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课题3分解纤维素的微生物的分离
纤维素酶及纤维素分解菌的筛选
[自读教材·夯基础]
1．纤维素
(1)基本组成单位：葡萄糖。
(2)含量：是地球上最丰富的多糖类物质。
(3)分布：棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物。此外，木材、作物秸秆等也富含纤维素。
2．纤维素酶
(1)组成：纤维素酶是一种复合酶，至少包括三种组分，即C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶。
(2)作用：
纤维素纤维二糖葡萄糖
(3)实验验证：
试管
滤纸条
缓冲液pH＝4.8
纤维素酶(70～80
U/mL)
条件
结果
1
1
cm×6
cm
10
mL
?1_mL
将两支试管固定在50
mL的锥形瓶中，在摇床上以140
r/min的转速振荡反应1
h
?完全分解
2
1
cm×6
cm
?11
mL
?基本无变化
3.纤维素分解菌的筛选
(1)方法：刚果红染色法，常用的有两种。一种是先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应；另一种是在倒平板时就加入刚果红。
(2)原理：
[跟随名师·解疑难]
纤维素分解菌的筛选
(1)筛选原理：
刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物，但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖反应。当纤维素被纤维素酶分解后，该复合物无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。
(2)筛选方法：
方法一
方法二
操作
先培养微生物，再加入刚果红
倒平板时加入刚果红
优点
显示出的颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用
操作简便，不存在菌落混杂的问题
缺点
操作繁琐，加入刚果红溶液会使菌落之间发生混杂
①由于在纤维素粉、琼脂和土豆汁中都含有淀粉类物质，可以使能够产生淀粉酶的微生物出现透明圈较为模糊的假阳性反应②有些微生物具有降解色素的能力，长时间培养会降解刚果红而形成明显的透明圈
实验设计和课题延伸
[自读教材·夯基础]
1．实验设计流程
2．课题延伸——纤维素分解菌的鉴定
(1)为确定得到的透明圈中的菌落是纤维素分解菌，需要进行发酵产纤维素酶的实验。纤维素酶的发酵方法有液体发酵和固体发酵两种。
(2)纤维素酶的测定方法，一般是采用对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进行定量测定。
1．阅读教材P29旁栏中的纤维素分解菌选择培养基的成分回答下列问题。
(1)旁栏中的配方是液体培养基还是固体培养基？为什么？
提示：是液体培养基，因为配方中无凝固剂。
(2)这个培养基对微生物是否具有选择作用？如果有，是如何进行选择的？
提示：有选择作用。本配方中的唯一碳源是纤维素粉，所以能分解纤维素的微生物可以大量繁殖，而不能分解纤维素的微生物被抑制。
(3)你能否设计一个对照实验，说明选择培养的作用？
提示：用接种了的牛肉膏蛋白胨培养基进行对照，若牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数大于选择培养基上的菌落数，说明选择培养基具有筛选作用。
2．在实验过程中，为什么要进行梯度稀释？
提示：通过梯度稀释使聚集在一起的微生物分散成单个细菌，在培养基表面形成单个的菌落。
3．分离分解纤维素的微生物实验，只是分离纯化的第一步，为确保得到的是纤维素分解菌，还需要做什么工作？
提示：还需要进行发酵产纤维素酶的实验。
[跟随名师·解疑难]
1．纤维素分解菌的筛选过程中所用两种培养基的成分和作用
(1)纤维素分解菌的选择培养基：
组分
含量
提供的主要营养物质
纤维素粉
5
g
碳源、能源
NaNO3
1
g
无机盐
Na2HPO4·7H2O
1.2
g
KH2PO4
0.9
g
MgSO4·7H2O
0.5
g
KCl
0.5
g
酵母膏
0.5
g
特殊营养成分、碳源、氮源
水解酪素
0.5
g
氮源、特殊营养成分
上述物质溶解后，用蒸馏水定容至1
000
mL
　　(2)鉴别纤维素分解菌的培养基：
组分
含量
提供的主要营养物质
CMC Na
5～10
g
碳源
酵母膏
1
g
碳源、氮源、特殊营养成分
KH2PO4
0.25
g
无机盐
琼脂
15
g
凝固剂
土豆汁
100
mL
碳源
上述物质溶解后，用蒸馏水定容至1
000
mL
2.纤维素分解菌的筛选过程中所用两种培养基的比较
(1)纤维素分解菌的选择培养基为液体培养基，利用液体培养基能使营养成分充分消耗，以增加纤维素分解菌的浓度。
(2)纤维素分解菌的鉴别培养基为固体培养基，因为需要在培养基上形成我们肉眼可见的菌落。
(3)在上述选择培养基中能以纤维素作为碳源和能源的微生物可以正常生长，而其他绝大多数微生物不能正常生长；而在上述鉴别培养基中，绝大多数微生物都可以正常生长。
[特别提醒]　
(1)判断某个培养基是否具有选择作用时，应设立基础培养基进行对照。
(2)判断所使用的培养基是否被杂菌污染时，应设立不接种该菌种的培养基进行空白对照。
刚果红染色法分析
[例1]
下列有关刚果红染色法的叙述，错误的是(　　)
A．刚果红可以在细菌菌落形成前倒平板时加入
B．刚果红可以在菌落形成后加入
C．在菌落形成前倒平板时加入，刚果红不需要灭菌
D．在菌落形成后加入刚果红时，刚果红不需要灭菌
[解析]　利用刚果红筛选纤维素分解菌时，刚果红可以在细菌菌落形成前倒平板时加入，也可以在菌落形成后加入。在细菌菌落形成前倒平板时加入，要进行灭菌，以防杂菌的侵入，影响纤维素分解菌菌落的形成；在菌落形成后加入刚果红，则不需要灭菌。
