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第39讲　基因工程
第1课时　基因工程的基本工具和基本操作程序
课标 要求 1.概述基因工程是在遗传学、微生物学、生物化学和分子生物学等学科基础上发展而来的 2.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具 3.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测鉴定等步骤
考点一　重组DNA技术的基本工具(固本·识记类)
1.基因工程
(1)概念理解
(2)基因工程能够实现的理论基础
项目 理论基础
外源基因 在受体细 胞内表达 ①基因是控制生物性状的遗传物质的结构和功能单位 ②遗传信息的传递都遵循中心法则 ③生物界共用一套遗传密码
基因拼接 ①DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸 ②DNA分子的复制都遵循碱基互补配对原则 ③双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构
2.重组DNA技术的基本工具
(1)“分子手术刀”——限制性内切核酸酶(限制酶)
[提醒]①限制酶的识别序列一般由6个核苷酸组成,少数由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。
②限制酶作用的化学键只能是磷酸二酯键。
③在切割含目的基因的DNA分子时,需用限制酶切割两次此DNA分子,产生4个末端。只有这样才能使目的基因的两端都有可连接的黏性末端或平末端。
(2)“分子缝合针”——DNA连接酶
(3)“分子运输车”——载体
深挖教材·拓思维
限制酶来源于原核生物,不切割自己的DNA分子的原因是　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　。[选择性必修3 P74“拓展应用”]
不能直接把目的基因导入受体细胞而要用载体的原因是　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
3.实践中常用某些病毒载体作为基因工程工具,除具备普通“质粒载体”的条件外,还应具有的条件是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　(答出两点即可)。
1.关于基因工程中的工具酶和载体,下列说法正确的是　　　　。
A.使用不同的限制酶也能产生相同的黏性末端[2024·贵州卷]
B.若受体大肠杆菌含有构建重组质粒时用到的限制性内切核酸酶,则一定有利于该重组质粒进入受体并保持结构稳定
C.DNA连接酶能将两碱基通过氢键连接起来
D.限制酶不可以识别和切割RNA
E.若两种限制酶的识别序列相同,则形成的末端一定能通过DNA连接酶相互连接
F.获取一个目的基因需限制酶切割2次,共产生2个游离的磷酸基团
G.基因工程中用的载体大多数为天然质粒
H.质粒是常用的载体,有2个游离的磷酸基团
I.质粒必须具有一个至多个限制酶切割位点,具有自我复制能力,有抗生素抗性基因
2.[2024·湖南卷] 某同学将质粒DNA 进行限制酶酶切时,发现DNA 完全没有被酶切,分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是 (　)
A.限制酶失活,更换新的限制酶
B.酶切条件不合适,调整反应条件如温度和酶的用量等
C.质粒DNA 突变导致酶识别位点缺失,更换正常质粒DNA
D.酶切位点被甲基化修饰,换用对DNA甲基化不敏感的限制酶
3.某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具,将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接,以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是 (　)
A.质粒和目的基因都用酶3切割,用E.coli DNA连接酶连接
B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割,用T4 DNA连接酶连接
C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割,用T4 DNA连接酶连接
D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割,用E.coli DNA连接酶连接
考点二　基因工程的基本操作程序(固本·应用类)
1.目的基因的筛选与获取
(1)筛选合适的目的基因
①目的基因:在基因工程的设计和操作中,用于改变　　　　　　　　或获得　　
　　　　等的基因。主要是指　　　　　　　的基因。
②筛选目的基因
a.从相关的已知　　　　　　　　的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。
b.利用　　　　　　　　　　　　　进行筛选。
③获取目的基因的方法:　　　　　　　　、　　　　　　、构建基因文库。
(2)利用PCR获取和扩增目的基因
①名称:　　　　　　　　　。
②原理:　　　　　　　　。
③仪器:PCR扩增仪。
④特点:使DNA复制在体外反复进行,特异性地快速扩增目的基因。
⑤条件
模板 　　　
原料 　　　　　　　　
酶 　　　　　　　　　　 (TaqDNA聚合酶)
引物 一小段能与　　　　　　　　　　　　　　　互补配对的短单链核酸,需2种引物
缓冲液 含　　　 (真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要　　　　激活)
⑥过程
⑦结果:扩增两引物之间的DNA片段。
⑧鉴定:　　　　　　　　　　法。
2.基因表达载体的构建(核心步骤)
(1)目的:让基因在受体细胞中　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(2)组成
[辨析]区分启动子、终止子、起始密码子、终止密码子
项目 本质 位置 功能
启动子(其上有一个重要的位点:RNA聚合酶识别和结合位点) DNA 目的基因上游 驱动转录
起始密码子 mRNA mRNA首端 驱动翻译
终止子 DNA 目的基因下游 终止转录
终止密码子 mRNA mRNA尾端 终止翻译
(3)构建过程
用同种限制酶或能　　　　　　　　的限制酶切割基因表达载体和含　　　　　　的DNA片段,再利用　　　　　　连接。
3.将目的基因导入受体细胞
生物 种类 常用 方法 转化过程 受体 细胞
植物 农杆菌 转化法 将①　　　　　　插入Ti质粒的T DNA中→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→在体细胞或受精卵中表达 ③　　　　　　
②　 　　 　　法 a.用微量注射器将含目的基因的DNA溶液(直接)注入子房中 b.可以在植物受粉后的一定时间内,剪去柱头,将DNA溶液滴加在花柱切面上,使目的基因借助花粉管通道进入胚囊
动物 ④　 　　 　　法 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 ⑤　　　　
微生 物 ⑥　 　　 处理法 Ca2+处理细胞→细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态→基因表达载体导入 原核细胞
[注意]农杆菌转化法的两次拼接和两次导入
第一次拼接: 　　　　　　　　　　　　　　　;
第二次拼接(非人工操作):　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　;
第一次导入:　　　　　　　　　　　　　　　;
第二次导入(非人工操作):　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
4.目的基因的检测与鉴定
(1)检测与鉴定的目的:检测和鉴定目的基因进入受体细胞后,是否　　　　　。
(2)检测与鉴定的方法
类型 检测与鉴定内容 方法
分子水 平检测 目的基因是否插入转基因生物的DNA上 PCR技术、抗原—抗体杂交等
目的基因是否转录出mRNA
目的基因是否翻译成蛋白质
个体生 物学水 平鉴定 是否具有抗性及抗性程度等 对转基因生物进行抗虫或抗病的接种实验
基因工程产品与天然产品的功能活性是否相同 比较基因工程产品与天然产品的功能活性
深挖教材·拓思维
1.PCR过程中需要引物的原因是 　。
需要设计两种引物的原因是 　。
2.构建基因的表达载体时使用不同的限制酶切割目的基因和质粒的两端的原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
命题角度一　考查PCR技术及其应用
1.[2026·江苏南通月考] 下图表示PCR过程中某个阶段反应体系的情况,①②③④表示相关物质,L、R表示方向。下列叙述正确的是 (　)
A.DNA体内复制与体外复制(PCR)所需能量均只来自dNTP
B.PCR过程中需要添加缓冲液,其中所含的Mg2+可用于激活DNA聚合酶
C.②链从L到R的方向为3'→5',①②链均可作为子链合成的模板
D.引物③的5'端添加了某序列,至少需经3次循环才可获得含有该序列的双链产物
2.[2025·浙江杭州模拟] 反向PCR是一种通过已知序列设计引物对未知序列进行扩增的技术,其过程如下图所示。下列叙述正确的是 (　)
A.应选择引物2和引物3进行PCR扩增
B.设计的引物中G、C碱基含量越高,变性的温度越高
C.PCR产物是包含部分已知序列和全部未知序列的链状DNA分子
D.整个过程需用到限制酶、DNA连接酶、耐高温的DNA聚合酶及逆转录酶
命题角度二　考查基因工程的基本操作程序
3.关于基因工程的基本操作程序,下列说法正确的是　　　　。
A.一个基因表达载体一般包括目的基因、标记基因、起始密码子和终止密码子等结构
B.启动子位于基因的上游,是DNA聚合酶识别和结合的部位,驱动基因转录出mRNA
C.标记基因的作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因,从而将含有目的基因的细胞筛选出来
D.用PCR技术扩增目的基因时,要有一段已知目的基因的核苷酸序列,以便合成引物
E.外源基因必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制
F.将重组Ti质粒导入土壤农杆菌中时,可以用钙离子处理细菌
G.为培育抗除草剂的作物新品种,导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体
H.某抗虫基因转基因是否成功,最简便的方法是观察该植物有没有抗虫性状
4.[2023·湖北卷] 用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒,构建基因表达载体(重组质粒),并转化到受体菌中。下列叙述错误的是 (　　)
A.若用HindⅢ酶切,目的基因转录的产物可能不同
B.若用PvuⅠ酶切,在含Tet(四环素)培养基中的菌落,不一定含有目的基因
C.若用SphⅠ酶切,可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D.若用SphⅠ酶切,携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落
5.[2025·安徽卷] 质粒K中含有β 半乳糖苷酶基因,将该质粒导入大肠杆菌细胞后,其编码的酶可分解X gal,产生蓝色物质,进而形成蓝色菌落,如图所示。科研小组以该质粒作为载体,采用基因工程技术实现人源干扰素基因在大肠杆菌中的高效表达。下列叙述错误的是 (　)
A.使用氯化钙处理大肠杆菌以提高转化效率,可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数
B.如果筛选平板中仅含卡那霉素,生长出的白色菌落不可判定为含目的基因的菌株
C.因质粒K中含两个标记基因,筛选平板中长出的白色菌落即为表达目标蛋白的菌株
D.若筛选平板中蓝色菌落偏多,原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌
经典真题·明考向
1.[2025·江西卷] 为了获得抗白叶枯病的水稻品种,研究人员构建了含有抗病基因D的重组Ti质粒(如图),通过农杆菌转化法将D基因导入水稻种子诱导的愈伤组织,最终获得抗病植株。下列叙述正确的是 (　)
