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(共81张PPT)
素养目标
p355
第43讲　第一课时　基因工程的基本工具与操作程序
夯实基础 精研教材
1.基因工程的概念理解
目的基因
基因重组
受体
分子
p355
考点一 重组DNA技术的基本工具
p355
2.基因工程的基本工具
(1)限制性内切核酸酶(限制酶)——“分子手术刀”
核苷酸序列
磷酸二酯键
一种特定的
脱氧核苷酸序列
黏性末端　
p355
p355
四点提醒
2.基因工程的基本工具
(1)限制性内切核酸酶(限制酶)——“分子手术刀”
(2)DNA连接酶——“分子缝合针”
p356
(3)基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
质粒
稳定保存
限制酶切割位点
p356
提醒：与膜载体的区别：基因工程中载体是DNA分子，能将目的基因导入受体细胞内，并利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制；膜载体是蛋白质，与细胞膜的通透性有关。
3.限制酶的选择原则
(1)根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类。
①应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶,
以便将目的基因“切出”,如图可选择PstⅠ。
②不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶,
防止破坏目的基因,如图不能选择SmaⅠ。
③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接,也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒,如图也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种限制酶的切割位点,而且这两种限制酶切割后不会完全破坏标记基因)。
p356
(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类。
p356
(3)根据Ti质粒的T-DNA片段选择限制酶,图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取,丙Ti质粒宜选取(设切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ)。
p356
4.标记基因的作用
标记基因可用于检测目的基因是否导入受体细胞。
p356
未导入
导入
导入
提示：当质粒(载体)上有两个标记基因时，可将目的基因插入其中一个标记基因中，也就是重组质粒上含有一个标记基因，普通质粒上含有两个标记基因。
则 的受体细胞不具有标记基因控制的性状，
的受体细胞具有两个标记基因控制的性状，
的受体细胞只具有一个标记基因控制的性状。
这样可准确筛选出含有重组质粒的受体细胞。
没有导入质粒
导入普通质粒
导入重组质粒
教材深挖
1.(选择性必修3 P71旁栏思考)存在于原核生物中的限制酶的作用是什么
2.(选择性必修3 P74拓展应用1)限制酶来源于原核生物,为什么不切割自身的DNA分子
切割外源DNA以保证自身安全,防止外来病原物的危害
原核生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制,其DNA分子中不具备这种限制酶的识别序列,或通过甲基化酶将甲基转移到限制酶所识别序列的碱基上,使限制酶不能将其切开
p356
易错排查
1.用某种限制性内切核酸酶完全酶切环状质粒后,出现3个条带,表明该质粒上一定至少有3个被该酶切开的位置。(　　)
2.用限制性内切核酸酶和DNA连接酶构建重组质粒。(　　)
3.切割质粒的限制性内切核酸酶均特异性地识别6个核苷酸序列。(　　)
√
√
×
p357
思维探究 考教衔接
(根据2021·全国乙卷、2021·辽宁卷、2020·江苏卷、2019·江苏卷、2018·全国Ⅱ卷、2020·北京卷情境设计)用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性,创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶,其中4种限制性内切核酸酶的切割位点如图所示。
p357
回答下列问题。
(1)EcoRⅠ是一种　　　　　 　　　　酶,它通过识别特定的　　　　　　切割特定位点。经SmaⅠ和EcoRⅤ切割出来的载体为　　　末端。
(2)常用DNA连接酶有E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶。上图中　　　　　　酶切割后的DNA片段更适合用T4 DNA连接酶连接。DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是　　　　　　。