[答案]　C
实验的拓展应用
[例2]
某实验小组欲从土壤中筛选出能分泌淀粉酶的芽孢杆菌，设计实验步骤如下，请给予合理的补充。
(1)采样与培养：将采集的土样混匀后称取1
g，置于经过________________法灭菌处理的________(填“固体”或“液体”)培养基中，28
℃振荡培养。
(2)接种与选择：为避免培养液中菌体浓度过高，需将培养液进行________处理。之后，将菌液涂布接种于以________为唯一碳源的固体培养基上，30
℃条件下培养。为避免污染，需将培养皿呈________状态放置。此外，为排除其他因素的影响，提高实验可信度，本步骤需设计________________________作为空白对照。
(3)筛选与纯化：将适量的碘液滴加在平板中的菌落周围，如果菌落周围的现象是________________，则说明此种菌能够____________________________。从平板中挑取实验效果明显的目的菌株，采用____________法接种于新的培养基平板上，可对菌株进行进一步的纯化。
[解析]　(1)对培养基的灭菌方式是高压蒸汽灭菌，因为后面要进行涂布，所以应该用液体培养基来培养。(2)减小培养液菌体浓度一般用稀释方法。由于题目要求选出能分泌淀粉酶的芽孢杆菌，所以培养基中的碳源就应只有淀粉。倒置可以减少培养基受污染，为排除其他因素影响，需要设置未接种的空白的培养基作对照组。(3)淀粉被水解，培养基会出现透明圈的现象。用平板划线法来培养，可进一步纯化菌种。
[答案]　(1)高压蒸汽灭菌　液体
(2)系列稀释(或梯度稀释)　淀粉　倒置　未接种的空白培养基(或接种等量无菌水的培养基)
(3)出现透明圈　分泌淀粉酶使淀粉发生水解　平板划线
归纳拓展
选择培养的“浓缩”作用
在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“浓缩”的作用。
[随堂基础巩固]
1．下列关于纤维素的叙述错误的是(　　)
A．纤维素是由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物
B．纤维素能被土壤中某些微生物分解利用，是因为这些微生物能产生纤维素酶
C．植物的根、茎、叶等器官都含有大量的纤维素
D．自然界中的各种生物均能把纤维素分解成葡萄糖，从而作为生物体的能量来源
解析：选D　自然界中许多生物都不能分解纤维素，只有能合成纤维素酶的生物才能分解纤维素。
2．在加入刚果红的培养基中会出现透明圈，产生的透明圈是(　　)
A．刚果红与纤维素形成的复合物
B．刚果红与纤维二糖形成的复合物
C．纤维素分解后形成的葡萄糖导致的
D．以纤维素分解菌为中心形成的
解析：选D　刚果红可以与纤维素结合形成红色复合物，但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红－纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。
3．微生物体内能够使纤维素分解成纤维二糖的酶是(　　)
A．C1酶和Cx酶
B．C1酶和葡萄糖苷酶
C．Cx酶和葡萄糖苷酶
D．C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶
解析：选A　纤维素酶包括C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶。前两种酶将纤维素分解为纤维二糖。
4．纤维素酶的测定方法一般是(　　)
A．对纤维素进行定量测定
B．对纤维素酶分解纤维素后所产生的葡萄糖量进行测定
C．对纤维素酶分解纤维素后所产生的纤维二糖进行定量测定
D．对纤维素分解菌进行定量测定
解析：选B　纤维素分解菌的鉴定常用发酵产纤维素酶的实验，即对纤维素酶分解纤维素后所产生的葡萄糖进行定量测定。
5．(2014·新课标Ⅰ)植物秸秆中的纤维素可被某些微生物分解。回答下列问题：
(1)分解秸秆中纤维素的微生物能分泌纤维素酶，该酶是由3种组分组成的复合酶，其中的葡萄糖苷酶可将________分解成________。
(2)在含纤维素的培养基中加入刚果红(CR)时，CR可与纤维素形成________色复合物。用含有CR的该种培养基培养纤维素分解菌时，培养基上会出现以该菌的菌落为中心的________。
(3)为从富含纤维素的土壤中分离获得纤维素分解菌的单菌落，某同学设计了甲、乙两种培养基(成分见下表)：
酵母膏
无机盐
淀粉
纤维素粉
琼脂
CR溶液
水
培养基甲
＋
＋
＋
＋
－
＋
＋
培养基乙
＋
＋
＋
－
＋
＋
＋
注：“＋”表示有，“－”表示无。
据表判断，培养基甲________(填“能”或“不能”)用于分离和鉴别纤维素分解菌，原因是____________________________________；培养基乙________(填“能”或“不能”)用于分离和鉴别纤维素分解菌，原因是____________________________________________
________________________________________________________________________。
解析：(1)纤维素酶包括三种组分，即C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶，C1酶、Cx酶催化纤维素分解成纤维二糖，葡萄糖苷酶将纤维二糖分解成葡萄糖。(2)CR能与培养基中的纤维素形成红色复合物。当纤维素被纤维素酶分解后，CR—纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌的菌落为中心的透明圈。(3)培养基甲中未添加琼脂，为液体培养基，液体培养基上不能形成单菌落，故不能用于分离和鉴别纤维素分解菌。培养基乙中未添加纤维素，不能和CR形成红色复合物，即使出现单菌落也不能确定为纤维素分解菌。