A.水稻愈伤组织细胞中RNA聚合酶无法识别U6启动子
B.在含重组Ti质粒的农杆菌中U6启动子不能驱动卡那霉素抗性基因表达
C.农杆菌侵染愈伤组织后所用的筛选培养基中需加入卡那霉素
D.愈伤组织再分化获得的含有D基因的幼苗属于抗病植株
2.[2025·陕青宁晋卷] 马铃薯作为重要农作物,提高其冷耐受性可拓展优质马铃薯的种植区域。我国科研人员发现,野生马铃薯中S基因的表达与其冷耐受性调控有关,将该基因导入栽培马铃薯中可显著增强其抗寒能力。回答下列问题。
限制酶 识别序列及 切割位点 限制酶 识别序列及 切割位点
BglⅡ EcoRⅠ
NdeⅠ BamHⅠ
XhoⅠ SalⅠ
XbaⅠ
(1)PCR扩增目的基因时,需要模板DNA、引物、　　　　　　　　、含Mg2+的缓冲液和耐高温的DNA聚合酶。DNA聚合酶在PCR的　　　　步骤中起作用。
(2)图中标识了载体和S基因中限制酶的切割位点。为将S基因正确插入载体,PCR扩增S基因时需在引物的　　　　(填“5'端”或“3'端”)添加限制酶识别序列,结合上表分析,上游引物应添加的碱基序列是5' 　　　　　　 3',切割载体时应选用的两种限制酶是　　　　,PCR扩增产物和载体分别被限制酶切割后,经纯化和连接,获得含S基因的表达载体并导入农杆菌。
(3)用携带S基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织时,基因表达载体中T DNA进入愈伤组织细胞,将S基因整合到　　　　　　　,抗性基因　　　　可用于筛选成功转化的愈伤组织。该愈伤组织经　　　　形成芽、根,继续培育可获得抗寒能力显著增强的马铃薯植株。
3.[2025·山东卷] 种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti质粒的改造,利用农杆菌转化法将Ti质粒上的T DNA随机整合到小麦基因组中,筛选到2个种子休眠相关基因的插入失活纯合突变体。与野生型相比,突变体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息已知。
(1)Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为　　　　。选用图甲中的SmaⅠ对抗除草剂基因X进行完全酶切,再选择SmaⅠ和　　　对Ti质粒进行完全酶切,将产生的黏性末端补平,补平时使用的酶是　　　　　　。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接,构建重组载体,转化大肠杆菌;经卡那霉素筛选并提取质粒后再选用限制酶　　　　进行完全酶切并电泳检测,若电泳结果呈现一长一短2条带,较短的条带长度近似为　　　bp,则一定为正向重组质粒。
(2)为证明这两个突变体是由于T DNA插入小麦基因组中同一基因导致的,提取基因组DNA,经酶切后产生含有T DNA的基因组片段(图乙)。在此酶切过程中,限于后续PCR难以扩增大片段DNA,最好使用识别序列为　　(填“4”“6”或“8”)个碱基对的限制酶,且T DNA中应不含该酶的酶切位点。需首先将图乙的片段　　　　,才能利用引物P1和P2成功扩增未知序列。PCR扩增出未知序列后,进行了一系列操作,其中可以判断出2条片段的未知序列是否属于同一个基因的操作为　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　(填“琼脂糖凝胶电泳”或“测序和序列比对”)。
(3)通过农杆菌转化法将构建的含有野生型基因的表达载体转入突变植株,如果检测到野生型基因,　　　　(填“能”或“不能”)确定该植株的表型为野生型。
第39讲　基因工程
第1课时　基因工程的基本工具和基本操作程序
考点一
● 必备知识
1.基因重组　受体　DNA分子　遗传性状
2.(1)原核生物　数千　特定核苷酸序列　磷酸二酯键　黏性末端　(2)磷酸二酯键　大肠杆菌　平末端　平末端　(3)质粒　限制酶切割位点
【深挖教材】
1.原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰
2.游离的DNA片段进入受体细胞一般会直接被分解,即使不分解也无法随着细胞分裂而进行复制,导致子代细胞中不再含有目的基因
3.对靶细胞具有较高的转化效率,不能增殖,对细胞无害,在宿主细胞中引起的免疫反应较弱
● 典型例题
1.AD　[解析] 若受体大肠杆菌含有构建重组质粒时用到的限制性内切核酸酶,该限制酶会对进入该受体细菌的重组质粒进行切割,不利于其保持结构稳定,B错误。DNA连接酶连接的是磷酸二酯键,C错误。若两种限制酶的识别序列相同,而切割位点不同,则形成的末端不能正常配对,故不一定能通过DNA连接酶相互连接,E错误。限制酶切割2次,共产生4个游离的磷酸基团,F错误。在基因工程操作中,真正被用作载体的质粒,都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的,这些质粒上常有特殊的标记基因,如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等,便于重组DNA分子的筛选,G错误。质粒是一种双链环状DNA分子,无游离的磷酸基团,H错误。载体质粒中必须有标记基因,但不一定是抗生素抗性基因,应具有一个至多个限制酶切割位点、具备自我复制的能力等,I错误。
2.B　[解析] 限制酶失活会使DNA完全不被酶切,此时应更换新的限制酶,A项正确;酶切条件不合适通常会使切割效果下降,此时会有部分DNA被酶切,应调整反应条件如温度、pH等,B项错误;质粒DNA突变导致限制酶识别位点缺失,会造成限制酶无法进行切割,此时应更换为正常质粒,C项正确;质粒DNA上酶切位点被甲基化修饰,会导致对 DNA甲基化敏感的限制酶无法进行酶切,此时应换用对DNA甲基化不敏感的限制酶,D项正确。
3.C　[解析] 酶3切割产生的是平末端,E.coli DNA连接酶连接具有平末端的DNA片段的效率要远远低于T4 DNA连接酶,故该方案不是效率最高的,A不符合题意;酶3和酶1切割产生的末端不互补,在DNA连接酶的作用下不能连接,B不符合题意;T4 DNA连接酶可以连接黏性末端和平末端,质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后,再用T4 DNA连接酶连接,可以防止目的基因自身环化或反向连接,也可防止切割后的质粒再次环化,是效率比较高的选择,C符合题意;酶4会破坏抗生素抗性基因,即破坏了标记基因,且酶2和酶4切割得到的黏性末端相同,目的基因会发生自身环化或反向连接,切割后的质粒也易发生环化,D不符合题意。
考点二
● 必备知识
1.(1)①受体细胞性状　预期表达产物　编码蛋白质　②结构和功能清晰　序列数据库和序列比对工具　③PCR获取和扩增　人工合成　(2)①聚合酶链式反应　②DNA半保留复制　⑤DNA母链 　4种脱氧核苷酸 　耐高温的DNA聚合酶　DNA母链的一段碱基序列　Mg2+　Mg2+　⑥两种引物　碱基互补配对　耐高温的DNA聚合酶　⑧琼脂糖凝胶电泳
2.(1)稳定存在、遗传、表达和发挥作用　(2)RNA聚合酶　转录　抗生素抗性　重组DNA分子　(3)产生相同末端　目的基因　DNA连接酶
3.目的基因　花粉管通道　体细胞或受精卵　显微注射　受精卵　Ca2+　将目的基因拼接到Ti质粒的T DNA上　插入目的基因的T DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上　将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌　含目的基因的T DNA导入受体细胞
4.(1)稳定维持和表达其遗传特性
【深挖教材】
1.DNA聚合酶不能从头开始合成DNA,只能从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸,从而延伸DNA子链　基因的两条链都作为模板,其碱基序列不同,且DNA聚合酶只能从引物的3'端延伸子链,用两种引物才能确保DNA两条链同时被扩增
2.防止质粒和目的基因的自身环化以及目的基因与载体的反向连接
● 典型例题
1.B　[解析] 体内DNA复制由ATP、dNTP提供能量,体外DNA复制(PCR)由dNTP和加热提供能量,A错误。DNA聚合酶需要Mg2+激活,因此PCR反应的缓冲液中一般要添加Mg2+,B正确。根据DNA分子中两条链反向平行的关系可判断,②链从 L 到 R 的方向为 5'→3',图中①②链均可作为子链合成的模板,C错误。引物③的5'端添加了某序列,经过第 1 次循环,得到的1个 DNA 分子中有 1 条链含有该序列;经过第 2 次循环,得到的1个 DNA 分子的两条链均含有该序列,所以至少需经 2 次循环就可获得含有该序列的双链产物,D错误。
2.C　[解析] DNA子链合成的方向为5'端到3'端,引物使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸,因此要通过已知序列设计引物对未知序列进行扩增应选择引物1和引物4,A错误;复性过程中引物与模板链结合,G、C碱基含量越高,碱基对间氢键的含量越多,复性的温度越高,B错误;根据题意和图示可知,DNA分子被限制酶切割,然后环化并加入根据已知序列合成的引物,再通过PCR扩增得到了中间是未知序列、两侧是已知序列的DNA分子,故PCR产物是包含部分已知序列和全部未知序列的链状DNA分子,C正确;整个过程需用到限制酶、DNA连接酶和耐高温的DNA聚合酶,不需要逆转录酶,D错误。
3.CDFH　[解析] 一个基因表达载体一般包括目的基因、标记基因、启动子和终止子等,A错误;启动子位于基因的上游,是RNA聚合酶识别和结合的部位,驱动基因转录出mRNA,B错误;外源基因必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行转录,E错误;转基因植物的受体细胞可以是体细胞,也可以是受精卵,G错误。
4.D　[解析] 图中质粒内,氨苄青霉素抗性基因(AmpR)内含有ScaⅠ和PvuⅠ的酶切位点,四环素抗性基因(TetR)内含有HindⅢ、SphⅠ和SalⅠ的酶切位点。若用HindⅢ酶切,目的基因可能正向插入,也可能反向插入,转录的产物可能不同,A正确。 若用PvuⅠ酶切,重组质粒和质粒中都有四环素抗性基因,因此在含Tet(四环素)培养基中的菌落,不一定含有目的基因,B正确。重组质粒的大小与质粒不同,DNA凝胶电泳技术可以分离不同大小的DNA片段,能够鉴定重组质粒构建成功与否,C正确。SphⅠ的酶切位点位于四环素抗性基因中,若用SphⅠ酶切,重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因,因此携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)的培养基中能形成菌落,在含Tet的培养基中不能形成菌落,D错误。
5.C　[解析] 使用氯化钙处理大肠杆菌,可使其处于感受态,提高转化效率,即更多的大肠杆菌能吸收质粒,这些质粒包括含目的基因的重组质粒(大肠杆菌吸收后形成白色菌落)和未重组的质粒K(大肠杆菌吸收后形成蓝色菌落),筛选平板上白色和蓝色菌落数均增加,A正确;如果筛选平板中仅含卡那霉素,生长出的菌落都具有卡那霉素抗性,白色菌落可能是导入了重组质粒(含目的基因)后形成的,也可能是导入未重组质粒后形成的,所以生长出的白色菌落不可判定为含目的基因的菌株,B正确;筛选平板中长出白色菌落,说明该菌株中导入了重组质粒(含目的基因),但不能确定是否可以表达目标蛋白,如目的基因反向连接,C错误;若筛选平板中蓝色菌落偏多,原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌,因为自身环化的质粒K中β 半乳糖苷酶基因完整,能表达活性β 半乳糖苷酶,分解X gal形成蓝色菌落,D正确。
经典真题·明考向
1.B　[解析] 将T DNA整合到水稻愈伤组织的染色体DNA后,若要使D基因表达并使水稻植株表现出抗病性状,那么D基因上游的U6启动子需被水稻愈伤组织细胞中RNA聚合酶识别, A错误。启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段,位于基因的上游,它是RNA聚合酶识别和结合的部位,并且能够驱动基因转录出mRNA,最终表达出蛋白质。由图可知,重组Ti质粒中的U6启动子并非位于卡那霉素抗性基因的上游,因而不能驱动卡那霉素抗性基因的表达, B正确。当农杆菌侵染愈伤组织后,T DNA整合到水稻细胞染色体的DNA中,通常情况下,若D基因能表达,那么T DNA上的潮霉素抗性基因也能表达,从而使得导入T DNA的水稻愈伤组织具有潮霉素抗性,因此,在农杆菌侵染愈伤组织后所用的筛选培养基中需加入潮霉素, C错误。检测是否成功获得转基因品种一般需要经历两个阶段,首先是分子水平的检测,包括检测目的基因是否导入宿主细胞、检测在宿主细胞中目的基因是否转录出mRNA或最终表达出蛋白质,其次,还需要进行个体生物学水平的鉴定。因此愈伤组织再分化获得的含有D基因的幼苗不一定是抗病植株, D错误。
