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第55讲　重组DNA技术的基本工具
选择性必修3　生物技术与工程
第九单元　生物技术与工程
1．阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。　2．实验：DNA的粗提取与鉴定。
一、基因工程的概念
考点1　重组DNA技术的基本工具
DNA分子
转基因
遗传特性　
生物类型
基因重组
特别提醒
基因工程的理论基础
二、基因工程的诞生和发展
1．肺炎链球菌转化实验不仅证明了遗传物质是DNA，还证明了DNA可以在同种生物的不同个体之间______。
2．DNA双螺旋结构的提出和____________的证明。
3．中心法则的确立。
4．__________的破译。
5．基因转移载体和_____________________________的发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。
转移
半保留复制
遗传密码
限制酶、DNA连接酶和逆转录酶
6．_____体外重组的实现。
7．重组DNA表达实验的成功。
8．DNA测序和合成技术的发明。
9．_____技术的发明。
10．____________技术可以实现对特定基因的定点插入、敲除或替换。
DNA
PCR　
基因组编辑
三、重组DNA技术的基本工具
1．限制性内切核酸酶(也称“限制酶”)
原核生物
特定核苷酸序列
磷酸二酯键
黏性末端　
特别提醒
(1)限制酶的识别序列一般由6个核苷酸组成，少数由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。
(2)限制酶作用的化学键只能是磷酸二酯键。
(3)在切割含目的基因的DNA分子时，需用限制酶切割两次此DNA分子，产生4个末端。只有这样才能使目的基因的两端都有可连接的黏性末端或平末端。
教材隐性知识
1．(人教版选择性必修3 P71旁栏思考)存在于原核生物中的限制酶的主要作用是_______________________________________________
___________________________________________________________。
提示：切割外源DNA以保证自身安全，防止外来病原体的危害
2．(人教版选择性必修3 P71正文)用两种不同的限制酶切割目的基因的优点是___________________________________________________
___________________________________________________________。
提示：防止质粒和目的基因的自我环化及质粒和目的基因的反向连接
2．DNA连接酶
磷酸二酯键
大肠杆菌
黏性末端和平末端
3．载体
噬菌体
一个至多个
自我复制
受体DNA
标记
教材隐性知识
3．(人教版选择性必修3 P72旁栏思考)DNA连接酶和DNA聚合酶的作用不相同，主要区别在于__________________________________
___________________________________________________________。
提示：DNA连接酶连接的是两个DNA片段，而DNA聚合酶是将单个的脱氧核苷酸连接到脱氧核苷酸链上
4．(人教版选择性必修3 P73正文)实践中常用某些病毒载体作为基因工程的工具，其除具备普通“质粒载体”的条件外，还应具有的条件是_______________________________________________________
___________________________________________________________
___________________________________________________________。
提示：对靶细胞具有较高的转化效率；不能增殖；对细胞无害
[深化拓展]
1．酶切方法：单酶切和双酶切
(1)单酶切
①过程：先用同一种限制酶切割载体和含目的基因的DNA分子，获得带有相同黏性末端或平末端的片段。再通过DNA连接酶连接平末端或相同的黏性末端，获得重组质粒。
②缺点：单酶切时，目的基因和载体的所有接口都是相同的，所以容易出现目的基因反接或自身环化，如下图所示。
(2)双酶切
①过程：利用两个不同限制酶切割目的基因和载体，使目的基因和载体均具有两个不同的黏性末端，就可以避免反接，并减少自身环化的情况。
②方向：插入位置前后分别要有启动子和终止子，保证目的基因的表达。
2．酶切位点选择
(1)不破坏目的基因和标记基因：若在目的基因、标记基因或其他重要结构上有某酶切位点，为避免这些结构被破坏，要避免使用相关的限制酶。
(2)根据T-DNA片段选择限制酶：若对Ti质粒进行操作，则酶切位点应位于T-DNA片段上，才能在农杆菌转化过程中将目的基因导入受体细胞基因组上。
