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第56讲　基因工程的基本操作程序
选择性必修3　生物技术与工程
第九单元　生物技术与工程
1．阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定等步骤。　2．实验：利用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段并完成电泳鉴定，或运用软件进行虚拟PCR实验。
一、目的基因的筛选与获取
1．筛选合适的目的基因
(1)目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。主要是指____________的基因。
考点1　基因工程的基本操作程序
编码蛋白质　
(2)筛选方法
①从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选是较为有效的方法之一。
②利用____________和序列比对工具进行筛选。
2．目的基因的获取
(1)人工合成目的基因。
序列数据库
(2)利用PCR获取和扩增目的基因。
引物
脱氧核苷酸　
耐高温　
温度
两种引物
耐高温的DNA聚合酶　
指数形式
琼脂糖凝胶电泳
(3)通过构建__________来获得目的基因。
基因文库
教材隐性知识
1．(人教版选择性必修3 P78图3-5)PCR反应体系中需要同时加入两种引物的原因是_____________________________________________
___________________________________________________________。
提示：DNA聚合酶只能从引物的3′端延伸DNA链，且DNA两条单链的序列不同，用两种引物才能确保DNA两条链同时被扩增
二、基因表达载体的构建——基因工程的核心
1．目的
(1)使目的基因在受体细胞中__________，并且可以遗传给下一代。
(2)使目的基因能够______和发挥作用。
稳定存在
表达
2．基因表达载体的组成
RNA聚合酶　
转录
3．基因表达载体的构建过程
三、将目的基因导入受体细胞
花粉管通道
T-DNA
染色体DNA
显微注射
受精卵　
Ca2+
特别提醒
(1)农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上。第一次导入是含目的基因的Ti质粒导入农杆菌。第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA导入受体细胞。
(2)导入的目的基因，可能存在于细胞质中，也可能整合到染色体DNA上。存在于染色体DNA上的目的基因有可能通过花粉传播进入杂草或其他作物中，造成“基因污染”。
四、目的基因的检测与鉴定
染色体DNA　
目的基因
mRNA　
抗原—抗体
教材隐性知识
2．(人教版选择性必修3 P82正文)转基因抗虫棉培育过程中，检测目的基因是否成功表达的常见方法有_____________、_____________。
提示：抗原—抗体杂交　采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫
[深化拓展]
1．筛选含有重组质粒的受体细胞的方法
(1)用“影印法”筛选含有重组质粒的受体细胞
①将混合处理后的细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养，能生长的是含重组质粒的细菌和含自身环化质粒的细菌，如图1、2、3、4、5菌落。
②再利用无菌的绒布影印到含有四环素的培养基上，如图能生长的菌落为2、3、4，则在含四环素培养基上不生长的即为含有目的基因的菌落，如图1、5菌落。
③最后，可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。
(2)用“蓝白斑”筛选含重组质粒的受体细胞
大肠杆菌产生的β-半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal切割成半乳糖和深蓝色的物质，在经人工插入外源基因后，大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因被插入的外源基因切断，无法形成完整的β-半乳糖苷酶，故不能对无色化合物X-gal进行切割，菌落呈白色，即在筛选平板上含有重组质粒的菌落呈白色。
2．引物设计应注意的问题
(1)设计引物的依据：目的基因两端的核苷酸序列。
(2)引物设计时既要考虑目的基因序列，又要考虑载体序列，原因：为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的5′端加上限制酶的酶切位点。
(3)使用的一对引物的序列不相同，因为目的基因两端具有不同的核苷酸序列。
(4)引物设计的要求(或引物失效的原因)：每种引物内部不能发生局部碱基互补配对；两种引物之间不能在局部发生碱基互补配对。
①每种引物内部不能发生局部碱基互补配对的原因：防止引物自身折叠。
②两种引物之间不能在局部发生碱基互补配对的原因：防止引物之间配对，导致引物不能同模板链结合。
(5)两种引物都结合在DNA模板链的3′端；脱氧核苷酸连接在引物的3′端进行延伸。
1．目的基因主要指编码蛋白质的基因。 (　　)
2．细菌的DNA聚合酶不需要用Mg2+激活。 (　　)
提示：细菌的DNA聚合酶需要用Mg2+激活。
3．DNA复制的引物使DNA聚合酶能够从引物的5′端开始连接脱氧核苷酸。 (　　)
提示：DNA复制的引物使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。
×
√
×
4．用基因工程技术调控植物激素代谢，可实现作物改良。用特异启动子诱导表达iaaM(生长素合成基因)可获得无子果实。 (　　)
5．检测目的基因是否表达可用抗原—抗体杂交技术。 (　　)
√
√
(人教版选择性必修3 P83概念检测)抗冻蛋白基因TmAFP是从黄粉虫幼虫体内分离得到的基因，其编码的蛋白质具有很强的抗冻活性。科学家成功将TmAFP基因导入甘薯中，并使甘薯获得抗冻能力，减少霜冻对甘薯的损害，提高甘薯的产量和质量。如图表示培育抗冻甘薯新品种的流程以及6种限制酶的识别序列(箭头表示切割位点)。回答下列问题：
(1)用不同的限制酶切割DNA形成的片段，______(填“不可能”或“有可能”)在DNA连接酶的作用下拼接在一起，理由是___________________________________________________________
___________________________________________________________(答出2点)。
(2)分析图示信息，进行①过程前，选择限制酶______________切割质粒P1，选择限制酶______________切割抗冻蛋白基因TmAFP。
(3)图示②～④过程，会发生磷酸二酯键断裂和合成的有______________。
(4)在个体水平上鉴定抗冻甘薯植株培育是否成功的方法是___________________________________________________________
___________________________________________________________。
提示：(1)有可能　不同的限制酶切割DNA形成的平末端可以拼接；不同的限制酶切割DNA可能形成相同的黏性末端可以拼接
(2)SmaⅠ、XbaⅠ　EcoRⅤ、SpeⅠ
(3)③④
(4)将抗冻甘薯植株与普通甘薯植株同时进行低温处理，观察植株的生长情况
考向1　PCR技术及应用
