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(共66张PPT)
第三章 基因工程
人教版·选择性必修3
水母的绿色荧光蛋白基因
基因表达
转基因荧光鱼
基因的结构和功能
1.基因与DNA的关系？
2.基因的基本单位是什么？
基因是有遗传效应的DNA片段
DNA平面结构
DNA立体结构
CH2
H
OH
H
H
H
H
碱基
磷酸
5’
4’
3’
2’
1’
脱氧核苷酸
记忆再挖掘
3.基因的功能？
储存、传递、表达遗传信息
复制
子代DNA
转录、翻译
控制蛋白质合成
复制
转录
翻译
DNA
RNA
逆转录
复制
蛋白质
记忆再挖掘
基因的结构和功能
1944年艾弗里等人证明了DNA可以在同种生物的不同个体之间转移。
1950年埃特曼发明了一种测定氨基酸序列的方法。
1958年梅塞尔森和斯塔尔用实验证明了DNA的半保留复制。
1953年沃森和克里克建立了DNA双螺旋结构模型。
1961年尼伦伯格和马太破译了第一个编码氨基酸的密码子。
1967年，科学家发现，在细菌拟核DNA之外的质粒有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移。
1970年科学家在细菌中发现了第一个限制性内切核酸酶（简称限制酶）。
20世纪70年代初，多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶被相继发现。
1972年，伯格成功构建了第一个体外重组DNA分子。
1973年，证明质粒可以作为基因工程的载体，构建重组DNA，导入受体细胞，使外源基因在原核细胞中成功表达，基因工程正式问世。
1977年，桑格等科学家发明了DNA序列分析的方法。此后，DNA合成仪的问世为体外合成DNA提供了方便。
1982年，第一个基因工程药物-重组人胰岛素被批准上市。
1983年，科学家采用农杆菌转化法培育出世界上第一例转基因烟草。
1984年，我国科学家朱作言领导的团队培育出世界上第一条转基因鱼。
1985年，穆里斯等人发明了PCR。
1990年，人类基因组计划启动。2003年完成
21世纪以来，科学家发明了多种高通量测序技术，加速了人们对基因组序列的了解。
2013年，华人科学家张锋及其团队首次报道利用最新的基因组编辑技术编辑了哺乳动物基因组。该技术可以实现对特定基因的定点插入、敲除或替换。
◎科技探索之路：基因工程发展历程

P68
　　指按照 ,进行严格的设计并通过 DNA重组和 等技术，赋予生物以新的遗传特性,创造出更符合人们需要的 。由于基因工程是在 上进行设计和施工的，因此又叫作 。
人们的愿望
体外
转基因
新的生物类型和生物产品
DNA分子水平
DNA重组技术
◎科技探索之路：基因工程发展历程
基因工程
P67
基因工程的别名：
操作环境：
操作对象：
操作水平：
基本过程：
原理：
结果：
重组DNA技术、
转基因技术
生物体外
基因
DNA 分子水平
剪切
基因重组
创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品
→拼接
→导入
→表达
优点：
克服远缘杂交不亲和障碍、 改造生物性状
定向
◎科技探索之路：基因工程发展历程
基因工程
P67
水母的绿色荧光蛋白基因
1.以下有关基因工程的叙述，正确的是（ ）
A．基因工程是细胞水平上的生物工程
B．基因工程的目的是获得目的基因表达的蛋白质产物
C．基因工程产生的变异属于人工诱变
D．基因工程育种的优点之一是可以定向地使生物产生可遗传的变异
D
◎活学活用
2.下列关于基因工程的叙述，不正确的是（ ）
A．基因工程的原理主要是基因重组
B．运用基因工程技术，可使生物发生定向变异
C．一种生物的基因转接到另一种生物的DNA分子上，
属于基因工程的内容
D．是非同源染色体上非等位基因的自由组合
D
◎活学活用
第三章 基因工程
人教版·选择性必修3
重组DNA技术的基本工具
第1节
普通棉花
如何能培育出自身就能抵抗虫害 的棉花新品种呢？
转基因抗虫棉
将苏云金杆菌中的Bt抗虫蛋白基因 转入普通棉花
从社会中来
我国是棉花的生产和消费大国，棉花在种植过程中，常会受到一些虫害的侵袭，其中以棉铃虫最为常见，它可以使棉花产量减少三分之一，甚至绝收。
大量施用农药
×
基因工程诞生的理论基础
拼接的基础
1. DNA的基本组成单位 。
表达的基础
2. 都遵循 原则
3. DNA分子的空间结构都是规则的 结构
1. 基因是控制生物 的结构与功能单位
2. 遗传信息的传递都遵循 法则
基因在空间上转移并成功表达
3. 生物界共用 。（相同的遗传信息在不同的生物体内表达出相同的蛋白质）。
DNA（基因）
转录
翻译
mRNA
蛋白质
基因工程
相同（四种脱氧核苷酸）
碱基互补配对
双螺旋
中心
一套遗传密码
性状
资料：DNA双螺旋的直径只有2nm，对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。
科学家究竟用到了哪些“分子工具”？
这些 “分子工具”各具有什么特征呢？
思考·讨论：
“分子运输车”
“分子手术刀”
“分子缝合针”
限制性内切核酸酶（限制酶）
DNA连接酶
