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PCR技术
拓展及应用
选择性必修3　生物技术与工程
重叠延伸PCR技术是采用具有互补末端的引物,使PCR产物形成了重叠链,从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸,将不同来源的扩增片段重叠拼接起来的技术。
这项技术目前主要有两个应用方向:基因定点突变、构建融合基因。
重叠延伸PCR技术
①引物1、2为一组，引物3、4为一组，分别对DNA进行扩增。
②第一轮扩增后，拟突变位点已经突变成功，两个新的DNA分子比原DNA分子少了一段。
③把第一轮扩增后获得的两种DNA分子混合杂交：高温解旋变成单链；低温复性，两种DNA分子碱基互补配对，有小概率出现突变位点互补配对的链。
④不需要引物，(两条链互为引物)突变位点互补配对的链从5'向3'延伸多轮PCR后就可获得突变了特殊位点的双链DNA。
重叠延伸PCR技术
设计引物的前提是知道目的基因两端的核苷酸序列，若目的基因中间序列已知，两侧序列未知，就需要用到反向PCR技术。
反向PCR技术是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段,对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。
反向PCR技术
→①用限制酶在链状DNA两端处理出相同的末端，让链状DNA首尾相连变成环状DNA分子。
→ ②利用己知序列两端设计引物扩增，产物就是环状DNA的未知序列。
反向PCR技术
RNA有不稳定性和容易被酶解的特点，扩增测序比较困难,所以可用RT-PCR；通过逆转录酶将RNA转化为cDNA,然后通过聚合酶链式反应扩增cDNA。RT表示逆转录
RT-PCR
mRNA
逆转录酶
杂交双链
核酸酶H
单链DNA
DNA聚合酶
双链cDNA（cDNA）
①RNA的逆转录。
在逆转录酶的催化下RNA单链形成一条由RNA单链和DNA单链组成的杂合链。
②RNA的水解。
RNA单链在RNA酶的作用下被水解，杂合链变成一条DNA单链
③cDNA的扩增。
DNA单链在DNA聚合酶的作用下扩增为DNA双链，DNA双链继续扩增形成多条DNA双链。
实时荧光定量PCR主要是通过荧光PCR连续监测荧光信号出现的先后顺序以及信号强弱的变化,实时分析目的基因的初始量,该技术的发明实现了PCR从定性到定量的飞跃。
（1）基因探针是带有检测标记且与目的基因互补的已知核酸序列（DNA或RNA），通过分子杂交显示特定基因。探针需为单链，若为双链则需预先进行变性处理。
根据来源可分为①基因组探针（来自基因组中有关的基因本身）②cDNA探针（从相应的基因转录获得了mRNA，再通过逆转录得到的探针）和③人工合成的寡核苷酸探针（在体外人工合成碱基数不多的与基因序列互补的DNA片段）三类
实时荧光定量PCR (qPCR)
实时荧光定量PCR (qPCR)
（2）两种主要荧光检测方式
①SYBR Green法
原理：染料结合到双链DNA小沟中发出荧光，游离时不发光；
特点：成本低,但特异性较差
②Taqman探针法
原理：Taqman探针是qPCR中一种常用的探针,一条很短的RNA单链，其5‘端连接报告荧光基团(R),3'端连接淬灭基团(Q)。
当探针完整时,两个基团距离很近,R发出的荧光信号被Q吸收而不能被检测到。
在qPCR过程中,当Taq DNA聚合酶遇到探针时,探针会水解,R和Q两个基团分离,R发出的荧光信号被相应仪器检测到,即可对PCR进行实时分析。
特点：特异性高，可多重检测
R
Q
（不发出荧光）
R
Q
（发出荧光）
实时荧光定量PCR (qPCR)
R
Q
R
Q
正向引物
反向引物
①聚合。Tagman探针可与目的基因中部序列特异性结合(碱基互补配对)。只有当样本中有目的基因片段时，才可能发生聚合。
②链取代。引物链在Taq酶的作用下延伸。
正向引物
反向引物
实时荧光定量PCR (qPCR)
R
Q
③探针被切断。当引物链延伸到Taqman探针的位置时，Taqman探针会被切断，R基团和Q基团分开，发出荧光。
④聚合完成。引物继续延伸，直至形成新的DNA双链。
正向引物
反向引物
正向引物
反向引物
正向引物也叫正义引物（F），其核苷酸序列和目标DNA双链中编码链（有义链）的5’端区域是一致的。
反向引物也叫反义引物（R），其序列和目标DNA双链中模板链的5’端区域互补。