1．(链接人教版选择性必修3 P78图3-5)应用农杆菌转化法时，目的基因插入T-DNA后，需要对T-DNA测序。测序前根据目的基因的序列设计引物对T-DNA进行PCR扩增的过程如图所示，下列说法正确的是(　　)
A．实验需要清楚目的基因的全部碱基序列
B．L、R酶切位点需要在T-DNA外侧，且需用同种限制酶切割
C．引物设计时需要考虑目的基因两侧序列，选择引物b、c
D．1个环状DNA分子首次PCR后得到的DNA分子含有两个游离的磷酸基团
√
D　[实验只需要清楚目的基因两侧的碱基序列，以便设计引物，A错误；L、R酶切位点需要在T-DNA内侧，且需用同种限制酶切割，B错误；引物设计时需要考虑目的基因两侧序列，选择引物a、d，b、c只能扩增出目的基因，C错误；1个环状DNA分子首次PCR后得到的DNA分子，含有两个游离的磷酸基团，D正确。]
考向2　基因工程的操作程序
2．(链接人教版选择性必修3 P76从社会中来)研究人员通过构建含G基因超表达载体(图1表示该载体的T-DNA结构示意图)，再利用农杆菌转化法获得了转G基因抗虫棉。基于基因组重测序技术、PCR技术，对比分析并验证其中1个转化体棉的基因组中携带G基因的T-DNA插入位点及侧翼序列(如图2)，以此构建检测转基因棉生物安全性的方法。据图分析下列错误的是(　　)
A．T-DNA结构中T-NOS是终止子序列，NPTⅡ基因属于标记基因
B．转G基因抗虫棉要获得抗虫性，T-DNA结构中还应该有复制原点
C．T-DNA的转化具有高效性，且易插入A、T碱基含量较高的序列中
D．转化体棉13号染色体上T-DNA的插入方式有正向、反向及不完整
√
B　[在基因表达载体中，T-NOS通常是终止子序列，可终止转录过程。 NPTⅡ基因作为抗生素抗性基因，常作为标记基因用于筛选含有重组质粒的受体细胞，A正确。转G基因抗虫棉要获得抗虫性，关键是G基因能够正常表达，而T-DNA本身在整合到受体细胞基因组后可借助受体细胞的复制系统进行复制，T-DNA结构中不需要额外有复制原点，B错误。农杆菌介导的T-DNA转化具有高效性。从图2来看，T-DNA插入位点的侧翼序列中A、T碱基含量相对较高，说明其易插入A、T碱基含量较高的序列中，C正确。从图2中T-DNA的多个拷贝的方向以及与侧翼序列的连接情况可以看出，转化体棉13号染色体上T-DNA的插入方式有正向、反向及不完整的情况，D正确。]
3．(链接人教版选择性必修3 P81资料卡)种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti质粒的改造，利用农杆菌转化法将Ti质粒上的T-DNA随机整合到小麦基因组中，筛选到2个种子休眠相关基因的插入失活纯合突变体。与野生型相比，突变体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息已知。
(1)Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为________。选用图甲中的SmaⅠ对抗除草剂基因X进行完全酶切，再选择SmaⅠ和________对Ti质粒进行完全酶切，将产生的黏性末端补平，补平时使用的酶是_____________。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌；经卡那霉素筛选并提取质粒后再选用限制酶_____________进行完全酶切并电泳检测，若电泳结果呈现一长一短2条带，较短的条带长度近似为________bp，则一定为正向重组质粒。
复制原点
XbaⅠ
DNA聚合酶
SpeⅠ和SmaⅠ
550
(2)为证明这两个突变体是由T-DNA插入小麦基因组中同一基因导致的，提取基因组DNA，经酶切后产生含有T-DNA的基因组片段(图乙)。在此酶切过程中，限于后续PCR难以扩增大片段DNA，最好使用识别序列为________(填“4”“6”或“8”)个碱基对的限制酶，且T-DNA中应不含该酶的酶切位点。需首先将图乙的片段________，才能利用引物P1和P2成功扩增未知序列。PCR扩增出未知序列后，进行了一系列操作，其中可以判断出2条片段的未知序列是否属于同一个基因的操作为________________(填“琼脂糖凝胶电泳”或“测序和序列比对”)。
4
环化
测序和序列比对
(3)通过农杆菌转化法将构建的含有野生型基因的表达载体转入突变植株，如果检测到野生型基因，________(填“能”或“不能”)确定该植株的表型为野生型。
不能
[解析]　(1)Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为复制原点，复制原点是DNA复制的起始位点，启动复制。切割质粒时，选择限制酶BamHⅠ会破坏终止子，选择限制酶PstⅠ会导致形成的黏性末端无法补平，只能选择SmaⅠ和XbaⅠ对Ti质粒进行完全酶切。将产生的黏性末端补平时使用的酶是DNA聚合酶。如果目的基因正向插入，靠近启动子一侧原先被XbaⅠ切割后连接起来的部位不能被SmaⅠ切开，靠近终止子一侧原先被SmaⅠ切割后连接起来的部位仍然能被SmaⅠ切开。选用限制酶SpeⅠ和SmaⅠ进行完全酶切并电泳检测，较短的条带长度近似为550 bp。
(2)识别序列为4个碱基对的限制酶，在DNA分子中切割位点较多，切割后可以获得更小的DNA片段，便于后续PCR扩增。根据图乙可知，将该片段环化，才能利用引物P1和P2成功扩增未知序列。电泳只能判断DNA片段大小，不能确定DNA的碱基序列，不能判断两个同样大小的DNA片段是否为同一基因。要判断2条片段的未知序列是否属于同一个基因的操作为测序和序列比对。(3)转基因生物中检测到野生型基因，但由于野生型基因不一定能够表达，或者表达的产物不一定有生物活性，所以不能确定该植株的表型为野生型。
1．PCR利用了_____________原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。
2．电泳：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷______的电极移动，这个过程就是电泳。
3．PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的____________等有关。
考点2　DNA片段的扩增及电泳鉴定
DNA的热变性
相反　
大小和构象
4．实验步骤
(1)DNA片段的扩增
微量移液器　
微量离心管　
使反应液集中在管的底部
(2)DNA片段的电泳鉴定
①根据待分离DNA片段的大小，用____________配制琼脂糖溶液，一般配制质量分数为0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在________或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的__________混匀。
②将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。
③待凝胶溶液完全凝固后，小心拔出梳子，取出凝胶放入________内。
电泳缓冲液
沸水浴　
核酸染料　
电泳槽
④将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶_______为宜。
⑤将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合，再用____________将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。
⑥接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5 V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。