限制性内切核酸(或限制)　
核苷酸序列
平
SmaⅠ、EcoRⅤ　
磷酸二酯键
思维探究 考教衔接
(根据2021·全国乙卷、2021·辽宁卷、2020·江苏卷、2019·江苏卷、2018·全国Ⅱ卷、2020·北京卷情境设计)用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性,创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶,其中4种限制性内切核酸酶的切割位点如图所示。
p357
(3)DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征。如质粒DNA分子上有复制原点,可以保证质粒在受体细胞中能　　　 　;质粒DNA分子上有　　　　　　　　,便于外源DNA插入;质粒DNA分子上有标记基因(如某种抗生素抗性基因),利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞,方法是
　 。
自我复制
限制酶切割位点
用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞,能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞
思维探究 考教衔接
(根据2021·全国乙卷、2021·辽宁卷、2020·江苏卷、2019·江苏卷、2018·全国Ⅱ卷、2020·北京卷情境设计)用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性,创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶,其中4种限制性内切核酸酶的切割位点如图所示。
p357
(4)若某科研团队将某种病毒的外壳蛋白(L1)基因连接在GFP基因的5'末端,获得了L1-GFP融合基因(简称为甲),并将其插入质粒P0,构建了真核表达载体P1,其部分结构和酶切位点的示意图如下,图中E1~E4四种限制酶产生的黏性末端各不相同。
据图推断,该团队在将甲插入质粒P0时,使用了两种限制酶,这两种酶是　　　　。使用这两种酶进行酶切是为了保证　　　　　,也是为了保证　　　　　　　　　　　。
E1和E4
甲的完整
甲与载体正确连接
思维探究 考教衔接
(根据2021·全国乙卷、2021·辽宁卷、2020·江苏卷、2019·江苏卷、2018·全国Ⅱ卷、2020·北京卷情境设计)用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性,创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶,其中4种限制性内切核酸酶的切割位点如图所示。
p357
(5)下图C1酶基因以B链为转录模板链,转录时mRNA自身的延伸方向为5'端→3'端。为了使C1酶基因按照正确的方向与已被酶切的HT质粒连接,克隆C1酶基因时在其两端添加了SmaⅠ和BamHⅠ的酶切位点。该基因内部没有这两种酶切位点。图中酶切位点1和2所对应的酶分别是
　　　　　 　　　
BamHⅠ、SmaⅠ(顺序不能调换)
p357
考法练透 素养提升
考法一　基因工程的基本工具
1.(2025·云南模拟)研究人员欲将某动物体内基因X导入大肠杆菌的质粒中保存,质粒含有抗性基因与酶切位点,目的基因两端酶切位点如下图所示,下列叙述错误的是(　　)
p357
A.使用HindⅢ和XbaⅠ进行酶切能避免基因X与质粒反向连接
B.目的基因X与质粒连接可使用E.coli DNA连接酶
C.Ca2+处理大肠杆菌能降低细胞膜通透性,有利于重组质粒导入受体细胞
D.含有基因X的大肠杆菌能在氨苄青霉素选择培养基中生长
答案 C　
p357
解析 分析题图可知,使用HindⅢ和XbaⅠ进行酶切会产生不同的黏性末端,故能避免基因X与质粒反向连接,A项正确;目的基因X与质粒用HindⅢ和XbaⅠ酶切会产生黏性末端,可使用E.coli DNA连接酶,B项正确;用Ca2+处理大肠杆菌,能提高细胞膜的通透性,使细胞处于感受态即能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,有利于重组质粒导入受体细胞,C项错误;分析题图可知,重组质粒上含有氨苄青霉素抗性基因,故含有基因X的大肠杆菌能在氨苄青霉素选择培养基中生长,D项正确。
p357
p358
考法二　基因工程载体的应用
2.(2024·辽宁丹东模拟)图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图,载体质粒P0具有四环素抗性基因(TetR)和氨苄青霉素抗性基因(AmpR)。请回答下列问题。