基因进入受体细胞的载体（如质粒）
基因工程
（准确切割DNA分子）
（将DNA片段连接起来）
（将体外重组好的DNA分子导入受体细胞）
1. 限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
① 来源：
主要是原核生物
T
A
C
G
G
C
A
T
G
C
G
C
A
T
5
3
5
3
④ 作用特点：
能够 双链DNA分子的特定脱氧核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的
断开。
② 化学本质：
蛋白质
③ 种类：
数千种
（限制酶不是一种酶，而是一类酶）
限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
一
识别
磷酸二酯键
1.你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？
2.为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？
思考·讨论：
原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。
通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中不具备这种限制酶识别的特定核苷酸序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。
原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已被修饰
切割外源DNA、使之失效，以保证自身安全
一
限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
一
2. 限制酶的识别序列
大多数限制酶的识别序列由 组成，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。
思考·讨论：
中轴线
限制酶所识别的序列，呈现碱基互补对称。无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线（如图），中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向、对称、重复排列的，称为回文序列。
想一想限制酶所识别的序列有什么特点？
一
限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
一
6个核苷酸
Sma I 限制酶只能识别 序列，切割 和 之间的 切开，切割后产生 。
3. 限制酶的作用结果
A
G
T
C
A
T
T
C
G
A
T
A
G
G
A
T
C
A
T
C
A
T
A
T
大肠杆菌(E.coli)的EcoRⅠ 限制酶能特异性识别_________序列，并切割___和___之间的____________，切割后产生__________。
GAATTC
G
A
磷酸二酯键
黏性末端
Eco RI 限制酶
Sma I 限制酶
CCCGGG
C
G
磷酸二酯键
平末端
C
C
C
G
G
G
G
G
G
C
C
C
G
G
G
C
C
C
C
C
C
G
G
G
限制酶
限制酶
限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
一
限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
一
4. 限制酶的命名
限制酶是用生物属名的头一个字母与种加词的头两个字母，组成了三个字母的略语，以此来表示这个酶是从哪种生物中分离出来的。限制酶的命名是根据细菌种类而定，以EcoRI为例:
E：Escherichia （属名）
co：coli （种加词）
R：RY13 （品系）
I：首先发现 在此类细菌中发现的顺序
EcoRⅠ：大肠杆菌（Escherichia coli）R型菌株中分离出的第一个限制酶；
SmaⅠ：粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）中分离出的第一个限制酶。
练习：流感嗜血杆菌的d菌株（Haemophilus influenzae d）中先后分离到3种限制酶，则分别命名为： 。
HindⅠ、HindⅡ、 HindⅢ
限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
一
知识巩固
1. 请写出下列限制酶切割形成的黏性末端，并思考同种限制酶切割产生的黏性末端是否相同？不同限制酶切割产生的黏性末端是否一定不同？
提示：
同种限制酶产生的黏性末端 。
限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
一
相同
结论1：
A
TGATC
CTAGA
T
CTAGT
A
T
AGATC
结论1：
同种限制酶产生的黏性末端相同;
不同的限制酶可能会形成相同的黏性末端，可通过DNA连接酶连接。
A
TGATC
CTAGA
T
(同尾酶)
使切割点的选择范围扩大.
