性引物均可与模板DNA单链结合;PCR扩增时引物是新子链的一部分,假设模板DNA分子初始数量为a个,6次循环后产生26a个DNA分子,因此该不对称PCR循环6次需要(26-1)a个限制性引物;据图可知,最终获得的ssDNA都是以乙链为模板合成的,因此,最终获得的ssDNA中都有非限制性引物;PCR技术的原理是DNA的半保留复制,DNA复制过程中,子链的延伸都是从引物的3′端开始的。
6.(2025·山东德州月考)反向PCR是利用已知序列设计引物对未知序列进行扩增的技术,其过程如图。下列叙述错误的是(　　)
A.过程①可用同种限制酶切割磷酸和脱氧核糖之间的磷酸二酯键
B.过程②需用DNA连接酶将酶切片段环化以实现对未知序列的扩增
C.过程③需添加引物1和引物3以便DNA聚合酶从引物的3′端延伸子链
D.过程③中将温度调至72 ℃的目的是使引物与模板链通过碱基互补配对结合
【答案】 D
【解析】 由图可知,过程①即酶切后,该片段能环化,说明两端的黏性末端相同,故过程①可用同一种限制酶对未知序列两端进行切割;过程②即环化,将DNA片段连接起来,该过程中使用DNA连接酶催化相邻核苷酸之间形成磷酸二酯键;过程③为扩增,需添加引物1和引物3以便DNA聚合酶从引物的3′端以未知序列为模板延伸子链;过程③中将温度调至72 ℃的目的是使DNA子链在耐高温的DNA聚合酶的作用下延伸。
7.(2025·福建厦门二模)实时荧光定量PCR是指在PCR反应体系中加入携带荧光基团的探针,利用荧光信号积累实时监测PCR反应进程的技术,可用于检测RNA病毒。提取病毒RNA,经逆转录形成cDNA,然后进行PCR,反应原理如下图所示。CT值表示PCR过程中荧光信号达到设定标准所需的循环次数。
下列叙述错误的是(　　)
A.探针与cDNA单链的结合遵循碱基互补配对原则
B.耐高温的DNA聚合酶具有催化探针水解的作用
C.CT值越小,意味着提取到的病毒RNA含量越低
D.若病毒发生单个碱基的突变,可能不会影响检测结果
【答案】 C
【解析】 CT值表示PCR过程中荧光信号达到设定标准所需的循环次数,CT值越小,说明达到设定标准需要的循环次数越少,因而意味着提取到的病毒RNA含量越高。
8.(2025·山东潍坊三模)融合PCR技术采用具有互补末端的引物,形成具有重叠链的PCR产物,通过PCR产物重叠链的延伸,从而将不同来源的任意DNA片段连接起来(如图)。下列说法错误的是(　　)
A.基因甲至少经3个循环才能获得含引物P2的双链等长DNA
B.不能为提高扩增效率把四种引物同时加入一个扩增体系
C.图中融合PCR第一步的两条链重叠部位可互相作为另一条链的引物
D.由融合基因经PCR扩增获得64个融合基因至少消耗63个引物P4
【答案】 A
【解析】 基因甲至少经2个循环才能获得含引物P2的双链等长DNA;在融合PCR 技术里,甲基因扩增依赖引物 P1、P2,乙基因扩增依赖引物 P3、P4,若加入同一扩增体系中,引物间易相互干扰(P2和P3存在互补序列),无法精准、高效完成甲、乙基因各自扩增,所以不能为提高扩增效率把四种引物同时加入一个扩增体系;由图可知,融合PCR的第一步两条链重叠部位互补配对,可互为另一条链的引物;由融合基因经PCR扩增获得64个融合基因,消耗引物数目和新合成的子链数目相同,即该过程消耗了64×2-2=126(个)引物,该过程消耗了126÷2=63(个)引物P4。
9.(2025·河北衡水模拟)科学家斯万特·帕博凭借对已灭绝古人类基因组和人类进化的发现荣获2022年诺贝尔生理学或医学奖。他在研究过程中使用了大引物PCR构建定点突变,其过程如图。下列相关叙述正确的是(　　)
A.进行PCR扩增需要的酶有解旋酶和耐高温的DNA聚合酶
B.与第一轮PCR相比,第二轮PCR的复性温度需要适当降低
C.第二轮PCR所用的引物为第一轮PCR所产生的DNA的两条链
D.要完成两处位点的突变,至少需要设计4种引物
【答案】 D
【解析】 进行PCR扩增需要的酶是耐高温的DNA聚合酶,不需要解旋酶;由图可知,第一轮PCR所用引物为常规引物和诱变引物,第二轮PCR所用的引物中一个是第一轮PCR所产生的DNA的一条链(大引物),另一个是常规引物,由于大引物的长度大于常规引物和诱变引物,因此与第一轮PCR相比,第二轮PCR的复性温度需要适当提高;由图可知,完成一处位点的突变需要两种常规引物和一种诱变引物,如果要完成两处位点的突变,则至少需要两种常规引物和两种诱变引物,即至少需要设计4种引物。
10.(2023·山东卷,25)科研人员构建了可表达JV5融合蛋白的重组质粒并进行了检测,该质粒的部分结构如图甲所示,其中V5编码序列表达标签短肽V5。
(1)与图甲中启动子结合的酶是　　　　　　　。除图甲中标出的结构外,作为载体,质粒还需具备的结构有　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　(答出2个结构即可)。