⑦取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。
1 mm
微量移液器
1．为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水等在使用前必须进行高压蒸汽灭菌处理。
2．缓冲液和酶应分装成小份，并在－20 ℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
3．在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
4．在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
1．(链接人教版选择性必修3 P84～85探究·实践)关于“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验，下列说法错误的是(　　)
A．DNA分子在琼脂糖凝胶中的移动速率与其大小成反比
B．用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，加热至熔化，稍冷却后加入核酸染料混匀
C．用微量移液器将PCR产物与电泳缓冲液混合，缓慢注入加样孔，留一孔加标准参照物
D．－20 ℃储存的小份缓冲液和酶，使用前从冰箱拿出，需要缓慢融化
√
C　[DNA分子在琼脂糖凝胶中的移动速率与其大小成反比，即相对分子量越大，迁移的速度越慢，A正确；根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量分数为0.8%～1.2%的琼脂糖溶液，在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖溶化，稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀，B正确；将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内，留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物，C错误；PCR所用缓冲液和酶从－20 ℃冰箱拿出之后，应放在冰块上缓慢融化，这样才能不破坏缓冲液中稳定性较差的成分，同样保护酶的活性不被破坏，D正确。]
2．(链接人教版选择性必修3 P84～85探究·实践)解磷菌可将难溶性磷转化为植物可吸收的形式，常见解磷菌有芽孢杆菌、假单胞杆菌等。某研究组从土壤中分离解磷菌，提取DNA并进行鉴定，随后通过PCR扩增其核糖体基因(多组样本在PCR仪中扩增约1 h)，并对产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果见下图。下列叙述错误的是(　　)
注：M表示DNA标准样液；1～11表示样本编号。
A．需在培养基中添加难溶性磷化合物，作为唯一的磷来源
B．提取液用二苯胺试剂沸水浴鉴定，若呈蓝色则可用于PCR
C．根据凝胶电泳的结果，仍然无法准确鉴定解磷菌的类型
D．样本7和样本11结果异常的原因是PCR循环次数不足
√
D　[在培养基中添加难溶性磷化合物作为唯一的磷来源，只有解磷菌能够利用这种磷源生长，从而达到筛选解磷菌的目的，A正确；提取的DNA可以用二苯胺试剂进行鉴定，在沸水浴条件下，DNA与二苯胺反应呈蓝色，若呈蓝色则说明提取到了DNA，可用于PCR，B正确；仅根据凝胶电泳结果，只能看到PCR扩增产物的条带情况，不同类型的解磷菌(如芽孢杆菌、假单胞杆菌等)在核糖体基因扩增产物上可能存在相似性，所以仍然无法准确鉴定解磷菌的类型，C正确；样本7和样本11结果异常，可能是DNA提取问题、引物问题、反应体系问题等多种原因，而不是简单的PCR循环次数不足，多组样本在PCR仪中扩增约1 h，说明整体的扩增时间是足够的，不是循环次数不足造成的，D错误。]
体验真题　感悟高考 · 有章可循
√
1．(2024·黑吉辽卷)关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验，下列叙述正确的是(　　)
A．琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小
B．凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置
C．在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快
D．琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来
A　[琼脂糖凝胶的浓度会影响DNA分子在凝胶中的迁移率和分辨率，琼脂糖凝胶的浓度通常是根据所需分离的DNA片段大小来选择的。对于较大的DNA片段，比如基因组DNA或质粒DNA，通常选择较低浓度的琼脂糖凝胶，因为它们需要更大的孔径来有效迁移。而对于较小的DNA片段，比如PCR产物或酶切片段，则需要选择较高浓度的琼脂糖凝胶，以提供更好的分辨率和分离效果，A正确。凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示电泳的进度，而不是指示DNA分子的具体位置，B错误。在琼脂糖凝胶电泳中，当电场作用时，DNA片段实际上是向正极迁移的，而不是向负极迁移。同时，DNA片段的迁移速率与其大小成反比，即DNA片段越长，迁移速率越慢，C错误。琼脂糖凝胶中的DNA分子需染色后，才可在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来，D错误。]
2．(2025·安徽卷)质粒K中含有β-半乳糖苷酶基因，将该质粒导入大肠杆菌细胞后，其编码的酶可分解X-gal，产生蓝色物质，进而形成蓝色菌落，如图所示。科研小组以该质粒作为载体，采用基因工程技术实现人源干扰素基因在大肠杆菌中的高效表达。下列叙述错误的是(　　)
A．使用氯化钙处理大肠杆菌以提高转化效率，可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数
B．如果筛选平板中仅含卡那霉素，生长出的白色菌落不可判定为含目的基因的菌株
C．因质粒K中含两个标记基因，筛选平板中长出的白色菌落即为表达目标蛋白的菌株
D．若筛选平板中蓝色菌落偏多，原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌
√
C　[氯化钙处理大肠杆菌能增强其对质粒的摄取能力，使更多大肠杆菌获得质粒，提高其转化效率；若获得空载质粒(β-半乳糖苷酶基因未被破坏)，则会在筛选平板上形成蓝色菌落；若获得重组质粒(人源干扰素基因的插入会破坏β-半乳糖苷酶基因)，则会在筛选平板上形成白色菌落；因此，使用氯化钙处理可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数，A正确。若筛选平板中仅含卡那霉素，能在上面形成白色菌落的菌可能是导入目的基因的大肠杆菌，也可能是导入空质粒的大肠杆菌，B正确。筛选平板中长出白色菌落，只能说明菌株中导入了β-半乳糖苷酶基因被破坏的质粒，但该质粒中是否正确连接目的基因，且目的基因是否转录、翻译，是否表达出目标蛋白未知，还需要进一步鉴定，C错误。质粒K经过BamH Ⅰ酶切后，若未与目的基因连接，其可能会自身环化重新形成完整质粒，导入大肠杆菌后，β-半乳糖苷酶基因正常表达，分解X-gal产生蓝色物质，形成蓝色菌落，D正确。]