限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
一
1. 请写出下列限制酶切割形成的黏性末端，并思考同种限制酶切割产生的黏性末端是否相同？不同限制酶切割产生的黏性末端是否一定不同？
2.请判断：以下黏性末端是由______种限制酶作用产生的。
3
注意观察识别序列和切割位点
①找到切割位点
②补全序列
限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
一
做题技巧：
3.下图所示的黏性末端属于同一种限制酶切割产生的是（ ）
C
A.①② B.①③ C.②④ D.③④
限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
一
4. 结合下图，推断限制酶切一次可断开几个磷酸二酯键？产生多少游离的磷酸基团？产生几个黏性末端？消耗几分子水？
限制酶切一次可断开 个磷酸二酯键，产生 个游离的磷酸基团，产生 个黏性末端，消耗 分子水
2
2
2
2
限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
一
5.若某链状DNA分子中含有两个BamHⅠ的识别序列，该DNA分子将被切成____个片段，共断裂____个磷酸二酯键，形成几个_____黏性末端。
3
4
4
限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
一
1.2 DNA连接酶——“分子缝合针”
如何将两个DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
G
C T T A A
A A T T C
G
G
C T T A A
A A T T C
G
用DNA连接酶连接两个片段之间的 。
DNA连接酶——“分子缝合针”
二
磷酸二酯键
1. DNA连接酶——“分子缝合针”
将双链___________“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的_____________。
DNA片段
磷酸二酯键
① 作用：
② 分类：
类型 来源 功能 相同点 差别
E.coli DNA连接酶
T4 DNA连接酶
大肠杆菌
T4噬菌体
能连接黏性末端和
平末端（效率较低）
只能连接黏性末端
恢复磷酸二酯键
DNA连接酶——“分子缝合针”
二
A
G
T
C
A
T
T
C
G
A
T
A
可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来；
E.coli DNA连接酶
T
C
G
A
T
C
注意：
DNA连接酶可连接双链DNA中的DNA单链缺口，但不能将单个脱氧核苷酸连接到DNA链上！
DNA连接酶——“分子缝合针”
二
T4 DNA连接酶
还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较 .
C
C
C
G
G
G
G
G
G
C
C
C
DNA连接酶——“分子缝合针”
二
低
DNA连接酶——“分子缝合针”
二
解旋酶
DNA聚合酶
DNA聚合酶
游离的
脱氧核苷酸
5
5
3
3
新合成的子链
思考：DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事吗？为什么？
DNA连接酶——“分子缝合针”
二
小结
DNA连接酶与DNA聚合酶的比较
DNA连接酶 DNA聚合酶
相同点 作用实质 化学本质 不 同 点 模板
作用对象
作用结果
用途
都能催化形成磷酸二酯键
都是蛋白质
不需要
需要DNA的一条链作模板
形成完整的重组DNA分子
形成DNA的一条链
基因工程
DNA复制
只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键
在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键
DNA连接酶——“分子缝合针”
二
思考·讨论
① DNA聚合酶
② DNA连接酶
③ DNA解旋酶
④ 限制酶
下列是有关DNA的各种酶，请选择对应的作用位点：
氢键
磷酸二酯键
T
A
C
G
G
C
A
T
G
C
G
C
5
3
5
3
DNA连接酶——“分子缝合针”
二
几种相关酶的比较
课堂小结
名称 作用部位 作用结果
限制酶
DNA连接酶
DNA聚合酶
DNA(水解)酶
解旋酶
磷酸二酯键
碱基对之间的氢键
将DNA切成两个片段
磷酸二酯键
将两个DNA片段连接为一个DNA分子
磷酸二酯键
将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端
磷酸二酯键
将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链。
DNA连接酶——“分子缝合针”
二
如何将人目标基因基因运送到大肠杆菌细胞呢？
思考：
（2）载体种类：
质粒、噬菌体、动植物病毒等
基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
三
1. 基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
（1）载体的作用
①作为运载工具，将 导入受体细胞中
②在受体细胞内对目的基因进行大量 .