图1
(1)EcoRⅤ酶切位点为…GAT↓ATC……CTA↑TAG…,EcoRⅤ酶切出来的线性载体P1为　　　末端。
(2)用TaqDNA聚合酶进行PCR扩增获得的目的基因片段,其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸。载体P1用酶处理,在两端各添加了一个碱基为_____________的脱氧核苷酸,形成P2;P2和目的基因片段在　　　　　　　　酶作用下,形成重组质粒P3。
平
胸腺嘧啶(T)　
DNA连接
p358
(3)为筛选出含有重组质粒P3的菌落,采用含有不同抗生素的平板进行筛选,得到A、B、C三类菌落,其生长情况如下表(“+”代表生长,“-”代表不生长)。根据表中结果判断,应选择的菌落是　　　(填表中字母)类,另外两类菌落质粒导入情况分别是　　　　　　　　　　、　　　　　　　　　　。
平板类型 菌落类型 A B C
无抗生素 + + +
氨苄青霉素 + + -
四环素 + - -
氨苄青霉素+四环素 + - -
B
A类菌落含有P0　
C类菌落未转入质粒
p358
(4)为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒,拟设计引物进行PCR鉴定。图2所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置,PCR鉴定时应选择的一对引物是　　　　　　　　。某学生尝试用图中另外一对引物,结果从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp片段,原因是　　　　　　　　　　。
图2
乙、丙
目的基因反向连接
p358
解析 (1)从图中可以看出,EcoRⅤ酶切出来的载体质粒为平末端。(2)由题意可知,目的基因片段的两端各有一个腺嘌呤脱氧核苷酸,由于载体P1为平末端,所以载体P1的两端应该各添加一个胸腺嘧啶脱氧核苷酸,这样在DNA连接酶的作用下才能把目的基因和载体P1连接起来。(3)由题意可知,构建重组质粒时四环素抗性基因被破坏,所以导入目的基因的菌落只能在没有抗生素或含有氨苄青霉素的培养基中存活,应该选B类菌落。A类菌落能在表中条件下存活,说明导入的是P0质粒。C类菌落只能在无抗生素的培养基中存活,说明C类菌落没有导入质粒。
p358
(4)据图分析,目的基因的外侧链只能用丙作引物,内侧链可用甲、乙作引物,如果用甲、丙作引物,则无论目的基因是否插入正确,都能通过PCR扩增大量目的基因,如果用乙、丙作为引物,当目的基因插入不正确(反向插入)时,则乙、丙两引物都结合在外侧,PCR不能正常进行,因此选用乙、丙作为引物可以进行RCR鉴定。若扩增出的DNA片段为400 bp,则正好是目的基因反向连接后,外侧链用乙作引物,内侧链用甲作引物扩增出的片段。
p358
夯实基础 精研教材
1.目的基因的筛选与获取
(1)目的基因:在基因工程的设计和操作中,用于改变　　　　　　　　或获得　　　　　　　等的基因。主要是指　　　　　　　　的基因。
(2)筛选目的基因
①从相关的已知　　　　　　　　　　　清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。
②利用测序技术、　　　　　　　　　　　和序列比对工具等进行筛选。
受体细胞性状　
预期表达产物
编码蛋白质　
结构和功能
序列数据库
p359
考点二 基因工程的基本操作程序
(3)目的基因的获取
①人工合成目的基因。
a.逆转录法:主要用于相对分子质量较大而又不知其核苷酸序列的基因。它以目的基因的mRNA为模板,借助逆转录酶合成双链DNA,其过程如下:
目的基因的mRNA 双链DNA(目的基因)
b.化学合成法:依据某一蛋白质的氨基酸序列,推测出其基因序列,然后直接合成目的基因,其过程如下:
蛋白质的氨基酸序列 mRNA的核苷酸序列 目的基因的核苷酸序列 目的基因
p359
②利用PCR　　　　和扩增　　　　　　。
获取
目的基因
引物　
脱氧核苷酸
耐高温
温度　
p359
归纳
( 1 ) 耐高温的DNA聚合酶的作用：催化合成DNA子链。
(2)引物(2种）的作用使 DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。
(3)缓冲液的作用：维持反应体系 pH稳定。
三点提醒：
①在PCR 过程中实际加人的为dNTP ( 即dATP、 dGTP 、dTTP 、dCTP), 既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA 的合成提供能量。
②引物既可以是DNA 单链、也可以为RNA 单 链。细胞内的DNA 进行复制时，也需要引物，一般为RNA片段
③真核细胞和细菌的DNA 聚合酶都需要Mg2+ 激 活。因此， PCR 反应缓冲溶液中一般要添加Mg2+
两种引物　
耐高温的DNA聚合酶
指数形式
琼脂糖凝胶电泳
p359