答案：(1)纤维二糖　葡萄糖　(2)红　透明圈　(3)不能　液体培养基不能用于分离单菌落　不能　培养基中没有纤维素，不会形成CR—纤维素红色复合物，即使出现单菌落也不能确定其为纤维素分解菌
[课时跟踪检测]
(满分50分　时间25分钟)
一、选择题(每小题3分，共24分)
1．在加入刚果红的培养基中出现透明圈的菌落是(　　)
A．分解尿素的细菌　　
B．硝化细菌
C．分解纤维素的细菌
D．乳酸菌
解析：选C　分解纤维素的细菌能将纤维素分解，则刚果红－纤维素的复合物就无法形成，培养基中就会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。
2．使用刚果红染色时，加入刚果红应在(　　)
①制备培养基时　②梯度稀释时　③倒平板时
④涂布时　⑤长出菌落时
A．①③
B．②⑤
C．③⑤
D．④⑤
解析：选C　常用的刚果红染色法有两种：一种是先培养微生物，长出菌落后再加入刚果红进行颜色反应；另一种是倒平板时就加入刚果红。最终，两种染色法都可以在培养基上观察到以纤维素分解菌为中心的透明圈。
3．下列关于纤维素酶的叙述，错误的是(　　)
A．纤维素酶只有一种，只能将纤维素分解为葡萄糖
B．纤维素酶是一种复合酶，至少包括C1、Cx和葡萄糖苷酶三种
C．纤维素可被纤维素酶水解成葡萄糖，为微生物提供营养物质
D．分解纤维素的细菌、真菌、放线菌，都是通过产生纤维素酶来分解纤维素的
解析：选A　纤维素酶是一种复合酶，一般认为至少包括三种组分，C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶。其中C1酶和Cx酶将纤维素分解为纤维二糖，葡萄糖苷酶将纤维二糖分解为葡萄糖。纤维素可以为以纤维素为碳源的真菌、细菌、放线菌提供营养物质。
4．分离土壤中纤维素分解菌用到的方法是(　　)
①稀释平板法　②涂布平板法　③单细胞挑取法
④选择培养分离法
A．①②
B．②③④
C．②③
D．①③④
解析：选B　分离土壤中的纤维素分解菌，先进行选择培养，增加纤维素分解菌的浓度，然后梯度稀释，涂布平板、培养，最后单细胞挑取以获得纯种培养。稀释平板法是先进行梯度稀释，然后分别取不同稀释液少许，与已熔化并冷却至50
℃左右的琼脂培养基混合摇匀后，倾入灭菌的培养皿中，制成可能含菌的琼脂平板，保温一定时间即可出现菌落。但此方法只适用于耐高温微生物的分离，不能用来分离纤维素分解菌。
5．要将能分解纤维素的细菌从土壤中分离出来，应将它们接种在(　　)
A．加入指示剂的鉴别培养基上
B．含有蛋白胨的固体培养基上
C．只含纤维素粉而无其他碳源的选择培养基上
D．含四大营养要素的培养基上
解析：选C　分解纤维素菌的选择条件是以纤维素为唯一碳源。
6．下列关于分离纤维素分解菌实验过程的操作，有误的是(　　)
A．经选择培养后将样品直接涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上
B．富集培养这一步可省略，但培养的纤维素分解菌少
C．经稀释培养后，用刚果红染色
D．对照组可用同样量的培养液涂布到不含纤维素的培养基上
解析：选A　经选择培养后，再经稀释，才能将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上；富集培养可省略；经稀释培养后，用刚果红染色；设置对照能证明经富集培养的确得到了欲分离的微生物。
7．利用农作物秸秆为原料可生产乙醇，生产过程中可采用微生物将秸秆水解或用酶水解，其主要技术流程如下图所示，下列相关说法错误的是(　　)
秸秆―→秸秆碎屑反应罐水解压滤出渣酒精发酵真空分馏
A．可用刚果红染色法筛选过程①所需的纤维素分解菌
B．过程①加入的纤维素酶是葡萄糖苷酶
C．酒精发酵接种的酵母菌需在无氧条件下发酵
D．酒精发酵前需对培养基进行高压蒸汽灭菌
解析：选B　筛选纤维素分解菌可采用刚果红染色法；纤维素酶为复合酶，至少包含三种组分，C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶；酒精发酵需在无氧条件下进行；酒精发酵前需对培养基进行高压蒸汽灭菌。
8．下表资料表明在各种培养基中细菌的生长情况，(S、C、M)为简单培养基，U、V、X、Y、Z代表加入培养基的不同物质，问哪一种物质细菌不能合成(　　)
培养基
生长状态
S、C、M
－
S、C、M＋V＋Z
－
S、C、M＋U＋Y
＋
S、C、M＋Z＋X
－
S、C、M＋V＋Y
＋
S、C、M＋U＋X
－
S、C、M＋Y＋Z
＋
注：表中“＋”表示能生长，“－”表示不能生长。
A．U
B．V
C．Y
D．Z
解析：选C　从表中可以看出，凡是能生长的均有Y，而不能生长的均无Y。因此，Y是细菌不能合成的物质。
二、非选择题(共26分)
9．(12分)有些微生物能合成纤维素酶，通过对这些微生物的研究和应用，使人们能够利用秸秆等废弃物生产酒精，用纤维素酶处理服装面料等。研究人员成功地从土壤中筛选到能产生纤维素酶的微生物。分析回答问题：
(1)在将样品稀释涂布到鉴别培养基之前，可以通过______(填“固体”或“液体”)培养基进行______以增加纤维素分解菌的浓度。
(2)刚果红可以与纤维素等多糖形成红色复合物，但并不与纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。常用的刚果红染色法有两种，第一种是先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应；第二种是在________时就加入刚果红。________(填“第一种”或“第二种”)方法会使菌落之间发生混杂。
(3)如果观察到产生________的菌落，说明可能获得了纤维素分解菌。为了确定是纤维素分解菌，还需要进行________产纤维素酶的实验。纤维素酶的测定方法一般是对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的________进行定量的测定。