5’
3’
3’
5’
DNA
转录
5’
3’
mRNA
编码链（有义链、非模板链）
不做模板，不直接参与转录
碱基序列和mRNA几乎一致
（仅DNA中T替换为RNA中U）
模板链（非编码链、反义链）
作为转录模板，RNA聚合酶沿此链合成mRNA
正向引物
反向引物
正向引物、反向引物
(3)应用
当样本中无目的基因时，R基团不发出荧光，当样本中有目的基因时，R基团发出荧光。利用实时荧光定量 PCR技术可以快速检测一个人是否患有相关疾病。常用于:新冠核酸检测(检测病毒RNA);转基因食品检测;肿瘤基因表达分析;基因表达水平定量比较。
qPCR可与RT结合,称为RT-gPCR(可定量检测mRNA水平即基因表达量)。
(4)Ct 值
当发出荧光的 R基团数量特别少时，人类是检测不出来的，所以存在一个人类能观察到的荧光数的极小值，也就存在一个能使荧光数量达到极小值的最小循环次数，这个次数叫做 Ct 值(循环阈值)。
通过 Ct 值可以定量分析样本中目的基因的数量。
Ct值的换算：每相差1个Ct值,起始模板量相差约2倍(因为DNA每循环翻一倍)。
实时荧光定量PCR (qPCR)
实时荧光定量PCR (qPCR)
基线期：在PCR的初始循环期间的信号水平，通常是3至15的循环之间，荧光信号低,无明显增长。
指数期(对数期)：荧光信号呈指数增长,最适合定量分析。
线性期：PCR反应后期，由于PCR反应体系各成分的消耗产物抑制等因素的影响，反应效率降低，产物量与初始模板量不再符合指数关系
平台期：扩增产物饱和,荧光不再明显增长。
阈值:在扩增曲线的指数增长区域内，选择任意适当位置设定的荧光检出界限。荧光阈值一般由仪器自动设置，也可以手动设置。荧光域值为基线荧光信号标准差的10倍。同一次反应中对于不同的基因可单独设置阈值，但对于同一个基因扩增一定要设置相同的阈值。
假设人类能观察到的荧光数的极小值是 1024，如果循环了 9次到了 1024，说明一开始样本中有2个目的基因(每循环一次数量翻倍，29×2=1024)，Ct值为 9；如果循环了一次就到了 1024，29×512=1024说明一开始样本中有 512 个目的基因，Ct 值为 1。
起始模板量越多，越早达到阈值，Ct值越小；反之
在病人的检测中，Ct值越低，说明病毒越多，病情越严重。
（循环数）
（荧光强度）
引物设计的原则
(1)引物最好在模板cDNA 的保守区内设计（cDNA：以mRNA为模板，反转录得到的DNA，无内含子，只对应表达的基因编码区）
DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCB上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件(比如DNAman)比对(Alignment)各基因相同的序列就是该基因的保守区。
(2)引物长度
引物长度一般15-30bp，常用为20bp左右。因为过长会导致其延伸温度大于74℃不适于Tag DNA 聚合酶进行反应。
(3)引物碱基
G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。
ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
引物Tm值范围为55-65℃，上下游引物Tm值不宜相差太大，最好不要超过5度，上下游引物GC含量合Tm值相差太大可引起PCR效率下降。
Tm值是寡核苷酸的解链温度（溶解温度），即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。GC含量越高，Tm越高。有效启动温度通常比Tm值高出5-10℃。根据公式Tm=4(G+C)+2(A+T)计算引物的Tm值，则有效引物的Tm范围为55-80°℃。为使复性条件达到最佳，引物的Tm值宜接近72°C。
(4)引物应避免自身互补
引物自身不能有连续4个碱基的互补，以免形成发夹状结构。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。
(5)引物之间应避免互补
引物之间不能有连续4个碱基的互补，尤其应避免3’端的互补重叠以防形成引物二聚体。
注:引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G值不要过高(应小于4.5kcalmol)。否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。