变性 复性 延伸
归纳(4)复性温度过高，则弓物难以与模板链结合，温度过低则易使两条母链配对结合，均无法获得PCR。
思维探究 考教衔接
PCR扩增过程如图所示,若一个Bt毒蛋白基因在PCR中经过n 轮循环,得到2n个DNA分子。
p361
(1)完善下表中相关内容:
含引物的DNA分子数　 含引物A(或B)的DNA分子数 同时含两种引物的DNA分子数 消耗引物数量 含不等长脱氧核苷酸链的DNA分子数 等长脱氧核苷酸链的DNA分子数
　　　 　　　　　 　　　　　 　　　 　 　 　　　　　
(2)要得到等长的双链DNA分子,至少需要经过　　　次循环。
2n　
2n-1
2n-2
2n+1-2
2n
2n-2n
3
p364
③通过构建　　　　　　来获取目的基因。
2.基因表达载体的构建 基因工程的核心内容
(1)构建基因表达载体的目的:使目的基因在受体细胞中　　　　　　　,并且可以　　　　给下一代,并能够　　　　和发挥作用。
基因文库
稳定存在
遗传
表达
p360
(2)基因表达载体的组成
p360
总结:启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比 项目 启动子 终止子 起始 密码子 终止
密码子
本质 DNA DNA mRNA mRNA
位置 目的基因上游 目的基因下游 mRNA 首端 mRNA
尾端
功能 RNA聚合
酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA 使转录在所需要的地方停下来 翻译的起
始信号(编
码氨基酸) 翻译的结束信号(不编码氨基酸 )
(3)基因表达载体的构建过程
p360
同尾酶
若考虑两两相连，则DNA连接酶连接 DNA片段会出现三种情况：
①目的基因与目的基因的连接；
②目的基因与质粒的连接；
③质粒与质粒的连接。
需筛选出重组质粒。
3.将目的基因导入受体细胞 该步骤未涉及碱基互补配对原则
生物类型 受体细胞 常用方法 转化过程
植物 体细胞 花粉管通 道法 ①用微量注射器直接注入　　　　;
②借助花粉管通道进入　　　
　 　 　
子房
胚囊
农杆菌
转化法
p360
3.将目的基因导入受体细胞 该步骤未涉及碱基互补配对原则
生物类型 受体细胞 常用方法 转化过程
植物 体细胞 花粉管通 道法 ①用微量注射器直接注入　　　　;
②借助花粉管通道进入　　　
　 　 　
子房
胚囊
农杆菌
转化法
p360
生物类型 受体细胞 常用方法 转化过程
动物 　 　 　 　 　 　 　
受精卵
显微注射技术
p360
3.将目的基因导入受体细胞
生物类型 受体细胞 常用方法 转化过程
微生物 原核细胞 感受态细胞法 能够吸收外界DNA Ca2+处理细胞
↓
感受态细胞
↓
基因表达载体与感受态细胞混合
↓
感受态细胞吸收DNA分子
p360
3.将目的基因导入受体细胞
能吸收周围环境中DNA分子的生理状态
4.目的基因的检测与鉴定
目的基因
杂交带
p361
易错排查
1.若受体大肠杆菌含有构建重组质粒时用到的限制性内切核酸酶,则一定有利于该重组质粒进入受体并保持结构稳定。(　　)
2.将抗除草剂基因转入某植物获得转基因植株,其DNA检测均含目的基因,抗性鉴定为抗除草剂和不抗除草剂。表明一定是前者表达了抗性蛋白而后者只表达抗性基因RNA。(　　)
3.可用抗原—抗体反应检测抗体基因表达产物。(　　)
4.可利用DNA分子杂交鉴定目的基因是否已导入受体细胞。(　　)
×
×
√
√
p361
思维探究 考教衔接
PCR扩增过程如图所示,若一个Bt毒蛋白基因在PCR中经过n 轮循环,得到2n个DNA分子。
p361
(1)完善下表中相关内容:
含引物的DNA分子数　 含引物A(或B)的DNA分子数 同时含两种引物的DNA分子数 消耗引物数量 含不等长脱氧核苷酸链的DNA分子数 等长脱氧核苷酸链的DNA分子数
　　　 　　　　　 　　　　　 　　　 　 　 　　　　　
(2)要得到等长的双链DNA分子,至少需要经过　　　次循环。
2n　
2n-1
2n-2
2n+1-2
2n
2n-2n
3
考法练透 素养提升
考法一　基因工程的操作程序
1.(2024·河北保定三模)番茄在低温下运输、储存的过程中,容易出现冻伤,影响番茄的品质。科学家利用基因工程技术将AFPs抗冻基因转入番茄植株,培育抗冻番茄。下列叙述错误的是(　　)
A.筛选与获取AFPs抗冻基因是培育抗冻番茄的首要步骤
B.基因表达载体中的启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点
C.AFPs抗冻基因可通过农杆菌转化法转移至双子叶植物细胞中
D.抗冻番茄培育成功的标志是检测出番茄细胞中含AFPs基因
D
p362