(4)实验结束后，使用过的培养基应该进行灭菌处理才能倒掉，这样做的目的是________________________________________________________________________。
解析：(1)在将样品稀释涂布到鉴别培养基之前，可以通过液体培养基进行选择培养以增加纤维素分解菌的浓度。
(2)常用的刚果红染色法有两种，一种是先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应，另一种是在倒平板时就加入刚果红。但第一种方法会使菌落之间发生混杂。
(3)如果观察到产生透明圈的菌落，说明可能获得了纤维素分解菌。为了确定是纤维素分解菌，还需要进行发酵产纤维素酶的实验。纤维素酶的测定方法一般是采用对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进行定量的测定。
(4)实验结束后，使用过的培养基应该进行灭菌处理才能倒掉，以免菌种对环境造成污染。
答案：(1)液体　选择培养　(2)倒平板　第一种
(3)透明圈　发酵　葡萄糖　(4)防止造成环境污染
10．(14分)进入冬季，部分城市出现严重雾霾，与秸秆野外焚烧有一定关系。为破解秸秆处理瓶颈，微生物专家力图通过微生物降解技术使秸秆能尽快腐烂掉，增加土壤肥力。缓解环境污染。试分析并回答有关问题：
(1)专家研制的降解秸秆的催腐剂是十余种能分解纤维素的霉菌、细菌和酵母菌的组合。其中________在细胞结构上与其他两者不同。
(2)纤维素酶是一种复合酶，其中的葡萄糖苷酶可以将__________分解为______________。
(3)微生物专家为从发黑的树干上分离出有分解纤维素能力的高产菌株，制备了选择培养基，将菌液进行一系列__________，从而得到单个菌落，再采用_________________法进行鉴定，得到如图所示的菌落。那么，图中降解纤维素能力最强的菌株是___________(填图中序号)。
(4)图中所示培养基从物理状态上看，属于____________培养基。
(5)为探究催腐剂在不同条件下对玉米秸秆的分解作用，将经过灭菌处理的秸秆平分成下表的甲、乙、丙三组，均放在无菌环境条件下进行培养，得到如下实验现象：
组别
催腐剂
温度/℃
实验现象
甲
无
25
第25天落叶还没变化
乙
有
25
第25天落叶完全腐烂
丙
有
35
第18天落叶完全腐烂
该实验还存在不完善之处，请说出其中一点______________________________________________________________。
解析：(1)霉菌和酵母菌属于真核生物中的真菌，细菌属于原核生物，原核细胞和真核细胞在结构上最主要的区别是原核细胞没有核膜包被的成形的细胞核。(2)纤维素酶是一种复合酶，其中的葡萄糖苷酶可以将纤维二糖分解为葡萄糖。(3)将菌液进行一系列梯度稀释，可以得到单个菌落，再采用刚果红染色法进行鉴定。纤维素酶的量越多，活性越强，分解的纤维素越多，透明圈越大，所以图中降解纤维素能力最强的菌株是①。(4)图中所示培养基从物理状态上看，属于固体培养基。(5)设计实验应遵循单一变量和对照性原则，分析实验表格可知，该实验还存在不完善之处，即缺少35
℃无催腐剂的对照组。
答案：(1)细菌　(2)纤维二糖　葡萄糖　(3)梯度稀释　刚果红染色　①　(4)固体　(5)缺少35
℃无催腐剂的对照组
1．纤维素酶是复合酶，包括C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶等组分。
2．纤维素酶的作用：纤维素eq
\o(――――→,\s\up7(C1酶和Cx酶),\s\do5(　　))纤维二糖eq
\o(――――→,\s\up7(葡萄糖苷酶),\s\do5(　　))葡萄糖。
3．刚果红与纤维素形成红色复合物。当纤维素被分解后，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。
4．分离分解纤维素的微生物的实验流程：土壤取样―→选择培养―→梯度稀释―→将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上―→挑选产生透明圈的菌落。
5．分离后，为确定得到的是纤维素分解菌，还需进行发酵产纤维素酶的实验。课题1微生物的实验室培养
培养基及无菌技术
[自读教材·夯基础]
1．培养基
(1)概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出的供其生长繁殖的营养物质。
(3)营养成分：水、无机盐、碳源、氮源，此外还要满足微生物生长对pH、特殊营养物质及氧气的要求。
2．无菌技术
(1)目的：获得纯净培养物。
(2)关键：防止外来杂菌的入侵。
(3)不同对象的无菌操作方法[连线]：
　　
1．下面是查氏培养基(培养霉菌所用)的主要成分，请根据下述培养基，回答下列问题：
蔗糖
15
g
NaNO3
3
g
K2HPO4
1
g
KCl
0.5
g
MgSO4·7H2O
0.5
g
FeSO4
0.01
g
琼脂
15～20
g
水
定容至1
000
mL
(1)该培养基根据物理性质划分应是什么培养基？为什么？
提示：固体培养基。因为该培养基加入了凝固剂琼脂。
(2)该培养基包含微生物生长和繁殖所需要的几类营养物质？分别是什么？
提示：4类物质。分别是碳源、氮源、无机盐和水。
(3)蔗糖提供的是哪类营养物质？NaNO3提供的是哪类营养物质？
提示：蔗糖提供的是碳源。NaNO3提供的是氮源和无机盐。
(4)在提供上述几种主要营养物质的基础上，培养基还需要满足微生物所需要的哪些条件？
提示：满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的需要。
2．探讨培养基、培养皿、接种环、实验者的双手、空气和牛奶所采用的灭菌或消毒方法。
提示：分别为高压蒸汽灭菌、干热灭菌、灼烧灭菌、化学消毒、紫外线灭菌、巴氏消毒法。