(3)同尾酶的使用：同尾酶是指一组识别序列不同，但切出的黏性末端相同的限制酶。比如限制酶MboⅠ(　　　)和BamHⅠ(　　　　)就是一对同尾酶，NotⅠ(　　　　　　)和Bsp120Ⅰ(　　　　　　)也是同尾酶。尽管同尾酶切割的黏性末端相同，可以被DNA连接酶连接，但是由于两端的序列不同，连接后的产物失去酶切位点，除非特殊情况，一般不会使用。
1．基因工程的原理是基因重组，此变异是不定向的。 (　　)
提示：此变异是定向的。
2．使用不同的限制酶也能产生相同的黏性末端。 (　　)
×
√
×
√
3．某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时，发现DNA完全没有被酶切，可能的原因并提出的解决方法为：酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等。 (　　)
提示：酶切条件不合适通常会使切割效果下降，此时应有部分DNA被酶切。
4．作载体的质粒都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。 (　　)
(人教版选择性必修3 P70～71图文信息)我国科学家将蓝细菌ictB蛋白(能高效转运和浓缩CO2)的基因(ictB基因)与水稻叶绿体基因组中PSbA基因的启动子(叶片特异性表达)连接成重组DNA，然后将重组DNA与Ti质粒构建成表达载体，再导入水稻叶肉细胞的叶绿体中，最终成功获得了转ictB基因水稻，提高了水稻的产量。在ictB基因表达载体的构建中，含PSbA启动子和ictB基因的重组DNA分子和Ti质粒的酶切位点如图所示。
(1)为使重组DNA分子能定向插入Ti质粒的相应区段中，可在重组DNA分子两端添加限制酶的识别序列，据图可知，M端、N端应添加的限制酶识别序列分别是________、________。
(2)经过酶切的重组DNA分子和 Ti质粒进行连接时，可选用______________(填“E．coli DNA连接酶”或“T4 DNA连接酶”)。
(3)构建ictB基因的表达载体时需用到连接酶，其中连接酶作用的底物为图中的___________(填“A”“B”或“A和B”)。
A　　　　　　　　　　　　B
提示：(1)BglⅠ　EcoRⅤ
(2)T4 DNA连接酶
(3)B
考向1　基因工程工具酶的应用
1．(链接人教版选择性必修3 P71图3-3及P72正文)蓝细菌中的B基因能表达一种有助于蓝细菌高效吸收的载体蛋白，B基因经限制酶Sau3AⅠ和BamHⅠ分别切割后，可形成4个和2个大小不同的片段。Sau3AⅠ和BamHⅠ的识别序列及切割位点如下表所示。下列叙述正确的是(　　)
A．这两种酶切割产生的片段连接后的新片段不能再被这两种酶切割
B．若同时用这两种酶处理该基因，会形成4个大小不同的DNA片段
C．两种限制酶切割后形成的末端只能通过T4 DNA连接酶连接
D．E．coli DNA连接酶连接平末端的DNA片段效率高于T4 DNA连接酶
限制酶名称 识别序列和切割位点
BamHⅠ
Sau3AⅠ
√
B　[Sau3AⅠ和BamHⅠ切割产生的黏性末端相同，都是—GATC，切割后产生的片段能够相连，连接后的片段仍含有GATC序列，可被Sau3AⅠ识别并切割，A错误；B基因经Sau3AⅠ处理后会形成4个大小不同的DNA片段，说明B基因上有3个Sau3AⅠ的酶切位点，BamHⅠ的识别序列包含在Sau3AⅠ识别序列中，若用两种酶共同处理B基因，相当于用Sau3AⅠ处理，会形成4个大小不同的DNA片段，B正确；上述两种限制酶切割出的末端既可用E．coli DNA连接酶连接，也可用T4 DNA连接酶连接，C错误；E．coli DNA连接酶连接平末端的DNA片段效率远低于T4 DNA连接酶，D错误。]
2．(链接人教版选择性必修3 P75拓展应用)同尾酶指识别位点不同但能切出相同黏性末端的限制酶；同裂酶指具有相同识别序列的限制酶(切割位点相同或不同均可)。几种基因工程中常用的限制酶如表所示。下列叙述错误的是(　　)
限制酶的名称 识别和切割位点
HinP1Ⅰ
GlaⅠ
HhaⅠ
A．HinP1Ⅰ和HhaⅠ为同裂酶，切出的黏性末端不同
B．HinP1Ⅰ和HpaⅡ切割的产物连接后，其序列不能被GlaⅠ切割
C．HinP1Ⅰ和NarⅠ为同尾酶，它们切割的产物连接后的序列不能被GlaⅠ切割
D．某质粒仅含1个GlaⅠ的识别位点，则该质粒能被NarⅠ切割的概率为1/16
√
限制酶的名称 识别和切割位点
HpaⅡ
NarⅠ
C　[由题表可知，二者识别序列均为5′-GCGC-3′，所以HinP1Ⅰ和HhaⅠ为同裂酶；HinP1Ⅰ切割后产生的黏性末端是-G和CGC-，HhaⅠ切割后产生的黏性末端是-GCG和C-，二者黏性末端不同，A正确。HinP1Ⅰ的识别和切割位点是　　　　　　，HpaⅡ的识别和切割位点是　　　　　　，二者切割产物连接后的序列为5′-GCGGC-3′，GlaⅠ的识别和切割位点是　　　　　　，故连接后的5′-GCGG-3′序列不能被GlaⅠ识别和切割，B正确。由题表分析可知，