外源基因
复制
它们的来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小也有很大差别。
合作探究：分析归纳载体需要具备的条件：
条件①：具有一个或多个限制酶切割位点；
条件②：能在受体细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制；
条件③：具有标记基因，便于重组DNA分子的筛选。
条件④：载体DNA必须是安全的，不会对受体细胞有害。
DNA连接酶——“分子缝合针”
二
问题3：我们用肉眼看不到载体是否进入受体细胞，为了便于筛选重组DNA分子，载体需要具备什么条件？
问题2：要使携带的外源基因在受体细胞中稳定存在，载体需要具备什么条件？
问题1：载体要与外源基因连接，需要具备什么条件？
供外源基因插入其中
使外源基因在受体细胞中稳定存在并复制，以扩增外源基因的数量
如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等
有标记基因的存在，可用含青霉素的培养基鉴别。
能复制，并带着插入的目的基因一起复制
是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我 能力的环状双链DNA分子。
有切割位点
基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
三
2.最常用的载体
—质粒：
复制
真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过 改造的。
人工
3.标记基因的筛选原理
03
基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
三
(1)重组DNA导入受体细胞不是100%，而且导入率较低
知识扩展
载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。如图所示：
标记基因的筛选原理
导入
受体细胞
培养
加入氨苄青霉素
只有含有载体，并且载体上的抗性基因表达的大肠杆菌才能存活并增殖
含有氨苄青霉素抗性基因载体（如质粒）
基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
三
如: 绿色荧光蛋白基因(GFP)、红色荧光蛋白基因(RFP)
(2) 标记基因通常有:
①抗生素的抗性基因
如: 抗氨苄青霉素基因(ampr)、
抗四环素基因(tetr)
②荧光蛋白基因
基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
三
思考·讨论1：重组DNA分子
请你根据图3-3中的相关信息找到两条片段上EcoRI 的识别序列和切割位点。 然后，用剪刀进行“切割”。待切割位点全部切开后，将从下面那条DNA链上切下的片段重组到上面那条DNA链的切口处，并用透明胶条将切口粘连起来。
…TATCGTACGATAGGTACTTAA
…ATAGCATGCTATCCATG
AATTCGGCATAC…
GCCGTATG…
…TCCTAG
…AGGATCTTAA
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
AATTCCATAC…
GGTATG…
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
三
思考·讨论2：重组DNA分子
1.剪刀和透明胶条分别代表哪种“分子工具”？
剪刀代表限制酶；透明胶条代表DNA连接酶。
如果制作的黏性末端的碱基不能互补配对，可能是剪切位点或连接位点选得不对，也可能是其他原因。
不能，因为基因的长度一般在100个碱基对以上。
2.你制作的黏性末端的碱基能不能互补配对？如果不能，可能是什么原因造成的？
3.你插入的DNA片段能称得上一个基因吗？
…TATCGTACGATAGGTACTTAA
…ATAGCATGCTATCCATG
AATTCGGCATAC…
GCCGTATG…
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
三
思考·讨论3：重组DNA分子
…TATCGTACGATAGGTACTTAA
…ATAGCATGCTATCCATG
AATTCGGCATAC…
GCCGTATG…
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
1. 从以上操作可推知，在切割含“目的片段”的DNA分子时，需用限制酶切割____次此DNA分子，产生____个黏性末端。
2. 目的片段翻转过来，可以连接吗？______
3. 目的片段可以自身环化吗？_______
4. 切割目的基因和载体时，需要用______限制酶，目的是____________________
2
4
可以
可以
同种
产生相同的黏性末端
*必须是同一种限制酶吗？
不一定，不同的限制酶切割可能形成相同的黏性末端。