3．消毒与灭菌的相同点与区别分别是什么？
提示：消毒是杀灭病原微生物和有害微生物，并不要求杀灭一切活的微生物；而灭菌则是杀死物体内外所有微生物，包括芽孢和孢子。
[跟随名师·解疑难]
1．培养基的成分
营养物质
定义
作用
主要来源
碳源
凡能提供所需碳元素的物质
构成生物体的细胞物质和一些代谢产物，有些是异养生物的能源物质
无机化合物：CO2、NaHCO3等；有机化合物：糖类、脂肪酸、花生粉饼、石油等
氮源
凡能提供所需氮元素的物质
合成蛋白质、核酸以及含氮的代谢产物
无机化合物：N2、NH3、铵盐、硝酸盐等；有机化合物：尿素、牛肉膏、蛋白胨等
生长因子
生长必不可少的微量有机物
酶和核酸的组成成分
维生素、氨基酸、碱基等
水
在生物体内含量很高
不仅是优良的溶剂而且可维持生物大分子结构的稳定
外界摄入
无机盐
为微生物提供除碳、氮以外的各种重要元素，包括大量元素
细胞内的组成成分，生理调节物质，某些化能自养菌的能源，酶的激活剂
无机化合物
2.实验室常用的消毒和灭菌方法
项目
概念
常用方法
应用范围
消毒
使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分微生物(不包括芽孢和孢子)
煮沸消毒法：在100
℃煮沸5～6
min
一般物品
巴氏消毒法：在70～75
℃煮30
min或在80
℃煮15
min
一些不耐高温的液体，如牛奶
化学药剂消毒法
如用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源等
紫外线消毒法：紫外灯照射30
min
接种室、操作台
灭菌
使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物(包括芽孢和孢子)
灼烧灭菌：酒精灯火焰
接种工具的灭菌和试管口的灭菌
干热灭菌：在160～170
℃下灭菌1～2
h
玻璃器皿、金属工具的灭菌
高压蒸汽灭菌：在压力为100
kPa，温度为121
℃的条件下，灭菌15～30
min
培养基及容器的灭菌
大肠杆菌的纯化培养
[自读教材·夯基础]
1．制备固体培养基
2．纯化大肠杆菌
(1)方法：
①平板划线法：通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。
②稀释涂布平板法：将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。
(2)鉴定：将接种后的培养基和一个未接种的培养基都放入37_℃恒温箱中，培养12
h和24
h后，分别记录观察。
(3)菌种保存：
对于频繁使用的菌种，可以采用临时保藏法；对于需要长期保存的菌种，可以采用甘油管藏法。
1．培养基灭菌后，需要冷却到50
℃左右时，才能用来倒平板，你用什么办法来估计培养基的温度？
提示：可以用手触摸，感觉上以刚不烫手为准。
2．如果需要调节培养基的pH，应在哪一步骤后进行？
提示：溶化后，灭菌前。
3．在用平板划线法接种大肠杆菌时，第一次划线前、每次划线前及划线操作结束后，都要灼烧接种环，请分析其目的分别是什么。
提示：
第一次灼烧
每次划线前灼烧
划线结束灼烧
目的
避免接种环上可能存在的微生物污染培养物
杀死上次划线结束后接种环上残留的微生物，使每次划线的微生物来自上次划线末端
杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者
4．在纯化大肠杆菌操作中，如何验证培养基灭菌是否彻底？
提示：将接种后的培养基和一个未接种的培养基，都放在37
℃恒温箱中培养，观察并记录结果。
[跟随名师·解疑难]
1．微生物培养中有关实验操作的注意事项
(1)倒平板操作：
①培养基灭菌后，需冷却至50
℃左右时才能倒平板，原因是琼脂在44
℃以下凝固。
②培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，不要完全打开。
③整个操作过程要在酒精灯火焰旁进行，避免杂菌污染。
④平板冷凝后要倒置的原因：防止皿盖上的冷凝水珠落入培养基，造成污染。
⑤若倒平板时，培养基溅在皿盖和皿底之间的部位，这个平板应丢弃。
(2)平板划线操作：
①第一次划线及每次划线之前都需灼烧接种环灭菌，划线操作结束仍需灼烧接种环。
②灼烧接种环之后，要等其冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种。
③划线时最后一区域不要与第一区域相连。
④划线用力要大小适当，防止用力过大将培养基划破。
2．稀释涂布平板操作
(1)稀释操作时：每支试管及其中9
mL水、移液管均需灭菌；操作时，试管口和移液管应在离火焰1～2
cm处。
(2)涂布平板时：稀释涂布平板的操作比较复杂，且各个细节均需保证“无菌”，应特别注意：
①酒精灯与培养皿的距离要合适。
②吸管头不要接触任何其他物体。
③吸管要在酒精灯火焰周围使用。
3．平板划线法和稀释涂布平板法的比较
项目
优点
缺点
适用范围
平板划线分离法
可以观察菌落特征，对混合菌进行分离
不能计数
适用于好氧菌
稀释涂布平板法
可以计数，可以观察菌落特征
吸收量较少、较麻烦，平板不干燥效果不好，容易蔓延
适用于厌氧菌和兼性厌氧菌
4.两种菌种保存方法的比较
项目
临时保藏法
甘油管藏法
适用对象
频繁使用的菌种
长期保存的菌种
培养基类型
固体斜面培养基
液体培养基
温度
4
℃
－20
℃
方法
菌落长成后于冰箱中保存，每3～6个月将菌种从旧的培养基转移到新鲜培养基上
将培养的菌液与等体积灭菌后的甘油混合均匀后于冷冻箱内保存
缺点
菌种易被污染或产生变异
培养基的成分
[例1]
下列描述正确的是(　　)
A．同一种物质不可能既作碳源又作氮源
B．除水以外的无机物仅提供无机盐
C．凡是碳源都能提供能量
D．有些无机氮源也能提供能量