HinP1Ⅰ和NarⅠ切割产物连接后的序列为5′-GCGC-3′，GlaⅠ的识别和切割位点是　　　　　　，该序列能被GlaⅠ识别和切割，C错误。由题表分析可知，NarⅠ的识别和切割位点是　　　　　　，包含GlaⅠ的识别位点，在仅含1个GlaⅠ识别位点的情况下，该质粒能被NarⅠ切割的概率为1/16(因为在GlaⅠ识别位点的基础上，前后各增加一个碱基，共16种可能情况，其中有一种是NarⅠ的识别位点)，D正确。]
考向2　基因工程载体的应用
3．(不定项)(链接人教版选择性必修3 P72图3-4、正文)Ti质粒的Vir基因表达产生的Vir蛋白能在T-DNA左右边界序列中产生切口，并复制出单链T-DNA从Ti质粒上释放后进入植物细胞。T-DNA利用左右边界序列与植物细胞DNA分子中某些序列有极强的同源性，插入植物细胞基因组中。T-DNA的生长素基因和细胞分裂素基因能使植物组织过度
生长，形成瘤状组织(冠瘿)，冠瘿碱合成基因使植物细胞
合成并分泌冠瘿碱，为农杆菌的生长提供碳源和氮源。
下列说法错误的是(　　)
A．Ti质粒中的冠瘿碱合成基因与植物细胞染色体DNA整合后，其表达产物可将冠瘿碱分解
B．为保证转基因植物正常生长，Ti质粒作载体时需将生长素基因和细胞分裂素基因敲除
C．应将目的基因插入Ti质粒的T-DNA上，且不能破坏左右边界序列
D．Ti质粒作为基因工程载体时，需将Vir基因替换成标记基因，用于重组DNA分子的筛选
√
√
AD　[Ti质粒中的冠瘿碱合成基因与植物细胞染色体DNA整合后，冠瘿碱合成基因使植物细胞合成并分泌冠瘿碱，A错误；Ti质粒上的T-DNA的生长素基因和细胞分裂素基因能使植物组织过度生长，所以Ti质粒作载体时需将生长素基因和细胞分裂素基因敲除，B正确；目的基因插入Ti质粒的T-DNA，且不破坏左右边界序列，可以随T-DNA整合到受体细胞的染色体DNA上，C正确；Ti质粒的Vir基因表达产生的Vir蛋白能在T-DNA左右边界序列中产生切口，并复制出单链T-DNA从Ti质粒上释放后进入植物细胞，所以Vir基因不能替换成标记基因，D错误。]
一、实验原理
考点2　DNA的粗提取与鉴定
酒精　
2 mol/L
蓝色
二、实验步骤
白色
丝状物
二苯胺
1．本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核(无DNA)。可选用鸡血细胞作材料。
2．加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫。加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。
3．二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。
4．提取植物细胞的DNA时，加入的洗涤剂能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；加入食盐(主要成分是NaCl)的目的是溶解DNA。
5．在DNA进一步提纯时，选用冷却的体积分数为95%的酒精溶液的作用是溶解杂质和析出DNA。
1．(链接人教版选择性必修3 P74～75探究·实践)如图为鸡血细胞中DNA的粗提取和鉴定实验过程中的部分操作示意图，请据图分析，下列相关叙述中，正确的是(　　)
A．该实验的正确操作顺序是③→①→②→④→⑤
B．用同样方法从等体积猪血和鸡血中提取的DNA量相近
C．⑤表示要鉴定步骤①中所得到的白色丝状物主要成分为DNA，可使用二苯胺试剂来鉴定，沸水浴冷却后，出现蓝色的试管组别是对照组
D．步骤①的目的是初步分离DNA与蛋白质，析出并获得DNA；步骤④中在2 mol/L的NaCl溶液中，DNA的溶解度较大
√
D　[DNA的粗提取和鉴定步骤：加入蒸馏水，破碎细胞→过滤，获取含DNA的滤液→去除滤液中的杂质→DNA的析出→鉴定，因此图中表示正确的实验操作顺序是③→②→①→④→⑤，A错误；猪成熟的红细胞中没有细胞核，提取不到DNA，用同样方法从等体积猪血和鸡血中提取的DNA量不相同，B错误；⑤表示要鉴定步骤①中所得到的白色丝状物主要成分为DNA，可使用二苯胺试剂来鉴定，沸水浴冷却后，出现蓝色的试管组别是实验组，C错误；步骤①的目的是析出并获得DNA，步骤④中在2 mol/L的NaCl溶液中，DNA的溶解度较大，D正确。]
2．(链接人教版选择性必修3 P74～75探究·实践)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是(　　)
A．整个提取过程中可以不使用离心机
B．研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中
C．鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变