2.(1)4种脱氧核苷酸　延伸
(2)5'端　AGATCT　BamHⅠ、EcoRⅠ
(3)染色体DNA上　2　再分化
[解析] (1)PCR扩增目的基因时,需要模板DNA、引物、4种脱氧核苷酸、含Mg2+的缓冲液和耐高温的DNA聚合酶。PCR一般分为变性、复性和延伸三步,其中DNA聚合酶在PCR的延伸步骤中起作用。(2)为了使目的基因能够被限制酶切割,扩增目的基因时,需要在引物的5'端添加限制酶的识别序列。结合图表分析,在载体的启动子和终止子之间有BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ 和Xba Ⅰ 的识别序列,而S基因内部含有Xba Ⅰ 、Nde Ⅰ 和BamH Ⅰ 的识别序列,为将S基因正确插入载体,要用BamH Ⅰ 、EcoR Ⅰ 、Xba Ⅰ 中的两种切割载体,又不能用Xba Ⅰ 、Nde Ⅰ 或BamH Ⅰ 切割S基因,再根据各种限制酶的识别序列及切割位点可知,需要用BamH Ⅰ 、EcoR Ⅰ 切割载体,同时用BamH Ⅰ 的同尾酶(识别序列不同,但切割后可产生相同的黏性末端)Bgl Ⅱ 和EcoR Ⅰ 切割S基因,故PCR扩增S基因时需在上游引物添加的碱基序列是5' AGATCT 3'。(3)T DNA属于可转移DNA,用携带S基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织时,基因表达载体中T DNA进入愈伤组织细胞,将S基因整合到马铃薯愈伤组织细胞的染色体DNA上,抗性基因1位于T DNA外部,用于筛选含有重组载体的农杆菌,而抗性基因2位于T DNA内部,可用于筛选成功转化的愈伤组织。该愈伤组织经再分化形成芽、根,继续培育可获得抗寒能力显著增强的马铃薯植株。
3.(1)复制原点　XbaⅠ　DNA聚合酶　SmaⅠ和SpeⅠ　550
(2)4　环化(或连接)　测序和序列比对
(3)不能
[解析] (1)DNA复制的起点是复制原点,因此Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为复制原点。根据SmaⅠ限制酶识别序列和切割位点可知,酶切形成的是平末端,若质粒仅用SmaⅠ酶切,抗除草剂基因X和质粒可以正向连接也可以反向连接,且无法区分,为了确定重组质粒是否正向连接,因此在构建重组质粒时需要用到另一种限制酶,因抗除草剂基因X需要插入启动子和终止子之间,因此不能选择BamHⅠ切割,因为该限制酶会破坏终止子,所以只能选择XbaⅠ或PstⅠ进行酶切,两者切割后产生的黏性末端如下:
PstⅠ:5' CTGCA　 XbaⅠ:5' T
　　　3' G　　　　　　　3' AGATC
由图可知,只有XbaⅠ酶切产生的黏性末端可被补平(DNA链的延伸方向是5'→3'),故应选择XbaⅠ和SmaⅠ对Ti质粒进行完全酶切。补平时使用的酶是DNA聚合酶。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接,构建重组载体,转化大肠杆菌。重组的T DNA片段上含有一个SmaⅠ和一个SpeⅠ酶切位点,故可以选择用SmaⅠ和SpeⅠ进行酶切,转录的方向是从模板的3'→5',经过两种酶的酶切后并电泳,结果呈现一长一短2条带,若正向连接,较短的条带长度近似为550 bp,若反向连接,较短的条带长度近似为200 bp。(2)由于后续PCR难以扩增大片段DNA,所以最好选择识别序列为4个碱基对的限制酶,原因是识别序列越短,酶切位点越多,切割产生的片段可能越小,更有利于后续的PCR扩增。由于引物是根据已知序列设计的,但此时需要扩增未知序列,因此可以将图乙的片段环化,这样就可以利用现有引物扩增出未知序列。为了确定未知序列是否是同一基因,需要准确比对其上的碱基序列,因此对扩增出的未知序列进行的操作为测序和序列比对。(3)突变植株成功导入野生型基因,但野生型基因未必可以正常表达,因此不能确定该植株的表型为野生型。(共141张PPT)
第39讲
基因工程
01
第1课时
基因工程的基本工具和基本操
作程序
1.概述基因工程是在遗传学、微生物学、生物化学和分子生物学等学
科基础上发展而来的
2.阐明重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、 连接酶
和载体三种基本工具
3.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达
载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测
鉴定等步骤
考点一 重组技术的基本工具（固本·识记类）
考点二 基因工程的基本操作程序（固本·应用类）
经典真题·明考向
备用习题
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考点一 重组 技术的基本工具(固本·识记类)
1.基因工程
(1)概念理解
基因重组
受体
分子
遗传性状
(2)基因工程能够实现的理论基础
项目 理论基础
外源基因 在受体细 胞内表达 ①基因是控制生物性状的遗传物质的结构和功能单位
②遗传信息的传递都遵循中心法则
③生物界共用一套遗传密码
基因拼接 ① 的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸
分子的复制都遵循碱基互补配对原则
③双链 分子的空间结构都是规则的双螺旋结构
2.重组 技术的基本工具
(1)“分子手术刀”——限制性内切核酸酶(限制酶)
原核生物
数千
特定核苷酸序列
磷酸二酯键
黏性末端
［提醒］①限制酶的识别序列一般由6个核苷酸组成，少数由4个、8
个或其他数量的核苷酸组成。
②限制酶作用的化学键只能是磷酸二酯键。
③在切割含目的基因的分子时，需用限制酶切割两次此 分子，
产生4个末端。只有这样才能使目的基因的两端都有可连接的黏性末
端或平末端。
(2)“分子缝合针” 连接酶
磷酸二酯键
大肠杆菌
平末端
平末端
(3)“分子运输车”——载体
质粒
限制酶切割位点
【深挖教材·拓思维】
1.限制酶来源于原核生物,不切割自己的 分子的原因是__________
___________________________________________________。［选择
性必修 “拓展应用”］
原核生物分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰
2.不能直接把目的基因导入受体细胞而要用载体的原因是___________
____________________________________________________________
________________________________________________。
游离的
片段进入受体细胞一般会直接被分解，即使不分解也无法随着细
胞分裂而进行复制,导致子代细胞中不再含有目的基因
3.实践中常用某些病毒载体作为基因工程工具,除具备普通“质粒载体”
的条件外,还应具有的条件是____________________________________
___________________________________________(答出两点即可)。
对靶细胞具有较高的转化效率,不能增殖,
对细胞无害，在宿主细胞中引起的免疫反应较弱
1.关于基因工程中的工具酶和载体，下列说法正确的是_____。
A.使用不同的限制酶也能产生相同的黏性末端［2024·贵州卷］
B.若受体大肠杆菌含有构建重组质粒时用到的限制性内切核酸酶,则一定有利
于该重组质粒进入受体并保持结构稳定
C. 连接酶能将两碱基通过氢键连接起来
D.限制酶不可以识别和切割
E.若两种限制酶的识别序列相同,则形成的末端一定能通过 连接酶相互连接
F.获取一个目的基因需限制酶切割2次,共产生2个游离的磷酸基团
G.基因工程中用的载体大多数为天然质粒
H.质粒是常用的载体,有2个游离的磷酸基团
I.质粒必须具有一个至多个限制酶切割位点，具有自我复制能力，有抗生素
抗性基因
√
√
[解析] 若受体大肠杆菌含有构建重组质粒时用到的限制性内切核酸
酶，该限制酶会对进入该受体细菌的重组质粒进行切割,不利于其保
持结构稳定，B错误。 连接酶连接的是磷酸二酯键，C错误。若
两种限制酶的识别序列相同,而切割位点不同,则形成的末端不能正常
配对,故不一定能通过连接酶相互连接， 错误。限制酶切割2次,
共产生4个游离的磷酸基团， 错误。在基因工程操作中，真正被用
作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的，这些
质粒上常有特殊的标记基因，如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性
基因等，便于重组分子的筛选， 错误。质粒是一种双链环状
分子，无游离的磷酸基团， 错误。载体质粒中必须有标记基因，
但不一定是抗生素抗性基因，应具有一个至多个限制酶切割位点、
具备自我复制的能力等， 错误。
2.[2024·湖南卷]某同学将质粒进行限制酶酶切时，发现 完全
没有被酶切，分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是
( )
A.限制酶失活，更换新的限制酶
B.酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等
C.质粒突变导致酶识别位点缺失，更换正常质粒
D.酶切位点被甲基化修饰，换用对 甲基化不敏感的限制酶
√
[解析] 限制酶失活会使 完全不被酶切,此时应更换新的限制酶,A
项正确;酶切条件不合适通常会使切割效果下降,此时会有部分 被
酶切，应调整反应条件如温度、等，B项错误;质粒 突变导致
限制酶识别位点缺失,会造成限制酶无法进行切割,此时应更换为正常
质粒,C项正确;质粒上酶切位点被甲基化修饰,会导致对 甲基
化敏感的限制酶无法进行酶切，此时应换用对 甲基化不敏感的
限制酶,D项正确。
3.某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、 连接酶为工具，将目
的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、
连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是( )
A.质粒和目的基因都用酶3切割，用 连接酶连接
B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用 连接酶连接
C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用 连接酶连接
D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用 连接酶连接
√
[解析] 酶3切割产生的是平末端， 连接酶连接具有平末端
的片段的效率要远远低于 连接酶，故该方案不是效率最
高的，A不符合题意；酶3和酶1切割产生的末端不互补，在 连接
酶的作用下不能连接，B不符合题意； 连接酶可以连接黏性
末端和平末端，质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后，
再用 连接酶连接，可以防止目的基因自身环化或反向连接，
也可防止切割后的质粒再次环化，是效率比较高的选择，C符合题意；
酶4会破坏抗生素抗性基因，即破坏了标记基因，且酶2和酶4切割得
到的黏性末端相同，目的基因会发生自身环化或反向连接，切割后
的质粒也易发生环化，D不符合题意。
【题后归纳】
与 有关的几种酶的比较
酶种类 作用底物 作用部位 作用结果
限制酶 分子 磷酸二酯键 将 切成两个或多个片段
连接酶 分子 片段 磷酸二酯键 将两个 片段连接为一个
分子
聚合酶 脱氧核苷酸 磷酸二酯键 以 单链为模板，将单个
脱氧核苷酸依次连接到已有
的 片段末端
酶种类 作用底物 作用部位 作用结果
解旋酶 分子 碱基对中的 氢键 将双链 分子局部解旋为