(2)构建重组质粒后,为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确,需进行PCR检测,若仅用一对引物,应选择图甲中的引物　　　　　　　　　　　　　　　。已知J基因转录的模板链位于b链,由此可知引物F1与图甲中J基因的　　　　　(填“a链”或“b链”)相应部分的序列相同。
(3)重组质粒在受体细胞内正确表达后,用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平,结果如图乙所示。其中,出现条带1证明细胞内表达了　　　　　
　　　　　,条带2所检出的蛋白　　　　　(填“是”或“不是”)由重组质粒上的J基因表达的。
【答案】 (1)RNA聚合酶　限制酶切割位点、标记基因、复制原点等
(2)F2和R1或F1和R2　a链
(3)JV5融合蛋白　不是
【解析】 (1)启动子位于基因的上游,能驱动基因转录出mRNA,是RNA聚合酶识别和结合的部位。作为载体,质粒必须具备的条件有①要具有限制酶的切割位点;②要有标记基因(如抗性基因),以便于重组后重组质粒的筛选;③能在宿主细胞中稳定存在并复制;④是安全的,对受体细胞无害,而且要易从供体细胞分离出来,图甲中有启动子和终止子等,因此质粒还需具备的结构有限制酶的切割位点、标记基因、复制原点等。
(2)据图甲可知,引物F2与R1或F1与R2结合部位包含J基因的碱基序列和部分连接序列,因此推测为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确,进行PCR检测时,若仅用一对引物,应选择图甲中的引物F2和R1或F1和R2。b是模板链,而根据图上启动子和终止子的位置可知转录方向是从左向右,对应的模板链方向应该是3′→5′,非模板链(也就是a链)是5′→3′;图中F1是前引物,在左侧,所以其配对的单链是3′→5′的b链,故其序列应该与a链相应部分的序列相同。
(3)据图乙可知,用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测,均出现条带1,说明条带1是JV5融合蛋白。抗J蛋白抗体检测出现条带2,抗V5抗体检测不出现条带2,说明条带2所检出的蛋白不是由重组质粒上的J基因表达的。微专题10　PCR相关问题归纳
题型一　利用PCR技术获取和扩增目的基因
1.利用PCR技术获取目的基因的过程图解(目的基因位于DNA片段中)
2.PCR中的数量关系
循环次数 1 2 3 n
DNA分子数 2 4 8 2n
含引物A(或B)的 DNA分子数 1 3 7 2n-1
同时含引 物A、B的 DNA分子数 0=21-2 2=22-2 6=23-2 2n-2
共消耗的 引物数量 2=21+1-2 6=22+1-2 14=23+1-2 2n+1-2
3.引物设计应注意的问题
(1)设计引物的依据:目的基因两端的核苷酸序列。
(2)引物设计时既要考虑目的基因序列,又要考虑载体序列,原因:为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接,需在引物的5′端加上限制酶的酶切位点。
(3)使用的一对引物的序列不相同,因为目的基因两端具有不同的核苷酸序列。
(4)引物设计的要求(或引物失效的原因):
①每种引物内部不能发生局部碱基互补配对,原因:防止引物自身折叠。
②两种引物之间不能在局部发生碱基互补配对,原因:防止引物之间配对,导致引物不能同模板链结合。
(5)两种引物都结合在DNA模板链的3′端;脱氧核苷酸连接在引物的3′端进行延伸。
1.(2025·黑吉辽内蒙古卷,25 )香树脂醇具有抗炎等功效,从植物中提取难度大、产率低。通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N,可高效生产香树脂醇。回答下列问题。
(1)可从　　　　　　中查询基因N的编码序列,设计特定引物。如图1所示,a链为转录模板链,为保证基因N与质粒pYL正确连接,需在引物1和引物2的5′端分别引入　　　 　和
　　　　限制酶识别序列。PCR扩增基因N,特异性酶切后,利用　　　　　连接DNA片段,构建重组质粒,大小约9.5 kb(kb为千碱基对),假设构建重组质粒前后,质粒pYL对应部分大小基本不变。
(2)进一步筛选构建的质粒,以1~4号菌株中提取的质粒为模板,使用引物1和引物2进行PCR扩增,电泳PCR产物,结果如图2。在第5组的PCR反应中,使用无菌水代替实验组的模板DNA,目的是检验PCR反应中是否有　　　　　　　的污染。初步判断实验组　　　　(从“1~4”中选填)的质粒中成功插入了基因N,理由是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(3)为提高香树脂醇合酶催化效率,将编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列,丙氨酸的密码子有GCA等。a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物(GCA为诱变序列),b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物,其配对模板与a的配对模板相同。据此分析,丙氨酸的密码子除GCA外,还有　　　　。
