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广东深圳高级中学2025-2026学年第二学期期中测试题 高二生物
1．藿香是一种重要的中草药，《本草纲目》记载“豆叶曰藿，其叶似之，而草味芳香，故名藿香”。科研人员利用藿香的叶片为外植体进行培养，过程如图所示。下列说法错误的是（　　）
A．①过程对外植体消毒时先用酒精处理，再用无菌水冲洗后用次氯酸钠处理
B．用射线处理愈伤组织细胞后，通过筛选可能获得具有优良性状的突变体
C．诱导生芽和生根阶段，可通过调整植物激素比例实现不同发育方向
D．过程②需要光照培养以促进愈伤组织的形成
2．下列有关动物细胞培养的叙述，错误的是（　　）
A．定期更换培养液可以防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害
B．培养箱气体环境为，的作用是维持培养液的
C．使用合成培养基时，应加入动物的血清等一些天然成分
D．部分细胞能够悬浮在培养液中生长增殖
3．猪繁殖与呼吸综合征是一种由P病毒引发的传染病。为诊断和治疗猪繁殖与呼吸综合征，科学家制备出抗P—GP3蛋白的单克隆抗体，制备过程如图所示，图中sp20 细胞是小鼠的骨髓瘤细胞。下列说法正确的是（　　）
A．对小鼠注射GP3蛋白的目的是获得抗GP3蛋白抗体
B．经第一次筛选获得的杂交瘤细胞能无限增殖但分泌抗体类型不一定相同
C．最后一步是将抗体检测为阴性的杂交瘤细胞进行扩大培养，以便获取大量的单克隆抗体
D．细胞丁只能注射到小鼠腹腔内培养，从而获得抗P—GP3蛋白单克隆抗体
4．为了保护粤东黑猪的遗传资源，下图为体细胞核移植的部分操作流程，有关分析正确的是（　　）
A．直接将取自小耳花猪卵巢的卵母细胞用作受体细胞
B．还可用梯度离心、紫外线照射或载体去除卵母细胞的核
C．用粤东黑猪胚胎细胞进行核移植难度更低，因其表现全能性相对容易
D．仔猪的性别由粤东黑猪和小耳花猪提供的遗传物质共同决定，与杜洛克母猪无关
5．胚胎工程的许多技术，实际上是在体外条件下，对动物的自然受精和早期胚胎发育条件进行的模拟操作。因此，了解哺乳动物受精和早期胚胎发育规律十分重要。下列有关描述错误的是（　　）
A．精子入卵后，卵细胞膜会发生反应阻止其他精子入卵
B．胚胎发育早期，细胞数量不断增加，但胚胎总体积并不增加
C．在囊胚阶段，胚胎的内部开始出现含有液体的腔，称为囊胚腔
D．自然条件下，哺乳动物的受精过程和早期胚胎发育都是在子宫内完成的
6．亚洲黑熊在野外因栖息地丧失和人为捕猎几乎灭绝。科学家期望通过体外受精、动物体细胞核移植、胚胎移植等方法拯救亚洲黑熊，其过程如下图。下列关于该过程的说法正确的是（　　）
A．胚胎工程一般采用促性腺激素释放激素处理A使其超数排卵
B．E后代遗传性状与A和C完全一致，F后代遗传性状与B完全一致
C．若过程①表示体外受精过程，从C获得的精子可直接受精
D．A排出的卵母细胞体外培养到MⅡ期时，才具备与精子受精的能力
7．同尾酶指一组识别序列不同，但切出的黏性末端相同的限制酶。图1是EcoRⅠ、BamHⅠ、BglⅡ、和MboⅠ四种限制酶的识别序列及酶切位点，图2表示构建基因表达载体时的某种质粒和目的基因，限制酶Ⅰ的识别序列和酶切位点是-G↓GATCC-，限制酶Ⅱ的识别序列和酶切位点是-↓GATC-。下列说法正确的是（　　）
A．EcoRⅠ切割双链DNA分子时不具有特异性
B．用DNA连接酶将BamHⅠ和MboⅠ形成的黏性末端连接后，可被MboⅠ重新切开
C．选用两种不同的限制酶切割质粒，都可以防止质粒自连
D．由图2可知，最好选用限制酶Ⅱ切割质粒、限制酶Ⅰ切割目的基因
8．戊型肝炎病毒是一种RNA病毒，ORF2基因编码的结构蛋白(pORF2)位于病毒表面，构成病毒的衣壳。我国科研人员利用基因工程技术，在大肠杆菌中表达pORF2，制备戊型肝炎疫苗，过程如图。下列关于该疫苗的叙述，正确的是（　　）
A．过程①需要的酶是RNA聚合酶，原料是A、U、G、C
B．过程①的产物和③必须用同种限制酶切割
C．过程⑤是将Ti质粒导入大肠杆菌
D．过程⑥大量制备pORF2蛋白前应做相应的检测与鉴定
9．我国科学家将含有人凝血因子基因的DNA片段注射到羊的受精卵中，由该受精卵发育而成的羊分泌的乳汁中含有人的凝血因子，可以治疗血友病。下列叙述正确的是（　　）
A．凝血因子基因应与凝血因子基因的启动子重组在一起
B．该羊分泌的乳汁中含有人的凝血因子基因
C．该受精卵发育成的羊必须是雌性
D．这项研究体现了基因工程在改善畜产品品质方面的应用
10．干扰素是动物体内合成的一种糖蛋白，体外很难保存。如果将干扰素分子上的一个半胱氨酸(密码子：UGU、UGC)变成丝氨酸(密码子：UCU、UCC、UCA、UCG)，就可以延长干扰素的体外保存时间。下列相关叙述，正确的是（　　）
A．干扰素是干扰细菌复制的糖蛋白，被广泛应用于治疗细菌感染性疾病
B．对天然干扰素的改造可通过对干扰素基因进行定点突变来实现
C．替换后的干扰素仍能发挥作用，说明其结构未改变
D．将新的干扰素基因导入大肠杆菌体内，正常表达即可得到预期的新的干扰素
11．某同学经“研磨→过滤→离心→析出→鉴定”步骤，提取花菜DNA并鉴定。相关叙述正确的是
A．该同学也可选择猪血中成熟的红细胞、香蕉为实验材料提取DNA，但方法可能有所不同
B．向含有DNA的粗提取液加入体积分数为95%的冷酒精后搅拌几分钟后过滤，DNA主要存在于滤液中
C．用玻璃棒沿一个方向快速搅拌卷起丝状物，可提高DNA的提取量
D．在溶有DNA的NaCl溶液中加入二苯胺试剂，沸水浴冷却后呈蓝色，设置对照组用来排除二苯胺受热变蓝的可能
12．蛛丝有超强韧性，将蛛丝蛋白基因转入羊的乳腺中可以生产蛛丝蛋白。图a是蛛丝蛋白基因的DNA片段；利用PCR技术对蛛丝蛋白基因进行检测，电泳结果如图b，其中1号来自普通羊，2号来自含蛛丝蛋白基因的质粒，其余来自转基因羊。下列叙述正确的是（　　）
A．用PCR技术扩增图中的蛛丝蛋白基因，可选择图中的引物①和④
B．电泳鉴定DNA利用了DNA在电场中会向着它所带电荷相同的电极移动的原理
C．在凝胶中DNA分子的迁移速率与DNA分子的大小呈正相关
D．使用抗原-抗体结合法可能在3、5、8号羊的乳汁中检测到蛛丝蛋白
13．紫杉醇是存在于红豆杉属植物体内具有高抗癌活性的物质，但从红豆杉中提取产量很低。科学家利用不同技术获得高产紫杉醇，获取途径如图所示。下列叙述正确的是（　　）
方法一 将紫杉醇合成的关键酶基因转入红豆杉体细胞 通过植物组织培养技术获得高产植株
方法二 将紫杉醇合成的关键酶基因转入大肠杆菌 利用微生物发酵技术生产紫杉醇前体
方法三 对红豆杉愈伤组织利用CRISPR/Cas9进行基因编辑改造 直接从培养物中提取紫杉醇
A．方法一和方法三都利用了植物细胞的全能性
B．方法二相较于方法一，可以通过发酵工程快速生产有生物活性的紫杉醇，大幅降低生产成本
C．方法三相较于方法一，能通过调控培养条件提高紫杉醇产量，不受植株培育的周期、季节的限制
D．方法一和方法三中，原生质体制备需用纤维素酶和果胶酶处理，应在低渗溶液中完成以维持细胞形态
14．噬菌体展示技术是将编码噬菌体表面蛋白的基因与外源肽段基因融合，使外源蛋白/肽段展示在噬菌体表面的筛选技术。下图是利用该技术制备人丙型肝炎病毒(HCV)单克隆抗体的流程。下列有关叙述正确的是（　　）
注：抗体重链可变区(VH)基因和轻链可变区(VL)基因连接获得单链抗体(scFv)基因
A．逆转录合成cDNA的过程，需要加入总RNA、逆转录酶和四种游离的核糖核苷酸
B．重组噬菌体侵染大肠杆菌时，应该使用处理使大肠杆菌处于吸收DNA分子的状态
C．专一抗体检验利用的原理是抗原和抗体的特异性结合
D．该技术产生的单克隆抗体可以直接用于人体疾病治疗，没有免疫排斥风险
15．科研人员利用农杆菌转化法将含有目的基因(GUS基因，长度500 bp)的Ti质粒导入拟南芥，经筛选获得若干候选转基因植株。提取各植株的基因组DNA，利用目的基因特异性引物进行PCR扩增，并通过琼脂糖凝胶电泳检测产物。电泳结果如下图所示(M为DNA分子标准参照物，泳道1~4为待测植株样品)，下列叙述正确的是（　　）
A．泳道1对应的植株一定是纯合的转基因植株
B．泳道2对应的植株未成功转化，应直接丢弃
C．泳道3对应的植株中出现非特异性扩增片段的原因可能是引物与非目的序列有同源性
D．泳道4对应的植株中目的基因的表达量较低
16．某科研小组研究了苋菜叶绿体基因pbsA编码的D1蛋白在特定位点发生突变，可获得对除草剂的抗性，野生型品系和突变品系的部分DNA碱基序列和氨基酸位置，结果如表所示。下列叙述正确的是（　　）
野生型品系 CGA丙氨酸 AGT丝氨酸 AAG苯丙氨酸 TTA天冬氨酸
突变品系 CGT丙氨酸 GGT脯氨酸 AAG苯丙氨酸 TTA天冬氨酸
氨基酸位置 227 228 229 230
A．叶绿体基因主要随卵细胞传递，该抗除草剂性状不易通过花粉造成基因污染
B．碱基编辑仅改变pbsA基因的碱基排列顺序，不改变基因数量，不属于基因突变
C．若编辑后基因转录产物不变，仅翻译产物改变，说明编辑发生在内含子区段
D．若将该抗除草剂基因通过农杆菌转化法整合到苋菜核基因组，其遗传仍不遵循孟德尔定律
17．紫花苜蓿被誉为“牧草之王”，但易造成家畜鼓胀病；百脉根富含单宁，饲喂时可防止家畜鼓胀病的发生。研究人员设计了下列技术路线，以期获得抗鼓胀病的新型苜蓿。(注：IOA可抑制植物细胞呼吸第一阶段，R-6G可阻止线粒体的功能)
（1）据图可知，本研究主要利用的两个生物技术的原理分别是　 　、　 　。
（2）①过程的发生，必须进行人工诱导，人工诱导原生质体融合的化学法除聚乙二醇融合法外，还有　 　法等。其中只有异源融合体才能存活和具有再生能力，请推测原因是　 　。
（3）百脉根富含单宁，单宁具有收敛止血、抗氧化、抗菌等作用被用于各类产品，若要通过　 　技术生产单宁，需将百脉根细胞培养到　 　阶段，再筛选出稳定高产单宁的细胞进行培养。
18．如图1表示利用生物技术制备抗X的单克隆抗体的过程；图2表示体外受精培育优质奶牛的过程；请据图回答下面的问题。
（1）图1中注射到小鼠体内的物质是　 　。与植物原生质体融合相比，细胞A的形成过程中特有的诱导融合方法是　 　。
（2）科学家从某些无限增殖细胞的细胞质中分离出了无限增殖调控基因(prG)，该基因能激发动物细胞分裂。据此，为获得既能产生抗体又能无限增殖的细胞，请简要写出一种新思路　 　。
（3）图2优质奶牛的培育过程需要进行体外受精、早期胚胎培养和胚胎移植。胚胎移植后的胚胎能在受体子宫中存活，其生理基础是　 　。
（4）若要同时获得多头与此优质奶牛相同的小牛，可对图2所示囊胚阶段的胚胎进行　 　，操作过程需要特别注意的问题是　 　，否则会影响分割后胚胎的恢复和进一步发育。
19．水螅具备很强的再生能力，其大部分身体结构被破坏都能够复原，理论上可以无限再生，近乎永生。研究表明，水螅的再生能力依赖体内的Wnt基因。为了研究Wnt基因的作用机理和对小鼠成纤维细胞再生是否有促进作用，科学家利用基因工程和细胞工程技术做了以下实验。回答下列问题：
（1）获取Wnt基因的途径之一是：提取了水螅细胞全部DNA后，采用PCR技术扩增Wnt基因，该技术的原理是　 　。已知Wnt基因一条链两端的序列为5’-AATTGCGG-Wnt基因-TCGAAACT-3’，根据其两端序列，则需要选择的一对引物序列是　 　(填字母)。
A．引物I是5’-AATTGCGG-3’，引物Ⅱ是5’-TCGAAACT-3’
B．引物I是5’-AATTGCGG-3’，引物Ⅱ是5’-AGTTTCGA-3’
C．引物I是5’-CCGCAATT-3’，引物Ⅱ是5’-TCGAAACT-3’
D．引物I是5’-CCGCAATT-3’，引物Ⅱ是5’-AGTTTCGA-3’
（2）如图甲为获取的含有Wnt基因的DNA片段，为保证目的基因和质粒丙正确连接，在该实验中，切割含有目的基因DNA片段使用的限制酶为　 　，原因是　 　。
（3）若要验证Wnt基因在小鼠成纤维细胞再生中是否起到促进作用，可以将对小鼠成纤维细胞进行体外培养，需先用　 　处理使组织分散成单个细胞。实验组小鼠细胞注入含有Wnt基因的重组载体，对照组注入不含Wnt基因的空载体，实验结果显示实验组小鼠细胞增殖和再生能力显著高于对照组，说明　 　。
20．胡萝卜素是一种抗氧化剂和维生素A前体。科研人员将crtE、crtB、crtI三个关键酶基因导入大肠杆菌，使其能利用内源前体法尼基焦磷酸(FPP)合成胡萝卜素。构建的表达载体如下图，三个目的基因以多顺反子结构(共用一个启动子，各自带有核糖体结合位点RBS)插入多克隆位点(MCS)。转化宿主为大肠杆菌，在含氨苄青霉素和X-gal的平板上筛选，挑取白色菌落验证后，再转入表达菌株诱导表达。
注：lacZ基因编码产生的半乳糖苷酶可以分解X-gal产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。请回答下列问题：
（1）在含氨苄青霉素和X-gal的平板上，白色菌落代表大肠杆菌导入　 　质粒，蓝色菌落代表大肠杆菌导入　 　质粒。在构建基因表达载体时，除需要限制酶外，还需要　 　酶。
（2）该载体采用多顺反子结构，三个基因共用一个启动子的作用是　 　。(任写一点即可)
（3）实验测得重组菌的胡萝卜素产量较低。科研人员推测可能是由于FPP供应不足。请提出一种基因工程层面的改进策略(不改变培养基成分)，　 　。
（4）若最终检测发现重组菌的胡萝卜素产量几乎为零，但菌落能在含氨苄青霉素的平板上正常生长，且菌落为白色。分析可能的原因(写出两点)　 　。
21．为研究干旱胁迫基因LEA和VOC对甘蓝型油菜油脂的积累机制，科研人员构建了两个基因表达载体。其中基因LEA与荧光素酶基因(Luc)构建成基因表达载体甲，基因VOC和标记基因构建成基因表达载体乙，相关序列如图所示。箭头表示转录方向。
（1）利用PCR扩增LEA基因时，需要在引物上添加的限制酶是　 　。
（2）常用农杆菌转化法将目的基因导入油菜受体细胞，目的基因将插入Ti质粒的　 　上，并最终将其整合到染色体DNA上，从而使其得以维持稳定和表达。
（3）乙酰—CoA羧化酶基因(AC)是油脂合成过程的关键酶基因，甘油三酯酯酶基因(ATGL)是油脂分解过程的关键酶基因。将基因表达载体甲、乙分别导入植物细胞，通过　 　技术获得转基因植物A、B，在干旱胁迫的环境下培养两种转基因植物和正常植物，分别检测植物体内AC和ATGL基因的表达水平，结果如下图。
　 正常植株 转基因A植株 转基因B植株
AC酶
ATGL酶
①在分子水平上，用　 　方法检测AC酶和ATGL酶的含量可得到上述表格结果。
②基于以上研究，干旱胁迫基因LEA和VOC在甘蓝型油菜油脂积累中的调控机制是　 　。
答案解析部分
1．【答案】D
【知识点】植物组织培养的过程；组织培养基的成分及作用；植物组织培养的影响因素
【解析】【解答】A、植物组织培养需严格无菌操作。对外植体消毒时，通常先用70%酒精进行表面杀菌，随后用无菌水漂洗以去除残留酒精，再用次氯酸钠溶液进一步灭菌，最后用无菌水多次冲洗干净，A正确；
B、愈伤组织细胞处于持续分裂状态，代谢活跃，经射线照射后易诱发基因突变，因此从中筛选可能获得带有有益性状的突变体，这是植物诱变育种的常见途径，B正确；