D．仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰
√
A　[在DNA的粗提取与鉴定实验中，可将获得的研磨液用纱布过滤后，在4 ℃的冰箱中放置几分钟，再取上清液，也可以直接将研磨液用离心机进行离心后取上清液，A正确；研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后，DNA在上清液中，应取上清液倒入烧杯中，B错误；鉴定过程中用沸水浴加热，DNA双螺旋结构会发生改变，C错误；加入二苯胺试剂后沸水浴处理的时间要在5分钟以上，且要等到冷却后再观察结果，这样才可以观察到较为明显的显色反应，仅设置一个对照组可以排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰，D错误。]
体验真题　感悟高考 · 有章可循
1．(不定项)(2025·江苏卷)图示人体正常基因A突变为致病基因a及Hind Ⅲ切割位点。AluⅠ限制酶识别序列及切割位点为　　　　，下列相关叙述正确的有(　　)
A．基因A突变为a是一种碱基增添的突变
B．用两种限制酶分别酶切A基因后，形成的末端类型不同
C．用两种限制酶分别酶切a基因后，产生的片段大小一致
D．产前诊断时，该致病基因可选用Hind Ⅲ限制酶开展酶切鉴定
√
√
BD　[由题图可知，基因A突变为基因a是由于T—A替换成了G—C，属于碱基的替换，A错误；Hind Ⅲ切割后形成的是黏性末端，AluⅠ切割后形成的是平末端，B正确；突变后的基因a中间片段不存在Hind Ⅲ的切割位点，存在AluⅠ的切割位点，基因a分别用Hind Ⅲ和AluⅠ酶切后产生的片段大小不一致，C错误；正常的基因A用Hind Ⅲ酶切后产生4个片段，突变后的基因a用Hind Ⅲ酶切后产生3个片段，D正确。]
2．(2024·安徽卷)下列关于“DNA 粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是(　　)
A．实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低
B．利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNA
C．DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA粗提物
D．将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应，可检测溶液中是否含有蛋白质杂质
√
D　[研磨液有利于蛋白质与DNA分离和稳定DNA的状态，若换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低，A正确；DNA不溶于酒精，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精，可初步分离DNA，B正确；DNA在NaCl溶液中的溶解度随着NaCl浓度的变化而改变，因此该原理可用于纯化DNA粗提物，C正确；在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺试剂会被染成蓝色，二苯胺试剂可用于鉴定DNA，无法检测蛋白质，D错误。]
3．(2023·全国新课标卷)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建基因表达载体。限制酶的切割位点如图所示。
下列基因表达载体构建方案合理且效率最高的是(　　)
A．质粒和目的基因都用酶3切割，用E．coli DNA连接酶连接
B．质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接
C．质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接
D．质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E．coli DNA连接酶连接
√
C　[酶3切割后得到的是平末端，E．coli DNA连接酶连接平末端的效率要远远低于T4 DNA连接酶，应该用T4 DNA连接酶连接，A不符合题意；质粒用酶3切割后得到的是平末端，目的基因用酶1切割后得到的是黏性末端，二者不能连接，B不符合题意；质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4 DNA连接酶连接后，还能保证目的基因在质粒上的连接方向，此基因表达载体的构建方案最合理且高效，C符合题意；若用酶2和酶4切割质粒和目的基因，会破坏质粒上的抗生素抗性基因，连接形成的基因表达载体缺少标记基因，无法进行后续的筛选，D不符合题意。]
4．(2023·广东卷)“DNA的粗提取与鉴定”实验的基本过程是：裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是(　　)