[解析]　对异养型微生物来说，含C、H、O、N的化合物既是碳源，又是氮源。如蛋白胨既是碳源又是氮源和能源，葡萄糖是碳源同时又是能源。除水以外的无机物种类繁多，如CO2和N2是无机物，但也是某些微生物的碳源和氮源。CO2是光能自养细菌的碳源，但不能提供能量。NaHCO3可作为自养型微生物的碳源和无机盐。硝化细菌所利用的氮源是无机氮源氨，同时氨也为硝化细菌提供用于化能合成作用的能源。
[答案]　D
归纳拓展　几种微生物的营养能量来源
微生物类型
碳源
氮源
能源
举例
化能异养型
糖类、蛋白质等有机物
蛋白质等
有机物
大肠杆菌
化能自养型
CO2
NH3
NH3
硝化细菌
光能自养型
CO2
NH、NO等
光能
蓝藻
共生固氮微生物
糖类等有机物　　
N2
有机物
根瘤菌
自生固氮微生物
CO2
N2
光能
固氮蓝藻
纯化大肠杆菌的方法
[例2]　下列有关平板划线的操作，正确的是(　　)
A．使用已灭菌的接种环、培养皿，操作过程中不再灭菌
B．打开含菌种的试管需通过火焰灭菌，取出菌种后需马上塞上棉塞
C．将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划3～5条平行线即可
D．最后将平板倒置，放入培养箱中培养
[解析]　在培养基上接种时，一定要做到无菌操作，以防止杂菌污染影响实验或研究的结果。微生物无处不在，包括空气中也充满了各种微生物，所以无菌操作显得很困难，但在酒精灯火焰附近约10
cm的四周为无菌区，因而菌种试管和待接种试管管口不能离开火焰附近，接种环、棉塞也不能离开火焰附近。接种完毕之后为了防止菌体污染，要在火焰上灼烧管口和接种环。为防止皿盖上的水珠落入培养基造成污染，应将平板倒置。
[答案]　D
易错提醒　要建立有菌观念，接种用具、器皿、空气中都充满了微生物，都有被污染的可能，必须严格地消毒灭菌。同时，在实验室中，不可吃东西、喝水，离开时一定要洗手，以防被微生物感染。使用过的培养基要经过高压蒸汽灭菌后才能丢弃，以免污染环境。
[随堂基础巩固]
1．下列叙述正确的是(　　)
A．培养基是为微生物的生长繁殖提供营养的基质
B．培养基只有两类：液体培养基和固体培养基
C．固体培养基中加入少量水即可制成液体培养基
D．微生物在固体培养基上生长时，可以形成肉眼可见的单个细菌
解析：选A　培养基是人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出的供其生长繁殖的营养基质。培养基的种类根据划分依据的不同而不同，如根据化学成分可分为天然培养基和合成培养基。固体培养基是液体培养基添加凝固剂形成的，其他成分均相同。单个的微生物形体微小，肉眼无法看到，必须借助仪器才能看到，在固体培养基上用肉眼观察到的是一个菌落。
2．下列操作错误的是(　　)
A．用酒精擦拭双手
B．用氯气消毒水源
C．实验室用紫外线进行消毒
D．玻璃器皿(吸管、培养皿)用酒精直接擦拭即可达到彻底灭菌的目的
解析：选D　玻璃器皿、金属用具等耐高温、需要保持干燥的物品，应采用干热灭菌法进行灭菌，而用酒精直接擦拭达不到彻底灭菌的目的。
3．下列关于牛肉膏蛋白胨固体培养基的制备，叙述错误的是(　　)
A．操作顺序为计算、称量、溶化、倒平板、灭菌
B．将称好的牛肉膏连同称量纸一同放入烧杯
C．待培养基冷却至50
℃左右时进行倒平板
D．等平板冷却凝固约5～10
min后将平板倒过来放置
解析：选A　制备牛肉膏蛋白胨固体培养基时，其操作顺序为计算―→称量―→溶化―→灭菌―→倒平板；由于牛肉膏比较黏稠，称量时可连同称量纸一同放入烧杯；待培养基冷却至50
℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板；平板冷凝后，应将平板倒过来放置，以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
4．某研究小组从有机废水中分离微生物用于废水处理。下列叙述正确的是(　　)
A．培养基分装到培养皿后进行灭菌
B．转换划线角度后需灼烧接种环再进行划线
C．接种后的培养皿须放在光照培养箱中培养
D．培养过程中每隔一周观察一次
解析：选B　培养微生物过程中应先灭菌再倒平板；每一次划线前都要进行接种环的灼烧灭菌；接种后的培养皿应在恒温培养箱中进行培养，光照会影响温度等条件；培养过程中观察间隔的时间一般不超过24
h。
[课时跟踪检测]
(满分50分　时间25分钟)
一、选择题(每小题3分，共24分)
1．下列关于平菇培养的操作程序，正确的是(　　)
A．配制牛肉膏蛋白胨培养基，接种，高压蒸汽灭菌，培养
B．配制牛肉膏蛋白胨培养基，高压蒸汽灭菌，接种，培养
C．配制棉子壳培养基，接种，高压蒸汽灭菌，培养
D．配制棉子壳培养基，高压蒸汽灭菌，接种，培养
解析：选D　培养平菇常用的培养基有棉子壳、花生饼、玉米芯等，具体的操作程序是：配制培养基，高压蒸汽灭菌，接种，培养。
2．下列有关一种以CO2为唯一碳源的自养微生物营养的描述错误的是(　　)
A．氮源物质为该微生物提供必要的氮素
B．碳源物质也是该微生物的能源物质
C．无机盐是该微生物不可缺少的营养物质
D．水是该微生物的营养要素之一
解析：选B　该碳源是CO2，属于无机物，不能作为微生物的能源物质。
3．无菌技术包括以下几个方面的叙述，其中错误的是(　　)
A．对培养操作的空间、操作者的衣着和手进行灭菌
B．对培养器皿、接种用具和培养基等进行灭菌
C．为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行
D．实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围物品相接触
解析：选A　灭菌是采用强烈的理化因素对用于微生物培养的培养皿、接种用具和培养基进行处理，使物体内外一切微生物，包括芽孢和孢子都要被杀死；实验操作者的衣着和手以及操作空间只能进行消毒。
4．关于实验室培养和纯化大肠杆菌过程中的部分操作，下列说法正确的是(　　)
A．配制培养基、倒平板、接种需要在酒精灯火焰旁进行
B．倒平板时，倒入的培养基冷却后盖上培养皿的皿盖
C．划线接种时，灼烧接种环后立即进行再次划线