3．(不定项)(2024·湖南卷)最早的双脱氧测序法是PCR反应体系中，分别再加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸(ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP)，子链延伸时，双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补配对原则，以加入ddATP的体系为例：若配对的为ddATP，延伸终止；若配对的为脱氧腺苷三磷酸(dATP)，继续延伸；PCR产物变性后电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列，结果如图所示。下列叙述正确的是(　　)
A．上述PCR反应体系中只加入一种引物
B．电泳时产物的片段越小，迁移速率越慢
C．5′-CTACCCGTGAT-3′为对照个体的一段序列
D．患者该段序列中某位点的碱基C突变为G
√
√
AC　[利用双脱氧测序法时，PCR反应体系中加入的模板是待测的单链DNA，故只需加入一种引物，A正确。电泳时，产物的片段越大，迁移速率越慢，B错误。依据双脱氧测序法的原理，可以确定每个泳道中的条带(DNA片段)的3′终端的碱基，如＋ddATP的泳道中出现的条带(DNA片段)的3′终端碱基就是A，另外由于每个片段的起始点相同，但终止点不同，因此可以通过比较片段的长度来确定DNA序列中每个位置上的碱基；图示电泳方向为从上→下，即对应的DNA片段为长→短，则对应的DNA测序结果为3′→5′，若对照个体的电泳结果最短的条带为＋ddCTP泳道组的条带，则说明该DNA片段5′端第一个碱基为C，因此对照个体的测序结果为5′-CTACCCGTGAT-3′，患者的测序结果为5′-CTACCTGTGAT-3′，C正确。对比患者和对照个体的测序结果可知，患者该段序列中某位点的碱基C突变为T，D错误。]
4．(2025·黑吉辽蒙卷)香树脂醇具有抗炎等功效，从植物中提取难度大、产率低。通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇。回答下列问题。
(1)可从____________中查询基因N的编码序列，设计特定引物。如图1所示，a链为转录模板链，为保证基因N与质粒pYL正确连接，需在引物1和引物2的5′端分别引入________和________限制酶的识别序列。PCR扩增基因N，特异性酶切后，利用______________连接DNA片段，构建重组质粒，大小约9.5 kb(kb为千碱基对)，假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变。
序列数据库
XhoⅠ
XbaⅠ
DNA连接酶
(2)进一步筛选构建的质粒，以1～4号菌株中提取的质粒为模板，使用引物1和引物2进行PCR扩增，电泳PCR产物，结果如图2。在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR反应中是否有__________的污染。初步判断实验组________(从“1～4”中选填)的质粒中成功插入了基因N，理由是___________________________________________________________
___________________________________________________________。
外源DNA
1
实验中的重组质粒的大小约为9.5 kb，而质粒pYL的大小为7.2 kb，因此目的基因的大小为2.3 kb左右
(3)为提高香树脂醇合酶催化效率，将编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列，丙氨酸的密码子有GCA等。a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物(GCA为诱变序列)，b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a的配对模板相同。据此分析，丙氨酸的密码子除GCA外，还有________。
a：5′-…GCA/CCC/GAG/TTC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC…-3′
b：5′-…GAA/CTG/TGG/GAC/ACC/CTG/AAC/TAC/TTC/TCT/GAG…-3′
c：5′-…GCC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC/CCC/TAC/CAC…-3′
d：5′-…GAT/AAT/AAG/ATC/CGA/GAG/AAG/GCC/ATG/CGA/AAG…-3′
GCC
(4)进一步检测转基因酵母菌发酵得到的____________含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。
香树脂醇
[解析]　(1)可以从序列数据库中查询某基因的编码序列。为保证目的基因插入质粒的启动子与终止子之间，应用SpeⅠ和XhoⅠ对质粒进行切割，但由于基因N中存在SpeⅠ的切割位点，故在设计引物时不能引入SpeⅠ的识别序列，由图1可知，XbaⅠ、SpeⅠ切割产生的黏性末端相同，故可在引物中引入XbaⅠ的识别序列来替代。已知a链为转录模板链，引物与DNA链的3′端结合，故a链的转录方向为从右向左，因此，引物2的5′端应引入XbaⅠ的识别序列，引物1的5′端应引入XhoⅠ的识别序列。连接DNA片段需要DNA连接酶。
(2)使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR反应中是否有外源DNA的污染。因为实验中的重组质粒的大小约为9.5 kb，而质粒pYL大小为7.2 kb，因此目的基因的大小约为2.3 kb，图2中实验组1的电泳条带数据符合目的基因的大小。(3)结合题中信息，仔细比较b、c、d与a序列(点拨：下图框中的序列一样)，只有c配对的模板与a相同，其中a中的GCA是诱变序列，c中的GCC是诱变序列，即GCC也是丙氨酸的密码子。
(4)转基因成功的酵母菌能表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇，因此进一步检测转基因酵母菌发酵得到的香树脂醇含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。
课时数智作业(五十六)　基因工程的基本操作程序[A卷]
题号
1
3
5
2
4
6
1．(2025·河北秦皇岛模拟)科学家利用PCR技术扩增人乳头瘤病毒HPV-16L1基因，构建了含HPV-16L1基因的表达载体pBI-L1，经根瘤农杆菌介导转化，获得了转基因烟草植株。该技术利用转基因烟草作为生物反应器，生产出了纯度较高的HPV-16L1蛋白。下列叙述正确的是(　　)
A．构建表达载体pBI-L1时可使用两种不同限制酶以确保正确连接
B．可以用DNA分子杂交法检测再生植株是否表达出HPV-16L1蛋白
C．利用PCR扩增HPV-16L1基因不需要已知该基因的一段碱基序列
D．必须选用烟草的受精卵作为受体细胞才能保证每个细胞中含有目的基因
√
题号
1
3
5
2
4
6
A　[用两种不同限制酶可保证目的基因和载体定向连接，且不发生自身环化，即构建表达载体pBI-L1时可使用两种不同限制酶以确保正确连接，A正确；可以用抗原－抗体杂交法检测再生植株是否表达出HPV-16L1蛋白，B错误；利用PCR扩增HPV-16L1基因需要已知该基因的一段碱基序列用于合成引物，C错误；未必选用烟草的受精卵作为受体细胞才能保证每个细胞中含有目的基因，转基因烟草的培育可以使用烟草的愈伤组织作为受体细胞，D错误。]
题号
1
3
5
2
4
6
2．(2025·辽宁沈阳模拟)聚合酶链式反应(PCR)是一种用于扩增特定的DNA片段的分子生物学技术。以下图DNA为模板，扩增n次后(n≥1)，与已知序列两条链等长的子代DNA分子数为(　　)
√
题号
1
3
5
2
4
6
A．2n+1－n－2　　　 B．2n－2n
C．2n－2 D．2n－n－1