A．裂解：使细胞破裂释放出DNA等物质
B．分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等
C．沉淀：可反复多次以提高DNA的纯度
D．鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色
√
D　[裂解是加蒸馏水让细胞吸水涨破，释放出DNA等物质，A正确；DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理可初步分离DNA与蛋白质，去除混合物中的多糖、蛋白质，B正确；DNA在不同浓度NaCl中溶解度不同，通过控制NaCl的浓度反复多次提高DNA纯度，C正确；将DNA溶解于NaCl溶液，加入二苯胺试剂，混合均匀后，沸水中加热五分钟，待冷却后，溶液能呈现蓝色，D错误。]
1．(2025·湖北名校联盟模拟)限制酶BsaⅠ识别序列如下图，若用BsaⅠ切割某基因，理论上产生的黏性末端最大种类数是(　　)
A．16种　　　　　　
B．64种
C．256种
D．1 024种
课时数智作业(五十五)　重组DNA技术的基本工具
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
√
C　[用BsaⅠ切割某基因，黏性末端有4个碱基，由于N代表任一碱基，则产生的黏性末端最大种类数是44＝256种，C正确。]
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
2．(2025·广东惠州一模)限制性内切核酸酶是基因工程中常用的一种酶。如图是6种不同限制酶的识别序列和切割位点，下列叙述错误的是(　　)
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
注：箭头表示识别序列中切断部位。
A．KpnⅠ和Aco65Ⅰ切割位点不同，但形成黏性末端是相同的
B．与EcoRⅠ相比，HhaⅠ识别序列较短，该序列在DNA中出现的概率高
C．BamHⅠ切割产生的黏性末端能够与MboⅠ切割成的黏性末端拼接
D．限制酶识别序列大多是沿中心轴回转180°相反重合
√
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
A　[由题图可知，KpnⅠ和Aco65Ⅰ切割位点不同，形成的黏性末端也不同，A错误；通常识别序列越短，其在DNA中出现的概率越高，B正确；BamHⅠ切割产生的黏性末端与MboⅠ切割成的黏性末端相同，故BamHⅠ切割产生的黏性末端能够与MboⅠ切割成的黏性末端拼接，C正确；限制酶的识别序列通常是回文序列，即沿中心轴回转180°相反重合，D正确。]
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
3．(2025·重庆一中月考)一般情况下，限制酶的识别序列越长，在DNA中出现的概率越低，切割频率越小。限制酶K的识别序列为　　　　　　　，限制酶L的识别序列为　　　　　。下列叙述正确的是(　　)
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
A．若DNA中碱基随机分布，限制酶L的识别序列在DNA中出现的理论概率是限制酶K的16倍
B．限制酶K的识别序列更长，故其在不同DNA分子中的切割频率都低于限制酶L
C．限制酶K的识别序列富含A－T碱基对，表明其切割活性依赖于DNA双链的局部解旋能力
D．限制酶K和L切割DNA后产生的片段可被T4 DNA连接酶“缝合”成一个新的DNA片段
√
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
A　[已知DNA中碱基随机分布，且DNA的碱基有4种(A、T、C、G)。 限制酶L的识别序列为　　　　，其在DNA中出现的理论概率为 (1/4)4。限制酶K的识别序列为　　　　　，共6个碱基，其在DNA中出现的理论概率为(1/4)6。即限制酶L的识别序列在DNA中出现的理论概率是限制酶K的16倍，A正确。不同DNA分子的碱基序列不同，若某DNA分子中限制酶K的识别序列较多，而限制酶L的识别序列较少，那么限制酶K在该DNA分子中的切割频率可能高于限制酶L，B错误。限制酶的切割活性依赖于其特定的空间结构和作用机制，而不是依赖于DNA双链的局部解旋能力，C错误。限制酶K和L切割DNA后产生的片段末端不互补，只有互补的末端或都是平末端才能被T4 DNA连接酶“缝合”成一个新的DNA片段，D错误。]
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
4．(2025·海南海口模拟)下列有关DNA粗提取和鉴定实验的叙述，正确的是(　　)
A．酵母菌、菜花和猪的成熟红细胞都可以作为提取DNA的材料
B．冷却的酒精可析出DNA，降低DNA水解酶活性，增加DNA分子的稳定性