单链
水解酶 分子 磷酸二酯键 将 片段水解为单个脱氧
核苷酸
续表
考点二 基因工程的基本操作程序(固本·应用类)
1.目的基因的筛选与获取
(1)筛选合适的目的基因
①目的基因:在基因工程的设计和操作中,用于改变______________或
获得______________等的基因。主要是指____________的基因。
受体细胞性状
预期表达产物
编码蛋白质
②筛选目的基因
.从相关的已知________________的基因中进行筛选是较为有效的方
法之一。
.利用__________________________进行筛选。
结构和功能清晰
序列数据库和序列比对工具
③获取目的基因的方法：_______________、__________、构建基因
文库。
获取和扩增
人工合成
(2)利用 获取和扩增目的基因
①名称：________________。
②原理：________________。
③仪器： 扩增仪。
聚合酶链式反应
半保留复制
④特点：使 复制在体外反复进行，特异性地快速扩增目的基因。
⑤条件
模板 __________
原料 _______________
酶 ____________________聚合酶
引物 一小段能与________________________互补配对的短单链
核酸，需2种引物
缓冲液 含______ (真核细胞和细菌的 聚合酶都需要______激
活)
母链
4种脱氧核苷酸
耐高温的聚合酶
母链的一段碱基序列
⑥过程
两种引物
碱基互补配对
⑦结果：扩增两引物之间的 片段。
⑧鉴定：________________法。
琼脂糖凝胶电泳
耐高温的聚合酶
【重点拓展】
技术和体内 复制的比较
技术 复制
场所 体外扩增仪中 细胞内(主要是细胞核内)
解旋方式 在高温下变性解旋 解旋酶催化
酶 耐高温的 聚合酶 解旋酶、 聚合酶
温度条件 在较高温度下进行，需控制温度 细胞内温和条件
合成对象 片段 分子
相同点 均需要模板、原料(四种脱氧核苷酸)、能量
2.基因表达载体的构建(核心步骤)
(1)目的：让基因在受体细胞中________________________________。
(2)组成
稳定存在、遗传、表达和发挥作用
聚合酶
转录
抗生素抗性
重组分子
［辨析］区分启动子、终止子、起始密码子、终止密码子
项目 本质 位置 功能
启动子(其上有一个重要的位点: 聚合酶识别和结合位点) 目的基因上 游 驱动转录
起始密码子 首端 驱动翻译
终止子 目的基因下 游 终止转录
终止密码子 尾端 终止翻译
(3)构建过程
用同种限制酶或能______________的限制酶切割基因表达载体和含
__________的 片段，再利用____________连接。
产生相同末端
目的基因
连接酶
3.将目的基因导入受体细胞
生物种类 常用方法 转化过程 受体细胞
植物 农杆菌转 化法 将①__________插入 质粒的 中 农杆菌 导入植物 细胞 整合到受体细胞的染色体 上 在体细胞或受精卵中 表达 ③______
_______
目的基因
体细胞
或受精卵
生物种类 常用方法 转化过程 受体细胞
植物 ②______ ________ 法 .用微量注射器将含目的基因的 溶液(直接)注入子房中 .可以在植物受粉后的一定时间 内，剪去柱头，将 溶液滴加在 花柱切面上，使目的基因借助花粉 管通道进入胚囊 ③______
_______
体细胞或受精卵
花粉
管通道
续表
生物种类 常用方法 转化过程 受体细胞
动物 ④______ ____法 将含有目的基因的表达载体提纯 取卵(受精卵) 显微注射 受精 卵发育 获得具有新性状的动物 ⑤______
___
微生物 ⑥______ 处理法 处理细胞 细胞处于一种能 吸收周围环境中 分子的生理状 态 基因表达载体导入 原核细胞
显微注射
受精卵
续表
［注意］农杆菌转化法的两次拼接和两次导入
第一次拼接: ___________________________________;
第二次拼接(非人工操作):______________________________________
_____________；
第一次导入：_______________________________;
第二次导入(非人工操作)：_________________________________。
将目的基因拼接到质粒的上
插入目的基因的拼接到受体细胞的
染色体上
将含目的基因的质粒导入农杆菌
含目的基因的导入受体细胞
4.目的基因的检测与鉴定
(1)检测与鉴定的目的：检测和鉴定目的基因进入受体细胞后，是否
__________________________。
稳定维持和表达其遗传特性
(2)检测与鉴定的方法
类型 检测与鉴定内容 方法
分子水平 检测 目的基因是否插入转基因生 物的 上 技术、抗原—抗体杂
交等
目的基因是否转录出
目的基因是否翻译成蛋白质
个体生物学 水平鉴定 是否具有抗性及抗性程度等 对转基因生物进行抗虫或
抗病的接种实验
基因工程产品与天然产品的 功能活性是否相同 比较基因工程产品与天然
产品的功能活性
【深挖教材·拓思维】
1. 过程中需要引物的原因是_________________________________
_____________________________________________________。
需要设计两种引物的原因是____________________________________
____________________________________________________________
________________________。
聚合酶不能从头开始合成，
只能从引物的端开始连接脱氧核苷酸，从而延伸子链
基因的两条链都作为模板，其碱基序列
不同，且聚合酶只能从引物的端延伸子链，用两种引物才能确
保两条链同时被扩增
2.构建基因的表达载体时使用不同的限制酶切割目的基因和质粒的两
端的原因是__________________________________________________
_________。
防止质粒和目的基因的自身环化以及目的基因与载体的
反向连接
命题角度一 考查 技术及其应用
1.[2026·江苏南通月考]下图表示 过程中某个阶段反应体系的情况，
①②③④表示相关物质，、 表示方向。下列叙述正确的是( )
A.体内复制与体外复制所需能量均只来自
B.过程中需要添加缓冲液，其中所含的可用于激活 聚合酶
C.②链从到的方向为， 链均可作为子链合成的模板
D.引物③的 端添加了某序列，至少需经3次循环才可获得含有该序列
的双链产物
√
[解析] 体内复制由、 提
供能量，体外复制由 和
加热提供能量，A错误。聚合酶需要激活，因此 反应
的缓冲液中一般要添加，B正确。根据 分子中两条链反向
平行的关系可判断，②链从到的方向为 ，图中①②链均可
作为子链合成的模板，C错误。引物③的 端添加了某序列，经过第
1 次循环，得到的1个 分子中有 1 条链含有该序列；经过第 2
次循环，得到的1个 分子的两条链均含有该序列，所以至少需经
2 次循环就可获得含有该序列的双链产物，D错误。
2.[2025·浙江杭州模拟]反向 是一种通过已知序列设计引物对未知
序列进行扩增的技术，其过程如下图所示。下列叙述正确的是( )
A.应选择引物2和引物3进行 扩增
B.设计的引物中 、C碱基含量越高，变性的温度
越高
C. 产物是包含部分已知序列和全部未知序列的
链状 分子
D.整个过程需用到限制酶、 连接酶、耐高温的
聚合酶及逆转录酶
√
[解析] 子链合成的方向为端到 端，引物
使聚合酶能够从引物的 端开始连接脱氧核
苷酸，因此要通过已知序列设计引物对未知序列
进行扩增应选择引物1和引物4，A错误；复性过
程中引物与模板链结合， 、C碱基含量越高，碱
基对间氢键的含量越多，复性的温度越高，B错误；根据题意和图示
可知， 分子被限制酶切割，
然后环化并加入根据已知序列合成的引物，再
通过 扩增得到了中间是未知序列、两侧是已
知序列的分子，故 产物是包含部分已知
序列和全部未知序列的链状 分子，C正确；
整个过程需用到限制酶、 连接酶和耐高温
的 聚合酶，不需要逆转录酶，D错误。
命题角度二 考查基因工程的基本操作程序
3.关于基因工程的基本操作程序，下列说法正确的是_______。
CDFH
A.一个基因表达载体一般包括目的基因、标记基因、起始密码子和终
止密码子等结构
B.启动子位于基因的上游,是 聚合酶识别和结合的部位,驱动基因转
录出
C.标记基因的作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因,从而将含有目
的基因的细胞筛选出来
D.用 技术扩增目的基因时,要有一段已知目的基因的核苷酸序列,以
便合成引物
E.外源基因必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制
F.将重组 质粒导入土壤农杆菌中时,可以用钙离子处理细菌
G.为培育抗除草剂的作物新品种,导入抗除草剂基因时只能以受精卵为
受体
H.某抗虫基因转基因是否成功,最简便的方法是观察该植物有没有抗虫
性状
[解析] 一个基因表达载体一般包括目的基因、标记基因、启动子和
终止子等，A错误；启动子位于基因的上游,是 聚合酶识别和结
合的部位,驱动基因转录出 ，B错误；外源基因必须位于重组质
粒的启动子和终止子之间才能进行转录， 错误；转基因植物的受体
细胞可以是体细胞,也可以是受精卵， 错误。
4.[2023·湖北卷]用氨苄青霉素抗性基因 、四环素抗性基因
作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的 片
段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并
转化到受体菌中。下列叙述错误的是( )
A.若用 酶切，目的基因转录的产物可能
不同
B.若用Ⅰ酶切，在含 (四环素)培养基中的
菌落，不一定含有目的基因
C.若用Ⅰ酶切，可通过 凝胶电泳技术鉴
定重组质粒构建成功与否
D.若用 Ⅰ酶切，携带目的基因的受体菌在含
(氨苄青霉素)和 的培养基中能形成菌落
√
[解析] 图中质粒内，氨苄青霉素抗性基因
内含有Ⅰ和 Ⅰ的酶切位点，四环
素抗性基因内含有、Ⅰ和 Ⅰ
的酶切位点。若用 酶切，目的基因可
能正向插入，也可能反向插入，转录的产物可能不同，A正确。 若
用Ⅰ酶切，重组质粒和质粒中都有四环素抗性基因，因此在含
(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因，B正确。重组质粒
的大小与质粒不同，凝胶电泳技术可以分离不同大小的 片
段，能够鉴定重组质粒构建成功与否，C正确。
Ⅰ的酶切位点位于四环素抗性基因中，若用
Ⅰ酶切，重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因，
因此携带目的基因的受体菌在含
(氨苄青霉素)的培养基中能形成菌落，在含 的培养基中不能形成
菌落，D错误。
5.[2025·安徽卷]质粒中含有 半乳糖苷酶
基因，将该质粒导入大肠杆菌细胞后，其编码
的酶可分解 ，产生蓝色物质，进而形成
蓝色菌落，如图所示。科研小组以该质粒作为
载体，采用基因工程技术实现人源干扰素基因在大肠杆菌中的高效表
达。下列叙述错误的是 ( )
A.使用氯化钙处理大肠杆菌以提高转化效率，可
增加筛选平板上白色和蓝色菌落数
B.如果筛选平板中仅含卡那霉素，生长出的白色
菌落不可判定为含目的基因的菌株
C.因质粒 中含两个标记基因，筛选平板中长出的
白色菌落即为表达目标蛋白的菌株
D.若筛选平板中蓝色菌落偏多，原因可能是质粒
经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌
√
[解析] 使用氯化钙处理大肠杆菌，可使其处
于感受态，提高转化效率，即更多的大肠杆
菌能吸收质粒，这些质粒包括含目的基因的
重组质粒(大肠杆菌吸收后形成白色菌落)和
未重组的质粒 (大肠杆菌吸收后形成蓝色菌落)，筛选平板上白色和
蓝色菌落数均增加，A正确；如果筛选平板中仅含卡那霉素，生长出
的菌落都具有卡那霉素抗性，白色菌落可能是导入了重组质粒
(含目的基因)后形成的，也可能是导入未重组质粒后形成的，所以生
长出的白色菌落不可判定为含目的基因的菌株，B正确；
筛选平板中长出白色菌落，说明该菌株中导
入了重组质粒(含目的基因)，但不能确定是
否可以表达目标蛋白，如目的基因反向连接，
C错误；若筛选平板中蓝色菌落偏多，原因