C、在组织培养的诱导生芽或生根阶段，主要通过调节生长素和细胞分裂素的比例来决定分化方向——细胞分裂素相对含量较高时促进芽的分化，生长素相对含量较高时利于根的形成，C正确；
D、过程②为诱导外植体形成愈伤组织，此阶段通常要求在暗培养条件下进行，因为光照会促使细胞提前分化，不利于愈伤组织的诱导和增殖，D错误。
故答案为：D
【分析】1、植物组织培养要求全程无菌，外植体（如藿香叶片）表面携带微生物，需进行表面消毒。标准流程为：酒精（70%左右）：短时浸泡，杀灭表面部分微生物，同时使外植体表面湿润，利于后续消毒剂渗透；无菌水冲洗：去除残留酒精，避免酒精对外植体细胞造成伤害；次氯酸钠溶液（或升汞）：进一步深度灭菌，杀死顽固的细菌和真菌孢子；无菌水多次冲洗：彻底清除消毒剂残留，保护外植体活力。
2、在组织培养中，生长素和细胞分裂素的浓度比值是决定器官分化的关键：生长素比例高 → 促进生根；细胞分裂素比例高 → 促进生芽；两者比例适中 → 维持愈伤组织持续增殖而不分化。
2．【答案】B
【知识点】动物细胞培养技术
【解析】【解答】A、培养过程中定期更换培养液，既能补充被消耗的营养物质，又能及时移除细胞代谢产生的废物，从而避免有害代谢产物积累对细胞正常活动造成不利影响，A正确；
B、动物细胞培养箱内通常供应95%空气和5%CO2的混合气体，其中CO2用于维持培养液的酸碱度（pH）稳定，而空气提供细胞有氧呼吸所需的氧气，并非95%的高浓度O2（过高浓度氧气反而会对细胞产生损伤），B错误；
C、目前商品化的合成培养基成分尚不全面，无法完全替代天然环境，因此在实际培养中需要添加适量动物血清等天然成分，以提供细胞生长所必需的各种未知因子和激素，C正确；
D、动物细胞在体外培养时，多数细胞类型需要贴附于支持物表面才能生长（贴壁生长），但也有一些细胞（如悬浮型细胞系或某些血液来源的细胞）能够直接在培养液中呈悬浮状态进行增殖，D正确。
故答案为：B
【分析】1、动物细胞在体外培养过程中，会不断消耗培养基中的葡萄糖、氨基酸等营养物质，同时分泌乳酸、氨等代谢废物。若这些废物累积过多，会改变培养液的渗透压和pH，并对细胞产生毒性作用。定期更换培养液既能补充新鲜养分，又能及时清除有害代谢物，是维持细胞持续健康增殖的基本操作。
2、动物细胞培养箱的气体组成通常为 95%空气 + 5% CO2，空气中的氧气（约21%）：为细胞有氧呼吸提供电子受体，满足能量代谢需求；CO2（5%）：与培养液中的碳酸氢盐缓冲系统共同作用，维持培养液 pH在7.2~7.4 左右，避免因细胞代谢产酸导致环境过酸。
3、动物细胞体外培养主要有两种生长模式：贴壁生长（大多数正常细胞，如成纤维细胞、上皮细胞）：需附着于培养瓶壁或微载体表面，依赖细胞外基质和贴附因子；悬浮生长（部分转化细胞系、杂交瘤细胞、血液来源的淋巴细胞等）：不需要附着表面，可直接在培养液中分散生长并增殖。两者均属于正常的培养类型，并非所有动物细胞都必须贴壁。
3．【答案】B
【知识点】单克隆抗体的制备过程
【解析】【解答】A、向小鼠体内注射GP3蛋白（作为抗原）是为了激发小鼠的免疫应答，从而获得能够产生抗GP3蛋白抗体的B淋巴细胞（即浆细胞），并非直接获取抗体本身，A错误；
B、第一次筛选只是从融合细胞中选出杂交瘤细胞（具备无限增殖能力），但这些杂交瘤细胞可能来源于不同的B细胞克隆，所分泌的抗体类型和特异性未必一致，因此还需通过后续筛选（如克隆化培养和抗体检测）获得单一目标细胞株，B正确；
C、最终应挑选抗体检测结果为阳性（即能分泌针对GP3蛋白的目标抗体）的杂交瘤细胞进行扩大培养，若结果为阴性则说明不产生所需抗体，不符合要求，C错误；
D、杂交瘤细胞（细胞丁）既可以在体外培养液中扩大培养，也可以注射到小鼠腹腔内进行体内培养，并非只有注射到腹腔这一种途径，D错误。
故答案为：B
【分析】1、单克隆抗体制备的第一步是将特定抗原（如本题中的GP3蛋白）注射到小鼠体内。其目的是激发小鼠的体液免疫，使小鼠脾脏中的B淋巴细胞（浆细胞）被特异性激活并增殖，这些B细胞能够分泌针对该抗原的抗体。注射抗原获得的不是抗体本身，而是能产生抗体的B淋巴细胞，后续需将这些B细胞与骨髓瘤细胞融合才能大量生产单克隆抗体。
2、获得目标杂交瘤细胞株后，可通过两种方式大量生产单克隆抗体：（1）体外培养：在细胞培养瓶或生物反应器中用合成培养基培养，从培养上清中收集抗体；（2）体内培养（小鼠腹腔）：将杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔内，利用小鼠腹水大量增殖，从腹水中提取高浓度抗体。
4．【答案】C
【知识点】动物细胞核移植技术
【解析】【解答】A、在体细胞核移植中，作为受体细胞的卵母细胞必须培养至减数第二次分裂中期（MⅡ期）才具备支持胚胎发育的能力，并非直接取自卵巢即可使用，A错误；
B、去除卵母细胞细胞核的常用方法是显微操作法，此外也可采用梯度离心、紫外线短时照射或化学物质处理等去核手段；但Ca2+载体通常用于激活重构胚（促进融合后的胚胎启动分裂），不属于去核方法，B错误；
C、胚胎细胞的分化程度较低，其细胞核的全能性较易表现，因此以粤东黑猪的胚胎细胞作为供核细胞进行核移植，相对于体细胞操作难度更小、成功率更高，C正确；
D、仔猪的遗传性状主要取决于细胞核中的遗传物质，而细胞核来自粤东黑猪，因此仔猪的性别等核遗传特征由粤东黑猪决定；小耳花猪仅提供去核卵母细胞的细胞质（含少量线粒体DNA），其遗传物质不影响性别决定，杜洛克母猪仅作为代孕母体，不提供遗传物质，D错误。
故答案为：C
【分析】1、在核移植中，通常选用处于减数第二次分裂中期（MⅡ期）的卵母细胞作为受体细胞。原因是此时期的卵母细胞细胞质中含有大量成熟促进因子（MPF）等物质，能够支持供体细胞核发生重编程（即恢复全能性），并启动胚胎分裂发育。直接从卵巢取出的卵母细胞尚未成熟，不具备支持发育的能力，需要在体外培养至MⅡ期才能使用。
2、去除卵母细胞原有细胞核（即去核）是核移植的关键步骤之一，常用方法有：（1）显微操作法（最常用）：在显微镜下用显微吸管吸出细胞核及周围少量细胞质（即第一极体和部分胞质）；（2）梯度离心法：利用密度梯度离心使细胞核移位或排出；（3）紫外线短时照射：破坏卵母细胞核DNA，使其丧失功能；（4）化学物质处理（如放线菌酮等）也可辅助去核。Ca2+载体（如离子霉素）通常用于激活重构胚——即电融合或化学融合后，用Ca2+载体模拟受精时精子引起的钙震荡，启动胚胎发育，不属于去核方法。
3、克隆动物的核遗传物质（包括决定性别的性染色体）全部来自供核细胞，因此：性别由供核动物（粤东黑猪）的性染色体组成（XX或XY）决定；受体卵母细胞（来自小耳花猪）仅提供细胞质中的线粒体DNA（胞质遗传），不参与核遗传性状（包括性别）的调控；代孕母体（杜洛克母猪）只提供妊娠环境（子宫），不提供任何遗传物质，仅负责胚胎的发育和分娩，不影响后代遗传组成。
5．【答案】D
【知识点】精子、卵子的发生和体内受精；动物胚胎发育的过程
【解析】【解答】A、当精子进入卵细胞后，卵细胞膜会迅速发生结构变化（即卵细胞膜反应），形成阻止多精入卵的第二道屏障，从而保证只有一个精子能与卵子完成受精，A正确；
B、在胚胎发育早期的卵裂阶段，受精卵通过连续的有丝分裂使细胞数目成倍增加，但分裂产生的子细胞体积逐渐变小，因此胚胎的总体积基本保持不变（甚至略有减小），并不增大，B正确；
C、发育至囊胚时期时，胚胎内部细胞间开始出现一个充满液体的腔隙，这个结构被称为囊胚腔，标志着胚胎已进入囊胚阶段，C正确；
D、在自然生理条件下，哺乳动物的受精过程发生在雌性生殖道的输卵管部位，而非子宫；同时，受精卵早期分裂和发育（从受精卵到桑椹胚乃至早期囊胚）也主要在输卵管内进行，之后才逐渐移入子宫并完成着床，并非全程都在子宫内完成，D错误。
故答案为：D
【分析】1、在受精过程中，当第一个精子进入卵细胞后，卵子会启动两种机制阻止其他精子进入：（1）透明带反应（第一道屏障）：精子触及透明带时，透明带结构发生变化，阻止其他精子穿越透明带；（2）卵细胞膜反应（第二道屏障）：精子入卵后，卵细胞膜立即发生电位和结构变化，阻止后续精子与卵细胞膜融合。
2、自然生理过程中，场所并非全部在子宫：（1）受精：发生在雌性生殖道的输卵管壶腹部（不是子宫）；（2）早期卵裂：受精卵在输卵管内进行分裂，发育至桑椹胚（约16~32细胞）阶段；（3）进入子宫：桑椹胚继续发育，进入囊胚阶段时，胚胎才从输卵管移至子宫，随后在子宫内进一步发育并进行着床（植入）。
6．【答案】D
【知识点】动物体细胞克隆；体外受精
【解析】【解答】A、在胚胎工程中，为获得较多卵母细胞，通常使用促性腺激素（如孕马血清促性腺激素PMSG或人绒毛膜促性腺激素hCG）处理供体母畜以实现超数排卵，而非使用促性腺激素释放激素（GnRH），后者主要作用于垂体调控自身促性腺激素的分泌，一般不直接用于超排处理，A错误；
B、E后代由A的卵细胞与C的精子体外受精发育而来，其核遗传物质一半来自A、一半来自C，因此遗传性状与A和C均相关，并非完全与A和C一致；F后代是核移植产物，核遗传物质主要来自B（供核个体），细胞质中少量线粒体DNA来自A（卵母细胞供体），因此F的多数性状与B相同，但部分胞质遗传性状与A有关，并非完全与B一致，B错误；
C、若过程①表示体外受精，则从C获得的精子在自然状态下尚未获得受精能力，必须在体外进行获能处理（如使用化学物质或培养液使其膜发生变化）后，才能与卵母细胞结合完成受精，C错误；
D、由A经超数排卵获得的卵母细胞在刚排出时尚未成熟，需在体外培养至减数第二次分裂中期（MⅡ期），此时卵细胞才具备完整的受精能力，可与经过获能处理的精子进行体外受精，D正确。
故答案为：D
【分析】1、在胚胎工程中，为了从供体母畜（如图中A）获得多枚卵母细胞，通常使用促性腺激素进行处理。这类激素能直接作用于卵巢，促进多个卵泡同时发育成熟并排卵。促性腺激素释放激素是由下丘脑分泌的，主要作用于垂体，促使垂体释放促性腺激素，但其作用间接且缓慢，一般不直接用于超数排卵处理。
2、哺乳动物的精子在刚采集时（如从附睾或射精获得）尚未具备受精能力，需要在体外进行获能处理——即精子在特定培养液（含Ca2+、HCO3-、血清白蛋白等）中孵育，使其质膜发生去能因子去除、膜流动性改变等生理变化，从而获得穿透卵丘细胞和透明带的能力。未经获能的精子无法完成受精。
7．【答案】B
【知识点】基因工程的基本工具（详细）
【解析】【解答】A、限制酶具有专一性，能够识别双链DNA中特定的碱基序列并在特定位点进行切割，EcoRⅠ也不例外，其切割作用同样具有特异性，A错误；
B、BamHⅠ和MboⅠ虽然识别序列不同，但二者切割后露出的黏性末端均为相同的-GATC-单链序列，因此可以用DNA连接酶将这两个末端连接。连接后形成的序列依然包含-GATC-，仍能被MboⅠ识别并切开，B正确；
C、若选用的两种限制酶属于同尾酶（即切出相同黏性末端），则二者切割质粒后产生的末端可以互相退火连接，质粒仍可能发生自身环化。因此并非任何两种不同的限制酶切割都能有效防止质粒自连，C错误；
D、由图2可知，质粒上含有限制酶Ⅱ的识别序列-GATC-，而该序列也存在于Gene Ⅰ和Gene Ⅱ内部。若用限制酶Ⅱ切割质粒，会同时切断质粒上的两个标记基因，破坏其完整结构；而限制酶Ⅰ的识别序列-GGATCC-仅出现在目的基因两端而不影响质粒关键元件，因此更合理的选择是用限制酶Ⅰ切割质粒和目的基因（或分别切割），而非题述方式，D错误。
故答案为：B
【分析】1、限制酶是一类能识别双链DNA中特定回文序列并在特定位点切割磷酸二酯键的酶。每种限制酶都有自己独特的识别序列和切割位点，例如：EcoRⅠ：识别 -GAATTC-，在G与A之间切割；BamHⅠ：识别 -GGATCC-，在G与G之间切割；BglⅡ：识别 -AGATCT-，在A与G之间切割；MboⅠ：识别 -GATC-，在G与A之间切割。
2、同尾酶：指识别序列不同，但切割后产生的黏性末端碱基序列相同的一组限制酶。
3、为了防止质粒载体自身环化（自连），通常采用两种不同的限制酶切割质粒，使其产生两个不同的黏性末端，这样两端无法互相连接，只能与外源目的基因的对应末端连接，从而提高重组效率。
4、在构建基因表达载体时，选择限制酶位点需遵循两个基本原则：目的基因两端应有该酶的识别序列（便于完整切割下目的基因）；质粒上的该酶识别位点不应位于启动子、终止子、标记基因（如抗性基因）等关键元件内部，否则会破坏其功能。
8．【答案】D
【知识点】基因工程的基本工具（详细）；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】A、过程①是以戊型肝炎病毒的RNA为模板来合成DNA，这一过程属于逆转录，所需的酶是逆转录酶，原料应为四种脱氧核糖核苷酸（dA、dT、dG、dC），而非核糖核苷酸（A、U、G、C），A错误；
B、过程①获得的产物（目的基因）与过程③涉及的质粒在切割时，不一定要使用同一种限制酶，只要两种限制酶切割后产生相同的黏性末端（即同尾酶），同样可以实现有效连接，B错误；
C、过程⑤是将构建好的重组基因表达载体导入大肠杆菌中，此处使用的载体是适用于大肠杆菌的表达载体（如pET系列等），并非Ti质粒——Ti质粒主要应用于农杆菌介导的植物遗传转化，C错误；
D、过程⑥在进行大规模培养和诱导表达pORF2蛋白之前，必须对转化后的大肠杆菌进行筛选和鉴定，确保其携带重组质粒并能正确表达目标蛋白，之后再扩大培养以大量制备pORF2蛋白，D正确。
故答案为：D
【分析】1、戊型肝炎病毒是RNA病毒，其遗传物质为RNA。要从病毒RNA中获得编码pORF2蛋白的ORF2基因，需要先以病毒RNA为模板，通过逆转录合成互补的DNA（cDNA）。所需酶：逆转录酶（又称反转录酶）；原料：四种脱氧核糖核苷酸（dATP、dTTP、dGTP、dCTP）。
2、在基因工程中，将目的基因与载体连接时，不一定非要用同一种限制酶切割。如果两种限制酶识别序列不同但切割后产生相同的黏性末端（即同尾酶），同样可以通过DNA连接酶将二者连接起来。
3、将重组DNA分子导入受体细胞时，需要根据宿主类型选择合适的载体：大肠杆菌作为受体细胞时，常用质粒载体（如pBR322、pET系列等），这些质粒带有大肠杆菌适用的复制起点和筛选标记；Ti质粒是农杆菌中的一种质粒，主要用于植物转基因，可将目的基因整合到植物染色体上，不适用于大肠杆菌转化。
9．【答案】C
【知识点】基因工程的应用
【解析】【解答】A、若要使人凝血因子基因在羊的乳腺细胞中成功表达，需要将该基因与羊乳腺蛋白基因的启动子等调控元件重组在一起，利用乳腺特异性启动子驱动其表达，而非使用该基因自身的启动子，A错误；
B、人凝血因子基因作为外源DNA已整合到该羊的体细胞核基因组中，但在其分泌的乳汁中仅含有人凝血因子蛋白（基因表达的产物），并不含凝血因子基因本身，B错误；
C、只有雌性个体具备发育完全的乳腺并在泌乳期能分泌乳汁，因此由该受精卵发育而成的羊必须是雌性，才能通过乳汁获得含有人凝血因子的产物，C正确；
D、该实例属于利用转基因动物作为“生物反应器”来生产药用蛋白（人凝血因子），用以治疗疾病，属于基因工程在生产药物方面的应用，而非用于改善畜产品品质（如提高瘦肉率、改善肉质等），D错误。
故答案为：C