基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
三
知识巩固
下列操作中选用哪种限制酶切割来构建重组质粒？
1、选目的基因两端和运载体都有的酶切位点；
2、所选酶切位点 破坏目的基因以及标记基因。
规律——选择酶切位点的原则：
BamH I 和 Hind III
① 防止目的基因的自身环化
不能用E.coRI 的原因
② 防止目的基因反向连接到载体
图1
图2
基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
三
不能
(1)获取目的基因和切割载体时, 通常使用同种限制酶，目的是：
_____________________________________________________。
但是使用该法缺点是容易发生___________________________________________
_______________，为了避免上述情况发生，可采取的措施是：
____________________________________________。
(2)选择限制酶的注意事项：(结构完整)
①切割目的基因时：能切下目的基因且不破坏目的基因
②切割质粒时：至少保留一个完整的标记基因，便于筛选
为了产生相同的黏性末端，便于目的基因与载体连接
分别使用两种限制酶去切割目的基因和载体
目的基因、载体的自身环化以及目的基因与
载体反向连接
练习与应用
1.若用家蚕作为某基因表达载体的受体细胞，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用 作为载体，其原因是？
噬菌体
噬菌体的宿主细胞是细菌，而不是家蚕
病毒对宿主细胞的侵染具有一定的物种（组织）特异性。
分析载体的种类和载体需具备的条件
基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
三
2．根据标记基因的作用，有同学认为在含有某种抗生素的培养基中筛选存活的受体细胞不一定是导入目的基因的受体细胞，这种说法是否合理？请解释。
合理，因为仅导入载体的和导入插入了目的基因的载体的受体细胞均能在该培养基中存活。
合作探究：
限制酶
作用部位：
种类
E.coli DNA连接酶
运载
工具
条件
③ 有一个至多个限制酶切割位点
质粒、噬菌体、动植物病毒
DNA连
接酶
作用部位：
切开DNA分子的磷酸二酯键
来源：
主要存在于原核生物中
特点：
具有专一性（能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列）
T4 DNA连接酶
① 对受体细胞无害
② 能自我复制或整合到宿主DNA上。
④ 常有特殊的标记基因
种类：
磷酸二酯键
作用结果：
产生黏性末端或平末端
◎课堂小结
实验 DNA 的粗提取与鉴定
◎实践与探究·DNA的粗提取与鉴定
在一定温度下(沸水浴)，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色
3.DNA 的鉴定
在 NaCl溶液中的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离目的。
课本P74-75
利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分
一 提取DNA的基本思路
2.DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2 mol/L的NaCl溶液中。
1.DNA不溶于酒精溶液
DNA不溶于酒精溶液，但细胞中某些蛋白质则溶于酒精。利用这一原理，可初步分离DNA与蛋白质。
二 实验原理
◎实践与探究·DNA的粗提取与鉴定
三 材料用具
1.选材：
DNA含量 的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等
问：能否选用牛、羊、马、猪等哺乳动物成熟的红细胞做实验材料？
不能，
哺乳动物成熟的红细胞中无细胞核和线粒体，几乎不含DNA
问：能否选用鸡血细胞做实验材料？
能，鸡是鸟类动物
◎实践与探究·DNA的粗提取与鉴定
相对较高
二苯胺试剂要现配现用
用棕色瓶保存
三 材料用具
2.试剂：
①研磨液
②体积分数为95%的酒精
③2mol/L 的NaCl溶液
④二苯胺试剂
含有NaCl、EDTA、SDS、Tris和HCl
析出DNA
溶解DNA
鉴定DNA
课本P117——附录2
研磨液成分 作用
Tris-HCl缓冲液 稳定DNA
EDTA 抑制DNA酶
SDS 使蛋白质变性
· 溶/瓦解细胞膜
· 使蛋白质变性与DNA分离
◎实践与探究·DNA的粗提取与鉴定
四 实验步骤
取材、研磨
过滤或离心取上清液
预冷酒精析出DNA或离心收集沉淀中的DNA
NaCl溶液溶解DNA并鉴定
◎实践与探究·DNA的粗提取与鉴定
四 实验步骤
1. 破碎细胞
称取30g洋葱， ，然后放入研钵中，倒入10mL研磨液，充分 .