可能是质粒 经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌，因为自身环化的
质粒中半乳糖苷酶基因完整，能表达活性 半乳糖苷酶，分
解 形成蓝色菌落，D正确。
【题后归纳】
1.限制酶的选择原则
(1)根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限
制酶的种类
①应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，
如图(一)可选择 Ⅰ。
②不能选择切割位点位于目的基因内部的限制
酶，如图(一)不能选择 Ⅰ。
(2)根据常规质粒的结构确定限制酶的种类
①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶一致，以确保产生相同的黏
性末端。
②当不适合选择某种限制酶时,可用其同尾酶替换,以获得相同的黏性
未端。(同尾酶指来源不同,但能产生相同黏性末端的限制酶。)
③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限
制酶切割目的基因和质粒，如图(一)也可选择用Ⅰ和 Ⅰ两种限制
酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点)。
(3)若质粒上标出 片段,则所选限制
酶切割位点应位于 片段中。设切
割目的基因的限制酶为Ⅰ和 Ⅰ,则下图
中甲、乙、丁质粒均不宜选取,而丙 质
粒宜选取,分析如下:
2.双标记基因与影印接种法筛选含重组质粒的菌落
(1)原理:将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时,如果插入
某种抗生素抗性基因内部,则会导致该抗生素抗性基因失活。如图，
目的基因插入四环素抗性基因内部,则四环素抗性基因失活。
(2)被转化的细菌有三种:含自身环化目的基因的细菌、含重组质粒的
细菌、含自身环化质粒的细菌。
(3)筛选方法:将混合处理后的细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培
养,能生长的是含重组质粒的细菌和含自身环化质粒的细菌，如图1、2、
3、4、5菌落，再利用无菌的绒布影印到含有四环素的培养基上，如
图能生长的菌落为2、3、4,则在含四环素培养基上不生长的细菌即为
含重组质粒的细菌，如图1、5菌落。最后，可在含氨苄青霉素的培养
基上挑取1、5菌落进行培养。
经典真题·明考向
1.[2025·江西卷]为了获得抗白叶枯病的水稻品种，研究人员构建了含
有抗病基因D的重组 质粒(如图)，通过农杆菌转化法将D基因导入水
稻种子诱导的愈伤组织，最终获得抗病植株。下列叙述正确的是
( )
A.水稻愈伤组织细胞中聚合酶无法识别 启动子
B.在含重组质粒的农杆菌中 启动子不能驱动卡那霉素抗性基因表达
C.农杆菌侵染愈伤组织后所用的筛选培养基中需加入卡那霉素
D.愈伤组织再分化获得的含有D基因的幼苗属于抗病植株
√
[解析] 将 整合到水稻愈伤组织的
染色体 后，若要使D基因表达并使水
稻植株表现出抗病性状，那么D基因上游的 启动子需被水稻愈伤
组织细胞中聚合酶识别， 错误。启动子是一段有特殊序列结
构的片段，位于基因的上游，它是 聚合酶识别和结合的部
位，并且能够驱动基因转录出 ，最终表达出蛋白质。由图可
知，重组质粒中的 启动子并非位于卡那霉素抗性基因的上游，
因而不能驱动卡那霉素抗性基因的表达， 正确。
当农杆菌侵染愈伤组织后， 整
合到水稻细胞染色体的 中，通常情
况下，若D基因能表达，那么 上的潮霉素抗性基因也能表达，
从而使得导入 的水稻愈伤组织具有潮霉素抗性，因此，在
农杆菌侵染愈伤组织后所用的筛选培养基中需加入潮霉素， 错误。
检测是否成功获得转基因品种一般需要经
历两个阶段，首先是分子水平的检测，包
括检测目的基因是否导入宿主细胞、检测在宿主细胞中目的基因是
否转录出 或最终表达出蛋白质，其次，还需要进行个体生物
学水平的鉴定。因此愈伤组织再分化获得的含有D基因的幼苗不一定
是抗病植株， 错误。
2.[2025 陕青宁晋卷］马铃薯作为重要农作物，
提高其冷耐受性可拓展优质马铃薯的种植区域。
我国科研人员发现，野生马铃薯中 基因的表
达与其冷耐受性调控有关，将该基因导入栽培
马铃薯中可显著增强其抗寒能力。回答下列问
题。
限制酶 识别序列及切割位点 限制酶 识别序列及切割位点
Ⅱ Ⅰ
Ⅰ Ⅰ
Ⅰ Ⅰ
Ⅰ
(1)扩增目的基因时，需要模板 、引物、
_______________、含 的缓冲液和耐高温的
聚合酶。聚合酶在 的______步骤中起
作用。
4种脱氧核苷酸
延伸
[解析] 扩增目的基因时，需要模板 、引
物、4种脱氧核苷酸、含 的缓冲液和耐高温
的聚合酶。一般分为变性、复性和延伸三步，其中 聚合
酶在 的延伸步骤中起作用。
(2)图中标识了载体和 基因中限制酶的切割位点。为
将基因正确插入载体，扩增 基因时需在引物
的_____(填“端”或“ 端”)添加限制酶识别序列，结
合上表分析，上游引物应添加的碱基序列是
_________ ，切割载体时应选用的两种限制酶是
端
、
_________________， 扩增产物和载体分别被限制酶切割后，经纯
化和连接，获得含 基因的表达载体并导入农杆菌。
[解析] 为了使目的基因能够被限制酶切割，扩增
目的基因时，需要在引物的 端添加限制酶的识
别序列。结合图表分析，在载体的启动子和终止
子之间有、 和 Ⅰ 的识别序
列，而基因内部含有 Ⅰ 、 Ⅰ 和
的识别序列，为将基因正确插入载体，要用 、
、 Ⅰ 中的两种切割载体，又不能用 Ⅰ 、 Ⅰ 或
切割 基因，
再根据各种限制酶的识别序列及切割位点可知，
需要用 、 切割载体，同时用
的同尾酶(识别序列不同，但切割后可
产生相同的黏性末端) Ⅱ 和 切割 基
因，故扩增 基因时需在上游引物添加的碱基
序列是 。
(3)用携带 基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织
时，基因表达载体中 进入愈伤组织细胞，
将 基因整合到______________，抗性基因___可
用于筛选成功转化的愈伤组织。该愈伤组织经
_________形成芽、根，继续培育可获得抗寒能力
显著增强的马铃薯植株。
染色体上
2
再分化
[解析] 属于可转移，用携带 基因
的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织时，基因表达
载体中进入愈伤组织细胞，将 基因整
合到马铃薯愈伤组织细胞的染色体 上，抗性
基因1位于 外部，用于筛选含有重组载
体的农杆菌，而抗性基因2位于 内部，可用于筛选成功转化
的愈伤组织。该愈伤组织经再分化形成芽、根，继续培育可获得抗
寒能力显著增强的马铃薯植株。
3.[2025·山东卷] 种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对 质粒的
改造,利用农杆菌转化法将质粒上的 随机整合到小麦基因组
中，筛选到2个种子休眠相关基因的插入失活纯合突变体。与野生型
相比，突变体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息已知。
(1) 质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为__________。选
用图甲中的Ⅰ对抗除草剂基因进行完全酶切，再选择 Ⅰ和
______对 质粒进行完全酶切，将产生的黏性末端补平，补平时使用
的酶是____________。利用 连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因
的片段与酶切并补平的 质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆
复制原点
Ⅰ
聚合酶
菌;经卡那霉素筛选并提取质粒后再选用限制酶____________进行完全
酶切并电泳检测，若电泳结果呈现一长一短2条带，较短的条带长度
近似为_____ ，则一定为正向重组质粒。
Ⅰ和Ⅰ
550
[解析] 复制的起点是复制原点，因此 质粒上与其在农杆菌中
的复制能力相关的结构为复制原点。根据 Ⅰ限制酶识别序列和切
割位点可知，酶切形成的是平末端，若质粒仅用 Ⅰ酶切，抗除草
剂基因 和质粒可以正向连接也可以反向连接，且无法区分，为了确
定重组质粒是否正向连接，因此在构建重组质粒时需要用到另一种
限制酶，因抗除草剂基因 需要插入启动子和终止子之间，因此不能
选择切割，因为该限制酶会破坏终止子，所以只能选择
Ⅰ或 Ⅰ进行酶切，两者切割后产生的黏性末端如下：
由图可知，只有Ⅰ酶切产生的黏性末端可被补平 链的延伸方
向是，故应选择Ⅰ和Ⅰ对 质粒进行完全酶切。补平时
使用的酶是聚合酶。利用 连接酶将酶切后的包含抗除草剂
基因的片段与酶切并补平的 质粒进行连接，构建重组载体，转化
大肠杆菌。重组的片段上含有一个Ⅰ和一个 Ⅰ酶切位
点，故可以选择用Ⅰ和 Ⅰ进行酶切，转录的方向是从模板的
，经过两种酶的酶切后并电泳，结果呈现一长一短2条带，若
正向连接，较短的条带长度近似为 ，若反向连接，较短的条
带长度近似为 。
(2)为证明这两个突变体是由于 插入小麦
基因组中同一基因导致的，提取基因组 ，经
酶切后产生含有 的基因组片段(图乙)。
4
环化(或连接)
测序和序列比对
在此酶切过程中，限于后续难以扩增大片段 ，最好使用识别
序列为___(填“4”“6”或“8”)个碱基对的限制酶，且 中应不含该
酶的酶切位点。需首先将图乙的片段_____________，才能利用引物P
1和P2成功扩增未知序列。 扩增出未知序列后，进行了一系列操作，
其中可以判断出2条片段的未知序列是否属于同一个基因的操作为
________________(填“琼脂糖凝胶电泳” 或“测序和序列比对”)。
[解析] 由于后续难以扩增大片段 ，所
以最好选择识别序列为4个碱基对的限制酶，原
因是识别序列越短，酶切位点越多，切割产生
的片段可能越小，更有利于后续的 扩增。由于引物是根据已知
序列设计的，但此时需要扩增未知序列，因此可以将图乙的片段环
化，这样就可以利用现有引物扩增出未知序列。为了确定未知序列
是否是同一基因，需要准确比对其上的碱基序列，因此对扩增出的
未知序列进行的操作为测序和序列比对。
(3)通过农杆菌转化法将构建的含有野生型基因的表达载体转入突变植
株，如果检测到野生型基因，______(填“能”或“不能”)确定该植株的表
型为野生型。
不能
[解析] 突变植株成功导入野生型基因，但野生型基因未必可以正常
表达，因此不能确定该植株的表型为野生型。
备用习题
1.同尾酶是一类识别不同核苷酸序列但切割后产生相同黏性末端的限制
酶，依靠同尾酶的这种特性，可以根据需要将不同的DNA片段进行灵
活重组。下列叙述正确的是 ( )
A. 产生限制酶的生物大多没有核膜包被的细胞核
B. 限制酶能识别DNA和RNA中特定的核苷酸序列
C. 限制酶可为磷酸二酯键水解提供所需活化能
D. 同尾酶是一类限制酶，每种限制酶都存在其同尾酶
√
[解析] 限制酶主要从原核生物中分离纯化得到，原核生物没有核膜包
被的细胞核，A正确；限制酶识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，
B错误；限制酶起催化作用，作用机理为降低化学反应所需的活化能，
但不提供能量，C错误；DNA分子经限制酶切割后可形成黏性末端或
平末端，产生平末端的限制酶不存在同尾酶，D错误。
2.科研人员将寒带地区海鱼中的抗冻基因转入千禧果细胞中，成功培
育出抗冻千禧果。下图为培育过程中使用的Ti质粒示意图，其中Vir区
的基因活化能促进T-DNA的加工和转移，下列叙述正确的是( )
构建基因表达载体时，最好选择限制酶Ⅱ
和Ⅲ来切割质粒
B. 利用PCR扩增抗冻基因，需提前检测抗冻
基因的全部碱基序列
C. Vir区的基因活化促进抗冻基因整合到千禧果细胞的染色体DNA上
D. 利用含卡那霉素的培养基可筛选出成功导入抗冻基因的千禧果细胞
√
[解析] 使用限制酶 Ⅱ 会破坏Vir区的基因，Vir区的基因活化能促进T-
DNA的加工和转移，因此不能选限制酶 Ⅱ ，A错误；使用PCR技术扩
增抗冻基因，只需要知道抗冻基因两端碱基序列并据此设计引物即可，
B错误；农杆菌侵染植物细胞后，Ti质粒上的T-DNA能转移到被侵染
的细胞，并整合到该细胞的染色体DNA上，所以Vir区基因活化可促
进抗冻基因整合到千禧果细胞的染色体DNA上，C正确；转化成功的
植物细胞染色体DNA上只整合了T-DNA片段，T-DNA上含有四环素抗