C．对研磨液中的材料充分研磨后进行离心可加速DNA沉淀，使DNA分子更加稳定
D．将白色丝状物溶于2 mol/L的NaCl溶液，加入二苯胺试剂后即会出现蓝色
√
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
B　[猪的成熟红细胞没有细胞核和众多细胞器，几乎不含DNA，不能作为提取DNA的材料，A错误。DNA不溶于酒精，而细胞中的某些蛋白质等物质则可以溶于酒精。冷却的酒精可降低DNA水解酶的活性，减少DNA的水解，同时使DNA析出，从而增加DNA分子的稳定性，B正确。对研磨液中的材料充分研磨后进行离心，其目的是使细胞碎片等沉淀，而DNA存在于上清液中，并不是加速DNA沉淀，且离心操作并不能使DNA分子更加稳定，C错误。将析出的DNA溶解在2 mol/L的NaCl溶液中，加入二苯胺试剂后需要水浴加热才会呈现蓝色，D错误。]
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
5．(2025·吉林长春模拟)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶切质粒，构建基因表达载体，并导入受体菌中。下列叙述正确的是(　　)
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
A．若用ScaⅠ酶切质粒，所得产物经凝胶电泳可形成1 个条带
B．若用HindⅢ和ScaⅠ酶切，可防止目的基因与质粒的反向连接
C．若用PvuⅠ酶切，并用含四环素的培养基筛选，存活受体菌中不一定含有目的基因
D．若用SphⅠ酶切，筛选时应先将转化处理的菌液涂布到含四环素的培养基中长成菌落，再影印接种到含氨苄青霉素的培养基中
√
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
C　[由于图示质粒中有两个ScaⅠ酶的酶切位点，所以用ScaⅠ酶切质粒，能得到2种DNA片段，所得产物经凝胶电泳可形成2个条带，A错误。若用HindⅢ和ScaⅠ酶切质粒，由于质粒中有两个ScaⅠ酶的切割位点，因而不一定能防止目的基因与质粒的反向连接，B错误。由于PvuⅠ的酶切位点位于氨苄青霉素抗性基因之中，若用PvuⅠ酶切质粒，则会破坏氨苄青霉素抗性基因，故重组质粒中只有四环素抗性基因未被破坏。因此成功导入重组质粒的受体细胞具有对四环素的抗性，若导入的是空质粒，则受体细胞也具有对四环素的抗性，进而可推测，在含四环素培养基中形成的菌落，不一定
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
含有目的基因，C正确。若用SphⅠ酶切，则会破坏四环素抗性基因(TetR)，氨苄青霉素抗性基因(AmpR)不受影响，因此携带目的基因的受体菌在含AmpR(氨苄青霉素抗性基因)的培养基中能形成菌落，在含TetR的培养基中不能形成菌落，因此，筛选时应先将转化处理的菌液涂布到含氨苄青霉素的培养基中长成菌落，再影印接种到含四环素的培养基中，只在含氨苄青霉素的培养基上生长的菌落即为目的菌，D错误。]
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
6．(2025·江西九江二模)下图A、B所示为Ti质粒和含S基因的DNA片段及一些酶切位点，图中所示的限制酶切割位点及其所产生的末端都不相同。下列说法错误的是(　　)
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
A．最好选用XbaⅠ和Hind Ⅲ切割含S基因的DNA片段和Ti质粒
B．PCR扩增S基因时，引物结合在S基因两条链的3′端
C．S基因应插入Ti质粒T-DNA的启动子与终止子之间
D．基因工程中使用的各种限制酶切割DNA所形成的末端都不相同
√
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
D　[结合图示可知，最好选用XbaⅠ和Hind Ⅲ切割含S基因的DNA片段和Ti质粒，这样可以在目的基因的两端形成不同的黏性末端，同时在质粒的T-DNA中有这两个限制酶的识别序列各一个，进而可以保证目的基因的正向连接，A正确；PCR扩增S基因时，引物结合在S基因两条链的3′端，因为引物上子链的延伸方向是5′→3′，且引物和模板链是反向平行的，B正确；S基因应插入Ti质粒T-DNA的启动子与终止子之间，这样可以保证目的基因的转移和表达，C正确；基因工程中使用的各种限制酶切割DNA所形成的末端可能相同，即存在同尾酶，D错误。]
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
7．(不定项)(2025·辽宁沈阳一模)在基因工程操作中，科研人员利用两种限制酶(EcoRⅠ和NotⅠ)处理基因载体，进行电泳检测，结果如图所示，下列相关叙述错误的是(　　)