解析 基因工程的基本操作程序包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定,故筛选和获取AFPs抗冻基因是培育抗冻番茄的首要步骤,A项正确;基因表达载体中的启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点,能控制转录的开始,B项正确;将目的基因导入植物细胞最常用的方法是农杆菌转化法,C项正确;只有番茄具有抗冻性才能代表抗冻番茄培育成功,含有的AFPs基因若不表达,也不会形成抗冻番茄,D项错误。
p362
2.研究人员将GNA基因和ACA基因连接成融合基因后再与pBI121质粒载体结合并导入玉米细胞,最终获得了抗蚜虫玉米新品种,部分操作如图所示。下列相关叙述错误的是(　　)
p362
A.提取GNA基因和ACA基因至少需要两种限制酶,①②过程均需要使用DNA连接酶
B.为了保证基因转录方向正确,需要用限制酶KpnⅠ和XhoⅠ处理融合基因和载体
C.只要检测出玉米细胞中含有融合基因,就说明抗蚜虫玉米培育成功
D.在加入了卡那霉素的培养基上存活下来的玉米细胞可能成功导入了重组载体
答案 C　
p362
解析 GNA和ACA基因两侧的酶切位点不同,因此提取GNA基因和ACA基因至少需要两种限制酶,①过程为获得融合基因,②过程为构建基因表达载体,两过程均需要使用DNA连接酶,A项正确;限制酶KpnⅠ和XhoⅠ作用位点不同,用KpnⅠ和XhoⅠ处理融合基因和载体,只有基因方向正确才能形成重组载体,从而保证基因转录方向正确,B项正确;检测出玉米细胞中含有融合基因,不一定能说明抗蚜虫玉米培育成功,因为融合基因可能不能正常表达,还需作修饰处理,C项错误;在加入卡那霉素的培养基上存活下来的细胞,可能是成功导入重组载体的细胞,也可能是导入含有卡那霉素抗性基因的非重组载体的细胞,D项正确。
p362
3.(2025·八省联考陕西卷)科研人员基于合成生物学原理在大肠杆菌中构建了合成产物Z的完整途径,其基因表达载体如图(a),基因1、2和3为该途径的必需基因,基因大小分别为2 650 bp、1 240 bp和3 476 bp。回答下列问题。
图(a)
图(b)
p362
(1)图(a)中,构建基因表达载体时用到的酶是　　　　　　　　　　　　,片段X是　　　　　　　　。
(2)基因表达载体导入大肠杆菌前,需要用Ca2+处理大肠杆菌使其处于一种　　　　　　　　　　　　　的生理状态,导入后在含卡那霉素的培养基上筛选到3个抗性菌落,分别对其所含DNA进行PCR和琼脂糖凝胶电泳检测,结果如图(b)。据图可知,PCR时选用的引物对是图(a)中的　　　　　　　 ,选择该引物对进行鉴定的原因是
　　　　　 　　 　　　　　　　　;菌落B中未检测到目标条带,其原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 。
限制酶、DNA连接酶　
复制原点
能吸收周围环境中DNA分子
引物2和引物5　
两种引物扩增的区段包含了完整的基因2以及基因1和基因3的部分片段
菌落B中导入的是普通质粒而非重组质粒
p362
(3)工程菌株合成产物Z的产量受到温度、pH和溶解氧等发酵条件的影响,请针对其中任一因素,探究其对产物Z产量的影响,写出简要的实验思路。
将工程菌株随机分成若干份,分别培养在一系列不同温度(或pH或溶解氧)的培养液中,其他环境条件相同且适宜,一段时间后测定产物Z的产量。
p362
解析 (1)构建基因表达载体时用到的酶是限制酶、DNA连接酶,利用限制酶切割质粒和目的基因所在的DNA片段获得相同的黏性末端,然后利用DNA连接酶连接质粒和目的基因获得重组DNA分子。质粒上一般包含启动子、终止子、复制原点、标记基因(抗性基因),结合图(a)分析,片段X是复制原点。
p362
(2)基因表达载体导入大肠杆菌前,需要用Ca2+处理大肠杆菌使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,这样有利于重组DNA分子的导入。导入后在含卡那霉素的培养基上筛选到3个抗性菌落,分别对其所含DNA进行PCR和琼脂糖凝胶电泳检测,结果如图(b)。电泳检测的目的是判断3个抗性菌落是否都含有目的基因(基因1、2和3),电泳结果显示,菌落A和C电泳条带显示扩增片段的大小介于2 000~3 000 bp之间,结合目的基因上的引物分析,应该选择引物2和引物5,两种引物扩增了基因2(1 240 bp)以及基因1和基因3的部分片段,扩增片段的大小在2 000~3 000 bp之间,而且可以判断大肠杆菌中是否成功导入了目的基因。菌落B中未检测到目标条带,即不含目的基因但含抗性基因,其原因是菌落B中导入的是普通质粒而非重组质粒。
p362
(3)本实验的实验目的是探究温度、pH和溶解氧等发酵条件对产物Z产量的影响,实验自变量是温度或pH或溶解氧,检测指标是产物Z产量。因此简要的实验思路是将工程菌株随机分成若干份,分别培养在一系列不同温度(或pH或溶解氧)的培养液中,其他环境条件相同且适宜,一段时间后测定产物Z的产量。
p362
p363
考法二　PCR技术