D　[设与已知序列两条链等长的子代DNA分子数为x，已知扩增n次后DNA分子总数为2n，那么不符合要求的数量为n＋1(其中1是原始模板DNA，n是在扩增过程中产生的长度不符合要求的新合成DNA，因为每次扩增都会产生一些长度不符合的DNA，总共扩增n次)，根据DNA分子总数与不符合要求的数量关系，可列出等式x＋n＋1＝2n，通过移项可得x＝2n－n－1，D正确。]
题号
1
3
5
2
4
6
3．(2025·云南昆明模拟)如图为某基因工程中构建重组质粒的过程及正确构建的重组质粒，图中P0、P1和P2为构建过程中的3种载体质粒，Tetr表示四环素抗性基因，AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，甲、乙、丙表示3种引物及其相应位置，目的基因中的箭头表示转录方向。下列相关叙述正确的是(　　)
题号
1
3
5
2
4
6
A．图中酶处理的结果是使P1两端各自带有一个胸腺嘧啶脱氧核苷酸
B．能够在含有氨苄青霉素的培养基中存活的细胞即成功导入了目的基因
C．将重组质粒导入大肠杆菌时一般先用Ca2+载体处理大肠杆菌
D．可选择引物乙、丙或引物甲、丙进行PCR以鉴定目的基因是否正确插入重组质粒
√
题号
1
3
5
2
4
6
A　[从图中看出，目的基因片段两端有两个腺嘌呤脱氧核苷酸，要将目的基因和P1质粒连接，需用酶处理使P1两端各自带有一个胸腺嘧啶脱氧核苷酸，保证其与目的基因配对，A正确。能够在含有氨苄青霉素的培养基中存活的细胞可能导入了普通质粒，也可能导入了P0、P1或P2，不一定含有目的基因，B错误。将重组质粒导入受体细胞大肠杆菌时一般先用Ca2+处理大肠杆菌，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，C错误。用引物乙、丙扩增出350 bp的片段，则可说明目的基因正确插入；用引物甲和丙能扩增出450 bp的片段，只能证明目的基因插入重组质粒中，无法证明目的基因正确插入重组质粒中，D错误。]
题号
1
3
5
2
4
6
4．(2025·河南郑州模拟)关于DNA片段的扩增及电泳鉴定的实验，下列叙述错误的是(　　)
A．配制PCR反应体系时，要加入等量的4种核糖核苷酸和2种引物
B．电泳缓冲液在电泳过程中能维持合适的pH，并具有一定的导电性
C．在电场强度一定的条件下，长度大的DNA片段的迁移速率较慢
D．在凝胶中添加核酸染料有利于在紫外灯下观察PCR产物的电泳结果
√
题号
1
3
5
2
4
6
A　[配制PCR反应体系时，需加入4种脱氧核糖核苷酸的等量混合液作为扩增原料，以及分别与两条模板链结合的2种引物，A错误；电泳缓冲液的作用是在电泳过程中维持合适的pH，并使溶液具有一定的导电性，利于核酸迁移，B正确；在电场强度一定的条件下，DNA片段的迁移速率与其长度成反比，即DNA片段长度越长，迁移速率越慢，C正确；琼脂糖凝胶制备中加入的核酸染料能与DNA分子结合，凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来，D正确。]
题号
1
3
5
2
4
6
5．(14分)(2025·广东广州阶段练习)麦芽四糖是一种具有保健作用的功能糖，具有抑制肠道内腐败菌的生长并促进肠道健康、促进人体对Ca2+的吸收、增强人体免疫力等多种功能。研究人员将外源麦芽四糖淀粉酶基因(mta)和麦芽糖诱导型启动子Pglv相连，并导入失活了8个蛋白酶基因的枯草芽孢杆菌中进行重组，并获得了活性蛋白，如图表示重组表达载体的结构，回答下列问题：
题号
1
3
5
2
4
6
(1)基因表达载体中启动子是____________识别并结合的位点，将基因表达载体导入枯草芽孢杆菌的常用方法是____________________。
(2)amyQ能编码分泌蛋白的信号肽，构建重组基因表达载体时将amyQ和mta基因相连，并敲除枯草芽孢杆菌中的8个蛋白酶基因，试分别阐述其作用①_________________________________________ ___________________________________________________________；②_________________________________________________________ ___________________________________________________________。
RNA聚合酶
Ca2+处理法
amyQ编码的信号肽可引导麦芽四糖淀粉酶分泌到细胞外，便于催化淀粉水解
敲除蛋白酶基因可避免麦芽四糖淀粉酶被枯草芽孢杆菌自身蛋白酶降解
题号
1
3
5
2
4
6
(3)实验小组将含麦芽糖诱导型启动子Pglv的重组表达载体导入枯草芽孢杆菌后，设计了三组实验探究载体功能与微生物生长的关系。甲组培养基中加入氨苄青霉素和2%的麦芽糖，乙组培养基中加入氨苄青霉素和2%的蔗糖，丙组培养基中不含氨苄青霉素并加入2%的麦芽糖。通过______________两组的实验结果对比可验证Pglv是麦芽糖诱导型启动子，甲组培养基中mta的浓度显著高于丙组，其原因是____________________________________________________ ___________________________________________________________。
甲和乙
丙组无氨苄青霉素，会与未导入重组表达载体的菌竞争营养，导致mta蛋白产量低
题号
1
3
5
2
4
6
(4)进一步研究发现麦芽糖水解产生的葡萄糖能激活葡萄糖苷酶，葡萄糖苷酶能结合Pglv启动子中的内部Cre序列，从而抑制Pglv启动子的功能，据此试提出一条质粒改造策略，以提高mta的产量。
___________________________________________________________
___________________________________________________________。
删除Pglv启动子内部的Cre序列(或诱导Cre序列发生突变，使之无法被葡萄糖苷酶结合)
题号
1
3
5
2
4
6
[解析]　(1)启动子是基因表达调控的关键元件，RNA聚合酶需结合启动子才能启动转录过程。原核生物(如枯草芽孢杆菌)导入外源DNA时，常用Ca2+处理法：通过Ca2+处理等手段，使细胞通透性改变，处于更易吸收外源DNA分子的状态。(2)信号肽是引导分泌蛋白靶向运输的序列，amyQ编码的信号肽可赋予mta表达产物分泌特性，让酶分泌到胞外发挥作用(如分解环境中的麦芽四糖)。原核生物自身含蛋白酶，会降解外源基因表达的重组蛋白，敲除蛋白酶基因可减少这一损耗，保障mta蛋白积累。
题号
1
3
5
2
4
6
(3)Pglv是麦芽糖诱导型启动子，仅在麦芽糖存在时启动转录。甲组用麦芽糖，乙组用蔗糖(非诱导物)，对比两组mta蛋白表达量(可通过检测酶活性或蛋白含量判断)，若甲组显著高于乙组，说明Pglv需麦芽糖诱导。氨苄青霉素抗性基因是标记基因，含重组载体的菌能在含氨苄青霉素的培养基中存活，丙组无氨苄青霉素，重组菌无生长优势，mta蛋白产量自然低于甲组。(4)葡萄糖苷酶结合Pglv内部Cre序列会抑制启动子功能，导致mta转录受阻。改造Pglv启动子，破坏Cre序列的结合位点，可解除抑制，让Pglv在麦芽糖存在时持续高效启动mta表达，提升产量。
题号
1
3
5
2
4
6
6．(13分)(2025·江苏泰州模拟)启动子的强度会影响基因表达产物的产量和细胞代谢水平。研究人员获得了POL1～POL5、CBF1共6种启动子，将其分别与荧光蛋白基因EGFP构建成重组型启动子并导入毕赤酵母细胞，以研究启动子的作用强度。含CBF1-EGFP重组型启动子质粒的结构如图所示，用于扩增CBF1和EGFP的引物的碱基序列如表1所示。回答下列问题：
题号
1
3
5
2
4
6
表1
引物名称 序列(5′→3′)