a:5′…GCA/CCC/GAG/TTC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC…3′
b:5′…GAA/CTG/TGG/GAC/ACC/CTG/AAC/TAC/TTC/TCT/GAG…3′
c:5′…GCC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC/CCC/TAC/CAC…3′
d:5′…GAT/AAT/AAG/ATC/CGA/GAG/AAG/GCC/ATG/CGA/AAG…3′
(4)进一步检测转基因酵母菌发酵得到的　　　 　含量并进行比较,可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。
题型二　PCR技术的应用
1.利用PCR技术鉴定目的基因的连接方式
在实际操作中,PCR技术不仅可以精准地鉴定受体细胞是否转入目的基因,还可以通过引物的巧妙设计鉴定目的基因的连接方式。设计PCR的一对引物时,一个引物与质粒DNA互补结合,另一个引物与目的基因DNA互补结合,这样只有以重组DNA为模板才能获得扩增产物。
2.利用PCR技术引导基因定点突变
(1)重叠延伸PCR。
重叠延伸PCR需要设计两对引物:上游引物a、突变引物b以及下游引物d、突变引物c。其中突变引物b和c加入了突变碱基,且具有重叠区域,如图所示,引物中突变碱基处用“·”表示。第一、第二轮PCR时(即图中PCR1和PCR2)分别用引物a、b和引物c、d在两个PCR体系中扩增出突变碱基上游片段和下游片段。此时,上游片段和下游片段都携带突变碱基,但不具有完整的DNA长度。由于这两个片段具有重叠区域,将其置于一起时能局部配对并延伸,再通过上游引物a和下游引物d进行PCR可以扩增出大量含有突变碱基的DNA。
(2)大引物PCR。
需要用到三条引物进行两轮PCR,这三条引物分别是突变上游引物、常规上游引物和常规下游引物。第一轮PCR利用突变上游引物和常规下游引物进行扩增,得到不完整的含有突变位点的DNA片段;第二轮PCR利用第一轮扩增产物中的一条DNA链作为下游大引物,它与常规上游引物一起扩增得到完整的含有突变位点的DNA片段,再以此片段为模板,以常规上游引物进行扩增即得到一个双链都含有突变位点的DNA。该技术的流程如图所示:
3.利用PCR扩增未知基因序列
当DNA的某些序列已知,而需要扩增已知序列两端的未知序列时,可采用反向PCR技术。原理是用限制酶切割该DNA,随后使用DNA连接酶将获得的酶切产物环化,这样就获得了已知序列两侧携带有未知序列的环状DNA分子。以该已知序列为模板设计一对相反方向的特异性引物,该对引物对已知序列反向,但对未知序列却是相向的,从而得以扩增出未知序列。原理如图。
4.利用PCR技术检测病毒核酸(实时荧光定量PCR技术)
实时荧光定量PCR扩增目的基因,需额外添加荧光标记探针(一小段单链DNA,可与目的基因中部序列特异性结合)。当探针完整时,不产生荧光。在PCR过程中,与目的基因结合的探针被耐高温的DNA聚合酶水解,R与Q分离后,R发出的荧光可被检测到(如图甲)。若待检测样品中存在相应病毒时,检测到的荧光强度变化如图乙,荧光到达预先设定阈值的循环数(Ct值)越小,说明病毒核酸浓度越高。
2.(2025·四川成都质检)反向PCR是一种通过已知序列设计引物对未知序列进行扩增的技术,其过程如下图所示。下列叙述正确的是(　　)
A.整个过程需用到限制酶、DNA连接酶、耐高温的DNA聚合酶及逆转录酶
B.环化阶段,可选E.coliDNA连接酶而不能选T4 DNA连接酶
C.PCR产物是包含所有已知序列和未知序列的环状DNA分子
D.应选择引物1和引物4进行PCR扩增
3. (2025·新疆乌鲁木齐二模)下图表示用荧光PCR法检测目的DNA的过程。在PCR反应体系中,加入足量与目的DNA部分序列互补的探针,探针包含一段脱氧核苷酸单链和发光基团,在完整的探针中发光基团不发光。在PCR过程中,当子链延伸到探针处时,TaqDNA聚合酶催化探针水解并释放发光基团,此时发光基团能发光。下列叙述错误的是(　　)
A.PCR的每一次循环包含变性、复性和延伸三步
B.探针和引物在目的DNA单链上的结合位点不同
C.TaqDNA聚合酶沿着子链5′→3′的方向催化氢键的形成
D.经历相同的循环次数,起始目的DNA量越多荧光强度越强
4.(2026·湖北联考)某科研小组利用PCR定点突变技术培育抗冻蔬菜新品种。设计含有非特异性碱基配对的引物,将突变位点引入编码抗冻蛋白的基因中,获得抗冻能力更强的突变基因。下列叙述正确的是(　　)
A.过程②还需要四种核糖核苷酸和耐高温的DNA聚合酶
B.过程③至少需要两次循环才能得到两条链等长的DNA分子
C.过程④需要使用引物1和4才能获得目的基因
D.合成的DNA分子经混合、变性、杂交后发现通过引物2和3延伸形成的两条链杂交在一起,说明引物2和3的碱基序列相同

展开更多......

收起↑