【分析】1、要让目的基因（如人凝血因子基因）在羊的乳腺细胞中特异性表达（即只在乳腺中产生蛋白，并随乳汁分泌），不能使用目的基因自身的启动子，而必须使用乳腺蛋白基因的启动子（如羊β-酪蛋白基因启动子）。该启动子具有组织特异性，能驱动下游基因在乳腺细胞中高效转录，而在其他组织中不表达。
2、乳腺生物反应器依赖于哺乳动物雌性个体的泌乳能力。只有雌性个体在性成熟并经历妊娠或激素诱导后，乳腺才能发育并分泌乳汁。
10．【答案】B
【知识点】蛋白质分子的化学结构和空间结构；蛋白质工程
【解析】【解答】A、干扰素属于动物体内产生的免疫活性物质，主要作用是抑制病毒增殖，并不具备抑制细菌复制的能力，因此不能用于治疗细菌感染性疾病，A错误；
B、要对天然干扰素进行定向改造，实质上是对其蛋白质结构进行设计，而蛋白质的氨基酸序列由基因的碱基序列决定，因此可通过基因的定点突变技术，改变编码半胱氨酸的密码子（UGU/UGC）为编码丝氨酸的密码子（UCU/UCC/UCA/UCG），从而实现对干扰素分子的改造，这属于蛋白质工程的核心思路，B正确；
C、将半胱氨酸替换为丝氨酸后，干扰素的氨基酸序列已发生改变，其一级结构（氨基酸排列顺序）乃至高级结构均可能变化，之所以仍能发挥作用，是因为其活性中心或功能构象未被破坏，而不是其结构未发生任何改变，C错误；
D、天然干扰素是一种糖蛋白，其成熟过程中需要在内质网和高尔基体中进行糖基化修饰，而大肠杆菌是原核生物，缺乏这些细胞器，无法对表达出的蛋白质进行糖基化加工，因此即便将新干扰素基因导入大肠杆菌，也无法获得具有完整糖基化结构的、有活性的预期干扰素，D错误。
故答案为：B
【分析】1、干扰素是动物体细胞在受到病毒等刺激后产生的一类具有抗病毒活性的糖蛋白。其主要作用机制是：与靶细胞表面的受体结合，诱导细胞合成多种抗病毒蛋白，从而抑制病毒的复制和扩散。
2、蛋白质工程的目标是改造天然蛋白质，使其具有更优的性能（如稳定性更高、活性更强等）。其基本途径是：预期功能 → 设计蛋白质结构 → 推测氨基酸序列 → 确定基因碱基序列 → 对基因进行改造→ 表达获得新蛋白质
11．【答案】D
【知识点】DNA的粗提取和鉴定
【解析】【解答】A、猪属于哺乳动物，其成熟红细胞无细胞核和线粒体等含DNA的细胞器，因此几乎不含DNA，不适合用作提取DNA的实验材料；香蕉为植物材料，细胞含细胞核，理论上可用，但哺乳动物成熟红细胞则不能，A错误；
B、DNA在体积分数为95%的冷酒精中溶解度很低，加入冷酒精后DNA会以白色丝状沉淀物形式析出，因此DNA主要存在于沉淀物（或滤渣）中，而非滤液中，B错误；
C、用玻璃棒卷起析出的DNA丝状物时应缓慢沿一个方向搅拌，以便将絮状DNA缠绕成较完整的团块；若快速搅拌则会打碎DNA丝状物，不利于收集，反而会降低获得量，C错误；
D、DNA在沸水浴条件下可与二苯胺试剂反应生成蓝色物质，为验证该蓝色确实来自DNA与二苯胺的反应，需设置对照组（如用等量蒸馏水代替DNA溶液，其他处理完全相同），以排除二苯胺试剂本身在加热过程中变蓝的可能性，从而确保实验结果的可靠性，D正确。
故答案为：D
【分析】1、提取DNA应选用DNA含量较高、组织细胞数目多的材料。常用植物材料：花菜、香蕉、洋葱、菠菜等，其细胞含有细胞核（含DNA）；动物材料：哺乳动物成熟红细胞（如猪血红细胞）没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA，不适合作为提取DNA的材料；而鸡血红细胞（鸟类）有细胞核，含大量DNA，是常用动物材料。
2、DNA在2 mol/L NaCl溶液中溶解度较大，在体积分数为95%的冷酒精中溶解度很低。
3、当DNA从冷酒精中析出时，呈细丝状、絮状。用玻璃棒沿一个方向缓慢搅拌，可以将这些絮状DNA缠绕在玻璃棒上，便于收集。
4、DNA在沸水浴条件下与二苯胺试剂反应，生成蓝色化合物，据此可鉴定DNA的存在。
12．【答案】D
【知识点】PCR技术的基本操作和应用；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】A、根据图示，DNA双链中磷酸基团端为5'端，羟基端为3'端。PCR扩增时，DNA聚合酶只能从引物的3'端开始沿着模板链的5'→3'方向延伸子链，因此引物需要与模板链的3'端区域互补结合。分析可知，应选用引物②和引物③，而非①和④，A错误；
B、电泳时，DNA分子的磷酸基团使其整体带负电荷，在电场中会向正极（阳极）方向迁移，即向与其所带电荷相反的电极移动，而非向相同电荷的电极移动，B错误；
C、在琼脂糖凝胶电泳中，DNA分子的迁移速率与其分子大小呈负相关——分子越小的片段在凝胶中受到的阻力越小，泳动速度越快，移动距离越远；分子越大的片段则移动越慢，C错误；
D、由图b电泳结果可知，3、5、8号羊的条带位置与2号（含蛛丝蛋白基因的质粒对照）一致，说明这3只羊体内成功整合了蛛丝蛋白基因。若该基因在羊的乳腺细胞中成功表达，则其乳汁中应含有蛛丝蛋白，因此可用抗原-抗体杂交（如Western blot或ELISA）在乳汁中进行检测，D正确。
故答案为：D
【分析】1、PCR扩增时，DNA聚合酶只能从引物的3'端开始，沿模板链的5'→3'方向延伸子链。因此：上游引物：应与模板链（通常为编码链）的5'端附近序列互补，其3'端指向待扩增区域的起点；下游引物：应与另一条模板链的5'端附近序列互补，其3'端指向待扩增区域的终点。
2、DNA分子中的磷酸基团在溶液中带负电荷。在琼脂糖凝胶电泳中，DNA在电场作用下会向正极（阳极）移动，即向与自身电荷相反的电极迁移（正负相吸）。
3、在凝胶电泳中，DNA分子的迁移速率主要取决于分子大小和凝胶浓度：分子越小，在凝胶孔隙中受到的阻力越小，迁移越快，跑得越远；分子越大，受到的阻力越大，迁移越慢，跑得越近。
13．【答案】C
【知识点】植物体细胞杂交的过程及应用；植物细胞工程的应用
【解析】【解答】A、方法一最终通过植物组织培养获得了完整的转基因植株，体现了植物细胞的全能性；而方法三只是对愈伤组织进行基因编辑并直接培养以提取紫杉醇，并未再生出完整植株，因此未体现细胞全能性，A错误；
B、方法二将关键酶基因导入大肠杆菌，但大肠杆菌为原核生物，缺乏内质网和高尔基体等细胞器，无法对表达出的酶进行必要的加工修饰，因此只能生产紫杉醇的合成前体，而不能直接获得具有生物活性的紫杉醇，B错误；
C、方法三利用愈伤组织在培养条件下直接生产紫杉醇，属于植物细胞工厂化生产途径，可以通过调节培养液中的营养成分、激素浓度、温度、光照及pH等环境因素来优化产量，且无需经历植物生长周期，不受季节和地域限制，C正确；
D、制备原生质体时需用纤维素酶和果胶酶去除细胞壁，但去除细胞壁后的原生质体无细胞壁保护，若置于低渗溶液中会因吸水过多而涨破，因此应在等渗或适当高渗溶液中完成操作，以维持其正常形态和活性，D错误。
故答案为：C
【分析】1、细胞全能性是指已经分化的细胞具有发育成完整有机体的潜能。其判断标准是：是否由单个或一团细胞经培养再生出完整的植株。
2、紫杉醇的合成涉及一系列酶促反应，其中部分关键酶需要经过内质网和高尔基体的加工修饰（如糖基化、折叠等）才能获得活性。大肠杆菌作为原核生物，细胞内缺乏内质网、高尔基体等膜性细胞器，不具备对真核来源的酶进行翻译后加工的能力。因此，即使将紫杉醇合成相关酶基因导入大肠杆菌，也只能生产出紫杉醇的前体物质，无法直接获得具有完整生物活性的紫杉醇。
3、制备原生质体时，需用纤维素酶和果胶酶去除植物细胞壁。去除细胞壁后的原生质体仅由细胞膜包裹，无细胞壁保护，对渗透压非常敏感。若置于低渗溶液中，细胞外水分会大量进入细胞内，导致原生质体吸水涨破。
14．【答案】C
【知识点】噬菌体侵染细菌实验；单克隆抗体的制备过程
【解析】【解答】A、逆转录过程是以RNA为模板合成互补DNA（cDNA），所需的原料应为四种脱氧核糖核苷酸（dATP、dTTP、dGTP、dCTP），而非核糖核苷酸，A错误；
B、重组噬菌体侵染大肠杆菌属于病毒感染过程，噬菌体通过其自身机制吸附并注入DNA，不需要像质粒转化那样用Ca2+处理使大肠杆菌处于感受态，B错误；
C、专一抗体检验的原理是抗原-抗体特异性结合——即让重组噬菌体表达的抗体与HCV抗原反应，若发生特异性结合则证明成功获得了抗HCV抗体，C正确；
D、利用噬菌体展示技术获得的抗体（如单链抗体scFv）尽管可能经过人源化处理，但作为外源蛋白进入人体后仍可能引发免疫反应，存在免疫排斥风险，通常还需进一步优化改造才能安全用于临床治疗，D错误。
故答案为：C
【分析】1、逆转录酶催化以RNA为模板合成DNA的过程。模板：总RNA（含目的mRNA）；酶：逆转录酶；原料：四种脱氧核糖核苷酸（dATP、dTTP、dGTP、dCTP），用于合成互补DNA（cDNA）。核糖核苷酸（A、U、G、C）是转录（RNA合成）的原料，而非逆转录的原料。
2、质粒转化：将裸露的DNA分子导入细菌（如大肠杆菌）时，通常需要用Ca2+处理细菌，使其细胞膜通透性增加，成为能摄取外源DNA的感受态细胞。噬菌体侵染：噬菌体是病毒，它通过其尾丝吸附于细菌表面，并注入自身的DNA，属于天然的感染过程，无需Ca2+处理即可完成侵染。
15．【答案】C
【知识点】PCR技术的基本操作和应用
【解析】【解答】A、泳道1出现了与阳性对照一致的目的条带（500 bp），仅能说明该植株基因组中整合了目的基因，但无法区分是纯合子（两条同源染色体均携带目的基因）还是杂合子（仅一条携带），因此不能据此判断其为纯合植株，A错误；
B、泳道2未出现任何扩增条带，可能的原因包括未成功转化，也可能是PCR扩增体系失败、模板DNA质量差或操作失误所致，需要重新提取DNA并重复实验加以确认，不宜直接判定为转化失败并丢弃，B错误；
C、泳道3除500 bp的目标条带外，还出现了其他非预期大小的条带，这通常是由于引物与基因组中非目标区域的序列存在一定同源性，导致引物错误配对并引发非特异性扩增，C正确；
D、该实验是对基因组DNA进行PCR扩增，检测目的基因是否整合，属于DNA水平的鉴定，无法反映目的基因是否转录或翻译，因此不能得出“表达量低”的结论；泳道4条带较暗仅说明扩增产物量少，可能受模板量或PCR效率影响，D错误。
故答案为：C
【分析】PCR只能检测基因组中是否存在目的基因，而无法区分是纯合插入还是杂合插入。纯合子：两条同源染色体均携带目的基因；杂合子：仅一条同源染色体携带目的基因。两者提取的基因组DNA中均含有目的基因序列，PCR均能扩增出条带，且条带位置相同。要区分纯合与杂合，通常需要进行Southern杂交或子代遗传分离比分析，单靠PCR电泳无法判断。
16．【答案】A
【知识点】基因的分离规律的实质及应用；基因的自由组合规律的实质及应用；基因突变的类型；转基因生物的安全性问题；遗传信息的翻译
【解析】【解答】A、叶绿体基因位于细胞质中，具有母系遗传的特点（因为受精卵的细胞质几乎全部来自卵细胞），精子的细胞质极少，因此该抗除草剂基因不会通过花粉扩散到近缘物种中，不易造成基因污染，A正确；
B、基因突变是指基因在结构上发生碱基对的替换、增添或缺失，从而导致基因碱基序列的改变。本题中碱基编辑使pbsA基因的碱基排列顺序发生了变化，虽然基因数量未变，但基因的分子结构已经改变，因此属于基因突变，B错误；
C、真核生物的基因包含外显子和内含子，内含子在转录后通过RNA剪接被去除，不参与蛋白质的翻译。若编辑发生在内含子区段，则成熟mRNA序列不会改变，翻译产物也不会变化；而题目中翻译产物发生了改变，说明编辑位点应位于编码蛋白质的外显子区段，C错误；
D、孟德尔遗传规律适用于真核生物细胞核中染色体上基因的遗传。若抗除草剂基因通过农杆菌转化法整合到苋菜的核基因组中，则该基因作为核基因，在减数分裂和受精过程中会遵循孟德尔分离定律和自由组合定律，D错误。
故答案为：A
【分析】1、叶绿体基因属于细胞质基因，位于细胞质中的叶绿体内。在高等植物的受精过程中：卵细胞含有大量的细胞质（含叶绿体、线粒体及其DNA）；精子（花粉）几乎只提供细胞核，细胞质极少，通常不携带叶绿体或线粒体。
2、基因突变是指基因在结构上发生碱基对的替换、增添或缺失，从而导致基因的碱基排列顺序（即遗传信息）发生改变。
3、真核生物的基因由外显子和内含子组成：（1）外显子：编码蛋白质的序列，在转录后保留在成熟mRNA中，参与翻译；（2）内含子：不编码蛋白质的间隔序列，在转录后通过RNA剪接被切除，不进入成熟mRNA。
4、孟德尔遗传规律（分离定律和自由组合定律）适用于真核生物细胞核中染色体上的基因在减数分裂和受精过程中的传递规律。
17．【答案】（1）细胞膜具有流动性；植物细胞具有全能性
（2）高高pH融合；异源融合的原生质体才能完整进行有氧呼吸的三个阶段，可恢复生长并获得再生能力
（3）植物细胞培养；愈伤组织
【知识点】植物体细胞杂交的过程及应用；细胞融合的方法；植物细胞工程的应用
【解析】【解答】（1）本流程首先通过原生质体融合将紫花苜蓿和百脉根的遗传物质组合在一起，这依赖细胞膜的流动性使两个原生质体融合为一个杂种细胞；之后再将杂种细胞培育成完整植株，这体现了植物细胞的全能性。因此两个生物技术的原理分别是细胞膜具有流动性和植物细胞具有全能性。
（2）①过程为原生质体融合，人工诱导的化学法除了聚乙二醇融合法外，还有高Ca2+—高pH融合法。实验中分别用IOA和R-6G处理两种原生质体：IOA抑制呼吸作用的第一阶段（糖酵解），R-6G阻止线粒体功能（阻碍有氧呼吸第二、三阶段）。因此，未融合的原生质体或同源融合体因呼吸链不完整，不能正常进行有氧呼吸而无法存活和再生；只有异源融合体同时获得了完整的细胞质和线粒体，能完整进行有氧呼吸的三个阶段，恢复生长并获得再生能力。
（3）若要利用细胞培养直接生产单宁，应选用植物细胞培养技术。该技术通常将植物材料培养至愈伤组织阶段，此时细胞分裂活跃且次生代谢产物合成能力较强，再从中筛选出稳定高产单宁的细胞系进行规模化培养，以获得单宁产品。
【分析】1、人工诱导融合的方法：（1）化学法：除了聚乙二醇（PEG）融合法，还有高Ca2+—高pH融合法，后者通过改变溶液中的钙离子浓度和pH值，促进原生质体膜融合。（2）物理法：电融合法、离心法等。
2、若要获得百脉根中的单宁（一种次生代谢产物），可采用植物细胞培养技术（又称细胞悬浮培养或愈伤组织培养）：首先将植物组织脱分化，诱导形成愈伤组织（一种未分化的细胞团）；愈伤组织细胞分裂旺盛，且具备合成次生代谢产物的能力；在愈伤组织阶段，通过筛选获得高产单宁的细胞系，再进行规模化液体培养，从培养基或细胞中提取单宁。该技术的优势是不需要培育完整植株，可人工控制培养条件，实现工业化连续生产。
（1）本研究用到了植物体细胞杂交技术和植物组织培养技术；植物体细胞杂交技术的原理是细胞膜具有流动性（原生质体融合的结构基础）；植物组织培养技术的原理是植物细胞的全能性（杂种细胞发育为完整植株的理论基础）。
（2）人工诱导原生质体融合的方法：化学法（聚乙二醇PEG和高Ca2+-高pH融合法）、物理法（电融合法、离心法等）； 用R-6G处理紫花苜蓿原生质体、IOA处理百脉根原生质体后，IOA可抑制植物细胞呼吸第一阶段，R-6G可阻止线粒体的功能（有氧呼吸第二和第三阶段），故原生质体及同源融合体不能再生愈伤组织（不能进行有氧呼吸），只有异源融合的原生质体才能完整进行有氧呼吸的三个阶段，可恢复生长并获得再生能力，因此能存活的就是异源融合体。
（3）要获得细胞的产物，要通过植物细胞培养技术生产单宁，需要将百脉根细胞培养到愈伤组织阶段，再筛选出稳定高产单宁的细胞进行培养。