CBF1引物1 CCGGAATTCCGTTAGGACTTCTT
CBF1引物2 TCCTCGCCCTTGCTCACCATT
EGFP引物1 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA
EGFP引物2 ACGCGTCGACTTACTTGTACAG
注：引物序列之外、CBF1和EGFP无表中相关限制酶的识别和切割位点。
题号
1
3
5
2
4
6
(1)用PCR扩增启动子CBF1时，CBF1引物1与模板链结合后，在________________________________酶的作用下将_______________ _________________，以延伸子链。
耐高温的DNA聚合(或Taq DNA聚合)
脱氧核苷酸连接到引物的3′端(2分)
题号
1
3
5
2
4
6
(2)限制酶及识别序列如表2所示。构建CBF1-EGFP重组型启动子质粒时，要选择限制酶________________________分别对图中a、b两处进行切割，EGFP的下游需要添加________________序列，使转录终止。
表2
限制酶 BamHⅠ EcoRⅠ SalⅠ SmaⅠ
识别和切 割序列 ↓ GGATCC ↓ GAATTC ↓ GTCGAC 　 ↓
GGGCCC
EcoRⅠ、SalⅠ(2分)
终止子
题号
1
3
5
2
4
6
(3)检测含CBF1-EGFP重组型启动子质粒是否构建成功时，将重组质粒导入大肠杆菌。培养后将大肠杆菌涂布到含有______________的培养基上，挑选单菌落并提取DNA，经酶切后利用表1中所示的____________________________两种引物进行PCR扩增和鉴定。
氨苄青霉素
CBF1引物1和EGFP引物2(2分)
题号
1
3
5
2
4
6
(4)EGFP基因能表达荧光蛋白，蛋白质含量与荧光强度呈正相关。为比较POL1～POL5、CBF1这6种启动子的作用强度，应将_________________(填“不同”或“相同”)重组型启动子质粒导入_______________细胞中。若POL3的作用强度最强，则预期结果是______________________________________________________________________________________________________________________。
不同
毕赤酵母
转入含POL3-EGFP重组型启动子质粒的毕赤酵母细胞的荧光强度最高(2分)
题号
1
3
5
2
4
6
[解析]　(1)在PCR扩增启动子CBF1时，CBF1引物1与模板链结合后，耐高温的DNA聚合酶只能将游离的脱氧核苷酸连接到引物的3′端，所以在耐高温的DNA聚合酶的作用下将脱氧核苷酸连接到引物的3′端，以延伸子链。(2)依据表2中4种限制酶的识别序列可知，CBF1引物1中有限制酶EcoRⅠ的识别和切割序列；EGFP的起始端使用引物1，则b点对应的引物是EGFP引物2，EGFP引物2的碱基序列中有限制酶SalⅠ的识别和切割序列。因此选择限制酶EcoRⅠ、SalⅠ分别切割a、b处。EGFP的下游需要添加终止子序列，使转录终止。
题号
1
3
5
2
4
6
(3)重组质粒的标记基因为氨苄青霉素抗性基因，筛选培养基中需要加入氨苄青霉素。若CBF1-EGFP重组型启动子质粒构建成功，则CBF1-EGFP是一个整体，可用CBF1引物1和EGFP引物2进行PCR扩增，会有相应的产物。(4)EGFP基因能表达荧光蛋白，蛋白质含量与荧光强度呈正相关。为比较POL1～POL5、CBF1这6种启动子的作用强度，应将不同重组型启动子质粒导入毕赤酵母细胞，再分别检测导入不同重组型启动子质粒的毕赤酵母细胞的荧光强度。若POL3的作用强度最强，则预期结果是转入含POL3-EGFP重组型启动子质粒的毕赤酵母细胞的荧光强度最高。
题号
1
3
5
2
4
6
(教师用书独具)
1．(2025·北京顺义一模)转基因抗虫棉的Bt蛋白在细胞质积累，可能与内源蛋白相互作用，产生非期望效应。C蛋白能结合纤维素，科研人员将C基因与Bt基因连接构建融合基因(如图)导入棉花细胞。相关叙述正确的是(　　)
A．使用DNA聚合酶催化C基因和Bt基因连接
B．选择引物2和4进行PCR以确保基因正确连接
C．可通过花粉管通道法将融合基因导入棉花细胞
D．融合基因表达可促进Bt蛋白在细胞膜定向积累
√
C　[连接两个基因需要的是DNA连接酶，因此使用DNA连接酶催化C基因和Bt基因连接，A错误；PCR检测融合基因时，需选择位于两个基因外侧的引物(如C基因上游和Bt基因下游)，确保仅当基因正确连接时才能扩增出目标片段，因此选择引物1和4进行PCR才可以确保基因正确连接，B错误；花粉管通道法通过将外源DNA直接导入花粉管，利用受精过程将基因整合到胚胎细胞中，因此可通过花粉管通道法将融合基因导入棉花细胞，C正确；C蛋白能结合纤维素(主要存在于细胞壁)，融合基因表达后，Bt蛋白通过与C蛋白的结合被定向至细胞壁附近，减少细胞质中的积累，从而避免非期望效应，D错误。]
2．(不定项)(2025·吉林长春模拟)某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因(GFP)整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期获得Gata3-GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，设计了引物1和引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。下列叙述正确的是(　　)
A．据图甲分析，进行PCR扩增时，用引物1的模板为M链
B．2号条带的小鼠是Gata3-GFP基因纯合子
C．Gata3-GFP基因转录是以N链为模板
D．选用引物1和引物3进行PCR，能更好的区分杂合子和纯合子
√
√
BC　[PCR扩增过程中，DNA子链是从5′→3′进行合成的，所以引物1的模板应为N链，A错误；整合GFP基因后，核酸片段变长，2号个体只有大片段，所以是Gata3-GFP基因纯合子，4号个体只有小片段，是野生型，B正确；据图可知，因启动子在左侧，转录从左向右，转录时是沿着模板链的3′→5′，据此推测Gata3-GFP基因转录是以N链为模板，C正确；若用引物1和引物3进行PCR，杂合子和Gata3-GFP基因纯合子都能扩增出相应的片段，不能区分杂合子和纯合子，D错误。]
1．(2025·河北邯郸模拟)OsGLO1、EcCAT、EcGCL和TSR四个基因分别编码四种不同的酶，研究人员将这些基因分别与叶绿体转运肽(引导合成的蛋白质进入叶绿体)基因连接，构建多基因表达载体(载体中部分序列如下图所示)，利用农杆菌转化法转化水稻，在水稻叶绿体内构建一条新代谢途径，提高了水稻的产量。下列叙述错误的是(　　)
题号
1
3
5
2
4
6
课时数智作业(五十六)　基因工程的基本操作程序[B卷]
A．水稻产量提高说明了该体系的四种酶活性均有所提高
B．四种酶合成的翻译过程均在细胞质中的核糖体上
C．潮霉素抗性基因的作用是筛选被农杆菌转化的水稻细胞
D．此过程T-DNA的作用是把该重组DNA转移到水稻染色体DNA上
题号
1
3
5
2
4
6
√
A　[水稻产量的提高只能说明该体系转入的基因发挥了作用，不能说明这四种酶的活性均有所提高，A错误；农杆菌转化法利用了农杆菌中的T-DNA可将目的基因导入受体细胞并整合到染色体DNA上的特点，故该过程的转化是将四个控制酶合成的基因转移到水稻细胞中的染色体DNA上，所以基因的转录发生在水稻细胞的细胞核内，翻译在细胞质中的核糖体上，B、D正确；据图分析，潮霉素抗性基因位于T-DNA序列中，所以可根据潮霉素抗性筛选被农杆菌转化的水稻细胞，C正确。]
题号
1
3
5
2
4
6
