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5.2多聚酶链式反应扩增dna片段
学案
目标导航　1.知道细胞内参与DNA复制的各种组成成分与反应条件；知道DNA合成方向。2.理解PCR的原理；掌握PCR的基本步骤及每个步骤前后发生的变化。
一、PCR技术的原理
1．PCR扩增方向
(1)3′端和5′端：为了明确地表示DNA的方向，通常将DNA的羟基(—OH)末端称为________，而含____________的末端称为________；一个双链DNA分子中含两个3′端和两个5′端，如果一条链的方向是________，则另一条链的方向就是________，这就是反向平行的含义。
(2)DNA分子中相邻两个脱氧核苷酸残基通过________________相连，该化学键是由一分子脱氧核苷酸中3号碳原子上的羟基(—OH)，与相邻的另一分子脱氧核苷酸中5号碳原子上的磷酸基团脱水聚合而成。所以DNA的合成方向总是从子链的________向________延伸。
2．PCR技术原理
(1)PCR原理：DNA分子在一定条件下可以进行半保留复制。
(2)DNA的热变性原理：在________的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为________；当温度缓慢下降后，两条被分离的DNA链又会重新结合成双链，这个过程称为________。
3．生物体内DNA复制与PCR反应的区别
体内复制
PCR反应
解旋
在______作用下，细胞提供能量，部分解开
加热至______，双链全部解开，不需解旋酶
引物
一小段RNA
可以是RNA或单链DNA分子片段
合成子链
在引物基础上，一条链连续合成，另一条链不连续合成
分别从两条链的______开始，都是连续合成，控制温度______
特点
____________，半保留复制
体外迅速扩增
Taq
DNA聚合酶
______
____
循环次数
受生物体自身控制
30多次
相同点
生物体内的DNA复制和PCR体外DNA扩增都需要____、____________作原料、____，子链延伸的方向都是从______到______，且都需要在一定的缓冲溶液中进行
二、PCR的反应过程
1．反应条件
(1)稳定的缓冲液环境。
(2)DNA模板。
(3)分别与模板DNA两条模板链相结合的两种引物。
(4)A、T、G、C四种脱氧核苷酸。
(5)耐高温的DNA聚合酶，一般用Taq
DNA聚合酶。
(6)能严格控制温度变化的温控设备。
2．过程
(1)________(90～95℃)：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA。
(2)________(55℃左右)：两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，形成局部双链。
(3)________(72℃左右)：在Taq
DNA聚合酶的作用下，以四种脱氧核苷酸为原料，根据碱基互补配对原则，从引物的5′端→3′端延伸合成与模板互补的DNA链。
3．结果
(1)PCR的每一轮循环包括变性、复性和延伸三步，从第二轮循环开始，每次循环的产物也做模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸。这样，DNA聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的DNA序列呈____________。
(2)PCR一般要经历三十多次循环，处于两引物间固定长度的序列数目约为________。
三、PCR反应的实验操作流程
1．操作步骤
________：按照PCR反应体系的配方将所需试剂摆放于实验桌上
　
________：用微量移液器按照配方在微量离心管中依次加入各组成成分
　
________：盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁
　
________：将微量离心管放在离心机上，离心约10
s。目的是使反应液集中在离心管底部
　
________：将离心管放入PCR仪中，设置程序进行反应
2．操作提示
(1)避免外源DNA污染：所用仪器、缓冲液、蒸馏水等使用前必须进行____________。
(2)缓冲液和酶分装成小份，并在________储存。
(3)每添加一种反应成分，更换一个________的枪头。
(4)混匀后离心处理，使反应液集中在________底部。
3．实验中DNA含量的测定
理论上DNA扩增呈指数增长，即一条DNA片段循环n次后的数目为2n，但实际可能会有诸多因素影响DNA含量，所以需要对DNA含量进行测定。
(1)原理
DNA在260
nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰。峰值的大小与DNA的含量有关。可以利用DNA这一特点进行DNA含量的测定。
(2)过程
①稀释：2
μL
PCR反应液，加入98
μL蒸馏水，即将样品进行50倍稀释。
②对照调零：以蒸馏水作为空白对照，在波长260
nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零。
③测定：取DNA稀释液100
μL至比色杯中，测定260
nm处的光吸收值。
④计算：DNA含量(μg/mL)＝50×(260
nm的读数)×稀释倍数。
知识点一　PCR的原理和反应过程
1．DNA扩增过程中，DNA片段经若干次扩增，与其数目的理论值变化相符的图是(　　)
2．在PCR扩增DNA的实验中，根据设计，一分子DNA经30次循环后，应得到约230个DNA分子，但结果只有约210个DNA分子。出现该现象的原因可能是(　　)