18．【答案】（1）抗原X；灭活的病毒处理
（2）通过基因工程向浆细胞中导入prG或利用核移植技术将浆细胞的细胞核移植到去核的无限增殖细胞中
（3）受体子宫不会对移入的胚胎发生免疫排斥反应
（4）胚胎分割；注意将囊胚的内细胞团进行均等分割
【知识点】细胞融合的方法；单克隆抗体的制备过程；胚胎移植；胚胎分割
【解析】【解答】（1）图1中向小鼠体内注射的物质是抗原X，目的是激发小鼠的体液免疫，使其脾脏中产生能分泌抗X抗体的B淋巴细胞。在细胞融合环节，植物原生质体融合常用物理法（如离心法、电融合法）或化学法（如PEG融合法），而动物细胞融合（形成杂交瘤细胞）特有的诱导方法是灭活的病毒处理（如灭活的仙台病毒），该方法可促进动物细胞膜的融合。
（2）若要从无限增殖细胞中获得prG基因并赋予浆细胞无限增殖能力，思路有两种：（1）基因工程途径：将prG基因通过载体导入浆细胞中，使其获得无限增殖的特性；（2）核移植途径：将浆细胞的细胞核移植到去核的无限增殖细胞中，利用后者细胞质中的调控因子使重组细胞既能无限增殖又能分泌特定抗体。两种思路均能实现既能产生抗体又能无限增殖的目标。
（3）图2中胚胎移植后，受体子宫能接纳并维持外来胚胎的生长发育，其生理基础是受体子宫对移入的胚胎基本不发生免疫排斥反应，因此胚胎能在受体子宫中存活并完成发育。
（4）若想获得多头遗传组成相同的优质奶牛，可对图2中发育至囊胚阶段的胚胎进行胚胎分割。操作时需特别注意将囊胚的内细胞团均等分割，因为内细胞团将来发育为胎儿的各种组织，若分割不均，会导致部分胚胎发育不全或无法形成完整个体，从而影响分割后胚胎的恢复和进一步发育。
【分析】1、植物原生质体融合常用物理法（电融合、离心）或化学法（PEG融合、高Ca2+—高pH融合）；而动物细胞融合（如B细胞与骨髓瘤细胞融合）还可以使用灭活的仙台病毒等灭活病毒处理，病毒表面的糖蛋白能介导细胞膜融合，这是动物细胞融合特有的方式。
2、若要获得多个基因型相同的个体，可对发育至囊胚期的胚胎进行胚胎分割。操作原理：将囊胚的内细胞团（将来发育为胎儿）和滋养层细胞（将来发育为胎盘）分割成若干份，每一份均可发育为一个完整胚胎。关键注意事项：必须将内细胞团均等分割。因为内细胞团是胚胎发育成完整个体的基础，若分割不均匀，部分胚胎可能因细胞数不足而发育失败或形成发育不全个体，影响移植后的存活率和后代质量。
（1）图1是制备抗X的单克隆抗体的过程，注射到小鼠体内的物质是抗原X，目的是刺激小鼠产生能分泌抗X抗体的B淋巴细胞。植物原生质体融合的方法有物理法、化学法，动物细胞融合（细胞A是杂交瘤细胞）特有的诱导融合方法是灭活的病毒处理。
（2）根据题意，无限增殖调控基因（prG）能激发动物细胞分裂。 新思路：通过基因工程向浆细胞中导入prG或利用核移植技术将浆细胞的细胞核移植到去核的无限增殖细胞中，使其既能无限增殖又能产生抗体。
（3）胚胎移植后胚胎能在受体子宫中存活的生理基础是：受体子宫对外来胚胎基本不发生免疫排斥反应。
（4） 要同时获得多头与此优质奶牛相同的小牛，可对囊胚阶段的胚胎进行胚胎分割，可以获得多头基因型相同的小牛。操作时需要特别注意将内细胞团均等分割，否则会影响分割后胚胎的恢复和进一步发育。
19．【答案】（1）DNA的半保留复制；B
（2）EcoRⅠ和BamHⅠ；使用两种不同的限制酶切割目的基因和质粒，可以产生不同的黏性末端，保证目的基因定向插入质粒，防止质粒自身环化，提高连接效率
（3）胰蛋白酶、胶原蛋白酶；Wnt基因对小鼠成纤维细胞再生有促进作用
【知识点】PCR技术的基本操作和应用；动物细胞培养技术；基因工程的基本工具（详细）；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）PCR技术扩增目的基因的原理是DNA的半保留复制，通过高温变性、低温退火和适温延伸的循环，使特定DNA片段呈指数级增加。设计引物时，引物序列需与模板链的3'端互补，且子链沿5'→3'方向延伸。已知Wnt基因两端的序列为5'-AATTGCGG—Wnt基因—TCGAAACT-3'，则上游引物应与左端模板链的3'端配对，故为5'-AATTGCGG-3'；下游引物应与右端模板链的3'端配对，其序列应为左端互补序列，即5'-AGTTTCGA-3'，因此正确选项为B。
（2）由图丙可知，质粒上含有EcoRⅠ和Sau3AⅠ两种限制酶识别位点，但Sau3AⅠ会切割目的基因内部（破坏Wnt基因），因此不能选用Sau3AⅠ切割含有目的基因的DNA片段。结合图甲分析，应选用EcoRⅠ和BamHⅠ同时切割目的基因片段和质粒。选用两种不同限制酶的好处是：产生不同的黏性末端，使目的基因只能以特定方向插入质粒，同时有效防止质粒自身环化，提高重组效率和后续筛选的准确性。
（3）进行动物细胞体外培养时，需先用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理组织，以分解细胞间的蛋白质，使组织分散为单个细胞，便于后续转染和增殖观察。实验组将含Wnt基因的重组载体导入小鼠成纤维细胞，对照组导入不含Wnt基因的空载体，结果显示实验组细胞增殖和再生能力显著高于对照组，说明Wnt基因对小鼠成纤维细胞的再生具有促进作用。【分析】1、引物必须与模板链的3'端互补结合，DNA聚合酶从引物的3'端开始沿模板链的5'→3'方向延伸子链。
2、图丙质粒上有EcoRⅠ和Sau3AⅠ两种酶切位点，但Sau3AⅠ的识别序列在目的基因内部也存在，若用它切割含目的基因的DNA片段，会破坏Wnt基因的完整结构，因此不可选用。应选用EcoRⅠ和BamHⅠ同时切割目的基因片段和质粒。
3、动物组织培养前，需用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理，分解细胞间质中的蛋白质（如胶原蛋白、纤连蛋白），使组织解离为单个细胞悬液，便于后续操作和计数。
（1）PCR技术的原理是DNA的半保留复制。引物是根据已知序列设计的，要与模板链结合，采用PCR技术扩增Wnt基因（5'-AATTGCGG-Wnt基因-TCGAAACT-3'）时，PCR中需要一对特异性的引物，该引物能与目的基因3'端的碱基互补配对，子链延伸时是从引物的5'向3'端延伸，所以符合条件的引物I是5'-AATTGCGG-3'，引物Ⅱ是5'-AGTTTCGA-3'，B正确，ACD错误。
（2）图丙中有EcoRI和Sau3A I两种限制酶，为了防止目的基因与质粒间的任意连接，应该选择Sau3A Ⅰ、EcoR Ⅰ切割质粒，结合图甲和图丙分析，Sau3A Ⅰ会破坏目的基因，应该选择EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ切割图1所示DNA片段，图乙中Sau3A Ⅰ和BamH Ⅰ的黏性末端相同。使用两种不同的限制酶切割目的基因和质粒，可以产生不同的黏性末端，保证目的基因定向插入质粒，防止质粒自身环化，提高连接效率。
（3）将小鼠成纤维细胞进行体外培养时，需先用胰蛋白酶、胶原蛋白酶处理使组织分散成单个细胞。实验组小鼠细胞注入含有Wnt基因的重组载体，对照组注入不含Wnt基因的空载体，实验结果显示实验组小鼠细胞增殖和再生能力显著高于对照组，说明Wnt基因对小鼠成纤维细胞再生有促进作用。
20．【答案】（1）重组质粒(或外源基因插入破坏lacZ基因)；普通质粒(或空质粒或lacZ基因完整)；DNA连接
（2）保证多个基因的同步表达
（3）过表达大肠杆菌内源的法尼基焦磷酸合成酶基因，增加FPP的合成量，为外源胡萝卜素合成途径提供更多前体。
（4）目的基因未正确插入、启动子失效、RBS失效、基因突变造成终止密码子提前、表达菌株选择不当(任选两点回答即可，合理即可)
【知识点】基因工程的基本工具（详细）；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）本载体中多克隆位点（MCS）位于lacZ基因内部。若目的基因成功插入MCS，会破坏lacZ基因的编码区，使宿主菌无法产生β-半乳糖苷酶，不能分解X-gal产生蓝色物质，因此菌落呈白色，代表导入了重组质粒。若质粒未插入目的基因（空质粒或普通质粒），lacZ基因保持完整，菌落呈蓝色。构建基因表达载体时，限制酶切割DNA后，需用DNA连接酶将目的基因与载体连接成重组DNA。
（2）多顺反子结构中，三个目的基因共用一个启动子。其优势在于：保证多个基因同步转录，实现协同表达，利于代谢通路的协调；节省质粒空间，避免重复插入多个启动子，简化载体构建。
（3）若胡萝卜素产量低的原因是前体FPP供应不足，在不改变培养基成分的前提下，可通过基因工程手段过表达大肠杆菌自身的法尼基焦磷酸合成酶基因（ispA），增强内源FPP的合成能力，为外源胡萝卜素合成途径提供更多底物；或敲除消耗FPP的旁路基因，减少FPP的竞争性消耗。
（4）菌落能在含氨苄青霉素的平板上生长，说明重组质粒已成功导入且氨苄抗性基因正常表达；菌落为白色，说明lacZ基因被破坏，即目的基因已插入MCS。但胡萝卜素产量几乎为零，说明目的基因未能有效表达或表达产物无功能，可能原因包括：目的基因未正确插入（如插入方向错误或阅读框移位）；启动子或RBS（核糖体结合位点）发生突变或失活，导致转录或翻译无法启动；目的基因内部出现碱基突变，引入提前终止密码子，翻译产物截短失活；所选表达菌株不适宜该载体的表达系统（如缺乏必要的转录因子或tRNA）。
【分析】1、蓝白斑筛选机制：载体质粒上的lacZ基因编码β-半乳糖苷酶，该酶能分解底物X-gal产生蓝色物质。若目的基因插入多克隆位点（MCS），而MCS位于lacZ基因内部，则目的基因的插入会破坏lacZ基因，使细胞无法产生β-半乳糖苷酶，菌落呈白色（即白色菌落代表含有重组质粒）。若质粒未插入目的基因（空载体），lacZ基因保持完整，菌落呈蓝色。
2、载体构建工具：切割DNA需用限制酶（产生黏性末端或平末端），连接目的基因与载体需用DNA连接酶。
3、多顺反子指多个基因共用一个启动子，转录出一条mRNA，每个基因前各有一个核糖体结合位点（RBS），供核糖体独立启动翻译。
（1）本题中多克隆位点（MCS）位于lacZ基因内部，目的基因插入后会破坏lacZ，使其无法编码β-半乳糖苷酶分解X-gal产生蓝色物质，因此白色菌落含重组质粒(或外源基因插入破坏lacZ基因)，蓝色菌落含未插入目的基因的普通质粒(或空质粒或lacZ基因完整)；构建载体时，限制酶切割后需要DNA连接酶连接目的基因和载体骨架。
（2）启动子是RNA聚合酶结合、启动转录的位点，多个基因共用一个启动子，既可以保证三个基因同步转录、协同发挥功能，也能节约质粒的序列空间，避免多个启动子的冗余。
（3）若FPP（β-胡萝卜素的合成前体）供应不足，基因工程层面可从两个方向改造：过表达大肠杆菌内源的法尼基焦磷酸合成酶基因，增加FPP的合成量，为外源β 胡萝卜素合成途径提供更多前体，或减少FPP的消耗（敲除大肠杆菌消耗FPP的无关基因），符合题干不改变培养基的要求。
（4）该结果说明质粒成功导入（含氨苄抗性基因，能在氨苄平板生长）、目的基因成功插入（破坏了lacZ，菌落为白色），但β-胡萝卜素几乎不合成，问题出在目的基因的表达或产物功能上，常见原因如目的基因未正确插入、启动子失效、RBS失效、基因突变造成终止密码子提前、表达菌株选择不当等。
21．【答案】（1）EcoRⅤ和Xbal
（2）T-DNA
（3）植物组织培养；抗原—抗体杂交；LEA通过促进AC的表达使植物油脂增加，VOC通过抑制ATGL的表达从而减弱油脂的降低
【知识点】PCR技术的基本操作和应用；基因工程的基本工具（详细）；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）利用PCR扩增LEA基因时，需在引物的5'端添加限制酶识别序列，以便后续将LEA基因与载体连接。由图可知，载体甲中LEA基因需与Luc基因融合，而Luc基因内部含有BamHⅠ的识别位点，若用BamHⅠ切割，会破坏Luc基因；同时，若只用一种限制酶切割，易导致载体自身环化或目的基因反向插入。因此应选用EcoRⅤ和XbaⅠ两种限制酶，以产生不同末端，实现定向连接。
（2）农杆菌转化法中，目的基因需插入Ti质粒的T-DNA区域。T-DNA能转移至植物细胞并整合到受体细胞的染色体DNA上，从而使目的基因在植物体内稳定存在并得以表达。
（3）将含目的基因的表达载体导入植物细胞后，需通过植物组织培养技术将转化细胞再生为完整植株，获得转基因植物A和B。
①AC酶和ATGL酶均为蛋白质，检测其在细胞中的含量，应在分子水平上采用抗原—抗体杂交技术（如Western blot），利用特异性抗体与目标蛋白结合进行定量分析。
②由表格结果可知：与正常植株相比，转基因A植株中AC酶含量升高（促进油脂合成），转基因B植株中ATGL酶含量降低（抑制油脂分解）。据此可推测：在干旱胁迫下，LEA基因通过促进AC基因的表达来增加油脂合成；VOC基因通过抑制ATGL基因的表达来减少油脂分解，两者共同作用使甘蓝型油菜在干旱条件下积累更多油脂。
【分析】1、PCR扩增目的基因后，需将其与载体连接，因此在引物5'端添加限制酶识别序列，以便酶切后产生黏性末端。所选限制酶在目的基因内部不能有识别位点，否则会切割目的基因；在载体上应有对应的酶切位点，且最好选用两种不同的限制酶，以产生不同黏性末端，实现定向连接并防止载体自身环化。
2、农杆菌的Ti质粒上有一段可转移的DNA区域，称为T-DNA。当农杆菌感染植物细胞时，T-DNA会从质粒上剪切下来，转移至植物细胞核并整合到受体细胞的染色体DNA中。
3、AC酶和ATGL酶的化学本质是蛋白质，检测其含量需用抗原—抗体杂交技术（如Western blot）。该法利用特异性抗体与目标蛋白结合，通过显色或发光信号定量检测蛋白表达水平，具有高灵敏度和特异性。
4、AC酶（乙酰-CoA羧化酶）：油脂合成关键酶，其含量越高，油脂合成越强。ATGL酶（甘油三酯酯酶）：油脂分解关键酶，其含量越高，油脂分解越强。
（1）利用PCR扩增LEA基因时，需要在引物上添加限制酶的识别序列。由题意和题图可知：基因LEA与荧光素酶基因（Luc）构建成基因表达载体甲，而Luc中存在BamH I识别序列，BamH I酶切可将Luc切断，单一酶切后可能会导致载体、LEA基因自身环化及LEA反向连接，因此引物添加序列对应的限制酶是 EcoR V和Xbal。
（2）农杆菌的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上。根据农杆菌的这一特点，如果将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上，通过农杆菌的转化作用，就可以把目的基因整合到油菜受体细胞中染色体DNA上，从而使其得以维持稳定和表达。
（3）乙酰-CoA羧化酶基因（AC）是油脂合成过程的关键酶基因，甘油三酯酯酶基因（ATGL）是油脂分解过程的关键酶基因。将基因表达载体甲、乙分别导入植物细胞，可以通过植物组织培养技术获得转基因植物A、B，AC酶和ATGL酶的化学本质是蛋白质，检测其含量，在分子水平上采用抗原—抗体杂交技术。根据检测结果，转基因A植株的AC酶表达量升高，转基因B植株的ATGL酶表达量变低，据此可推测在干旱胁迫的环境下，LEA通过促进AC的表达使植物油脂增加；VOC通过抑制ATGL的表达从而减弱油脂的降低。