2．(2025·湖北黄冈模拟)研究人员将目的基因插入质粒，构建重组质粒的过程如图所示，再将该重组质粒导入大肠杆菌中。由β-半乳糖苷酶基因编码产生的β-半乳糖苷酶可分解X-gal产生蓝色物质，使菌落呈蓝色，否则菌落为白色。下列叙述正确的是(　　)
题号
1
3
5
2
4
6
A．将目的基因插入质粒中时，需要用到的酶有XhoⅠ、NheⅠ和DNA 聚合酶
B．大肠杆菌被导入重组质粒前需用Ca2+处理大肠杆菌，使其细胞壁软化
C．将按图示构建的重组质粒导入大肠杆菌后，大肠杆菌不能表达该目的基因
D．在含有X-gal和四环素的培养基上形成的蓝色菌落就是含重组质粒的大肠杆菌
√
题号
1
3
5
2
4
6
C　[用DNA连接酶将目的基因与质粒连接起来，A错误；用Ca2+处理大肠杆菌，使细胞处于一种能够吸收周围环境中DNA分子的生理状态，而不是使细胞壁软化，B错误；从图中可以看出，目的基因插入的方向与启动子的方向相反，大肠杆菌不能正常表达该目的基因，C正确；目的基因未插入β-半乳糖苷酶基因中，没有破坏β-半乳糖苷酶基因，其可以正常表达，并能分解X-gal产生蓝色物质，可见含重组质粒的大肠杆菌形成的是蓝色菌落，但含空质粒的大肠杆菌也是蓝色的，可见在含有X-gal和四环素的培养基上形成的蓝色菌落不一定是含重组质粒的大肠杆菌，D错误。]
题号
1
3
5
2
4
6
3．(2025·山东青岛二模)CRISPR/Cas9系统包含向导RNA(sgRNA)和核酸酶Cas9，可以对哺乳动物细胞进行基因组编辑。编辑时，Cas9蛋白在sgRNA的引导下，结合基因组的特定位点并进行切割。科研人员利用图中sgRNA和Cas9共表达质粒，对体外培养的小鼠细胞中A基因的表达进行调控。下列说法错误的是(　　)
题号
1
3
5
2
4
6
A．可以依据A基因的部分序列设计共表达质粒中的编码sgRNA的序列
B．编码sgRNA的序列需要整合到受体细胞基因组DNA上才能发挥作用
C．导入该质粒后使用含潮霉素的液体培养基筛选受体细胞
D．用抗原—抗体杂交技术检测结果为部分细胞A蛋白表达量降低
√
题号
1
3
5
2
4
6
B　[由图知，sgRNA序列中插入了A基因片段，故可以依据A基因的部分序列设计共表达质粒中的编码sgRNA的序列，A正确；编码sgRNA的序列不需要整合到受体细胞基因组DNA上就能发挥作用，其作用的对象是受体细胞DNA中的特定基因，B错误；重组质粒中标记基因为潮霉素抗性基因，所以导入该质粒后使用含潮霉素的液体培养基筛选受体细胞，能存活的即为导入了质粒的细胞，C正确；检测蛋白质的表达用抗原—抗体杂交技术，部分细胞A基因切除后A蛋白表达量降低，D正确。]
题号
1
3
5
2
4
6
4．(2025·江西卷)为了获得抗白叶枯病的水稻品种，研究人员构建了含有抗病基因D的重组Ti质粒(如图)，通过农杆菌转化法将D基因导入水稻种子诱导的愈伤组织，最终获得抗病植株。下列叙述正确的是(　　)
题号
1
3
5
2
4
6
A．水稻愈伤组织细胞中RNA聚合酶无法识别U6启动子
B．在含重组Ti质粒的农杆菌中U6启动子不能驱动卡那霉素抗性基因表达
C．农杆菌侵染愈伤组织后所用的筛选培养基中需加入卡那霉素
D．愈伤组织再分化获得的含有D基因的幼苗属于抗病植株
√
题号
1
3
5
2
4
6
B　[将T-DNA整合到水稻愈伤组织的染色体DNA后，若要使D基因表达并使水稻植株表现出抗病性状，那么D基因上游的U6启动子需被水稻愈伤组织细胞中RNA聚合酶识别， A错误。启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，并能够驱动基因转录出mRNA，最终表达出蛋白质。由图得出，题述重组Ti质粒中的U6启动子并非位于卡那霉素抗性基因的上游，因而不能驱动卡那霉素抗性基因的表达，B正确。愈伤组织多指将植物体的某一组织、器官置于特定培养基中培养，诱导产生的无定形的组织团块，当农杆菌侵染愈伤组织后，T-DNA整合
题号
1
3
5
2
4
6
到水稻细胞染色体的DNA中，通常情况下，若D基因能表达，那么T-DNA上的潮霉素抗性基因也能表达，从而使得导入T-DNA的水稻愈伤组织具有潮霉素的抗性；卡那霉素抗性基因不位于T-DNA上，不会发生上述生理过程。因此，在农杆菌侵染愈伤组织后所用的筛选培养基中需加入潮霉素， C错误。检测是否成功获得转基因品种一般需要经历两个阶段，首先是分子水平的检测，包括检测目的基因是否导入宿主细胞、检测在宿主细胞中目的基因是否转录出mRNA或最终表达出蛋白质，其次，还需要进行个体生物学水平的鉴定。因此愈伤组织再分化获得的含有D基因的幼苗不一定是抗病植株， D错误。]
题号
1
3
5
2
4
6
5．(10分)(2025·天津津南开学考试)研究者拟构建高效筛选系统，将改进的苯丙氨酸合成关键酶基因P1导入谷氨酸棒状杆菌，以提高苯丙氨酸产量。
题号
1
3
5
2
4
6
(1)如图是该高效筛选系统载体的构建过程。载体1中含有(卡那霉素抗性基因)和SacB两个标记基因，为去除筛选效率较低的SacB，应选择引物__________________，并在引物的________(填“5′”或“3′”)端引入XhoⅠ酶的识别序列，进行PCR扩增，产物经酶切、连接后环化成载体2。
1和4
5′
题号
1
3
5
2
4
6
(2)PCR扩增载体3中筛选效率较高的标记基因RpsL(链霉素敏感基因)时，引物应包含__________________(填“EcoRⅠ”“HindⅢ”或“XhoⅠ”)酶的识别序列，产物经单酶切后连接到载体2构建高效筛选载体4。
(3)将改进的P1基因整合到载体4构建载体5。将载体5导入链霉素不敏感(由RpsL突变造成)、卡那霉素敏感的受体菌。为获得成功导入载体5的菌株，应使用含有__________________的平板进行初步筛选。
XhoⅠ
卡那霉素
题号
1
3
5
2
4
6
(4)可采用__________________技术鉴定成功整合P1基因的菌株。之后以发酵法检测苯丙氨酸产量。
PCR
题号
1
3
5
2
4
6
[解析]　(1)据图可知，根据引物箭头方向可知，要想复制KanR(卡那霉素抗性基因)，需要引物1和4，因此为去除筛选效率较低的SacB，应选择引物1和4。PCR时，在引物作用下，DNA聚合酶从引物的3′端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5′端向3′端延伸的，因此在引物的5′端引入XhoⅠ酶的识别序列。(2)据图可知，载体4中RpsL(链霉素敏感基因)的两侧具有XhoⅠ酶的识别序列，载体3中不含XhoⅠ酶的识别序列，如果将载体2和载体3连接形成高效筛选载体4时，需要的引物应该含有XhoⅠ酶的识别序列。
题号
1
3
5
2
4
6
(3)基因表达载体中的标记基因，有利于目的基因的初步检测，据题意可知，载体5中含有RpsL(链霉素敏感基因)和KanR(卡那霉素抗性基因)，将载体5导入链霉素不敏感(由RpsL突变造成)、卡那霉素敏感的受体菌。为获得成功导入载体5的菌株，应使用含有卡那霉素的平板进行初步筛选。(4)通过PCR技术可以检测目的基因是否插入受体细胞的染色体DNA中或目的基因是否转录出了mRNA，因此可采用PCR技术鉴定成功整合P1基因的菌株。
题号
1
3
5
2
4
6
6．(12分)(2025·河北卷节选)为治理水体中对生物有毒害的镉污染，研究者构建了分泌信号肽SP7、镉离子结合蛋白CADR、定位于细胞壁的蛋白GP1和黄色荧光蛋白YFP编码序列融合表达的载体，转入单细胞衣藻，实现CADR大量合成、分泌并定位于细胞壁，以吸附水体中的镉离子。回答下列问题：
题号
1
3
5
2
4
6
(1)在DNA聚合酶、引物、模板DNA和脱氧核苷酸中，随着PCR反应进行，分子数量逐渐减少的是______和____________。模板与引物在PCR反应的________阶段开始结合。PCR中使用的DNA聚合酶需耐高温，其原因为_________________________________________