D．划线接种结束后，需将平板倒置后放入培养箱中培养
解析：选D　倒平板、接种需要在酒精灯火焰旁进行，配制培养基不需要在酒精灯火焰旁进行，A错误；倒入培养基后应立即盖上培养皿的皿盖，冷却后将平板倒过来放置，B错误；划线接种时，灼烧接种环后要待其冷却后才能进行再次划线，C错误；划线接种结束后，需将平板倒置后放入培养箱中培养，D正确。
5．将接种后的培养基和一个未接种的培养基都放入37
℃恒温箱的目的是(　　)
A．对比观察培养基有没有被微生物利用
B．对比分析培养基是否被杂菌污染
C．没必要放入未接种的培养基
D．为了下次接种时再使用
解析：选B　放入未接种的培养基，起到对照作用，可确定培养基是否被杂菌污染。
6．为了保存菌种的纯净需要进行菌种的保藏，下列有关叙述错误的是(　　)
A．对于频繁使用的菌种，可以采用临时保藏的方法
B．临时保藏的菌种一般是接种到试管的斜面培养基上
C．临时保藏菌种容易被污染或发生变异
D．对于需要长期保存的菌种，可以采用低温－4
℃保藏的方法
解析：选D　对于需要长期保存的菌种，可采用甘油管藏法，即在3
mL甘油瓶中加入1
mL的甘油后灭菌，将1
mL的菌液转移到甘油瓶中，放在－20
℃的冷冻箱中保存。
7．平板划线法和稀释涂布平板法是接种微生物的两种常用方法，下列描述正确的是(　　)
A．都要将菌液进行一系列的梯度稀释
B．平板划线法是将不同稀释度的菌液通过接种环连续划在固体培养基表面
C．稀释涂布平板法是将不同稀释度的菌液倒入液体培养基上进行培养
D．都会在培养基表面形成单个的菌落
解析：选D　平板划线法不需要进行梯度稀释，稀释涂布平板法需要将不同稀释度的菌液涂布到固体培养基的表面。平板划线法和稀释涂布平板法都能在培养基表面形成单个的菌落。
8.右面是微生物平板划线示意图。划线的顺序为①②③④⑤。下列叙述正确的是(　　)
A．在五个区域中划线前后都要对接种环和培养基进行灭菌
B．划线操作时完全打开皿盖，划完立即盖上
C．接种时不能划破培养基，否则难以达到分离单菌落的目的
D．第①区和第⑤区的划线最终要连接起来，以便比较前后的菌落数
解析：选C　在每次划线前后都要对接种环进行灭菌；进行划线操作时，左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖；注意接种时不能划破培养基，否则难以达到分离单菌落的目的；划线时第①区和第⑤区的划线不能相连。
二、非选择题(共26分)
9．(12分)回答下列微生物培养的问题：
(1)如表是某培养液的成分及含量，该培养液培养的微生物同化作用类型是________；若用此培养液培养固氮微生物，则应除去的成分是__________，应加入的物质是________。
编号
①
②
③
④
⑤
⑥
成分
(NH4)HCO3
KH2PO4
CaSO4
FeCl2
维生素
水
含量
0.5
g
3.0
g
0.5
g
0.5
g
少许
1
000
mL
(2)下表为牛肉膏蛋白胨培养基的成分列表，据此回答：
成分
牛肉膏
蛋白胨
NaCl
H2O
含量
0.5
g
1
g
0.5
g
100
mL
①牛肉膏、蛋白胨在培养基中的作用是提供__________、________、________等营养。
②要用表中所给材料配制观察细菌菌落状况的培养基，还需添加的成分是________。
③表中各成分含量确定的原则是________________________________________________________________________。
④培养基配制好后，分装前应进行的工作是__________。
⑤从配制培养基直到培养完成，所采用的预防杂菌感染的方法0是______________、______________、______________等。
(3)微生物接种的方法很多，最常用的是______________和________。
解析：(1)培养基中不含有机碳源，可判断培养的生物同化作用类型为自养型；若用此培养液培养固氮微生物，则应除去氮源(NH4)HCO3，但需加入有机物提供碳源。(2)根据所培养微生物对各营养成分的需要量配制培养基的成分，若要观察细菌菌落状况需用固体培养基，还需添加琼脂；微生物培养时需对培养基、接种工具进行无菌处理，并进行严格的无菌操作。(3)常用的微生物接种方法有平板划线法和稀释涂布平板法。
答案：(1)自养型　(NH4)HCO3(或①)　有机物
(2)①碳源　氮源　维生素(或磷酸盐等)　②琼脂(凝固剂)　③所培养微生物对各营养成分的需要量　④调整pH　⑤高压蒸汽灭菌　烧灼接种环　酒精棉擦手(或棉塞塞试管口、在火焰旁接种)　(3)平板划线法　稀释涂布平板法
10．(14分)炭疽病是由炭疽杆菌引起的一种人畜共患传染病。炭疽杆菌两端截平、呈竹节状排列，菌落呈卷发状。对炭疽病疑似患者，可根据噬菌体的宿主专一性，通过实验确诊。
(1)细菌培养：采集疑似患者的样本，分离培养，获得可疑菌落。
(2)细菌鉴定：实验流程如图所示：
①对配制的液体培养基等需采取________方法灭菌；实验所用液体培养基的碳源为________(填“无机碳”或“有机碳”)。
②挑选可疑菌落制片后，用____________观察，可看到呈竹节状排列的杆菌。
③接种可疑菌后，35
℃培养24
h，液体培养基变浑浊，原因是________________。对照组试管中应加入________，与实验组同时培养6
h后，若实验组液体培养基的浑浊度比对照组________(填“高”或“低”)，则可明确疑似患者被炭疽杆菌感染；反之则排除。
④对排除的疑似患者及易感人群，可接种炭疽杆菌疫苗，刺激机体产生相应抗体，与产生抗体相关的细胞除T细胞、B细胞外，还有________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