1 / 1广东深圳高级中学2025-2026学年第二学期期中测试题 高二生物
1．藿香是一种重要的中草药，《本草纲目》记载“豆叶曰藿，其叶似之，而草味芳香，故名藿香”。科研人员利用藿香的叶片为外植体进行培养，过程如图所示。下列说法错误的是（　　）
A．①过程对外植体消毒时先用酒精处理，再用无菌水冲洗后用次氯酸钠处理
B．用射线处理愈伤组织细胞后，通过筛选可能获得具有优良性状的突变体
C．诱导生芽和生根阶段，可通过调整植物激素比例实现不同发育方向
D．过程②需要光照培养以促进愈伤组织的形成
【答案】D
【知识点】植物组织培养的过程；组织培养基的成分及作用；植物组织培养的影响因素
【解析】【解答】A、植物组织培养需严格无菌操作。对外植体消毒时，通常先用70%酒精进行表面杀菌，随后用无菌水漂洗以去除残留酒精，再用次氯酸钠溶液进一步灭菌，最后用无菌水多次冲洗干净，A正确；
B、愈伤组织细胞处于持续分裂状态，代谢活跃，经射线照射后易诱发基因突变，因此从中筛选可能获得带有有益性状的突变体，这是植物诱变育种的常见途径，B正确；
C、在组织培养的诱导生芽或生根阶段，主要通过调节生长素和细胞分裂素的比例来决定分化方向——细胞分裂素相对含量较高时促进芽的分化，生长素相对含量较高时利于根的形成，C正确；
D、过程②为诱导外植体形成愈伤组织，此阶段通常要求在暗培养条件下进行，因为光照会促使细胞提前分化，不利于愈伤组织的诱导和增殖，D错误。
故答案为：D
【分析】1、植物组织培养要求全程无菌，外植体（如藿香叶片）表面携带微生物，需进行表面消毒。标准流程为：酒精（70%左右）：短时浸泡，杀灭表面部分微生物，同时使外植体表面湿润，利于后续消毒剂渗透；无菌水冲洗：去除残留酒精，避免酒精对外植体细胞造成伤害；次氯酸钠溶液（或升汞）：进一步深度灭菌，杀死顽固的细菌和真菌孢子；无菌水多次冲洗：彻底清除消毒剂残留，保护外植体活力。
2、在组织培养中，生长素和细胞分裂素的浓度比值是决定器官分化的关键：生长素比例高 → 促进生根；细胞分裂素比例高 → 促进生芽；两者比例适中 → 维持愈伤组织持续增殖而不分化。
2．下列有关动物细胞培养的叙述，错误的是（　　）
A．定期更换培养液可以防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害
B．培养箱气体环境为，的作用是维持培养液的
C．使用合成培养基时，应加入动物的血清等一些天然成分
D．部分细胞能够悬浮在培养液中生长增殖
【答案】B
【知识点】动物细胞培养技术
【解析】【解答】A、培养过程中定期更换培养液，既能补充被消耗的营养物质，又能及时移除细胞代谢产生的废物，从而避免有害代谢产物积累对细胞正常活动造成不利影响，A正确；
B、动物细胞培养箱内通常供应95%空气和5%CO2的混合气体，其中CO2用于维持培养液的酸碱度（pH）稳定，而空气提供细胞有氧呼吸所需的氧气，并非95%的高浓度O2（过高浓度氧气反而会对细胞产生损伤），B错误；
C、目前商品化的合成培养基成分尚不全面，无法完全替代天然环境，因此在实际培养中需要添加适量动物血清等天然成分，以提供细胞生长所必需的各种未知因子和激素，C正确；
D、动物细胞在体外培养时，多数细胞类型需要贴附于支持物表面才能生长（贴壁生长），但也有一些细胞（如悬浮型细胞系或某些血液来源的细胞）能够直接在培养液中呈悬浮状态进行增殖，D正确。
故答案为：B
【分析】1、动物细胞在体外培养过程中，会不断消耗培养基中的葡萄糖、氨基酸等营养物质，同时分泌乳酸、氨等代谢废物。若这些废物累积过多，会改变培养液的渗透压和pH，并对细胞产生毒性作用。定期更换培养液既能补充新鲜养分，又能及时清除有害代谢物，是维持细胞持续健康增殖的基本操作。
2、动物细胞培养箱的气体组成通常为 95%空气 + 5% CO2，空气中的氧气（约21%）：为细胞有氧呼吸提供电子受体，满足能量代谢需求；CO2（5%）：与培养液中的碳酸氢盐缓冲系统共同作用，维持培养液 pH在7.2~7.4 左右，避免因细胞代谢产酸导致环境过酸。
3、动物细胞体外培养主要有两种生长模式：贴壁生长（大多数正常细胞，如成纤维细胞、上皮细胞）：需附着于培养瓶壁或微载体表面，依赖细胞外基质和贴附因子；悬浮生长（部分转化细胞系、杂交瘤细胞、血液来源的淋巴细胞等）：不需要附着表面，可直接在培养液中分散生长并增殖。两者均属于正常的培养类型，并非所有动物细胞都必须贴壁。
3．猪繁殖与呼吸综合征是一种由P病毒引发的传染病。为诊断和治疗猪繁殖与呼吸综合征，科学家制备出抗P—GP3蛋白的单克隆抗体，制备过程如图所示，图中sp20 细胞是小鼠的骨髓瘤细胞。下列说法正确的是（　　）
A．对小鼠注射GP3蛋白的目的是获得抗GP3蛋白抗体
B．经第一次筛选获得的杂交瘤细胞能无限增殖但分泌抗体类型不一定相同
C．最后一步是将抗体检测为阴性的杂交瘤细胞进行扩大培养，以便获取大量的单克隆抗体
D．细胞丁只能注射到小鼠腹腔内培养，从而获得抗P—GP3蛋白单克隆抗体
【答案】B
【知识点】单克隆抗体的制备过程
【解析】【解答】A、向小鼠体内注射GP3蛋白（作为抗原）是为了激发小鼠的免疫应答，从而获得能够产生抗GP3蛋白抗体的B淋巴细胞（即浆细胞），并非直接获取抗体本身，A错误；
B、第一次筛选只是从融合细胞中选出杂交瘤细胞（具备无限增殖能力），但这些杂交瘤细胞可能来源于不同的B细胞克隆，所分泌的抗体类型和特异性未必一致，因此还需通过后续筛选（如克隆化培养和抗体检测）获得单一目标细胞株，B正确；
C、最终应挑选抗体检测结果为阳性（即能分泌针对GP3蛋白的目标抗体）的杂交瘤细胞进行扩大培养，若结果为阴性则说明不产生所需抗体，不符合要求，C错误；
D、杂交瘤细胞（细胞丁）既可以在体外培养液中扩大培养，也可以注射到小鼠腹腔内进行体内培养，并非只有注射到腹腔这一种途径，D错误。
故答案为：B
【分析】1、单克隆抗体制备的第一步是将特定抗原（如本题中的GP3蛋白）注射到小鼠体内。其目的是激发小鼠的体液免疫，使小鼠脾脏中的B淋巴细胞（浆细胞）被特异性激活并增殖，这些B细胞能够分泌针对该抗原的抗体。注射抗原获得的不是抗体本身，而是能产生抗体的B淋巴细胞，后续需将这些B细胞与骨髓瘤细胞融合才能大量生产单克隆抗体。
2、获得目标杂交瘤细胞株后，可通过两种方式大量生产单克隆抗体：（1）体外培养：在细胞培养瓶或生物反应器中用合成培养基培养，从培养上清中收集抗体；（2）体内培养（小鼠腹腔）：将杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔内，利用小鼠腹水大量增殖，从腹水中提取高浓度抗体。
4．为了保护粤东黑猪的遗传资源，下图为体细胞核移植的部分操作流程，有关分析正确的是（　　）
A．直接将取自小耳花猪卵巢的卵母细胞用作受体细胞
B．还可用梯度离心、紫外线照射或载体去除卵母细胞的核
C．用粤东黑猪胚胎细胞进行核移植难度更低，因其表现全能性相对容易
D．仔猪的性别由粤东黑猪和小耳花猪提供的遗传物质共同决定，与杜洛克母猪无关
【答案】C
【知识点】动物细胞核移植技术
【解析】【解答】A、在体细胞核移植中，作为受体细胞的卵母细胞必须培养至减数第二次分裂中期（MⅡ期）才具备支持胚胎发育的能力，并非直接取自卵巢即可使用，A错误；
B、去除卵母细胞细胞核的常用方法是显微操作法，此外也可采用梯度离心、紫外线短时照射或化学物质处理等去核手段；但Ca2+载体通常用于激活重构胚（促进融合后的胚胎启动分裂），不属于去核方法，B错误；
C、胚胎细胞的分化程度较低，其细胞核的全能性较易表现，因此以粤东黑猪的胚胎细胞作为供核细胞进行核移植，相对于体细胞操作难度更小、成功率更高，C正确；
D、仔猪的遗传性状主要取决于细胞核中的遗传物质，而细胞核来自粤东黑猪，因此仔猪的性别等核遗传特征由粤东黑猪决定；小耳花猪仅提供去核卵母细胞的细胞质（含少量线粒体DNA），其遗传物质不影响性别决定，杜洛克母猪仅作为代孕母体，不提供遗传物质，D错误。
故答案为：C
【分析】1、在核移植中，通常选用处于减数第二次分裂中期（MⅡ期）的卵母细胞作为受体细胞。原因是此时期的卵母细胞细胞质中含有大量成熟促进因子（MPF）等物质，能够支持供体细胞核发生重编程（即恢复全能性），并启动胚胎分裂发育。直接从卵巢取出的卵母细胞尚未成熟，不具备支持发育的能力，需要在体外培养至MⅡ期才能使用。
2、去除卵母细胞原有细胞核（即去核）是核移植的关键步骤之一，常用方法有：（1）显微操作法（最常用）：在显微镜下用显微吸管吸出细胞核及周围少量细胞质（即第一极体和部分胞质）；（2）梯度离心法：利用密度梯度离心使细胞核移位或排出；（3）紫外线短时照射：破坏卵母细胞核DNA，使其丧失功能；（4）化学物质处理（如放线菌酮等）也可辅助去核。Ca2+载体（如离子霉素）通常用于激活重构胚——即电融合或化学融合后，用Ca2+载体模拟受精时精子引起的钙震荡，启动胚胎发育，不属于去核方法。
3、克隆动物的核遗传物质（包括决定性别的性染色体）全部来自供核细胞，因此：性别由供核动物（粤东黑猪）的性染色体组成（XX或XY）决定；受体卵母细胞（来自小耳花猪）仅提供细胞质中的线粒体DNA（胞质遗传），不参与核遗传性状（包括性别）的调控；代孕母体（杜洛克母猪）只提供妊娠环境（子宫），不提供任何遗传物质，仅负责胚胎的发育和分娩，不影响后代遗传组成。
5．胚胎工程的许多技术，实际上是在体外条件下，对动物的自然受精和早期胚胎发育条件进行的模拟操作。因此，了解哺乳动物受精和早期胚胎发育规律十分重要。下列有关描述错误的是（　　）
A．精子入卵后，卵细胞膜会发生反应阻止其他精子入卵
B．胚胎发育早期，细胞数量不断增加，但胚胎总体积并不增加
C．在囊胚阶段，胚胎的内部开始出现含有液体的腔，称为囊胚腔
D．自然条件下，哺乳动物的受精过程和早期胚胎发育都是在子宫内完成的
【答案】D
【知识点】精子、卵子的发生和体内受精；动物胚胎发育的过程
【解析】【解答】A、当精子进入卵细胞后，卵细胞膜会迅速发生结构变化（即卵细胞膜反应），形成阻止多精入卵的第二道屏障，从而保证只有一个精子能与卵子完成受精，A正确；
B、在胚胎发育早期的卵裂阶段，受精卵通过连续的有丝分裂使细胞数目成倍增加，但分裂产生的子细胞体积逐渐变小，因此胚胎的总体积基本保持不变（甚至略有减小），并不增大，B正确；
C、发育至囊胚时期时，胚胎内部细胞间开始出现一个充满液体的腔隙，这个结构被称为囊胚腔，标志着胚胎已进入囊胚阶段，C正确；
D、在自然生理条件下，哺乳动物的受精过程发生在雌性生殖道的输卵管部位，而非子宫；同时，受精卵早期分裂和发育（从受精卵到桑椹胚乃至早期囊胚）也主要在输卵管内进行，之后才逐渐移入子宫并完成着床，并非全程都在子宫内完成，D错误。
故答案为：D
【分析】1、在受精过程中，当第一个精子进入卵细胞后，卵子会启动两种机制阻止其他精子进入：（1）透明带反应（第一道屏障）：精子触及透明带时，透明带结构发生变化，阻止其他精子穿越透明带；（2）卵细胞膜反应（第二道屏障）：精子入卵后，卵细胞膜立即发生电位和结构变化，阻止后续精子与卵细胞膜融合。
2、自然生理过程中，场所并非全部在子宫：（1）受精：发生在雌性生殖道的输卵管壶腹部（不是子宫）；（2）早期卵裂：受精卵在输卵管内进行分裂，发育至桑椹胚（约16~32细胞）阶段；（3）进入子宫：桑椹胚继续发育，进入囊胚阶段时，胚胎才从输卵管移至子宫，随后在子宫内进一步发育并进行着床（植入）。
6．亚洲黑熊在野外因栖息地丧失和人为捕猎几乎灭绝。科学家期望通过体外受精、动物体细胞核移植、胚胎移植等方法拯救亚洲黑熊，其过程如下图。下列关于该过程的说法正确的是（　　）
A．胚胎工程一般采用促性腺激素释放激素处理A使其超数排卵
B．E后代遗传性状与A和C完全一致，F后代遗传性状与B完全一致
C．若过程①表示体外受精过程，从C获得的精子可直接受精
D．A排出的卵母细胞体外培养到MⅡ期时，才具备与精子受精的能力
【答案】D
【知识点】动物体细胞克隆；体外受精
【解析】【解答】A、在胚胎工程中，为获得较多卵母细胞，通常使用促性腺激素（如孕马血清促性腺激素PMSG或人绒毛膜促性腺激素hCG）处理供体母畜以实现超数排卵，而非使用促性腺激素释放激素（GnRH），后者主要作用于垂体调控自身促性腺激素的分泌，一般不直接用于超排处理，A错误；
B、E后代由A的卵细胞与C的精子体外受精发育而来，其核遗传物质一半来自A、一半来自C，因此遗传性状与A和C均相关，并非完全与A和C一致；F后代是核移植产物，核遗传物质主要来自B（供核个体），细胞质中少量线粒体DNA来自A（卵母细胞供体），因此F的多数性状与B相同，但部分胞质遗传性状与A有关，并非完全与B一致，B错误；
C、若过程①表示体外受精，则从C获得的精子在自然状态下尚未获得受精能力，必须在体外进行获能处理（如使用化学物质或培养液使其膜发生变化）后，才能与卵母细胞结合完成受精，C错误；
D、由A经超数排卵获得的卵母细胞在刚排出时尚未成熟，需在体外培养至减数第二次分裂中期（MⅡ期），此时卵细胞才具备完整的受精能力，可与经过获能处理的精子进行体外受精，D正确。
故答案为：D
【分析】1、在胚胎工程中，为了从供体母畜（如图中A）获得多枚卵母细胞，通常使用促性腺激素进行处理。这类激素能直接作用于卵巢，促进多个卵泡同时发育成熟并排卵。促性腺激素释放激素是由下丘脑分泌的，主要作用于垂体，促使垂体释放促性腺激素，但其作用间接且缓慢，一般不直接用于超数排卵处理。
2、哺乳动物的精子在刚采集时（如从附睾或射精获得）尚未具备受精能力，需要在体外进行获能处理——即精子在特定培养液（含Ca2+、HCO3-、血清白蛋白等）中孵育，使其质膜发生去能因子去除、膜流动性改变等生理变化，从而获得穿透卵丘细胞和透明带的能力。未经获能的精子无法完成受精。
7．同尾酶指一组识别序列不同，但切出的黏性末端相同的限制酶。图1是EcoRⅠ、BamHⅠ、BglⅡ、和MboⅠ四种限制酶的识别序列及酶切位点，图2表示构建基因表达载体时的某种质粒和目的基因，限制酶Ⅰ的识别序列和酶切位点是-G↓GATCC-，限制酶Ⅱ的识别序列和酶切位点是-↓GATC-。下列说法正确的是（　　）
A．EcoRⅠ切割双链DNA分子时不具有特异性
B．用DNA连接酶将BamHⅠ和MboⅠ形成的黏性末端连接后，可被MboⅠ重新切开
C．选用两种不同的限制酶切割质粒，都可以防止质粒自连
D．由图2可知，最好选用限制酶Ⅱ切割质粒、限制酶Ⅰ切割目的基因
【答案】B
【知识点】基因工程的基本工具（详细）
【解析】【解答】A、限制酶具有专一性，能够识别双链DNA中特定的碱基序列并在特定位点进行切割，EcoRⅠ也不例外，其切割作用同样具有特异性，A错误；
B、BamHⅠ和MboⅠ虽然识别序列不同，但二者切割后露出的黏性末端均为相同的-GATC-单链序列，因此可以用DNA连接酶将这两个末端连接。连接后形成的序列依然包含-GATC-，仍能被MboⅠ识别并切开，B正确；
C、若选用的两种限制酶属于同尾酶（即切出相同黏性末端），则二者切割质粒后产生的末端可以互相退火连接，质粒仍可能发生自身环化。因此并非任何两种不同的限制酶切割都能有效防止质粒自连，C错误；
D、由图2可知，质粒上含有限制酶Ⅱ的识别序列-GATC-，而该序列也存在于Gene Ⅰ和Gene Ⅱ内部。若用限制酶Ⅱ切割质粒，会同时切断质粒上的两个标记基因，破坏其完整结构；而限制酶Ⅰ的识别序列-GGATCC-仅出现在目的基因两端而不影响质粒关键元件，因此更合理的选择是用限制酶Ⅰ切割质粒和目的基因（或分别切割），而非题述方式，D错误。