(6)引物5'端可以修饰
引物的5’端决定PCR产物的长度，对扩增特异性影响不大。因此可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5’端修饰包括:加酶切位点;标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等:引入蛋白质结合DNA序列;引入点突变、插入突变、缺失突变序列;引入启动子序列等。
引物设计的原则
(7)引物3'端不可修饰
引物的延伸是从3’端开始的，不能进行任何修饰。
3’端也不能有形成任何二级结构的可能，除在特殊的PCR(AS-PCR)反应中，引物3端不能发生错配。
(8)引物扩增跨度 （一对上下游引物结合在模板DNA上，两个结合位点之间的DNA片段长度，也就是PCR最终扩增出来的目的片段大小）
以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段
(9)引物的特异性
特异性是指针对DNA片段设计出来的引物只能扩增出此DNA片段(扩增产物应该是单一条带)，而不能扩增出其他DNA片段。
引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。
引物设计完成以后，应对其进行BLAST（是一种用于比对核酸或蛋白质序列的工具。它通过局部序列比对来发现两个序列之间的相似性）检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。
引物设计的原则
正常的PCR反应需要一对相对配置的引物同时扩增的两条模板链。如果只加入一条引物,那么将会只扩增一条模板链。像这种加入一条引物扩增的PCR反应叫作不对称PCR。此技术可制备单链DNA片段用于序列分析或核酸杂交的探针。
不对称PCR
不对称PCR
不对称PCR主要只扩增一条模板链,实际操作时,为了增加模板量,也可以加入一对引物,只是两条引物在浓度上应存在差异,分别是限制性引物（数量较少）和非限制性引物（数量较多），其最佳比例一般为1:50-1:100 。
不对称PCR
在PCR反应的最初10-15个循环中，其扩增产物最初主要是双链DNA（dsDNA），可以增加模板DNA的数量，以便后期更快得到较多数量的目标DNA单链（单链DNA探针）。当低浓度的引物(限制性引物)被消耗尽,以后的循环只产生高浓度引物(非限制性引物)的延伸产物（ss-DNA），扩增产物线性增加。
双链DNA和单链DNA的相对分子质量（碱基数量）不同，可通过电泳将其分离。
巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应，指先后用外、内引物扩增目的基因的方法（外引物预扩+内引物精扩），使用两对（而非一对）PCR引物扩增完整的片段。
原理为:先以比目的基因大的DNA片段为模板,用一对外引物进行扩增,获得大量含目的基因的中间产物,再以扩增后的中间产物为模板,用一对内引物扩增目的基因。
第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。第二对引物称为巢式引物（因为他们在第一次PCR扩增片段的内部）结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。
巢式PCR的好处在于：如果第一次扩增产生了错误片段，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。
巢氏PCR
巢式PCR是指先后用外、内引物扩增目的基因的方法。其原理为:先以比目的基因大的DNA片段为模板,用一对外引物进行扩增,获得大量含目的基因的中间产物,再以扩增后的中间产物为模板,用一对内引物扩增目的基因。
巢氏PCR
巢式PCR共使用了两对引物,进行了两轮PCR,第二次扩增可以减少或排除第一次扩增中出现的非特异性产物,所以该操作可以提高PCR的特异性和灵敏度,可用于极少量DNA模板的扩增。
巢式PCR两次扩增所用的引物是不同的,因此两个阶段反应一般不在同一试管完成,如果两套引物一起加入反应体系中,外引物复性温度要明显高于内引物,使外引物先进行反应。

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