___________________________________________________________。
题号
1
3
5
2
4
6
引物
脱氧核苷酸
复性
PCR过程中变性和延伸需要的温度均较高，一般的DNA聚合酶在高温下会变性失活
(2)载体中可用的酶切位点信息和拟构建载体的部分结构如图1所示。在将CADR、GP1和YFP基因逐个构建到载体时，为避免错误连接，需向以上三个基因的两端分别添加限制酶的识别序列，其中GP1两端应添加______________________(填两种限制酶)的识别序列。用DNA连接酶连接时，可催化载体和目的基因之间形成________键。
题号
1
3
5
2
4
6
Sma Ⅰ、EcoR Ⅰ
磷酸二酯
(3)若在荧光显微镜下观察到转基因衣藻表现为________________，初步表明融合蛋白表达成功。将转基因衣藻和野生型衣藻置于含镉离子的培养液中培养一段时间后，若转基因衣藻细胞壁比野生型衣藻细胞壁的镉离子含量________，则表明融合蛋白能结合镉离子。
题号
1
3
5
2
4
6
发出黄色荧光
高
(4)将转基因衣藻和野生型衣藻在不同镉离子浓度的培养液中培养6天后，检测细胞密度，结果见图2。转基因衣藻在含有不同浓度镉离子的培养液中生长均优于野生型衣藻的原因可能是____________
___________________________________________________________
___________________________________________________________。
题号
1
3
5
2
4
6
转基因衣藻细胞壁上的镉离子结合蛋白可以吸附培养液中的镉离子，减少镉离子对衣藻细胞的毒害(2分)
240 μmol·L-1镉离子浓度下，转基因衣藻和野生型衣藻生长均被明显抑制的原因可能是_________________________________________
______________________________________________________________________________________________________________________。
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镉离子浓度过高，转基因衣藻细胞壁上的CADR数量和吸附能力有限，镉离子进入细胞对转基因衣藻和野生型衣藻均造成了较严重的毒害(2分)
[解析]　(1)PCR反应过程包括①变性：温度超过90 ℃时，双链DNA解聚为单链；②复性：温度下降到50 ℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合；③延伸：温度上升到72 ℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。PCR过程中变性和延伸需要的温度均较高，一般的DNA聚合酶在高温下会变性失活，只有耐高温的DNA聚合酶在这种温度条件下可以正常发挥作用。
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(2)分析图1所示中几种限制酶可知，NheⅠ与XbaⅠ酶切后产生的黏性末端相同，为了防止载体和目的基因出现自身环化和二者之间反向连接，不能同时在目的基因两端添加这两种酶的识别序列。根据题图中几种基因和限制酶的顺序可得出目的基因与对应酶切位点的位置关系，如图所示，即GP1基因两端应分别添加Sma Ⅰ和EcoR Ⅰ的识别序列。
DNA连接酶催化载体和目的基因之间形成磷酸二酯键，完成DNA片段的连接。
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(3)根据题干信息可知，该转基因衣藻中转入的融合表达载体中含有黄色荧光蛋白YFP的编码序列，若在荧光显微镜下观察到转基因衣藻发出黄色荧光，说明YFP基因表达成功，初步表明融合蛋白表达成功。构建成功的转基因衣藻中含有镉离子结合蛋白CADR、分泌信号肽SP7和定位于细胞壁的蛋白GP1的编码序列，可大量合成CADR，并定位于细胞壁；若转基因衣藻细胞壁的镉离子含量高于野生型衣藻，则说明融合蛋白可结合镉离子。
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(4)由图2可知，不同镉离子浓度的培养液处理下，转基因衣藻的细胞密度相对值均大于野生型衣藻，原因可能是转基因衣藻细胞壁上的镉离子结合蛋白可以吸附培养液中的镉离子，减少镉离子对衣藻细胞的毒害。240 μmol·L-1镉离子浓度下，转基因衣藻和野生型衣藻生长均被明显抑制，原因可能是培养液中的镉离子浓度过高，转基因衣藻细胞壁上的CADR数量和吸附能力有限，镉离子对转基因衣藻和野生型衣藻均造成了较严重的毒害。
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(教师用书独具)
1．(2025·湖北武汉模拟)远科105D是由中国科研人员培育出的抗除草剂转基因玉米新品种，其细胞中含有来源于农杆菌的耐草甘膦酶基因——EPSPS。下图所示为草甘膦施药7天后远科105D各组织中EPSPS蛋白表达量。下列分析错误的是(　　)
A．若已知EPSPS基因两端的碱基序列，则可利用PCR获取和扩增目的基因
B．构建完成的重组Ti质粒应含有EPSPS基因、标记基因、启动子和终止子
C．EPSPS基因应插入T-DNA中，利用农杆菌对玉米的天然侵染能力完成转化
D．种植远科105D的玉米田中，可用较高浓度草甘膦灭除杂草而不伤害玉米
√
C　[利用PCR获取和扩增目的基因，需要知道基因两端的序列，以合成引物，A正确；基因表达载体包括目的基因(EPSPS基因)、标记基因、启动子和终止子等，B正确；农杆菌在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有侵染能力，C错误；图中显示使用草甘膦后，EPSPS蛋白表达量增加，可以预测杂草可能被杀灭，转基因玉米具备抗草甘膦的能力而存活并正常生长，D正确。]
2．(不定项)(2025·湖南郴州模拟)蛋白A是动物细胞分泌的一种优质蛋白，为使得大肠杆菌具备合成蛋白A的能力，研究人员进行了如图1所示的操作，图2表示3种限制酶的切割位点。下列叙述正确的是(　　)
A．利用PCR技术扩增基因A应选择的一对引物是引物2和引物3
B．为使得扩增出的目的基因带有限制酶的切割序列，上游引物序列为5′-GGATCCATTACGGATCG-3′
C．抗生素M应为氯霉素，在该平板上能生长的菌落就是含有重组质粒的大肠杆菌
D．从动物细胞提取DNA扩增获得的基因A，正确导入大肠杆菌后能正常表达出蛋白质A
√
√
AB　[子链的合成方向均是由5′端→3′端，引物需与目的基因的3′端(—OH端)碱基互补配对，所以扩增基因A应选择的是引物2和引物3，A正确；由图1可知上游引物2序列应为5′-ATTACGGATCG-3′，由于目的基因需要插入载体的启动子和终止子之间，故需要的限制酶为BamHⅠ和SalⅠ，根据图2中限制酶的酶切位点可知，为使得扩增出的目的基因带有限制酶的切割序列，应添加在引物的5′端，则上游引物序列是5′-GGATCCATTACGGATCG-3′，B正确；图1中质粒插入目的基因时，四环素抗性基因被破坏了，所以制备含抗生素M的培养基时，抗生素M是指氯霉素，但能在平板上生长的菌落可能是含有空载质粒的大肠杆菌，C错误；从动物细胞提取DNA扩增获得的基因A中含有内含子序列，直接导入原核生物中转录、翻译，过程中没有相应的加工过程，所以不能正确表达出蛋白质A，D错误。]
谢 谢 ！

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