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第52讲　基因工程的基本操作程序
考点1　基因工程的基本操作程序
一、目的基因的筛选与获取
1．筛选合适的目的基因
(1)目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。主要是指编码蛋白质的基因。
(2)筛选目的基因的方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。
2．利用PCR获取和扩增目的基因
(1)原理：DNA半保留复制。
(2)条件：DNA模板、2种引物、耐高温的DNA聚合酶和4种脱氧核苷酸。
(3)PCR反应过程
(4)PCR产物的鉴定：常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定。
二、基因表达载体的构建——基因工程的核心
1．构建基因表达载体的目的
(1)使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。
(2)使目的基因能够表达和发挥作用。
2．基因表达载体的组成
3．基因表达载体的构建过程
三、将目的基因导入受体细胞
四、目的基因的检测与鉴定
考点2　DNA片段的扩增及电泳鉴定
1．实验基础
(1)PCR原理：利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。
(2)电泳：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
(3)PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。
2．实验步骤
(1)DNA片段的扩增
(2)DNA片段的电泳鉴定
①根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量分数为0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。
②将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。
③待凝胶溶液完全凝固后，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。
④将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1 mm为宜。
⑤将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。
⑥接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5 V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。
⑦取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。

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