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
A．该基因载体最可能是环状DNA分子
B．该DNA分子上有2个EcoRⅠ的酶切位点
C．EcoRⅠ和NotⅠ的切点之间最长相距约9 kb
D．限制酶作用于该载体的氢键使其断裂
√
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
√
BD　[由题图可知，当仅用NotⅠ切割载体时，仅产生一种长度的DNA片段(10 kb)，因此该载体最有可能为环状DNA分子，该DNA分子上只有1个NotⅠ的酶切位点，A正确。当仅用EcoRⅠ切割载体时，产生2种长度的DNA片段：2 kb和6 kb，结合A项可知，用EcoRⅠ切割载体应产生3个DNA片段：2个2 kb和1个6 kb。故该DNA分子上有3个EcoRⅠ的酶切位点，B错误。两种限制酶同时切割时产生6 kb、2 kb和1 kb 3种长度的DNA片段：1个6 kb、1个2 kb、2个1 kb，所以两种限制酶的酶切位点最长相距9 kb，C正确；限制酶切割载体时直接破坏的是作用位点上两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键，D错误。]
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
8．(14分)(2025·黑龙江哈尔滨模拟)阿斯巴甜是一种新型高效的甜味剂，应用广泛。研究人员将来源于蜡样芽孢杆菌的蛋白酶基因(图1)与质粒pET-20b连接，构建重组质粒，转化大肠杆菌bl21得到重组大肠杆菌，从而构建全细胞催化剂(图2)，以此菌株高效转化苄氧羰基天冬氨酸和苯丙氨酸甲酯生产阿斯巴甜。此项技术解决了工业上化学合成法生产阿斯巴甜高成本、低得率、污染严重的问题。请回答下列问题：
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
限制酶 识别序列
HindⅢ ↓　　 　
AAGCTT
KpnⅠ ↓
GGTACC
PstⅠ 　　 ↓
CTGCAG
BamHⅠ ↓
GGATCC
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
(1)限制性内切核酸酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的_______________断开。结合图1和图2分析，实验中应该选择________________(填限制酶名称)切割质粒pET-20b，以实现目的基因与质粒的定向连接，不选择KpnⅠ的原因是_________________________________________________________。
磷酸二酯键(1分)
BamHⅠ和PstⅠ
KpnⅠ的识别序列不在启动子和终止子之间且会破坏目的基因
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
(2)已知蛋白酶基因两侧没有上述限制酶的识别序列和酶切位点，所以PCR技术扩增蛋白酶基因时，需要在引物两端增加相应的限制酶的识别序列，图1表示蛋白酶基因上一条链的碱基序列，箭头表示转录方向，则目的基因转录的模板链是_________链。结合表中各种限制酶的识别序列，复性时与此链相结合的引物上的碱基序列是5′-________________________-3′(写出10个碱基)。
甲
GGATCCTCTG
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
(3)已知图2中的70 bp和80 bp代表两种限制酶之间的碱基数，图3是限制酶HindⅢ切割重组质粒和质粒pET-20b后的电泳图谱，据此推测蛋白酶基因上有____________个HindⅢ的识别序列，判断依据是______________________________________________________________________________________________________________________，
同时也可以推理出目的基因的长度是________bp。
2(或两)(1分)
质粒pET-20b原有的2个HindⅢ切割位点被目的基因置换走1个后，得到环状的重组质粒仍然能被HindⅢ切割成3段
350
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
[解析]　(1)限制性内切核酸酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。结合图1和图2分析，实验中应选择BamHⅠ和PstⅠ切割质粒pET-20b，以实现目的基因与质粒的定向连接。不选择KpnⅠ的原因是KpnⅠ的识别序列不在启动子和终止子之间且会破坏目的基因。(2)图1表示蛋白酶基因上一条链的碱基序列，箭头表示转录方向，转录是mRNA由5′→3′，则目的基因转录的模板链是甲链。由于用BamHⅠ和PstⅠ切割质粒pET-20b，复性时与此链相结合的引物的5′端添加BamHⅠ的识别序列，因此该引物的碱基序列为5′-GGATCCTCTG-3′。