故答案为：B
【分析】1、限制酶是一类能识别双链DNA中特定回文序列并在特定位点切割磷酸二酯键的酶。每种限制酶都有自己独特的识别序列和切割位点，例如：EcoRⅠ：识别 -GAATTC-，在G与A之间切割；BamHⅠ：识别 -GGATCC-，在G与G之间切割；BglⅡ：识别 -AGATCT-，在A与G之间切割；MboⅠ：识别 -GATC-，在G与A之间切割。
2、同尾酶：指识别序列不同，但切割后产生的黏性末端碱基序列相同的一组限制酶。
3、为了防止质粒载体自身环化（自连），通常采用两种不同的限制酶切割质粒，使其产生两个不同的黏性末端，这样两端无法互相连接，只能与外源目的基因的对应末端连接，从而提高重组效率。
4、在构建基因表达载体时，选择限制酶位点需遵循两个基本原则：目的基因两端应有该酶的识别序列（便于完整切割下目的基因）；质粒上的该酶识别位点不应位于启动子、终止子、标记基因（如抗性基因）等关键元件内部，否则会破坏其功能。
8．戊型肝炎病毒是一种RNA病毒，ORF2基因编码的结构蛋白(pORF2)位于病毒表面，构成病毒的衣壳。我国科研人员利用基因工程技术，在大肠杆菌中表达pORF2，制备戊型肝炎疫苗，过程如图。下列关于该疫苗的叙述，正确的是（　　）
A．过程①需要的酶是RNA聚合酶，原料是A、U、G、C
B．过程①的产物和③必须用同种限制酶切割
C．过程⑤是将Ti质粒导入大肠杆菌
D．过程⑥大量制备pORF2蛋白前应做相应的检测与鉴定
【答案】D
【知识点】基因工程的基本工具（详细）；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】A、过程①是以戊型肝炎病毒的RNA为模板来合成DNA，这一过程属于逆转录，所需的酶是逆转录酶，原料应为四种脱氧核糖核苷酸（dA、dT、dG、dC），而非核糖核苷酸（A、U、G、C），A错误；
B、过程①获得的产物（目的基因）与过程③涉及的质粒在切割时，不一定要使用同一种限制酶，只要两种限制酶切割后产生相同的黏性末端（即同尾酶），同样可以实现有效连接，B错误；
C、过程⑤是将构建好的重组基因表达载体导入大肠杆菌中，此处使用的载体是适用于大肠杆菌的表达载体（如pET系列等），并非Ti质粒——Ti质粒主要应用于农杆菌介导的植物遗传转化，C错误；
D、过程⑥在进行大规模培养和诱导表达pORF2蛋白之前，必须对转化后的大肠杆菌进行筛选和鉴定，确保其携带重组质粒并能正确表达目标蛋白，之后再扩大培养以大量制备pORF2蛋白，D正确。
故答案为：D
【分析】1、戊型肝炎病毒是RNA病毒，其遗传物质为RNA。要从病毒RNA中获得编码pORF2蛋白的ORF2基因，需要先以病毒RNA为模板，通过逆转录合成互补的DNA（cDNA）。所需酶：逆转录酶（又称反转录酶）；原料：四种脱氧核糖核苷酸（dATP、dTTP、dGTP、dCTP）。
2、在基因工程中，将目的基因与载体连接时，不一定非要用同一种限制酶切割。如果两种限制酶识别序列不同但切割后产生相同的黏性末端（即同尾酶），同样可以通过DNA连接酶将二者连接起来。
3、将重组DNA分子导入受体细胞时，需要根据宿主类型选择合适的载体：大肠杆菌作为受体细胞时，常用质粒载体（如pBR322、pET系列等），这些质粒带有大肠杆菌适用的复制起点和筛选标记；Ti质粒是农杆菌中的一种质粒，主要用于植物转基因，可将目的基因整合到植物染色体上，不适用于大肠杆菌转化。
9．我国科学家将含有人凝血因子基因的DNA片段注射到羊的受精卵中，由该受精卵发育而成的羊分泌的乳汁中含有人的凝血因子，可以治疗血友病。下列叙述正确的是（　　）
A．凝血因子基因应与凝血因子基因的启动子重组在一起
B．该羊分泌的乳汁中含有人的凝血因子基因
C．该受精卵发育成的羊必须是雌性
D．这项研究体现了基因工程在改善畜产品品质方面的应用
【答案】C
【知识点】基因工程的应用
【解析】【解答】A、若要使人凝血因子基因在羊的乳腺细胞中成功表达，需要将该基因与羊乳腺蛋白基因的启动子等调控元件重组在一起，利用乳腺特异性启动子驱动其表达，而非使用该基因自身的启动子，A错误；
B、人凝血因子基因作为外源DNA已整合到该羊的体细胞核基因组中，但在其分泌的乳汁中仅含有人凝血因子蛋白（基因表达的产物），并不含凝血因子基因本身，B错误；
C、只有雌性个体具备发育完全的乳腺并在泌乳期能分泌乳汁，因此由该受精卵发育而成的羊必须是雌性，才能通过乳汁获得含有人凝血因子的产物，C正确；
D、该实例属于利用转基因动物作为“生物反应器”来生产药用蛋白（人凝血因子），用以治疗疾病，属于基因工程在生产药物方面的应用，而非用于改善畜产品品质（如提高瘦肉率、改善肉质等），D错误。
故答案为：C
【分析】1、要让目的基因（如人凝血因子基因）在羊的乳腺细胞中特异性表达（即只在乳腺中产生蛋白，并随乳汁分泌），不能使用目的基因自身的启动子，而必须使用乳腺蛋白基因的启动子（如羊β-酪蛋白基因启动子）。该启动子具有组织特异性，能驱动下游基因在乳腺细胞中高效转录，而在其他组织中不表达。
2、乳腺生物反应器依赖于哺乳动物雌性个体的泌乳能力。只有雌性个体在性成熟并经历妊娠或激素诱导后，乳腺才能发育并分泌乳汁。
10．干扰素是动物体内合成的一种糖蛋白，体外很难保存。如果将干扰素分子上的一个半胱氨酸(密码子：UGU、UGC)变成丝氨酸(密码子：UCU、UCC、UCA、UCG)，就可以延长干扰素的体外保存时间。下列相关叙述，正确的是（　　）
A．干扰素是干扰细菌复制的糖蛋白，被广泛应用于治疗细菌感染性疾病
B．对天然干扰素的改造可通过对干扰素基因进行定点突变来实现
C．替换后的干扰素仍能发挥作用，说明其结构未改变
D．将新的干扰素基因导入大肠杆菌体内，正常表达即可得到预期的新的干扰素
【答案】B
【知识点】蛋白质分子的化学结构和空间结构；蛋白质工程
【解析】【解答】A、干扰素属于动物体内产生的免疫活性物质，主要作用是抑制病毒增殖，并不具备抑制细菌复制的能力，因此不能用于治疗细菌感染性疾病，A错误；
B、要对天然干扰素进行定向改造，实质上是对其蛋白质结构进行设计，而蛋白质的氨基酸序列由基因的碱基序列决定，因此可通过基因的定点突变技术，改变编码半胱氨酸的密码子（UGU/UGC）为编码丝氨酸的密码子（UCU/UCC/UCA/UCG），从而实现对干扰素分子的改造，这属于蛋白质工程的核心思路，B正确；
C、将半胱氨酸替换为丝氨酸后，干扰素的氨基酸序列已发生改变，其一级结构（氨基酸排列顺序）乃至高级结构均可能变化，之所以仍能发挥作用，是因为其活性中心或功能构象未被破坏，而不是其结构未发生任何改变，C错误；
D、天然干扰素是一种糖蛋白，其成熟过程中需要在内质网和高尔基体中进行糖基化修饰，而大肠杆菌是原核生物，缺乏这些细胞器，无法对表达出的蛋白质进行糖基化加工，因此即便将新干扰素基因导入大肠杆菌，也无法获得具有完整糖基化结构的、有活性的预期干扰素，D错误。
故答案为：B
【分析】1、干扰素是动物体细胞在受到病毒等刺激后产生的一类具有抗病毒活性的糖蛋白。其主要作用机制是：与靶细胞表面的受体结合，诱导细胞合成多种抗病毒蛋白，从而抑制病毒的复制和扩散。
2、蛋白质工程的目标是改造天然蛋白质，使其具有更优的性能（如稳定性更高、活性更强等）。其基本途径是：预期功能 → 设计蛋白质结构 → 推测氨基酸序列 → 确定基因碱基序列 → 对基因进行改造→ 表达获得新蛋白质
11．某同学经“研磨→过滤→离心→析出→鉴定”步骤，提取花菜DNA并鉴定。相关叙述正确的是
A．该同学也可选择猪血中成熟的红细胞、香蕉为实验材料提取DNA，但方法可能有所不同
B．向含有DNA的粗提取液加入体积分数为95%的冷酒精后搅拌几分钟后过滤，DNA主要存在于滤液中
C．用玻璃棒沿一个方向快速搅拌卷起丝状物，可提高DNA的提取量
D．在溶有DNA的NaCl溶液中加入二苯胺试剂，沸水浴冷却后呈蓝色，设置对照组用来排除二苯胺受热变蓝的可能
【答案】D
【知识点】DNA的粗提取和鉴定
【解析】【解答】A、猪属于哺乳动物，其成熟红细胞无细胞核和线粒体等含DNA的细胞器，因此几乎不含DNA，不适合用作提取DNA的实验材料；香蕉为植物材料，细胞含细胞核，理论上可用，但哺乳动物成熟红细胞则不能，A错误；
B、DNA在体积分数为95%的冷酒精中溶解度很低，加入冷酒精后DNA会以白色丝状沉淀物形式析出，因此DNA主要存在于沉淀物（或滤渣）中，而非滤液中，B错误；
C、用玻璃棒卷起析出的DNA丝状物时应缓慢沿一个方向搅拌，以便将絮状DNA缠绕成较完整的团块；若快速搅拌则会打碎DNA丝状物，不利于收集，反而会降低获得量，C错误；
D、DNA在沸水浴条件下可与二苯胺试剂反应生成蓝色物质，为验证该蓝色确实来自DNA与二苯胺的反应，需设置对照组（如用等量蒸馏水代替DNA溶液，其他处理完全相同），以排除二苯胺试剂本身在加热过程中变蓝的可能性，从而确保实验结果的可靠性，D正确。
故答案为：D
【分析】1、提取DNA应选用DNA含量较高、组织细胞数目多的材料。常用植物材料：花菜、香蕉、洋葱、菠菜等，其细胞含有细胞核（含DNA）；动物材料：哺乳动物成熟红细胞（如猪血红细胞）没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA，不适合作为提取DNA的材料；而鸡血红细胞（鸟类）有细胞核，含大量DNA，是常用动物材料。
2、DNA在2 mol/L NaCl溶液中溶解度较大，在体积分数为95%的冷酒精中溶解度很低。
3、当DNA从冷酒精中析出时，呈细丝状、絮状。用玻璃棒沿一个方向缓慢搅拌，可以将这些絮状DNA缠绕在玻璃棒上，便于收集。
4、DNA在沸水浴条件下与二苯胺试剂反应，生成蓝色化合物，据此可鉴定DNA的存在。
12．蛛丝有超强韧性，将蛛丝蛋白基因转入羊的乳腺中可以生产蛛丝蛋白。图a是蛛丝蛋白基因的DNA片段；利用PCR技术对蛛丝蛋白基因进行检测，电泳结果如图b，其中1号来自普通羊，2号来自含蛛丝蛋白基因的质粒，其余来自转基因羊。下列叙述正确的是（　　）
A．用PCR技术扩增图中的蛛丝蛋白基因，可选择图中的引物①和④
B．电泳鉴定DNA利用了DNA在电场中会向着它所带电荷相同的电极移动的原理
C．在凝胶中DNA分子的迁移速率与DNA分子的大小呈正相关
D．使用抗原-抗体结合法可能在3、5、8号羊的乳汁中检测到蛛丝蛋白
【答案】D
【知识点】PCR技术的基本操作和应用；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】A、根据图示，DNA双链中磷酸基团端为5'端，羟基端为3'端。PCR扩增时，DNA聚合酶只能从引物的3'端开始沿着模板链的5'→3'方向延伸子链，因此引物需要与模板链的3'端区域互补结合。分析可知，应选用引物②和引物③，而非①和④，A错误；
B、电泳时，DNA分子的磷酸基团使其整体带负电荷，在电场中会向正极（阳极）方向迁移，即向与其所带电荷相反的电极移动，而非向相同电荷的电极移动，B错误；
C、在琼脂糖凝胶电泳中，DNA分子的迁移速率与其分子大小呈负相关——分子越小的片段在凝胶中受到的阻力越小，泳动速度越快，移动距离越远；分子越大的片段则移动越慢，C错误；
D、由图b电泳结果可知，3、5、8号羊的条带位置与2号（含蛛丝蛋白基因的质粒对照）一致，说明这3只羊体内成功整合了蛛丝蛋白基因。若该基因在羊的乳腺细胞中成功表达，则其乳汁中应含有蛛丝蛋白，因此可用抗原-抗体杂交（如Western blot或ELISA）在乳汁中进行检测，D正确。
故答案为：D
【分析】1、PCR扩增时，DNA聚合酶只能从引物的3'端开始，沿模板链的5'→3'方向延伸子链。因此：上游引物：应与模板链（通常为编码链）的5'端附近序列互补，其3'端指向待扩增区域的起点；下游引物：应与另一条模板链的5'端附近序列互补，其3'端指向待扩增区域的终点。
2、DNA分子中的磷酸基团在溶液中带负电荷。在琼脂糖凝胶电泳中，DNA在电场作用下会向正极（阳极）移动，即向与自身电荷相反的电极迁移（正负相吸）。
3、在凝胶电泳中，DNA分子的迁移速率主要取决于分子大小和凝胶浓度：分子越小，在凝胶孔隙中受到的阻力越小，迁移越快，跑得越远；分子越大，受到的阻力越大，迁移越慢，跑得越近。
13．紫杉醇是存在于红豆杉属植物体内具有高抗癌活性的物质，但从红豆杉中提取产量很低。科学家利用不同技术获得高产紫杉醇，获取途径如图所示。下列叙述正确的是（　　）
方法一 将紫杉醇合成的关键酶基因转入红豆杉体细胞 通过植物组织培养技术获得高产植株
方法二 将紫杉醇合成的关键酶基因转入大肠杆菌 利用微生物发酵技术生产紫杉醇前体
方法三 对红豆杉愈伤组织利用CRISPR/Cas9进行基因编辑改造 直接从培养物中提取紫杉醇
A．方法一和方法三都利用了植物细胞的全能性
B．方法二相较于方法一，可以通过发酵工程快速生产有生物活性的紫杉醇，大幅降低生产成本
C．方法三相较于方法一，能通过调控培养条件提高紫杉醇产量，不受植株培育的周期、季节的限制
D．方法一和方法三中，原生质体制备需用纤维素酶和果胶酶处理，应在低渗溶液中完成以维持细胞形态
【答案】C
【知识点】植物体细胞杂交的过程及应用；植物细胞工程的应用
【解析】【解答】A、方法一最终通过植物组织培养获得了完整的转基因植株，体现了植物细胞的全能性；而方法三只是对愈伤组织进行基因编辑并直接培养以提取紫杉醇，并未再生出完整植株，因此未体现细胞全能性，A错误；
B、方法二将关键酶基因导入大肠杆菌，但大肠杆菌为原核生物，缺乏内质网和高尔基体等细胞器，无法对表达出的酶进行必要的加工修饰，因此只能生产紫杉醇的合成前体，而不能直接获得具有生物活性的紫杉醇，B错误；
C、方法三利用愈伤组织在培养条件下直接生产紫杉醇，属于植物细胞工厂化生产途径，可以通过调节培养液中的营养成分、激素浓度、温度、光照及pH等环境因素来优化产量，且无需经历植物生长周期，不受季节和地域限制，C正确；
D、制备原生质体时需用纤维素酶和果胶酶去除细胞壁，但去除细胞壁后的原生质体无细胞壁保护，若置于低渗溶液中会因吸水过多而涨破，因此应在等渗或适当高渗溶液中完成操作，以维持其正常形态和活性，D错误。
故答案为：C
【分析】1、细胞全能性是指已经分化的细胞具有发育成完整有机体的潜能。其判断标准是：是否由单个或一团细胞经培养再生出完整的植株。
2、紫杉醇的合成涉及一系列酶促反应，其中部分关键酶需要经过内质网和高尔基体的加工修饰（如糖基化、折叠等）才能获得活性。大肠杆菌作为原核生物，细胞内缺乏内质网、高尔基体等膜性细胞器，不具备对真核来源的酶进行翻译后加工的能力。因此，即使将紫杉醇合成相关酶基因导入大肠杆菌，也只能生产出紫杉醇的前体物质，无法直接获得具有完整生物活性的紫杉醇。
3、制备原生质体时，需用纤维素酶和果胶酶去除植物细胞壁。去除细胞壁后的原生质体仅由细胞膜包裹，无细胞壁保护，对渗透压非常敏感。若置于低渗溶液中，细胞外水分会大量进入细胞内，导致原生质体吸水涨破。
14．噬菌体展示技术是将编码噬菌体表面蛋白的基因与外源肽段基因融合，使外源蛋白/肽段展示在噬菌体表面的筛选技术。下图是利用该技术制备人丙型肝炎病毒(HCV)单克隆抗体的流程。下列有关叙述正确的是（　　）
注：抗体重链可变区(VH)基因和轻链可变区(VL)基因连接获得单链抗体(scFv)基因