4.(2025·广东揭阳模拟)利用PCR获得目的基因后,用限制酶EcoRⅠ同时处理目的基因与质粒,拼接后可得到重组基因表达载体,其部分DNA片段如下图所示。下列有关引物的分析正确的是(　　)
A.通过PCR获取目的基因时,所选的
引物可为引物2和引物3
B.检测目的基因是否插入质粒且方向
是否正确时,应选用引物1和引物4进行PCR
C.若设计的引物与模板不完全配对,可适当提高PCR复性的温度
D.DNA聚合酶能与引物结合,并从引物的5'端连接脱氧核苷酸
A
p363
解析 引物结合在模板链的3'端,通过PCR获取目的基因时,所选的引物可为引物2和引物3,A项正确;引物结合在模板链的3'端,检测目的基因是否插入质粒且方向是否正确时,应选用引物2和引物4进行PCR,B项错误;若设计的引物与模板不完全配对,可适当降低PCR复性的温度,以便引物与模板链结合,C项错误;DNA聚合酶能与引物结合,并从引物的3'端连接脱氧核苷酸,D项错误。
p363
夯实基础 精研教材
1.DNA的粗提取与鉴定
(1)实验原理
酒精
NaCl溶液
2 mol/L
蓝色
p363
考点三 实验:DNA的粗提取与鉴定、
DNA片段的扩增及电泳鉴定
教p74、p75
(2)实验
步骤
研磨
上清液
p363
提醒：①本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核(无DNA) 。可选用鸡血细胞作为材料。
一、研磨液的配制方法（P117）
1．将 10.1 g Tris（三羟甲基氨基甲烷）加入 50 mL 蒸馏水中，使其溶解。
2．用 2 mol/L 的 HCl 溶液调节 pH 至 8.0。
3．在溶液中加入 8.76 g NaCl、37.2 g EDTA（乙二胺四乙酸）(抑制DNase)、20 g SDS（十二烷基硫酸钠）(抑制DNase;溶解细胞膜；破坏蛋白质结构；与DNA结合增强其亲水性)， 待药品全部溶解后，用蒸馏水定容至 1 000 mL。
教p74、p75
(2)实验
步骤
研磨
上清液
95%
一个方向
2 mol/L
p363
提醒：②加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成丝状沉淀。
教p74、p75
(2)实验
步骤
研磨
上清液
95%
一个方向
2 mol/L
二苯胺
5 min
蓝色
p363
提醒：③DNA 鉴定时，待试管溶液冷却后，比较两支试 管中溶液颜色的变化。
教p74、p75
实验组
对照组
水浴加热
二、二苯胺试剂的配制方法 （P117）
1．称取 1.5 g 二苯胺，溶于 100 mL 冰乙酸中。
2．在溶液中加入 1.5 mL 浓硫酸，用棕色瓶保存。
3．临用前，在 10 mL 的上述溶液中再加入 0.1 mL 体积分数为 0.2% 的乙醛溶液。
p363
提醒：①本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作为实 验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核(无 DNA) 。可选用鸡血细胞作为材料。
提醒：②加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以 免加剧DNA 分子的断裂，导致DNA 分子不能形成 丝状沉淀。
提醒：③DNA 鉴定时，待试管溶液冷却后，比较两支试 管中溶液颜色的变化。
实验组
对照组
水浴加热
2.DNA片段的扩增及电泳鉴定
(1)实验基础
相反
大小和构象
p363
p364
PCR仪
p364
p364
(2)PCR实验操作步骤和电泳鉴定
微量移液器
离心管
底部
p364
提醒：
（1）为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
（2）在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换，避免试剂的污染。
（3）在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
&.方法步骤
制备凝胶
观察鉴定
进行电泳
电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。
将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。
待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。
①熔化：
②倒模:
③凝固:
探究·实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定
P85-4
P85-5
P85-6
DNA染色剂，常用溴化乙锭
&.方法步骤
制备凝胶
观察鉴定
进行电泳
将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜
扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂(常用溴酚蓝))混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物（marker）。
①加液
②加样
③电泳
探究·实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定
P85-7
P85-8
P85-9
P117
3.方法步骤
制备凝胶
观察鉴定
进行电泳
接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待迁移指示剂前沿接近凝胶边缘时，停止电泳
①加液
②加样
③电泳
探究·实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定
P85-7
P85-8
P85-9
注意事项：
1、接通电源，一般红色为正极，黑色为负极，DNA样品由负极往正极泳动（靠近加样孔的一端为负），电压为5 V/cm（长度以两个电极之间的距离计算）
①有颜色，使样品呈现颜色，便于加样。
②分子量较小，指示样品迁移的速率及方向。
2、根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳。当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1~2cm处停止电泳。
3.方法步骤
制备凝胶
观察鉴定
进行电泳
取出凝胶置于 下观察和照相。
紫外灯
探究·实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定
P85-10
(3)DNA的测定:凝胶中的DNA分子通过染色,可以在波长为　　　　　的紫外灯下被检测出来。
300 nm
教材深挖
1.(选择性必修3 P85结果分析与评价)电泳鉴定时未出现特异性条带的原因有哪些
2.(选择性必修3 P85结果分析与评价)如何来评价扩增的效果
模板DNA出现污染;Taq DNA聚合酶出现质量问题;引物特异性不强(如与非目的基因的核苷酸序列有同源性)或形成引物二聚体;复性时的温度过低;PCR循环次数过多等
观察DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的效果
p364
易错排查
1.配制PCR反应体系时,加入等量的4种核糖核苷酸溶液作为扩增原料。(2024·河北卷)(　　)
2.利用添加核酸染料的凝胶对PCR产物进行电泳后,在紫外灯下观察结果。(2024·河北卷)(　　)
3.在PCR反应中使用Taq酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶。(　　)
4.PCR反应中温度的周期性改变是为了DNA聚合酶催化不同的反应。(　)
×
√
√
×
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考法练透 素养提升
考法一　DNA的粗提取与鉴定
1.(2024·山东卷)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验,下列说法正确的是(　　)
A.整个提取过程中可以不使用离心机
B.研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后,应充分摇匀再倒入烧杯中
C.鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变
D.仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰
A
p364
解析 组织研磨液中上清液的获取可以采用低温静置法或离心法,A项正确;研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后,取上清液,其中含有DNA,不能再摇匀,B项错误;鉴定过程中需要沸水浴加热,会导致DNA变性,DNA的双螺旋结构发生改变,C项错误;仅设置一个只加2 mol/L的NaCl溶液的对照组即可排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰,D项错误。
p364
考法二　DNA片段的扩增及电泳鉴定
2.(2024·湖南卷)最早的双脱氧测序法是在PCR反应体系中,分别再加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸(ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP),子链延伸时,双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补配对原则,以加入ddATP的体系为例:若配对的为ddATP,延伸终止;若配对的为脱氧腺苷三磷酸(dATP),继续延伸;PCR产物变性后电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列,结果如图所示。下列叙述正确的是(　　)