研磨的目的：
破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中
利用动物细胞提取DNA破碎细胞的方法：
◎实践与探究·DNA的粗提取与鉴定
切碎
研磨
动物细胞无细胞壁，可直接吸水涨破(省去研磨步骤)
(2) 上清液中除了DNA之外，可能含有那些杂质？
四 实验步骤
2. 过滤或离心取上清液
→去除滤液中的杂质
方案一
在漏斗中垫上 ，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取 。
低温抑制DNA水解酶的活性，进而抑制DNA降解
(1) 用纱布过滤的方法中，低温放置几分钟的作用？
可能含有核蛋白、多糖、脂质等杂质
◎实践与探究·DNA的粗提取与鉴定
(3) 过滤能否用滤纸代替纱布？
不可以。
因为DNA会被吸附到滤纸上而大量损失，影响最终提取的DNA量。
纱布
上清液
方案二
也可直接将研磨液倒入塑料离心管中，1500r/min的转速下 ，再取上清液放入烧杯中。
四 实验步骤
2. 过滤或离心取上清液
→去除滤液中的杂质
◎实践与探究·DNA的粗提取与鉴定
离心5min
(1)搅拌时应轻缓、并沿一个方向：
四 实验步骤
3. 预冷酒精析出DNA或离心收集沉淀中的DNA
减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子
(2)预冷的酒精具有以下优点：
◎实践与探究·DNA的粗提取与鉴定
①可抑制DNA水解酶的活性，进而抑制DNA降解
②抑制分子运动，使DNA易形成沉淀析出
③低温有利于增加DNA分子的柔韧性，减少其断裂
方案一
在上清液中加入体积 的、预冷的 (体积分数为95%)，静置2-3min，溶液中出现的 物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向 ，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分。
【思考】此步骤的目的是：
使蛋白质等溶解在酒精中，DNA
不溶于酒精而析出。
相等
酒精溶液
白色丝状
搅拌
四 实验步骤
3. 预冷酒精析出DNA或离心收集沉淀中的DNA
方案一
在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%)，静置2-3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分。
方案二
或将溶液倒入塑料离心管中，在10000r/min的转速下离心5min， 上清液，将管底的 晾干。
◎实践与探究·DNA的粗提取与鉴定
弃
沉淀物（粗提取的DNA）
四 实验步骤
4. NaCl溶液溶解DNA并鉴定
实验组
水浴加热5min，冷却后
对照组
取两支20mL的试管，各加入 5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCI溶液中。向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。
混合均匀后，将试管置于 中加热5min
待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化
蓝色
◎实践与探究·DNA的粗提取与鉴定
2mol/L的NaCl溶液
沸水
五 结果分析与评价
二苯胺试剂鉴定呈现蓝色说明实验基本成功；
如果不呈现蓝色，可能的原因有所提取的DNA含量低，或者在实验操作过程中出现了失误等
本实验粗提取的DNA可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质
1.你提取出白色丝状物或沉淀物了吗？用二苯胺试剂鉴定的结果如何？
2.你能分析出粗提取的DNA中可能含有哪些杂质吗？
观察提取的DNA的颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多
◎实践与探究·DNA的粗提取与鉴定
注意事项
1．以血液（如鸡血细胞）为实验材料时，每100 mL血液中需要加入3 g柠檬酸钠，防止血液凝固
3．加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，且沿一个方向搅拌，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀
2．利用动物细胞提取DNA破碎细胞的方法：动物细胞无细胞壁，可直接吸水涨破(省去研磨步骤)