A．逆转录合成cDNA的过程，需要加入总RNA、逆转录酶和四种游离的核糖核苷酸
B．重组噬菌体侵染大肠杆菌时，应该使用处理使大肠杆菌处于吸收DNA分子的状态
C．专一抗体检验利用的原理是抗原和抗体的特异性结合
D．该技术产生的单克隆抗体可以直接用于人体疾病治疗，没有免疫排斥风险
【答案】C
【知识点】噬菌体侵染细菌实验；单克隆抗体的制备过程
【解析】【解答】A、逆转录过程是以RNA为模板合成互补DNA（cDNA），所需的原料应为四种脱氧核糖核苷酸（dATP、dTTP、dGTP、dCTP），而非核糖核苷酸，A错误；
B、重组噬菌体侵染大肠杆菌属于病毒感染过程，噬菌体通过其自身机制吸附并注入DNA，不需要像质粒转化那样用Ca2+处理使大肠杆菌处于感受态，B错误；
C、专一抗体检验的原理是抗原-抗体特异性结合——即让重组噬菌体表达的抗体与HCV抗原反应，若发生特异性结合则证明成功获得了抗HCV抗体，C正确；
D、利用噬菌体展示技术获得的抗体（如单链抗体scFv）尽管可能经过人源化处理，但作为外源蛋白进入人体后仍可能引发免疫反应，存在免疫排斥风险，通常还需进一步优化改造才能安全用于临床治疗，D错误。
故答案为：C
【分析】1、逆转录酶催化以RNA为模板合成DNA的过程。模板：总RNA（含目的mRNA）；酶：逆转录酶；原料：四种脱氧核糖核苷酸（dATP、dTTP、dGTP、dCTP），用于合成互补DNA（cDNA）。核糖核苷酸（A、U、G、C）是转录（RNA合成）的原料，而非逆转录的原料。
2、质粒转化：将裸露的DNA分子导入细菌（如大肠杆菌）时，通常需要用Ca2+处理细菌，使其细胞膜通透性增加，成为能摄取外源DNA的感受态细胞。噬菌体侵染：噬菌体是病毒，它通过其尾丝吸附于细菌表面，并注入自身的DNA，属于天然的感染过程，无需Ca2+处理即可完成侵染。
15．科研人员利用农杆菌转化法将含有目的基因(GUS基因，长度500 bp)的Ti质粒导入拟南芥，经筛选获得若干候选转基因植株。提取各植株的基因组DNA，利用目的基因特异性引物进行PCR扩增，并通过琼脂糖凝胶电泳检测产物。电泳结果如下图所示(M为DNA分子标准参照物，泳道1~4为待测植株样品)，下列叙述正确的是（　　）
A．泳道1对应的植株一定是纯合的转基因植株
B．泳道2对应的植株未成功转化，应直接丢弃
C．泳道3对应的植株中出现非特异性扩增片段的原因可能是引物与非目的序列有同源性
D．泳道4对应的植株中目的基因的表达量较低
【答案】C
【知识点】PCR技术的基本操作和应用
【解析】【解答】A、泳道1出现了与阳性对照一致的目的条带（500 bp），仅能说明该植株基因组中整合了目的基因，但无法区分是纯合子（两条同源染色体均携带目的基因）还是杂合子（仅一条携带），因此不能据此判断其为纯合植株，A错误；
B、泳道2未出现任何扩增条带，可能的原因包括未成功转化，也可能是PCR扩增体系失败、模板DNA质量差或操作失误所致，需要重新提取DNA并重复实验加以确认，不宜直接判定为转化失败并丢弃，B错误；
C、泳道3除500 bp的目标条带外，还出现了其他非预期大小的条带，这通常是由于引物与基因组中非目标区域的序列存在一定同源性，导致引物错误配对并引发非特异性扩增，C正确；
D、该实验是对基因组DNA进行PCR扩增，检测目的基因是否整合，属于DNA水平的鉴定，无法反映目的基因是否转录或翻译，因此不能得出“表达量低”的结论；泳道4条带较暗仅说明扩增产物量少，可能受模板量或PCR效率影响，D错误。
故答案为：C
【分析】PCR只能检测基因组中是否存在目的基因，而无法区分是纯合插入还是杂合插入。纯合子：两条同源染色体均携带目的基因；杂合子：仅一条同源染色体携带目的基因。两者提取的基因组DNA中均含有目的基因序列，PCR均能扩增出条带，且条带位置相同。要区分纯合与杂合，通常需要进行Southern杂交或子代遗传分离比分析，单靠PCR电泳无法判断。
16．某科研小组研究了苋菜叶绿体基因pbsA编码的D1蛋白在特定位点发生突变，可获得对除草剂的抗性，野生型品系和突变品系的部分DNA碱基序列和氨基酸位置，结果如表所示。下列叙述正确的是（　　）
野生型品系 CGA丙氨酸 AGT丝氨酸 AAG苯丙氨酸 TTA天冬氨酸
突变品系 CGT丙氨酸 GGT脯氨酸 AAG苯丙氨酸 TTA天冬氨酸
氨基酸位置 227 228 229 230
A．叶绿体基因主要随卵细胞传递，该抗除草剂性状不易通过花粉造成基因污染
B．碱基编辑仅改变pbsA基因的碱基排列顺序，不改变基因数量，不属于基因突变
C．若编辑后基因转录产物不变，仅翻译产物改变，说明编辑发生在内含子区段
D．若将该抗除草剂基因通过农杆菌转化法整合到苋菜核基因组，其遗传仍不遵循孟德尔定律
【答案】A
【知识点】基因的分离规律的实质及应用；基因的自由组合规律的实质及应用；基因突变的类型；转基因生物的安全性问题；遗传信息的翻译
【解析】【解答】A、叶绿体基因位于细胞质中，具有母系遗传的特点（因为受精卵的细胞质几乎全部来自卵细胞），精子的细胞质极少，因此该抗除草剂基因不会通过花粉扩散到近缘物种中，不易造成基因污染，A正确；
B、基因突变是指基因在结构上发生碱基对的替换、增添或缺失，从而导致基因碱基序列的改变。本题中碱基编辑使pbsA基因的碱基排列顺序发生了变化，虽然基因数量未变，但基因的分子结构已经改变，因此属于基因突变，B错误；
C、真核生物的基因包含外显子和内含子，内含子在转录后通过RNA剪接被去除，不参与蛋白质的翻译。若编辑发生在内含子区段，则成熟mRNA序列不会改变，翻译产物也不会变化；而题目中翻译产物发生了改变，说明编辑位点应位于编码蛋白质的外显子区段，C错误；
D、孟德尔遗传规律适用于真核生物细胞核中染色体上基因的遗传。若抗除草剂基因通过农杆菌转化法整合到苋菜的核基因组中，则该基因作为核基因，在减数分裂和受精过程中会遵循孟德尔分离定律和自由组合定律，D错误。
故答案为：A
【分析】1、叶绿体基因属于细胞质基因，位于细胞质中的叶绿体内。在高等植物的受精过程中：卵细胞含有大量的细胞质（含叶绿体、线粒体及其DNA）；精子（花粉）几乎只提供细胞核，细胞质极少，通常不携带叶绿体或线粒体。
2、基因突变是指基因在结构上发生碱基对的替换、增添或缺失，从而导致基因的碱基排列顺序（即遗传信息）发生改变。
3、真核生物的基因由外显子和内含子组成：（1）外显子：编码蛋白质的序列，在转录后保留在成熟mRNA中，参与翻译；（2）内含子：不编码蛋白质的间隔序列，在转录后通过RNA剪接被切除，不进入成熟mRNA。
4、孟德尔遗传规律（分离定律和自由组合定律）适用于真核生物细胞核中染色体上的基因在减数分裂和受精过程中的传递规律。
17．紫花苜蓿被誉为“牧草之王”，但易造成家畜鼓胀病；百脉根富含单宁，饲喂时可防止家畜鼓胀病的发生。研究人员设计了下列技术路线，以期获得抗鼓胀病的新型苜蓿。(注：IOA可抑制植物细胞呼吸第一阶段，R-6G可阻止线粒体的功能)
（1）据图可知，本研究主要利用的两个生物技术的原理分别是　 　、　 　。
（2）①过程的发生，必须进行人工诱导，人工诱导原生质体融合的化学法除聚乙二醇融合法外，还有　 　法等。其中只有异源融合体才能存活和具有再生能力，请推测原因是　 　。
（3）百脉根富含单宁，单宁具有收敛止血、抗氧化、抗菌等作用被用于各类产品，若要通过　 　技术生产单宁，需将百脉根细胞培养到　 　阶段，再筛选出稳定高产单宁的细胞进行培养。
【答案】（1）细胞膜具有流动性；植物细胞具有全能性
（2）高高pH融合；异源融合的原生质体才能完整进行有氧呼吸的三个阶段，可恢复生长并获得再生能力
（3）植物细胞培养；愈伤组织
【知识点】植物体细胞杂交的过程及应用；细胞融合的方法；植物细胞工程的应用
【解析】【解答】（1）本流程首先通过原生质体融合将紫花苜蓿和百脉根的遗传物质组合在一起，这依赖细胞膜的流动性使两个原生质体融合为一个杂种细胞；之后再将杂种细胞培育成完整植株，这体现了植物细胞的全能性。因此两个生物技术的原理分别是细胞膜具有流动性和植物细胞具有全能性。
（2）①过程为原生质体融合，人工诱导的化学法除了聚乙二醇融合法外，还有高Ca2+—高pH融合法。实验中分别用IOA和R-6G处理两种原生质体：IOA抑制呼吸作用的第一阶段（糖酵解），R-6G阻止线粒体功能（阻碍有氧呼吸第二、三阶段）。因此，未融合的原生质体或同源融合体因呼吸链不完整，不能正常进行有氧呼吸而无法存活和再生；只有异源融合体同时获得了完整的细胞质和线粒体，能完整进行有氧呼吸的三个阶段，恢复生长并获得再生能力。
（3）若要利用细胞培养直接生产单宁，应选用植物细胞培养技术。该技术通常将植物材料培养至愈伤组织阶段，此时细胞分裂活跃且次生代谢产物合成能力较强，再从中筛选出稳定高产单宁的细胞系进行规模化培养，以获得单宁产品。
【分析】1、人工诱导融合的方法：（1）化学法：除了聚乙二醇（PEG）融合法，还有高Ca2+—高pH融合法，后者通过改变溶液中的钙离子浓度和pH值，促进原生质体膜融合。（2）物理法：电融合法、离心法等。
2、若要获得百脉根中的单宁（一种次生代谢产物），可采用植物细胞培养技术（又称细胞悬浮培养或愈伤组织培养）：首先将植物组织脱分化，诱导形成愈伤组织（一种未分化的细胞团）；愈伤组织细胞分裂旺盛，且具备合成次生代谢产物的能力；在愈伤组织阶段，通过筛选获得高产单宁的细胞系，再进行规模化液体培养，从培养基或细胞中提取单宁。该技术的优势是不需要培育完整植株，可人工控制培养条件，实现工业化连续生产。
（1）本研究用到了植物体细胞杂交技术和植物组织培养技术；植物体细胞杂交技术的原理是细胞膜具有流动性（原生质体融合的结构基础）；植物组织培养技术的原理是植物细胞的全能性（杂种细胞发育为完整植株的理论基础）。
（2）人工诱导原生质体融合的方法：化学法（聚乙二醇PEG和高Ca2+-高pH融合法）、物理法（电融合法、离心法等）； 用R-6G处理紫花苜蓿原生质体、IOA处理百脉根原生质体后，IOA可抑制植物细胞呼吸第一阶段，R-6G可阻止线粒体的功能（有氧呼吸第二和第三阶段），故原生质体及同源融合体不能再生愈伤组织（不能进行有氧呼吸），只有异源融合的原生质体才能完整进行有氧呼吸的三个阶段，可恢复生长并获得再生能力，因此能存活的就是异源融合体。
（3）要获得细胞的产物，要通过植物细胞培养技术生产单宁，需要将百脉根细胞培养到愈伤组织阶段，再筛选出稳定高产单宁的细胞进行培养。
18．如图1表示利用生物技术制备抗X的单克隆抗体的过程；图2表示体外受精培育优质奶牛的过程；请据图回答下面的问题。
（1）图1中注射到小鼠体内的物质是　 　。与植物原生质体融合相比，细胞A的形成过程中特有的诱导融合方法是　 　。
（2）科学家从某些无限增殖细胞的细胞质中分离出了无限增殖调控基因(prG)，该基因能激发动物细胞分裂。据此，为获得既能产生抗体又能无限增殖的细胞，请简要写出一种新思路　 　。
（3）图2优质奶牛的培育过程需要进行体外受精、早期胚胎培养和胚胎移植。胚胎移植后的胚胎能在受体子宫中存活，其生理基础是　 　。
（4）若要同时获得多头与此优质奶牛相同的小牛，可对图2所示囊胚阶段的胚胎进行　 　，操作过程需要特别注意的问题是　 　，否则会影响分割后胚胎的恢复和进一步发育。
【答案】（1）抗原X；灭活的病毒处理
（2）通过基因工程向浆细胞中导入prG或利用核移植技术将浆细胞的细胞核移植到去核的无限增殖细胞中
（3）受体子宫不会对移入的胚胎发生免疫排斥反应
（4）胚胎分割；注意将囊胚的内细胞团进行均等分割
【知识点】细胞融合的方法；单克隆抗体的制备过程；胚胎移植；胚胎分割
【解析】【解答】（1）图1中向小鼠体内注射的物质是抗原X，目的是激发小鼠的体液免疫，使其脾脏中产生能分泌抗X抗体的B淋巴细胞。在细胞融合环节，植物原生质体融合常用物理法（如离心法、电融合法）或化学法（如PEG融合法），而动物细胞融合（形成杂交瘤细胞）特有的诱导方法是灭活的病毒处理（如灭活的仙台病毒），该方法可促进动物细胞膜的融合。
（2）若要从无限增殖细胞中获得prG基因并赋予浆细胞无限增殖能力，思路有两种：（1）基因工程途径：将prG基因通过载体导入浆细胞中，使其获得无限增殖的特性；（2）核移植途径：将浆细胞的细胞核移植到去核的无限增殖细胞中，利用后者细胞质中的调控因子使重组细胞既能无限增殖又能分泌特定抗体。两种思路均能实现既能产生抗体又能无限增殖的目标。
（3）图2中胚胎移植后，受体子宫能接纳并维持外来胚胎的生长发育，其生理基础是受体子宫对移入的胚胎基本不发生免疫排斥反应，因此胚胎能在受体子宫中存活并完成发育。
（4）若想获得多头遗传组成相同的优质奶牛，可对图2中发育至囊胚阶段的胚胎进行胚胎分割。操作时需特别注意将囊胚的内细胞团均等分割，因为内细胞团将来发育为胎儿的各种组织，若分割不均，会导致部分胚胎发育不全或无法形成完整个体，从而影响分割后胚胎的恢复和进一步发育。
【分析】1、植物原生质体融合常用物理法（电融合、离心）或化学法（PEG融合、高Ca2+—高pH融合）；而动物细胞融合（如B细胞与骨髓瘤细胞融合）还可以使用灭活的仙台病毒等灭活病毒处理，病毒表面的糖蛋白能介导细胞膜融合，这是动物细胞融合特有的方式。
2、若要获得多个基因型相同的个体，可对发育至囊胚期的胚胎进行胚胎分割。操作原理：将囊胚的内细胞团（将来发育为胎儿）和滋养层细胞（将来发育为胎盘）分割成若干份，每一份均可发育为一个完整胚胎。关键注意事项：必须将内细胞团均等分割。因为内细胞团是胚胎发育成完整个体的基础，若分割不均匀，部分胚胎可能因细胞数不足而发育失败或形成发育不全个体，影响移植后的存活率和后代质量。
（1）图1是制备抗X的单克隆抗体的过程，注射到小鼠体内的物质是抗原X，目的是刺激小鼠产生能分泌抗X抗体的B淋巴细胞。植物原生质体融合的方法有物理法、化学法，动物细胞融合（细胞A是杂交瘤细胞）特有的诱导融合方法是灭活的病毒处理。
（2）根据题意，无限增殖调控基因（prG）能激发动物细胞分裂。 新思路：通过基因工程向浆细胞中导入prG或利用核移植技术将浆细胞的细胞核移植到去核的无限增殖细胞中，使其既能无限增殖又能产生抗体。
（3）胚胎移植后胚胎能在受体子宫中存活的生理基础是：受体子宫对外来胚胎基本不发生免疫排斥反应。
（4） 要同时获得多头与此优质奶牛相同的小牛，可对囊胚阶段的胚胎进行胚胎分割，可以获得多头基因型相同的小牛。操作时需要特别注意将内细胞团均等分割，否则会影响分割后胚胎的恢复和进一步发育。
19．水螅具备很强的再生能力，其大部分身体结构被破坏都能够复原，理论上可以无限再生，近乎永生。研究表明，水螅的再生能力依赖体内的Wnt基因。为了研究Wnt基因的作用机理和对小鼠成纤维细胞再生是否有促进作用，科学家利用基因工程和细胞工程技术做了以下实验。回答下列问题：
（1）获取Wnt基因的途径之一是：提取了水螅细胞全部DNA后，采用PCR技术扩增Wnt基因，该技术的原理是　 　。已知Wnt基因一条链两端的序列为5’-AATTGCGG-Wnt基因-TCGAAACT-3’，根据其两端序列，则需要选择的一对引物序列是　 　(填字母)。
A．引物I是5’-AATTGCGG-3’，引物Ⅱ是5’-TCGAAACT-3’
B．引物I是5’-AATTGCGG-3’，引物Ⅱ是5’-AGTTTCGA-3’
C．引物I是5’-CCGCAATT-3’，引物Ⅱ是5’-TCGAAACT-3’