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
(3)质粒pET-20b原有的2个HindⅢ切割位点被目的基因置换走1个后，得到环状的重组质粒仍然能被HindⅢ切割成3段，推测蛋白酶基因上有2个HindⅢ的识别序列，同时也可以推理出目的基因的长度是350 bp。
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
(教师用书独具)
1．(2025·安徽合肥模拟)CRISPR/Cas9技术是一种革命性的基因编辑工具，具有深远的意义。它使得通过操纵DNA来提供所需的基因或让致病性的基因失去功能成为可能，极大地推动了科学研究、医疗和农业等领域的发展。CRISPR/Cas9基因编辑工作原理如图所示。下列说法正确的是(　　)
A．sgRNA通过碱基互补配对原则识别目标DNA分子
B．由图可知，Cas9蛋白的功能与DNA连接酶相似
C．Cas9-sgRNA复合物与限制酶均可断开特定部位的氢键
D．人工设计的sgRNA可作为翻译的模板合成Cas9蛋白
√
A　[从题图中可以看出，sgRNA与目标DNA分子之间存在结合，而RNA与DNA结合是通过碱基互补配对原则实现的，A正确。Cas9蛋白的作用是切断DNA，而DNA连接酶的作用是连接DNA片段，二者功能不同，B错误。限制酶切断的是特定部位的磷酸二酯键，而不是氢键；由题图可知Cas9-sgRNA复合物切断的也是DNA的磷酸二酯键，C错误。翻译的模板是mRNA，而不是人工设计的sgRNA，D错误。]
2．(2025·山东济宁模拟)用DNaseⅠ酶切割DNA分子，可产生一系列不同长度的DNA片段，且相邻片段只相差1个核苷酸。当DNA分子中的某一区段与特异的转录因子蛋白质结合后，加入DNaseⅠ酶时该区段会得到保护，在凝胶电泳放射性自显影图片上会出现一个空白区“足迹”，这种检测DNA序列的方法称为DNaseⅠ足迹法。上述过程如图所示，下列说法正确的是(　　)
A．需设置不添加DNaseⅠ酶的对照组
B．对照组的每个DNA分子只发生一次磷酸二酯键的断裂
C．未与特定蛋白结合的DNA切割后的片段长度相同
D．此方法可筛选能与DNA进行特异性结合的目标蛋白
√
D　[该实验是研究加入DNaseⅠ酶后，DNA分子与转录因子蛋白质结合及切割情况，不需要设置不添加DNaseⅠ酶的对照组，A错误；用DNaseⅠ酶切割DNA分子可产生一系列不同长度的DNA片段，且相邻片段只相差1个核苷酸，这说明对照组的DNA分子被多次切割，磷酸二酯键多次断裂，而不是只发生一次磷酸二酯键的断裂，B错误；因为用DNaseⅠ酶切割DNA分子会产生一系列不同长度的DNA片段，所以未与特定蛋白结合的DNA切割后的片段长度是不同的，C错误；由于当DNA分子中的某一区段与特异的转录因子蛋白质结合后，加入DNaseⅠ酶时该区段会得到保护，在凝胶电泳放射性自显影图片上会出现一个空白区“足迹”，通过观察是否有“足迹”，就可以判断是否有能与DNA进行特异性结合的目标蛋白，所以此方法可筛选能与DNA进行特异性结合的目标蛋白，D正确。]
3．(不定项)(2025·河北沧州模拟)进行DNA的粗提取时，某研究小组欲探究提纯时不同的去杂质方式对实验结果的影响，相关数据如下表所示。下列有关叙述正确的是(　　)
去杂质方式 沉淀质量/g OD260/OD280 二苯胺鉴定
离心 0.168 1.51 蓝色
4 ℃冰箱静置 0.1028 1.41
注：OD260/OD280可反映DNA纯度，纯DNA的OD260/OD280为1.8，当存在蛋白质等物质时，这一比值会明显降低。
A．实验流程为取材→破碎细胞→获得沉淀物→去除杂质→提纯→DNA鉴定
B．酵母菌、菠菜、菜花和猪血等均适宜作为实验材料进行DNA的粗提取
C．与4 ℃冰箱静置相比，离心法可获得更高纯度的DNA
D．为排除二苯胺加热后可能变蓝，可设置一组对照实验
√
√
CD　[该实验的流程为取材→破碎细胞→获得滤液(DNA溶解在滤液中)→去除杂质→提纯→DNA鉴定，A错误；酵母菌、菠菜、菜花细胞中均含有DNA，均适宜作为实验材料进行DNA的粗提取，但猪血中的成熟红细胞没有细胞核，不含DNA，不适合作为DNA粗提取的材料，B错误；OD260/OD280可反映DNA纯度，离心时OD260/OD280为1.51，而4 ℃冰箱静置时OD260/OD280为1.41，说明离心法可以获得更高纯度的DNA，C正确；可设置一组对照实验，将未加入DNA的二苯胺试剂加热，以排除二苯胺加热后可能变蓝的情况，D正确。]
谢 谢 ！

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