4．提纯DNA时，选用体积分数为95%的冷酒精的原因：体积分数为95%的冷酒精提纯效果更佳
预冷的酒精具有以下优点：①可抑制DNA水解酶的活性，进而抑制DNA降解
②抑制分子运动，使DNA易形成沉淀析出
③低温有利于增加DNA分子的柔韧性，减少其断裂
◎实践与探究·DNA的粗提取与鉴定
1.下列有关“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，正确的是(　　)
A.新鲜猪血、菜花等动植物材料均可用于DNA的粗提取
B.植物材料需先研磨破碎细胞
C.DNA只能溶于2 mol/L的NaCl溶液
D.溶有DNA的NaCl溶液中加入二苯胺试剂后颜色呈紫色
B
◎实践与探究·DNA的粗提取与鉴定
【概念检测】
1. DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是（ ）
A. 能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键
B. 能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键
C. 能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键
D. 只能连接双链DNA片段互补的黏性末端，不能连接双链DNA片段的平末端
练习与应用
教材P74
2. 在重组DNA技术中，将外源基因送入受体细胞的载体可以是（ ）
A. 大肠杆菌的质粒
B. 切割DNA分子的酶
C. DNA片段的黏性末端
D. 用来识别特定基因的DNA探针
A
C
【扩展应用】
1. 想一想，为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？
教材P75
是因为含有某种限制酶的细胞的DNA分子或者不具备这种限制酶的识别序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶，也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA入侵。
练习与应用
【扩展应用】有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶切speⅠ进行切割，B片段分别用限制酶HindⅢ, XbaⅠ、EcoRⅤ和XhoⅠ进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。
教材P75
(1)哪种限制酶切割B片段产生的DNA片段能与限制酶speⅠ切割A片段产生的DNA片段相连接？为什么？
XbaⅠ。
因为XbaⅠ与SpeⅠ切割产生了相同的黏性末端。
(2)不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，这在基因工程操作中有什么意义？
识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。同尾酶使构建载体时，切割位点的选择范围扩大。
例如，我们选择了用某种限制酶切割载体，如果目的基因的核苷酸序列中恰好含有该限制酶的识别序列，那么用该限制酶切割含有目的基因的DNA片段时，目的基因就很可能被切断；这时可以考虑用合适的同尾酶（目的基因的核苷酸序列中不能有它的识别序列）来获取目的基因。
练习与应用
1.下列有关基因工程中载体的说法，正确的是 ( )
A.在基因工程操作中，被用作载体的质粒都是天然质粒
B.作为载体的质粒DNA分子上应有对重组DNA进行鉴定和筛选的标记基因
C.携带目的基因的重组质粒只有整合到受体细胞的DNA上才会复制
D.质粒是真核细胞细胞核或原核细胞拟核中的具有自我复制能力的环状双链DNA分子
D
当堂检测
2.某研究所的研究人员拟将生长激素基因通过质粒介导进入大肠杆菌的细胞内，已知质粒中存在两个抗性基因：A是抗链霉素基因，B是抗氨苄青霉素基因，目的基因要插入基因B中，且大肠杆菌本身不带有任何抗性基因。下列叙述正确的是( )
A.导入大肠杆菌的质粒一定为重组质粒
B.抗生素抗性基因是目的基因表达的必要条件
C.成功导入重组质粒的大肠杆菌可以在含氨苄青霉素的培养基上生长
D.能在含链霉素的培养基中生长的大肠杆菌不一定符合生产要求
D
当堂检测
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