D．引物I是5’-CCGCAATT-3’，引物Ⅱ是5’-AGTTTCGA-3’
（2）如图甲为获取的含有Wnt基因的DNA片段，为保证目的基因和质粒丙正确连接，在该实验中，切割含有目的基因DNA片段使用的限制酶为　 　，原因是　 　。
（3）若要验证Wnt基因在小鼠成纤维细胞再生中是否起到促进作用，可以将对小鼠成纤维细胞进行体外培养，需先用　 　处理使组织分散成单个细胞。实验组小鼠细胞注入含有Wnt基因的重组载体，对照组注入不含Wnt基因的空载体，实验结果显示实验组小鼠细胞增殖和再生能力显著高于对照组，说明　 　。
【答案】（1）DNA的半保留复制；B
（2）EcoRⅠ和BamHⅠ；使用两种不同的限制酶切割目的基因和质粒，可以产生不同的黏性末端，保证目的基因定向插入质粒，防止质粒自身环化，提高连接效率
（3）胰蛋白酶、胶原蛋白酶；Wnt基因对小鼠成纤维细胞再生有促进作用
【知识点】PCR技术的基本操作和应用；动物细胞培养技术；基因工程的基本工具（详细）；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）PCR技术扩增目的基因的原理是DNA的半保留复制，通过高温变性、低温退火和适温延伸的循环，使特定DNA片段呈指数级增加。设计引物时，引物序列需与模板链的3'端互补，且子链沿5'→3'方向延伸。已知Wnt基因两端的序列为5'-AATTGCGG—Wnt基因—TCGAAACT-3'，则上游引物应与左端模板链的3'端配对，故为5'-AATTGCGG-3'；下游引物应与右端模板链的3'端配对，其序列应为左端互补序列，即5'-AGTTTCGA-3'，因此正确选项为B。
（2）由图丙可知，质粒上含有EcoRⅠ和Sau3AⅠ两种限制酶识别位点，但Sau3AⅠ会切割目的基因内部（破坏Wnt基因），因此不能选用Sau3AⅠ切割含有目的基因的DNA片段。结合图甲分析，应选用EcoRⅠ和BamHⅠ同时切割目的基因片段和质粒。选用两种不同限制酶的好处是：产生不同的黏性末端，使目的基因只能以特定方向插入质粒，同时有效防止质粒自身环化，提高重组效率和后续筛选的准确性。
（3）进行动物细胞体外培养时，需先用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理组织，以分解细胞间的蛋白质，使组织分散为单个细胞，便于后续转染和增殖观察。实验组将含Wnt基因的重组载体导入小鼠成纤维细胞，对照组导入不含Wnt基因的空载体，结果显示实验组细胞增殖和再生能力显著高于对照组，说明Wnt基因对小鼠成纤维细胞的再生具有促进作用。【分析】1、引物必须与模板链的3'端互补结合，DNA聚合酶从引物的3'端开始沿模板链的5'→3'方向延伸子链。
2、图丙质粒上有EcoRⅠ和Sau3AⅠ两种酶切位点，但Sau3AⅠ的识别序列在目的基因内部也存在，若用它切割含目的基因的DNA片段，会破坏Wnt基因的完整结构，因此不可选用。应选用EcoRⅠ和BamHⅠ同时切割目的基因片段和质粒。
3、动物组织培养前，需用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理，分解细胞间质中的蛋白质（如胶原蛋白、纤连蛋白），使组织解离为单个细胞悬液，便于后续操作和计数。
（1）PCR技术的原理是DNA的半保留复制。引物是根据已知序列设计的，要与模板链结合，采用PCR技术扩增Wnt基因（5'-AATTGCGG-Wnt基因-TCGAAACT-3'）时，PCR中需要一对特异性的引物，该引物能与目的基因3'端的碱基互补配对，子链延伸时是从引物的5'向3'端延伸，所以符合条件的引物I是5'-AATTGCGG-3'，引物Ⅱ是5'-AGTTTCGA-3'，B正确，ACD错误。
（2）图丙中有EcoRI和Sau3A I两种限制酶，为了防止目的基因与质粒间的任意连接，应该选择Sau3A Ⅰ、EcoR Ⅰ切割质粒，结合图甲和图丙分析，Sau3A Ⅰ会破坏目的基因，应该选择EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ切割图1所示DNA片段，图乙中Sau3A Ⅰ和BamH Ⅰ的黏性末端相同。使用两种不同的限制酶切割目的基因和质粒，可以产生不同的黏性末端，保证目的基因定向插入质粒，防止质粒自身环化，提高连接效率。
（3）将小鼠成纤维细胞进行体外培养时，需先用胰蛋白酶、胶原蛋白酶处理使组织分散成单个细胞。实验组小鼠细胞注入含有Wnt基因的重组载体，对照组注入不含Wnt基因的空载体，实验结果显示实验组小鼠细胞增殖和再生能力显著高于对照组，说明Wnt基因对小鼠成纤维细胞再生有促进作用。
20．胡萝卜素是一种抗氧化剂和维生素A前体。科研人员将crtE、crtB、crtI三个关键酶基因导入大肠杆菌，使其能利用内源前体法尼基焦磷酸(FPP)合成胡萝卜素。构建的表达载体如下图，三个目的基因以多顺反子结构(共用一个启动子，各自带有核糖体结合位点RBS)插入多克隆位点(MCS)。转化宿主为大肠杆菌，在含氨苄青霉素和X-gal的平板上筛选，挑取白色菌落验证后，再转入表达菌株诱导表达。
注：lacZ基因编码产生的半乳糖苷酶可以分解X-gal产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。请回答下列问题：
（1）在含氨苄青霉素和X-gal的平板上，白色菌落代表大肠杆菌导入　 　质粒，蓝色菌落代表大肠杆菌导入　 　质粒。在构建基因表达载体时，除需要限制酶外，还需要　 　酶。
（2）该载体采用多顺反子结构，三个基因共用一个启动子的作用是　 　。(任写一点即可)
（3）实验测得重组菌的胡萝卜素产量较低。科研人员推测可能是由于FPP供应不足。请提出一种基因工程层面的改进策略(不改变培养基成分)，　 　。
（4）若最终检测发现重组菌的胡萝卜素产量几乎为零，但菌落能在含氨苄青霉素的平板上正常生长，且菌落为白色。分析可能的原因(写出两点)　 　。
【答案】（1）重组质粒(或外源基因插入破坏lacZ基因)；普通质粒(或空质粒或lacZ基因完整)；DNA连接
（2）保证多个基因的同步表达
（3）过表达大肠杆菌内源的法尼基焦磷酸合成酶基因，增加FPP的合成量，为外源胡萝卜素合成途径提供更多前体。
（4）目的基因未正确插入、启动子失效、RBS失效、基因突变造成终止密码子提前、表达菌株选择不当(任选两点回答即可，合理即可)
【知识点】基因工程的基本工具（详细）；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）本载体中多克隆位点（MCS）位于lacZ基因内部。若目的基因成功插入MCS，会破坏lacZ基因的编码区，使宿主菌无法产生β-半乳糖苷酶，不能分解X-gal产生蓝色物质，因此菌落呈白色，代表导入了重组质粒。若质粒未插入目的基因（空质粒或普通质粒），lacZ基因保持完整，菌落呈蓝色。构建基因表达载体时，限制酶切割DNA后，需用DNA连接酶将目的基因与载体连接成重组DNA。
（2）多顺反子结构中，三个目的基因共用一个启动子。其优势在于：保证多个基因同步转录，实现协同表达，利于代谢通路的协调；节省质粒空间，避免重复插入多个启动子，简化载体构建。
（3）若胡萝卜素产量低的原因是前体FPP供应不足，在不改变培养基成分的前提下，可通过基因工程手段过表达大肠杆菌自身的法尼基焦磷酸合成酶基因（ispA），增强内源FPP的合成能力，为外源胡萝卜素合成途径提供更多底物；或敲除消耗FPP的旁路基因，减少FPP的竞争性消耗。
（4）菌落能在含氨苄青霉素的平板上生长，说明重组质粒已成功导入且氨苄抗性基因正常表达；菌落为白色，说明lacZ基因被破坏，即目的基因已插入MCS。但胡萝卜素产量几乎为零，说明目的基因未能有效表达或表达产物无功能，可能原因包括：目的基因未正确插入（如插入方向错误或阅读框移位）；启动子或RBS（核糖体结合位点）发生突变或失活，导致转录或翻译无法启动；目的基因内部出现碱基突变，引入提前终止密码子，翻译产物截短失活；所选表达菌株不适宜该载体的表达系统（如缺乏必要的转录因子或tRNA）。
【分析】1、蓝白斑筛选机制：载体质粒上的lacZ基因编码β-半乳糖苷酶，该酶能分解底物X-gal产生蓝色物质。若目的基因插入多克隆位点（MCS），而MCS位于lacZ基因内部，则目的基因的插入会破坏lacZ基因，使细胞无法产生β-半乳糖苷酶，菌落呈白色（即白色菌落代表含有重组质粒）。若质粒未插入目的基因（空载体），lacZ基因保持完整，菌落呈蓝色。
2、载体构建工具：切割DNA需用限制酶（产生黏性末端或平末端），连接目的基因与载体需用DNA连接酶。
3、多顺反子指多个基因共用一个启动子，转录出一条mRNA，每个基因前各有一个核糖体结合位点（RBS），供核糖体独立启动翻译。
（1）本题中多克隆位点（MCS）位于lacZ基因内部，目的基因插入后会破坏lacZ，使其无法编码β-半乳糖苷酶分解X-gal产生蓝色物质，因此白色菌落含重组质粒(或外源基因插入破坏lacZ基因)，蓝色菌落含未插入目的基因的普通质粒(或空质粒或lacZ基因完整)；构建载体时，限制酶切割后需要DNA连接酶连接目的基因和载体骨架。
（2）启动子是RNA聚合酶结合、启动转录的位点，多个基因共用一个启动子，既可以保证三个基因同步转录、协同发挥功能，也能节约质粒的序列空间，避免多个启动子的冗余。
（3）若FPP（β-胡萝卜素的合成前体）供应不足，基因工程层面可从两个方向改造：过表达大肠杆菌内源的法尼基焦磷酸合成酶基因，增加FPP的合成量，为外源β 胡萝卜素合成途径提供更多前体，或减少FPP的消耗（敲除大肠杆菌消耗FPP的无关基因），符合题干不改变培养基的要求。
（4）该结果说明质粒成功导入（含氨苄抗性基因，能在氨苄平板生长）、目的基因成功插入（破坏了lacZ，菌落为白色），但β-胡萝卜素几乎不合成，问题出在目的基因的表达或产物功能上，常见原因如目的基因未正确插入、启动子失效、RBS失效、基因突变造成终止密码子提前、表达菌株选择不当等。
21．为研究干旱胁迫基因LEA和VOC对甘蓝型油菜油脂的积累机制，科研人员构建了两个基因表达载体。其中基因LEA与荧光素酶基因(Luc)构建成基因表达载体甲，基因VOC和标记基因构建成基因表达载体乙，相关序列如图所示。箭头表示转录方向。
（1）利用PCR扩增LEA基因时，需要在引物上添加的限制酶是　 　。
（2）常用农杆菌转化法将目的基因导入油菜受体细胞，目的基因将插入Ti质粒的　 　上，并最终将其整合到染色体DNA上，从而使其得以维持稳定和表达。
（3）乙酰—CoA羧化酶基因(AC)是油脂合成过程的关键酶基因，甘油三酯酯酶基因(ATGL)是油脂分解过程的关键酶基因。将基因表达载体甲、乙分别导入植物细胞，通过　 　技术获得转基因植物A、B，在干旱胁迫的环境下培养两种转基因植物和正常植物，分别检测植物体内AC和ATGL基因的表达水平，结果如下图。
　 正常植株 转基因A植株 转基因B植株
AC酶
ATGL酶
①在分子水平上，用　 　方法检测AC酶和ATGL酶的含量可得到上述表格结果。
②基于以上研究，干旱胁迫基因LEA和VOC在甘蓝型油菜油脂积累中的调控机制是　 　。
【答案】（1）EcoRⅤ和Xbal
（2）T-DNA
（3）植物组织培养；抗原—抗体杂交；LEA通过促进AC的表达使植物油脂增加，VOC通过抑制ATGL的表达从而减弱油脂的降低
【知识点】PCR技术的基本操作和应用；基因工程的基本工具（详细）；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）利用PCR扩增LEA基因时，需在引物的5'端添加限制酶识别序列，以便后续将LEA基因与载体连接。由图可知，载体甲中LEA基因需与Luc基因融合，而Luc基因内部含有BamHⅠ的识别位点，若用BamHⅠ切割，会破坏Luc基因；同时，若只用一种限制酶切割，易导致载体自身环化或目的基因反向插入。因此应选用EcoRⅤ和XbaⅠ两种限制酶，以产生不同末端，实现定向连接。
（2）农杆菌转化法中，目的基因需插入Ti质粒的T-DNA区域。T-DNA能转移至植物细胞并整合到受体细胞的染色体DNA上，从而使目的基因在植物体内稳定存在并得以表达。
（3）将含目的基因的表达载体导入植物细胞后，需通过植物组织培养技术将转化细胞再生为完整植株，获得转基因植物A和B。
①AC酶和ATGL酶均为蛋白质，检测其在细胞中的含量，应在分子水平上采用抗原—抗体杂交技术（如Western blot），利用特异性抗体与目标蛋白结合进行定量分析。
②由表格结果可知：与正常植株相比，转基因A植株中AC酶含量升高（促进油脂合成），转基因B植株中ATGL酶含量降低（抑制油脂分解）。据此可推测：在干旱胁迫下，LEA基因通过促进AC基因的表达来增加油脂合成；VOC基因通过抑制ATGL基因的表达来减少油脂分解，两者共同作用使甘蓝型油菜在干旱条件下积累更多油脂。
【分析】1、PCR扩增目的基因后，需将其与载体连接，因此在引物5'端添加限制酶识别序列，以便酶切后产生黏性末端。所选限制酶在目的基因内部不能有识别位点，否则会切割目的基因；在载体上应有对应的酶切位点，且最好选用两种不同的限制酶，以产生不同黏性末端，实现定向连接并防止载体自身环化。
2、农杆菌的Ti质粒上有一段可转移的DNA区域，称为T-DNA。当农杆菌感染植物细胞时，T-DNA会从质粒上剪切下来，转移至植物细胞核并整合到受体细胞的染色体DNA中。
3、AC酶和ATGL酶的化学本质是蛋白质，检测其含量需用抗原—抗体杂交技术（如Western blot）。该法利用特异性抗体与目标蛋白结合，通过显色或发光信号定量检测蛋白表达水平，具有高灵敏度和特异性。
4、AC酶（乙酰-CoA羧化酶）：油脂合成关键酶，其含量越高，油脂合成越强。ATGL酶（甘油三酯酯酶）：油脂分解关键酶，其含量越高，油脂分解越强。
（1）利用PCR扩增LEA基因时，需要在引物上添加限制酶的识别序列。由题意和题图可知：基因LEA与荧光素酶基因（Luc）构建成基因表达载体甲，而Luc中存在BamH I识别序列，BamH I酶切可将Luc切断，单一酶切后可能会导致载体、LEA基因自身环化及LEA反向连接，因此引物添加序列对应的限制酶是 EcoR V和Xbal。
（2）农杆菌的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上。根据农杆菌的这一特点，如果将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上，通过农杆菌的转化作用，就可以把目的基因整合到油菜受体细胞中染色体DNA上，从而使其得以维持稳定和表达。
（3）乙酰-CoA羧化酶基因（AC）是油脂合成过程的关键酶基因，甘油三酯酯酶基因（ATGL）是油脂分解过程的关键酶基因。将基因表达载体甲、乙分别导入植物细胞，可以通过植物组织培养技术获得转基因植物A、B，AC酶和ATGL酶的化学本质是蛋白质，检测其含量，在分子水平上采用抗原—抗体杂交技术。根据检测结果，转基因A植株的AC酶表达量升高，转基因B植株的ATGL酶表达量变低，据此可推测在干旱胁迫的环境下，LEA通过促进AC的表达使植物油脂增加；VOC通过抑制ATGL的表达从而减弱油脂的降低。
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