性基因，不含卡那霉素抗性基因，可利用含四环素的培养基筛选成功
导入抗冻基因的千禧果细胞，D错误。
作业手册
题组一 重组 技术的基本工具
1.[2025·湖北八校三模]下列关于基因工程的叙述，错误的是( )
A.目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物
B.限制性内切核酸酶和 连接酶是两类常用的工具酶
C.人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生物活性
D.载体上的抗性基因有利于筛选含重组 的细胞和促进目的基因的
表达
√
[解析] 基因工程中目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物，
A正确；限制性内切核酸酶和 连接酶是获取目的基因和构建基因
表达载体必要的工具酶，B正确；大肠杆菌属于原核生物，没有内质
网和高尔基体，不能对核糖体上合成的人胰岛素原进行加工修饰，
所以胰岛素原没有生物活性，C正确；载体上的抗性基因有利于筛选
含重组 的细胞，但不能促进目的基因的表达，D错误。
2.[2025·陕西西安期末]限制酶和 连接酶是基因工程的工具酶，下
列说法错误的是( )
A.连接酶和 聚合酶均能催化形成磷酸二酯键
B. 连接酶能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段上
C.限制酶只能切割双链片段，不能切割 片段
D.限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，不会剪切自身的
√
[解析] 连接酶催化两个片段间磷酸二酯键的形成， 聚
合酶在 复制时将单个脱氧核苷酸连接到已有的核苷酸链上，两
者均能催化形成磷酸二酯键，A正确，B错误；限制酶特异性识别双
链分子的特定核苷酸序列并进行切割，无法识别或切割 片
段，C正确；限制酶主要来源于原核生物，因为自身 分子中不存
在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰，所以不会剪切自身的
，D正确。
3.[2025·山东烟台模拟]同尾酶是指一组识别序列不同，但切出的黏性
末端相同的限制酶。下图为、、Ⅱ和 Ⅰ四种限
制酶的识别序列及酶切位点。下列说法正确的是( )
A.、Ⅱ、 Ⅰ属于同尾酶，它们的识别序列相同
B.当目的基因编码区内有识别序列时，使用 Ⅰ可避免目的
基因被破坏
C.选用上述任意两种不同的限制酶切割目的基因，就可以防止目的基
因自身环化
D.用连接酶将和 Ⅱ形成的黏性末端连接后，仍可再被
图中某种限制酶切开
√
[解析] 、Ⅱ、 Ⅰ识别序列不同，但切出的黏性末端相
同，属于同尾酶，A错误；根据相关限制酶的识别序列和切割位点可
知，由于的识别序列包括 Ⅰ的识别序列，所以当目的基
因编码区内有识别序列时，使用 Ⅰ也会破坏目的基因，B
错误；、 Ⅱ的识别序列不同，但会产生相同的黏性末端，
若用二者切割目的基因，不能防止目的基因自身的环化，C错误；用
连接酶将和 Ⅱ形成的黏性末端连接后，不能被二者
切开，但可被限制酶 Ⅰ切开，D正确。
4.[2025·河北衡水月考]将外源基因导入受体细胞的过程中需要使用载
体，下列有关载体的叙述错误的是( )
A.载体应对宿主细胞无伤害，以免影响宿主细胞的正常生命活动
B.载体应具有一个至多个限制酶切割位点，以便于目的基因的插入
C.基因工程中被用作载体的质粒都是在天然质粒的基础上改造的
D.将外源基因导入受体细胞的载体可以是切割 分子的酶
√
[解析] 载体需和目的基因一起进入宿主细胞，因此载体应对宿主细
胞无伤害，以免影响宿主细胞的正常生命活动，A正确；载体应具有
一个至多个限制酶切割位点，以便与目的基因拼接形成重组 ，B
正确；基因工程中用到的质粒都是在天然质粒的基础上进行过人工
改造的，C正确；切割 分子的酶，如限制酶，是基因工程的工具
之一，但不能作为载体，D错误。
5.[2025·江西赣州模拟]图甲为某种质粒简图，图乙表示某外源 上
的目的基因，小箭头所指分别为限制酶、、 的
酶切位点。下列有关叙述错误的是( )
A.在基因工程中若只用一种限制酶完成对质粒和外源 的切割，则
可选
B.如果将一个外源分子和一个质粒分别用 酶切后，再用
连接酶连接，形成一个含有目的基因的重组，此重组 中
切割位点有2个
C.为了防止质粒和含目的基因的外源 片段自身环化，酶切时可使
用和 两种限制酶同时处理质粒和目的基因
D.一个如图甲所示的质粒分子经 切割后，含有1个游离的磷酸
基团
√
[解析] 由题图可知，目的基因两侧及质粒都有限制酶 的酶切
位点，所以在基因工程中若只用一种限制酶完成对质粒和外源
的切割，可选，A正确；如果将一个外源 分子和一个质
粒分别用酶切后，再用 连接酶连接，形成一个含有目的
基因的重组，此重组中 酶切位点有2个，B正确；
为了防止质粒和含目的基因的外源 片段自身环化，酶切时可使
用和 两种限制酶同时处理，C正确；一个图甲所示的
质粒分子经 切割后，产生两个黏性末端，因此含有2个游离
的磷酸基团，D错误。
题组二 基因工程的基本操作程序
6.下列有关基因工程基本操作程序的叙述不正确的是( )
A.引物是一小段能与 母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸
B.构建基因表达载体是基因工程的核心工作，将目的基因导入受体细
胞不需要进行碱基互补配对
C.转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和
表达的过程
D.应用 技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因是否转录
和翻译
√
[解析] 引物是一小段能与 母链的一段碱基序列互补配对的短单
链核酸，A正确；构建基因表达载体是基因工程的核心步骤，将目的
基因导入受体细胞不涉及碱基互补配对，B正确；转化是指目的基因
进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，C正
确； 技术不能检测目的基因是否翻译，D错误。
7.[2025·湖北武汉一模] 技术的每轮循环可以分为变性、复性、延
伸三步。引物与其模板链形成的杂合分子的解链温度称为引物的
值。下列叙述正确的是( )
A.引物与模板链的结合属于延伸过程
B.变性过程的温度一般要低于复性过程
C.复性过程的温度应设置为略低于 值
D.中所用的两种引物的 值越接近,引物之间越容易结合
√
[解析] 一般要经历多次循环，每次循环可以分为变性、复性和
延伸三步，引物与模板链的结合属于复性过程，A错误；变性过程的
温度一般要高于复性过程，B错误；题意显示，引物与其模板链形成
的杂合分子的解链温度称为引物的 值，复性过程的温度应设置为
略低于值，否则会导致引物结合失败，C正确；引物的 值越
接近,两引物与对应模板链结合的同步性越好, 结果可能越好,但两
引物之间能否结合主要与其碱基序列有关,D错误。
8.[2026·广东深圳月考]下图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图。
下列相关叙述正确的是( )
A.①中 质粒应包含启动子、复制原点等元件
B.②的构建需要限制酶和 聚合酶等物质的参与
C.③侵染后，重组 质粒的全部序列都整合到④的染色体上
D.④的染色体上若含抗虫基因，则⑤就一定表现出抗虫性状
√
[解析] 基因表达载体除目的基因、
标记基因外，还必须有启动子、终
止子、复制原点等，即①中 质粒
应包含启动子、终止子、标记基因和复制原点等元件，A正确；②是
目的基因表达载体，其构建过程需要限制酶和 连接酶，B错误；
③侵染植物细胞后，重组质粒上的 整合到受体细胞的染色
体 上，C错误；即使④的染色体上含抗虫基因，但目的基因也可
能不能转录或者不能翻译，或者表达的蛋白质不具有生物活性，即
⑤不一定表现出抗虫性状，D错误。
9.[2026·河南信阳月考]为了提高基因 的表达
能力，可将基因 与外源强启动子连接，如
图所示(图中①②③④表示引物)。下列叙述错
误的是( )
A.强启动子是 聚合酶识别和结合的部位
B.可用连接酶将基因 与外源强启动子连接
C.利用 检测连接是否成功时选择的引物可为①③
D.引物可使聚合酶从引物的 端开始连接脱氧核苷酸
√
[解析] 聚合酶识别和结合强启动子，启动转录，A正确；
连接酶可以连接两个片段，可用连接酶将基因 与外源强
启动子连接，B正确；由题图可知，利用 检测连接是否成功时选
择的引物可为①③，C正确；引物可使聚合酶从引物的 端开始
连接脱氧核苷酸，D错误。
10.[2025·湖南长沙期中]蛛丝有超强韧性，
其主要成分蛛丝蛋白是一种特殊的纤维蛋
白，具有独特的结构与性质。科学家将蛛
丝蛋白基因转入羊的受精卵中以生产蛛丝
A.若受体细胞为大肠杆菌，则蛛丝蛋白可能需要进一步加工才具有相
应的功能
B.欲在羊乳汁中提取蛛丝蛋白，需将蛛丝蛋白基因与乳腺中特异性表
达的基因的启动子等调控元件重组在一起
C.用 技术扩增图中的蛛丝蛋白基因，可选择图中的引物①和④
D.若一个蛛丝蛋白基因扩增了4次，则共消耗引物30个
蛋白，下图是蛛丝蛋白基因的 片段。下列说法错误的是( )
√
[解析] 若受体细胞为大肠杆菌，大肠杆
菌为原核生物，没有高尔基体和内质网，
蛛丝蛋白需要进一步加工才具有相应的功
能，A正确；若想让目的基因在乳腺中特异性表达，需要将目的基因
与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起，B正确；
在扩增时聚合酶从引物的 端开始连接脱氧核苷酸，故用
技术扩增题图中蛛丝蛋白基因应选择引物②和引物③，C错误；
在 分子扩增时，需要2种引物，由于
新合成的子链都需要引物作为复制的起点，
故所需的引物数目等于新合成的 子链
数目，若一个蛛丝蛋白基因扩增了4次，共需要消耗引物的数量为
(个)，D正确。
11.[2025·湖北黄冈二模]研究人员将目的基因插入质
粒，构建重组质粒的过程如图所示，再将该重组质
粒导入大肠杆菌中。由 半乳糖苷酶基因编码产
生的半乳糖苷酶可分解 产生蓝色物质，使菌落呈蓝色，否
则菌落为白色。下列叙述正确的是( )
A.将目的基因插入质粒中时，需要用到 聚合酶
B.重组质粒被导入大肠杆菌前，需用 处理大肠
杆菌，使其细胞壁软化
C.将按图示构建的重组质粒导入大肠杆菌后，大肠
杆菌不能表达该目的基因
D.在含有 和四环素的培养基上形成的蓝色菌
落就是含重组质粒的大肠杆菌
√
[解析] 将目的基因插入质粒时，用到的是 连
接酶，而不是聚合酶，A错误；用 处理
大肠杆菌细胞，是使其处于感受态，从而能够吸
收周围环境中的 分子，而不是使细胞壁软化，B错误；由题图可
以看出，目的基因的转录方向与启动子的方向相反，启动子无法启
动目的基因的转录，所以大肠杆菌不能表达该目的基因，C正确；
分析题图可知， 半乳糖苷酶基因没有被破坏，
其可以正常表达，产生 半乳糖苷酶，分解
产生蓝色物质，可见含重组质粒的大肠杆
菌形成的是蓝色菌落，含空质粒的大肠杆菌也可
能形成蓝色菌落，因此在含有 和四环素的培养基上形成的蓝
色菌落不一定是含重组质粒的大肠杆菌，D错误。
12.[2025·山西长治月考]为培育能表达 融合蛋白的转基因
拟南芥，研究人员所构建的重组质粒部分结构如图。下列叙述错误的
是( )
A.启动子是 聚合酶识别和结合的部位，但不是转录的起始位点
B.图中融合基因的链为模板链，该基因转录生成的 与其序列互补
C.为确定融合基因是否定向插入，可选用引物和
进行 后电泳鉴定
D.可通过转基因拟南芥细胞能否发出绿色荧光来判断融合基因是否成
功表达
√
[解析] 启动子是 聚合酶识别和结
合的部位，它能驱动基因转录出
，启动子本身通常不被转录，
转录的起始位点是 分子上转录开始的那个特定的核苷酸，A正确；
转录时，以 的一条链(模板链)为模板，按照碱基互补配对原则合
成，因此该基因转录生成的 与其模板链互补，B正确；
用引物和 扩增只能检测是否成功导
入融合基因，不能确定是否是正向连接，
应该选用和来确定是否定向导入了融合基因，C错误； 基因
为绿色荧光蛋白基因，若融合基因成功表达，转基因拟南芥细胞会
表达出绿色荧光蛋白，从而发出绿色荧光，所以可通过观察细胞是
否发出绿色荧光来判断融合基因是否成功表达，D正确。
综合应用练
13.[2025·安徽芜湖二模] 为提高棉花植株的抗虫特性，研究小组将抗
虫基因 导入棉花细胞中以得到转基因抗虫棉，过程如图甲。该
过程涉及的各种限制酶及酶切位点如表。回答下列问题：
限制酶 Ⅰ Ⅰ Ⅰ Ⅰ Ⅲ
识别序列
(1)目的基因的筛选与获取:研究人员将苏云金杆