①循环次数不够　②Taq
DNA聚合酶活力不够或其活性受到抑制　③引物不能与模板链结合　④系统设计欠妥
A．①②③
B．②③④
C．①③④
D．①②④
知识点二　PCR的实验操作
3．在遗传病及刑侦破案中常需要对样品DNA进行分析，PCR技术能快速扩增DNA片段，在几个小时内复制出上百万份的DNA拷贝，有效地解决了因为样品中DNA含量太低而难以对样品进行分析研究的问题。据图回答相关问题：
a链5′－G－G……T－C－3′　　5′－G－G－OH(引物Ⅰ)
b链3′－C－C……A－G－5′　　________(引物Ⅱ)
　　　　　　
95℃↓
5′－G－G……T－C－3′　3′－C－C……A－G－5′
　　　　　　
55℃↓
5′－G－G……T－C－3′　3′－C－C……A－G－5′
　　　　　　　　　
5′－G－G－OH
　　　　　　
72℃↓
　______________　　______________
(1)在相应的横线上写出引物Ⅱ，并在复性这一步骤中将引物Ⅱ置于合适的位置。
(2)在相应的横线上写出循环一次后生成的DNA分子。
(3)若将作为原料的四种脱氧核苷酸用32P标记，请分析循环一次后生成的DNA分子的特点是______________________________；循环n次后生成的DNA分子中不含放射性的单链占总单链的比例为________。
4．有关下列操作过程的叙述，错误的是(　　)
A．PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌
B．PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在－20℃储存
C．PCR所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后，迅速融化
D．在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换
参考答案
一、1.(1)3′端　磷酸基团　5′端　3′→5′　5′→3′
(2)3′ 5′磷酸二酯键　5′端　3′端
2．(2)80～100℃　变性　复性
3．解旋酶　95℃　引物端　72℃　边解旋边复制　不需要　需要　模板　四种脱氧核苷酸　酶　5′端　3′端
二、2.(1)变性　(2)复性　(3)延伸
3．(1)指数扩增　(2)230
三、1.准备　移液　混合　离心　反应
2．(1)高压灭菌　(2)－20℃　(3)移液器　(4)离心管
对点训练
1．C　[PCR反应中DNA的扩增数目和生物体内的DNA复制是类似的，即1个DNA分子复制一次，变为2个，复制2次，产生4个DNA分子，呈指数扩增，开始有一个DNA分子的模板，经过n次复制后得到的DNA分子的数量为2n，与曲线C相符合。]
规律链接　扩增后，循环次数与DNA总数间的有关计算问题
在进行PCR扩增后，若以一个DNA片段作为模板，经n次循环后DNA分子总数为2n；若N个DNA片段作模板，经n次循环后DNA分子总数为N·2n。
2．D　[该现象属于在PCR扩增中假阴性现象。其原因有：(1)Taq
DNA聚合酶活力不够或其活性受到抑制导致催化效率降低，得到的产物比预期的少；(2)引物设计不合理，可能不能与模板DNA结合，导致无法进行扩增；(3)提取的模板数量或质量不过关，不起模板作用，无法进行扩增；(4)PCR系统设置不妥，达不到预期的效果；(5)循环次数过少，产物的量比预期的少。]
3．(1)5′—G—A—OH
5′—G—G……T—C—3′　3′—C—C……A—G—5′
　
HO—A—G—5′　5′—G—G—OH
72℃
(2)3′—C—C……A—G—5′　3′—C—C……A—G—5′
5′—G—G……T—C—3′　5′—G—G……T—C—3′
(3)每个DNA分子各有一条链含32P标记　1/2n
解析　(1)DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3′端延伸DNA链，所以引物就提供了3′端，子链延伸方向5′→3′，引物Ⅰ与b链部分碱基互补，引物Ⅱ则与a链部分碱基互补，且连接到a链的3′端，故引物Ⅱ的结构为5′—G—A—OH，复性结果为：
　
HO—A—G—5′
5′—G—G……T—C—3′
(2)经过一次循环后，产生的两个DNA分子分别含有引物Ⅰ和引物Ⅱ。
(3)由于作为原料的四种脱氧核苷酸被32P标记，所以新合成的子链均含有放射性，一次循环后的两个DNA各有一条链含32P，若复制n次，产生子链共2n×2，其中只有亲本的两条母链不含32P，则其所占比例为2/(2n·2)＝1/2n。
联想　PCR扩增的方向总是从子链5′端向3′延伸，所以子链的一端需要引物。
规律链接　PCR扩增需要注意的问题
1．DNA复制需要引物的原因：DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3′端延伸DNA链。PCR中，引物长度通常为20～30个核苷酸。
2．当PCR反应体系的温度由变性后快速冷却到50℃左右时，引物与模板可结合，一般不需要考虑解开的两个DNA模板链的重新结合，原因是：
(1)模板DNA链比引物长得多而且复杂得多，不易重新结合。
(2)引物和模板之间的碰撞机会远远高于模板互补链之间的碰撞机会。
(3)加入的引物的量足够大，而模板链数量少。
4．C　[在冰箱中放置的缓冲液和酶从冰箱中取出后应放在冰块上缓慢融化，而不能迅速融化，即C错误。]
联想　为避免外源DNA污染，所用仪器、缓冲液、蒸馏水等使用前必须高压灭菌，每添加一种反应成分更换一个移液器的枪头，混合后离心处理，使反应液集中在离心管底部。

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