p365
A.上述PCR反应体系中只加入一种引物
B.电泳时产物的片段越小,迁移速率越慢
C.5'-CTACCCGTGAT-3'为对照个体的一段序列
D.患者该段序列中某位点的碱基C突变为G
答案 AC　
解析 利用双脱氧测序法时,PCR反应体系中加入的模板是待测的单链DNA,故只需加入一种引物,A项正确;电泳时产物的片段越大,迁移速率越慢,B项错误;对照个体测序结果为5'-CTACCCGTGAT-3',患者个体测序结果为5'-CTACCTGTGAT-3',对比可知,患者该段序列中某位点的碱基C突变为T,C项正确,D项错误。
p365
3.(2024·黑吉辽卷)关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验,下列叙述正确的是(　　)
A.琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小
B.凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置
C.在同一电场作用下,DNA片段越长,向负极迁移速率越快
D.琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来
A
p365
解析 琼脂糖凝胶的密度对其中DNA分子的迁移和分辨率有影响。根据所需分离的DNA片段大小,通常会选择适当浓度的琼脂糖凝胶。对于大型DNA片段(如基因组DNA或质粒DNA),一般选择低浓度琼脂糖凝胶,以便实现高效迁移所需较大孔径;对于小型DNA片段(如PCR产物或酶切片段),则需要选择高浓度琼脂糖凝胶以提供更好的分辨率和分离效果,A项正确。凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是用于确定样品迁移的位置,B项错误。在琼脂糖凝胶电泳中,施加电场后,会使得DNA片段向正极方向迁移,同时,DNA片段的迁移速率与其长度呈负相关,即越长的DNA片段,迁移速率越慢,C项错误。凝胶中的DNA分子通过染色,可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来,D项错误。
p365
1.(选择性必修3 P80正文)为什么切割含有目的基因的DNA片段和载体要选用同一种限制酶 是否只能用同一种限制酶

2.(选择性必修3 P80正文)基因表达载体是载体的一种,除目的基因、标记基因外,还必须含有启动子、　　　　等。其中标记基因和启动子的作用分别是　　　　　 　　　　　、　　　　　　　　 　　。
选用同一种限制酶切割会产生相同的末端,可以在DNA连接酶的作用下将切割的目的基因和载体连接起来。也可以使用能产生相同末端的不同限制酶切割
终止子
便于重组DNA分子的筛选　
与RNA聚合酶识别和结合
p365
聚焦表达 回扣落实
3.(逻辑推理类)设计引物是PCR技术的关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如图),请分别说明理由。
①第1组: 　　　　　　　　 　　　　　　　;
②第2组: 　　　　　　　　　　　　　　　。
引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效
引物Ⅰ自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效
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4.(选择性必修3 P81资料卡)在培育某些转基因植物时,常用农杆菌转化法,农杆菌的作用是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。在用土壤农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞的过程中,为什么一定要将目的基因插入Ti质粒的T-DNA上
_____________________________________________________________。
5.(识记表达类)为确定转基因抗盐烟草是否培育成功,既要用___________　　　　　　　进行检测目的基因是否已插入,又要在个体水平上鉴定,后者的具体过程是
侵染植物,将目的基因转移到受体细胞中　
Ti质粒上的T-DNA也称为可转移的DNA,可转移至受体细胞,并且整合到受体细胞染色体DNA上
PCR技术
将培育的烟草幼苗栽培于含有一定盐的土壤中,观察该烟草植株的生长状态
p365

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