菌中获取的 基因成功导入棉花细胞并表达，
但产物表达量较低，需要将其中多个密码子替换
为植物偏爱密码子。在已知 基因序列的前
提下，可采用__________方法获取新的目的基因。
人工合成
[解析] 在已知 基因序列的前提下，可采用人工合成方法获取
新的目的基因。
(2)基因表达载体的构建:目的基因需要连接在启动子和终止子之间，
为实现该操作，需要在目的基因两端添加 限制酶识别序列，该
方法的不足是________________________________________________
_____________。研究人员为改善该问题，在目的基因两侧增加了其
他限制酶识别序列如图乙，则可选择的限制酶组合有___种
(不考虑与质粒的连接问题)。
易出现目的基因和质粒的自身环化，及目的基因与质
粒的错误连接
5
[解析] 基因工程中，目的基因和质粒都需
要经过酶切，如果处理不当，容易出现目
的基因和质粒的自身环化，及目的基因与
质粒的错误连接，影响后续的转化效率。由表可知， Ⅰ 和
Ⅰ 的识别序列相同，只是酶切位点不同，因此， Ⅰ 的识别序列
也能被 Ⅰ 识别。分析图乙，可选择的限制酶组合有5种可能，
即 和 、 和 Ⅰ 、 Ⅰ 和
、 Ⅰ 和 、 Ⅰ 和 。
(3)将目的基因导入受体细胞:除图示的方法外，将抗虫基因导入棉花
细胞的方法还有______________，该方法相比于图示方法的优点是
____________________________________________________________
___(答出2点)。
花粉管通道法
无须进行组织培养，缩短培育周期；成本低，操作简单(言之有理即可)
[解析] 花粉管通道法是一种简便的转基因方法，可以直接将外源
导入植物的生殖细胞，无须进行组织培养，缩短培育周期；成
本低，操作简单。
(4)目的基因的检测与鉴定:除了利用 技术检测目的基因是否成功插
入并转录外，还需在个体水平进行鉴定，为判断转基因抗虫棉是否培
育成功，需要对其进行的操作是________________________________
_____________________________________。
在转基因抗虫棉生长期投放棉铃虫
幼虫，观察抗虫棉的生长情况(合理即可)
[解析] 欲在个体水平上鉴定转基因抗虫棉是否真正培育成功，需在
转基因抗虫棉生长期投放棉铃虫幼虫，观察抗虫棉的生长情况。
14.[2025·重庆南岸区二模] 利用转基因技术，将奶牛细胞中编码凝乳
酶的基因转移到大肠杆菌细胞中，以达到大规模生产凝乳酶的目的。
如图表示用作载体的质粒和凝乳酶基因所在 片段，图中标注了相
关限制酶的酶切位点，不同限制酶的识别序列和酶切位点不同。
(1)利用扩增凝乳酶基因所在的 片段应选择的两种引物是
_______________，引物的作用是_______________________________
_________________________。
引物1和引物2
使聚合酶能沿引物的端连接
脱氧核糖核苷酸，延伸子链
[解析] 由于子链的延伸方向是 ，脱氧核苷酸依次连接在引物
的端，因此，利用扩增凝乳酶基因所在的 片段应选择的两
种引物是引物1和引物2。引物在中的作用是使 聚合酶能沿引
物的 端连接脱氧核糖核苷酸，延伸子链。
(2)构建重组质粒的过程中应该选用的两种限制酶是_____________，
使用双酶切的优势是__________________________________________
_____________(答2点)。
Ⅰ、
防止质粒和目的基因自身环化、防止目的基因
反向插入质粒
[解析] 由于质粒中存在两个限制酶 的切割位点，且会把四
环素抗性基因破坏掉，因此构建重组质粒的过程中应该选用的两种
限制酶是Ⅰ、 ，这两种限制酶的切割位点位于目的基因的
两侧，且在质粒中都存在相应的识别序列。在构建重组质粒时，使
用双酶切的优势是防止质粒和目的基因自身环化、防止目的基因反
向插入质粒。
(3)若转化过程中，含抗生素基因的未重组载体也可转化大肠杆菌，请
写出利用标记基因筛选出目的菌的简要实验思路： _______________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
_________________________________________ 。
首先将转化后的
大肠杆菌接种到含四环素的固体培养基上进行培养，然后将长出的菌
落用灭菌的绒布原位转移至含氨苄青霉素的培养基中培养，比较两培
养基上菌落的生长及位置分布，挑取含氨苄青霉素的培养基中没有而
在含四环素的培养基相应位置存在的菌落
[解析] 若转化过程中，含抗生素基因的未重组载体(空质粒)也可转
化大肠杆菌，即导入重组质粒和空质粒的大肠杆菌均会在含四环素
的培养基上生长，但重组质粒中氨苄青霉素抗性基因受到破坏，因
此导入重组质粒的大肠杆菌对氨苄青霉素不具有抗性，而导入空质
粒的大肠杆菌对氨苄青霉素有抗性，
则具体的筛选思路为首先将转化后的大肠杆菌接种到含四环素的固
体培养基上进行培养，然后将长出的菌落用灭菌的绒布原位转移至
含氨苄青霉素的培养基中培养，比较两培养基上菌落的生长及位置
分布，挑取含氨苄青霉素的培养基中没有而在含四环素的培养基相
应位置存在的菌落。
(4)除选择培养基外，可用于检测转基因是否成功的技术还有________
_____________________________(答2种)。
、
核酸分子杂交、抗原—抗体检测
[解析] 除选择培养基外，还可在分子水平上检测转基因是否成功，
具体的技术有 、核酸分子杂交、抗原-抗体检测。中小学教育资源及组卷应用平台
课时作业(五十四)　基因工程的基本工具和基本操作程序
题组一　重组DNA技术的基本工具
1.[2025·湖北八校三模] 下列关于基因工程的叙述,错误的是 (　)
A.目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物
B.限制性内切核酸酶和DNA连接酶是两类常用的工具酶
C.人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生物活性
D.载体上的抗性基因有利于筛选含重组DNA的细胞和促进目的基因的表达
2.[2025·陕西西安期末] 限制酶和DNA连接酶是基因工程的工具酶,下列说法错误的是 (　)
A.DNA连接酶和DNA聚合酶均能催化形成磷酸二酯键
B.DNA连接酶能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段上
C.限制酶只能切割双链DNA片段,不能切割RNA片段
D.限制酶主要从原核生物中分离纯化而来,不会剪切自身的DNA
3.[2025·山东烟台模拟] 同尾酶是指一组识别序列不同,但切出的黏性末端相同的限制酶。下图为EcoRⅠ、BamHⅠ、BglⅡ和MboⅠ四种限制酶的识别序列及酶切位点。下列说法正确的是 (　)
A.BamHⅠ、BglⅡ、MboⅠ属于同尾酶,它们的识别序列相同
B.当目的基因编码区内有BamHⅠ识别序列时,使用MboⅠ可避免目的基因被破坏
C.选用上述任意两种不同的限制酶切割目的基因,就可以防止目的基因自身环化
D.用DNA连接酶将BamHⅠ和BglⅡ形成的黏性末端连接后,仍可再被图中某种限制酶切开
4.[2025·河北衡水月考] 将外源基因导入受体细胞的过程中需要使用载体,下列有关载体的叙述错误的是 (　)
A.载体应对宿主细胞无伤害,以免影响宿主细胞的正常生命活动
B.载体应具有一个至多个限制酶切割位点,以便于目的基因的插入
C.基因工程中被用作载体的质粒都是在天然质粒的基础上改造的
D.将外源基因导入受体细胞的载体可以是切割DNA分子的酶
5.[2025·江西赣州模拟] 图甲为某种质粒简图,图乙表示某外源DNA上的目的基因,小箭头所指分别为限制酶EcoRⅠ、BamHⅠ、HindⅢ的酶切位点。下列有关叙述错误的是 (　)
A.在基因工程中若只用一种限制酶完成对质粒和外源DNA的切割,则可选EcoRⅠ
B.如果将一个外源DNA分子和一个质粒分别用EcoRⅠ酶切后,再用DNA连接酶连接,形成一个含有目的基因的重组DNA,此重组DNA中EcoRⅠ切割位点有2个
C.为了防止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化,酶切时可使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时处理质粒和目的基因
D.一个如图甲所示的质粒分子经EcoRⅠ切割后,含有1个游离的磷酸基团
题组二　基因工程的基本操作程序
6.下列有关基因工程基本操作程序的叙述不正确的是 (　)
A.引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸
B.构建基因表达载体是基因工程的核心工作,将目的基因导入受体细胞不需要进行碱基互补配对
C.转化是指目的基因进入受体细胞内,并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程
D.应用PCR技术,可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因是否转录和翻译
7.[2025·湖北武汉一模] PCR技术的每轮循环可以分为变性、复性、延伸三步。引物与其模板链形成的杂合分子的解链温度称为引物的Tm值。下列叙述正确的是 (　)
A.引物与模板链的结合属于延伸过程
B.变性过程的温度一般要低于复性过程
C.复性过程的温度应设置为略低于Tm值
D.PCR中所用的两种引物的Tm值越接近,引物之间越容易结合
8.[2026·广东深圳月考] 下图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图。下列相关叙述正确的是 (　)
A.①中Ti质粒应包含启动子、复制原点等元件
B.②的构建需要限制酶和DNA聚合酶等物质的参与
C.③侵染后,重组Ti质粒的全部序列都整合到④的染色体上
D.④的染色体上若含抗虫基因,则⑤就一定表现出抗虫性状
9.[2026·河南信阳月考] 为了提高基因M的表达能力,可将基因M与外源强启动子连接,如图所示(图中①②③④表示引物)。下列叙述错误的是 (　)
A.强启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位
B.可用DNA连接酶将基因M与外源强启动子连接
C.利用PCR检测连接是否成功时选择的引物可为①③
D.引物可使DNA聚合酶从引物的5'端开始连接脱氧核苷酸
10.[2025·湖南长沙期中] 蛛丝有超强韧性,其主要成分蛛丝蛋白是一种特殊的纤维蛋白,具有独特的结构与性质。科学家将蛛丝蛋白基因转入羊的受精卵中以生产蛛丝蛋白,下图是蛛丝蛋白基因的DNA片段。下列说法错误的是 (　)
A.若受体细胞为大肠杆菌,则蛛丝蛋白可能需要进一步加工才具有相应的功能
B.欲在羊乳汁中提取蛛丝蛋白,需将蛛丝蛋白基因与乳腺中特异性表达的基因的启动子等调控元件重组在一起
C.用PCR技术扩增图中的蛛丝蛋白基因,可选择图中的引物①和④
D.若一个蛛丝蛋白基因扩增了4次,则共消耗引物30个
11.[2025·湖北黄冈二模] 研究人员将目的基因插入质粒,构建重组质粒的过程如图所示,再将该重组质粒导入大肠杆菌中。由β 半乳糖苷酶基因编码产生的β 半乳糖苷酶可分解X gal产生蓝色物质,使菌落呈蓝色,否则菌落为白色。下列叙述正确的是 (　)
A.将目的基因插入质粒中时,需要用到DNA 聚合酶
B.重组质粒被导入大肠杆菌前,需用Ca2+处理大肠杆菌,使其细胞壁软化
C.将按图示构建的重组质粒导入大肠杆菌后,大肠杆菌不能表达该目的基因
D.在含有X gal和四环素的培养基上形成的蓝色菌落就是含重组质粒的大肠杆菌
12.[2025·山西长治月考] 为培育能表达SGF14a GFP融合蛋白的转基因拟南芥,研究人员所构建的重组质粒部分结构如图。下列叙述错误的是 (　)
A.启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位,但不是转录的起始位点
B.图中融合基因的a链为模板链,该基因转录生成的mRNA与其序列互补
C.为确定SGF14a GFP融合基因是否定向插入,可选用引物F2和R2进行PCR后电泳鉴定
D.可通过转基因拟南芥细胞能否发出绿色荧光来判断融合基因是否成功表达
综合应用练
13.[2025·安徽芜湖二模] 为提高棉花植株的抗虫特性,研究小组将抗虫基因Cry1A导入棉花细胞中以得到转基因抗虫棉,过程如图甲。该过程涉及的各种限制酶及酶切位点如表。回答下列问题:
限制酶 BamHⅠ EcoRⅠ SmaⅠ XmaⅠ HindⅢ
识别 序列 G↓GATCC G↓AATTC CCC↓GGG C↓CCGGG A↓AGCTT
(1)目的基因的筛选与获取:研究人员将苏云金杆菌中获取的Cry1A基因成功导入棉花细胞并表达,但产物表达量较低,需要将其中多个密码子替换为植物偏爱密码子。在已知Cry1A基因序列的前提下,可采用　　　　　　方法获取新的目的基因。
(2)基因表达载体的构建:目的基因需要连接在启动子和终止子之间,为实现该操作,需要在目的基因两端添加HindⅢ限制酶识别序列,该方法的不足是　　　　　
　　　　　 　　　　　　　。研究人员为改善该问题,在目的基因两侧增加了其他限制酶识别序列如图乙,则可选择的限制酶组合有　　 　　种(不考虑与质粒的连接问题)。
(3)将目的基因导入受体细胞:除图示的方法外,将抗虫基因导入棉花细胞的方法还有　　　　 　,该方法相比于图示方法的优点是　　　　　 　
　　　　　　　　　　　　　　　　　(答出2点)。
(4)目的基因的检测与鉴定:除了利用PCR技术检测目的基因是否成功插入并转录外,还需在个体水平进行鉴定,为判断转基因抗虫棉是否培育成功,需要对其进行的操作是　　　　　　　　　　　　　　　　 　　　　
　　　 　　。
14.[2025·重庆南岸区二模] 利用转基因技术,将奶牛细胞中编码凝乳酶的基因转移到大肠杆菌细胞中,以达到大规模生产凝乳酶的目的。如图表示用作载体的质粒和凝乳酶基因所在DNA片段,图中标注了相关限制酶的酶切位点,不同限制酶的识别序列和酶切位点不同。
(1)利用PCR扩增凝乳酶基因所在的DNA片段应选择的两种引物是　　　　　,引物的作用是　　　　　　　　　　　　　　 　　 　　　　　　。
(2)构建重组质粒的过程中应该选用的两种限制酶是　　　　　　　　,使用双酶切的优势是　　　　　　　　　　 　　　　　　　　　　　　　　　(答2点)。
(3)若转化过程中,含抗生素基因的未重组载体也可转化大肠杆菌,请写出利用标记基因筛选出目的菌的简要实验思路: 　


　 。
(4)除选择培养基外,可用于检测转基因是否成功的技术还有　　　　　　　　　　　　　　　　　(答2种)。
课时作业(五十四)　基因工程的基本工具和基本操作程序
1.D　[解析] 基因工程中目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物,A正确;限制性内切核酸酶和DNA连接酶是获取目的基因和构建基因表达载体必要的工具酶,B正确;大肠杆菌属于原核生物,没有内质网和高尔基体,不能对核糖体上合成的人胰岛素原进行加工修饰,所以胰岛素原没有生物活性,C正确;载体上的抗性基因有利于筛选含重组DNA的细胞,但不能促进目的基因的表达,D错误。
2.B　[解析] DNA连接酶催化两个DNA片段间磷酸二酯键的形成,DNA聚合酶在DNA复制时将单个脱氧核苷酸连接到已有的核苷酸链上,两者均能催化形成磷酸二酯键,A正确,B错误;限制酶特异性识别双链DNA分子的特定核苷酸序列并进行切割,无法识别或切割RNA片段,C正确;限制酶主要来源于原核生物,因为自身DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰,所以不会剪切自身的DNA,D正确。
3.D　[解析] BamHⅠ、BglⅡ、MboⅠ识别序列不同,但切出的黏性末端相同,属于同尾酶,A错误;根据相关限制酶的识别序列和切割位点可知,由于BamHⅠ的识别序列包括MboⅠ的识别序列,所以当目的基因编码区内有BamHⅠ识别序列时,使用MboⅠ也会破坏目的基因,B错误;BamHⅠ、BglⅡ的识别序列不同,但会产生相同的黏性末端,若用二者切割目的基因,不能防止目的基因自身的环化,C错误;用DNA连接酶将BamHⅠ和BglⅡ形成的黏性末端连接后,不能被二者切开,但可被限制酶MboⅠ切开,D正确。
4.D　[解析] 载体需和目的基因一起进入宿主细胞,因此载体应对宿主细胞无伤害,以免影响宿主细胞的正常生命活动,A正确;载体应具有一个至多个限制酶切割位点,以便与目的基因拼接形成重组DNA,B正确;基因工程中用到的质粒都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的,C正确;切割DNA分子的酶,如限制酶,是基因工程的工具之一,但不能作为载体,D错误。
5.D　[解析] 由题图可知,目的基因两侧及质粒都有限制酶EcoRⅠ的酶切位点,所以在基因工程中若只用一种限制酶完成对质粒和外源DNA的切割,可选EcoRⅠ,A正确;如果将一个外源DNA分子和一个质粒分别用EcoRⅠ酶切后,再用DNA连接酶连接,形成一个含有目的基因的重组DNA,此重组DNA中EcoRⅠ酶切位点有2个,B正确;为了防止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化,酶切时可使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时处理,C正确;一个图甲所示的质粒分子经EcoRⅠ切割后,产生两个黏性末端,因此含有2个游离的磷酸基团,D错误。
6.D　[解析] 引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸,A正确;构建基因表达载体是基因工程的核心步骤,将目的基因导入受体细胞不涉及碱基互补配对,B正确;转化是指目的基因进入受体细胞内,并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程,C正确;PCR技术不能检测目的基因是否翻译,D错误。
7.C　[解析] PCR一般要经历多次循环,每次循环可以分为变性、复性和延伸三步,引物与模板链的结合属于复性过程,A错误;变性过程的温度一般要高于复性过程,B错误;题意显示,引物与其模板链形成的杂合分子的解链温度称为引物的Tm值,复性过程的温度应设置为略低于Tm值,否则会导致引物结合失败,C正确;引物的 Tm 值越接近,两引物与对应模板链结合的同步性越好,PCR结果可能越好,但两引物之间能否结合主要与其碱基序列有关,D错误。
8.A　[解析] 基因表达载体除目的基因、标记基因外,还必须有启动子、终止子、复制原点等,即①中Ti质粒应包含启动子、终止子、标记基因和复制原点等元件,A正确;②是目的基因表达载体,其构建过程需要限制酶和DNA连接酶,B错误;③侵染植物细胞后,重组Ti质粒上的T DNA整合到受体细胞的染色体DNA上,C错误;即使④的染色体上含抗虫基因,但目的基因也可能不能转录或者不能翻译,或者表达的蛋白质不具有生物活性,即⑤不一定表现出抗虫性状,D错误。
9.D　[解析] RNA聚合酶识别和结合强启动子,启动转录,A正确;DNA连接酶可以连接两个DNA片段,可用DNA连接酶将基因M与外源强启动子连接,B正确;由题图可知,利用PCR检测连接是否成功时选择的引物可为①③,C正确;引物可使DNA聚合酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸,D错误。
10.C　[解析] 若受体细胞为大肠杆菌,大肠杆菌为原核生物,没有高尔基体和内质网,蛛丝蛋白需要进一步加工才具有相应的功能,A正确;若想让目的基因在乳腺中特异性表达,需要将目的基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起,B正确;在PCR扩增时DNA聚合酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸,故用PCR技术扩增题图中蛛丝蛋白基因应选择引物②和引物③,C错误;在DNA分子扩增时,需要2种引物,由于新合成的子链都需要引物作为复制的起点,故所需的引物数目等于新合成的DNA子链数目,若一个蛛丝蛋白基因扩增了4次,共需要消耗引物的数量为2×24-2=30(个),D正确。
11.C　[解析] 将目的基因插入质粒时,用到的是DNA连接酶,而不是DNA聚合酶,A错误;用Ca2+处理大肠杆菌细胞,是使其处于感受态,从而能够吸收周围环境中的DNA分子,而不是使细胞壁软化,B错误;由题图可以看出,目的基因的转录方向与启动子的方向相反,启动子无法启动目的基因的转录,所以大肠杆菌不能表达该目的基因,C正确;分析题图可知,β 半乳糖苷酶基因没有被破坏,其可以正常表达,产生β 半乳糖苷酶,分解X gal产生蓝色物质,可见含重组质粒的大肠杆菌形成的是蓝色菌落,含空质粒的大肠杆菌也可能形成蓝色菌落,因此在含有X gal和四环素的培养基上形成的蓝色菌落不一定是含重组质粒的大肠杆菌,D错误。
12.C　[解析] 启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位,它能驱动基因转录出mRNA,启动子本身通常不被转录,转录的起始位点是DNA分子上转录开始的那个特定的核苷酸,A正确;转录时,以DNA的一条链(模板链)为模板,按照碱基互补配对原则合成mRNA,因此该基因转录生成的mRNA与其模板链互补,B正确;用引物F2和R2扩增只能检测是否成功导入融合基因,不能确定是否是正向连接,应该选用F1和R2来确定是否定向导入了融合基因,C错误;GFP基因为绿色荧光蛋白基因,若融合基因成功表达,转基因拟南芥细胞会表达出绿色荧光蛋白,从而发出绿色荧光,所以可通过观察细胞是否发出绿色荧光来判断融合基因是否成功表达,D正确。
13.(1)人工合成
(2)易出现目的基因和质粒的自身环化,及目的基因与质粒的错误连接　5
(3)花粉管通道法　无须进行组织培养,缩短培育周期;成本低,操作简单(言之有理即可)
(4)在转基因抗虫棉生长期投放棉铃虫幼虫,观察抗虫棉的生长情况(合理即可)
[解析] (1)在已知Cry1A基因序列的前提下,可采用人工合成方法获取新的目的基因。(2)基因工程中,目的基因和质粒都需要经过酶切,如果处理不当,容易出现目的基因和质粒的自身环化,及目的基因与质粒的错误连接,影响后续的转化效率。由表可知,Xma Ⅰ 和Sma Ⅰ 的识别序列相同,只是酶切位点不同,因此,Sma Ⅰ 的识别序列也能被Xma Ⅰ 识别。分析图乙,可选择的限制酶组合有5种可能,即EcoR Ⅰ 和BamH Ⅰ 、EcoR Ⅰ 和Sma Ⅰ 、Sma Ⅰ 和BamH Ⅰ 、Xma Ⅰ 和EcoR Ⅰ 、Xma Ⅰ 和BamH Ⅰ 。(3)花粉管通道法是一种简便的转基因方法,可以直接将外源DNA导入植物的生殖细胞,无须进行组织培养,缩短培育周期;成本低,操作简单。(4)欲在个体水平上鉴定转基因抗虫棉是否真正培育成功,需在转基因抗虫棉生长期投放棉铃虫幼虫,观察抗虫棉的生长情况。
14.(1)引物1和引物2　使DNA聚合酶能沿引物的3'端连接脱氧核糖核苷酸,延伸子链
(2)BclⅠ、HindⅢ　防止质粒和目的基因自身环化、防止目的基因反向插入质粒
(3)首先将转化后的大肠杆菌接种到含四环素的固体培养基上进行培养,然后将长出的菌落用灭菌的绒布原位转移至含氨苄青霉素的培养基中培养,比较两培养基上菌落的生长及位置分布,挑取含氨苄青霉素的培养基中没有而在含四环素的培养基相应位置存在的菌落
(4)PCR、核酸分子杂交、抗原—抗体检测
[解析] (1)由于子链的延伸方向是5'→3',脱氧核苷酸依次连接在引物的3'端,因此,利用PCR扩增凝乳酶基因所在的DNA片段应选择的两种引物是引物1和引物2。引物在PCR中的作用是使DNA聚合酶能沿引物的3'端连接脱氧核糖核苷酸,延伸子链。(2)由于质粒中存在两个限制酶BamHⅠ的切割位点,且会把四环素抗性基因破坏掉,因此构建重组质粒的过程中应该选用的两种限制酶是BclⅠ、HindⅢ,这两种限制酶的切割位点位于目的基因的两侧,且在质粒中都存在相应的识别序列。在构建重组质粒时,使用双酶切的优势是防止质粒和目的基因自身环化、防止目的基因反向插入质粒。(3)若转化过程中,含抗生素基因的未重组载体(空质粒)也可转化大肠杆菌,即导入重组质粒和空质粒的大肠杆菌均会在含四环素的培养基上生长,但重组质粒中氨苄青霉素抗性基因受到破坏,因此导入重组质粒的大肠杆菌对氨苄青霉素不具有抗性,而导入空质粒的大肠杆菌对氨苄青霉素有抗性,则具体的筛选思路为首先将转化后的大肠杆菌接种到含四环素的固体培养基上进行培养,然后将长出的菌落用灭菌的绒布原位转移至含氨苄青霉素的培养基中培养,比较两培养基上菌落的生长及位置分布,挑取含氨苄青霉素的培养基中没有而在含四环素的培养基相应位置存在的菌落。(4)除选择培养基外,还可在分子水平上检测转基因是否成功,具体的技术有PCR、核酸分子杂交、抗原-抗体检测。

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