解析：①培养基应用高压蒸汽方法进行灭菌。炭疽杆菌同化类型为异养型，应选有机碳作为其碳源。②微生物个体小，肉眼观察不到，必须借助显微镜才能观察到菌体特征。③在液体培养基中，细菌大量繁殖会导致培养液变浑浊；该实验中实验变量为是否加入噬菌体，所以对照组除不加噬菌体外，其他处理都应该和实验组保持一致(即应加入不含噬菌体的生理盐水)。噬菌体可破坏细菌细胞，从而使培养液变清。④在特异性免疫的感应阶段，吞噬细胞参与了对抗原的摄取、处理和呈递，效应B(浆)细胞是直接产生抗体的细胞。
答案：(2)①高压蒸汽(98
kPa蒸汽)　有机碳
②显微镜
③细菌大量繁殖　等量生理盐水　低
④吞噬细胞、效应B(浆)细胞
1.培养基中含有水、无机盐、碳源、氮源和生长因子等营养物质。
2．实验室常用的灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌和高压蒸汽灭菌等。
3．固体培养基的配制过程为：计算―→称量―→溶化―→灭菌―→倒平板。
4．平板划线法和稀释涂布平板法是微生物接种的常用方法。
5．消毒的目的是杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物；灭菌则是杀死物体内外所有的微生物，包括孢子和芽孢。阶段质量检测(二)　微生物的培养与应用
(B卷　能力素养提升)
(满分：100分　时间：40分钟)
一、选择题(每小题4分，共48分)
1．从土壤中分离能分解尿素的细菌，可以利用选择培养基，其成分中一定有(　　)
①尿素　②有机氮化物　③无机盐　④有机碳化物　⑤水　⑥无机碳化物
A．①③④⑤　　　　　　
B．②③④⑤
C．①③⑤⑥
D．②③⑤⑥
解析：选A　分离能分解尿素的细菌，培养基中一定有尿素且是唯一氮源。另外，水、无机盐和碳源、能源也是细菌生长所必不可少的。有机碳在这里既是碳源又是能源，因为分解尿素的细菌是异养微生物，不能利用无机碳化物。一定没有有机氮化物，因为其他异养型微生物可利用有机氮化物作氮源而能和分解尿素的细菌共同生长，起不到选择培养的作用。
2．稀释涂布平板法是微生物培养中的一种常用的接种方法。下列相关叙述错误的是(　　)
A．操作中需要将菌液进行一系列的浓度梯度稀释
B．需将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基表面
C．不同浓度的菌液均可在培养基表面形成单个的菌落
D．操作过程中对培养基和涂布器等均需进行严格灭菌处理
解析：选C　稀释涂布平板法是将菌液进行一系列的浓度梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，在适宜条件下培养。只有在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物才被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。
3．“筛选”是生物学中培育生物新类型常用的手段，下列有关技术过程中不可能筛选成功的有(　　)
A．在无氮培养基上筛选圆褐固氮菌
B．在不含精氨酸的培养液中筛选能合成精氨酸的杂交细胞
C．用含青霉素的培养基筛选酵母菌和霉菌
D．用不含碳源的培养基筛选根瘤菌
解析：选D　圆褐固氮菌可以固定氮气，所以可以在无氮培养基上生长；青霉素可抑制细菌细胞壁的形成，而对酵母菌和霉菌无抑制作用；根瘤菌是异养生物，在不含碳源的培养基上不能生长。
4．大肠杆菌能够在哪种培养基上生长繁殖(　　)
A．无氮培养基
B．分解尿素的细菌的选择培养基
C．纤维素分解菌的选择培养基
D．牛肉膏蛋白胨培养基
解析：选D　大肠杆菌在含碳源、氮源、水、无机盐的培养基上才能生长，A中没有氮元素，B、C中的氮元素和碳元素不能被大肠杆菌利用。
5．在平板划线操作中，错误的是(　　)
A．将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环烧红
B．将烧红的接种环在火焰旁边冷却
C．接种环在平板上划线位置是随机的
D．在挑取菌种前和接种完毕后均要将试管口通过火焰
解析：选C　接种环灼烧及接种前后试管口要通过火焰，其目的是为了防止杂菌污染，将接种环先冷却再接种可以避免高温杀死菌种，因此都是正确的。在平板上划线时，要划3～5条平行线，而不是随机划线。
6．含氨苄青霉素的LB培养基在基因工程中有很重要的应用。该培养基能杀死一切不抗氨苄青霉素的细菌，只有对氨苄青霉素具有抗性的细菌才能正常生长繁殖。由其作用可知该培养基是一种(　　)
A．固体培养基
B．合成培养基
C．天然培养基
D．选择培养基
解析：选D　该培养基由于含有氨苄青霉素，能杀死一切不抗氨苄青霉素的细菌，只有对氨苄青霉素具有抗性的细菌才能正常生长繁殖。因此氨苄青霉素起到了选择作用。
7．下列有关分解纤维素微生物的分离的叙述，错误的是(　　)
A．纤维素酶的发酵方法有液体发酵和固体发酵
B．对分解纤维素的微生物进行了初步筛选后，无需再进行其他实验
C．纤维素酶的测定方法，一般是对所产生的葡萄糖进行定量地测定
D．纤维素酶是一种复合酶
解析：选B　初步筛选只是分离纯化的第一步，为确定得到的是纤维素分解菌，还需进行发酵产生纤维素酶的实验；纤维素酶的发酵方法有液体发酵和固体发酵两种；纤维素酶的测定方法，一般是对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进行定量测定。
8．尿素是尿素分解菌的氮源，因此在配制培养基时(　　)
A．葡萄糖在培养基中含量越多越好
B．尿素在培养基中含量越少越好
C．尿素分解菌有固氮能力，故培养基中尿素为无机氮
D．尿素分解菌无固氮能力，故培养基中的尿素为化合态氮
解析：选D　尿素分解菌为异养型微生物，培养基中含葡萄糖是必要的，但不是越多越好，葡萄糖的含量过多会使细菌失水过多而不能生长。尿素分解菌没有固氮能力，不能利用游离态的氮，只能利用化合态的氮。尿素在培养基中含量过多或过少都不利于细菌的正常生长。尿素为小分子有机物。
9．除了高温加热以外，其他灭菌方法还有(　　)
A．紫外线照射
B．真空包装
C．用保鲜膜密闭
D．添加防腐剂
解析：选A　灭菌是使用强烈的理化因素杀死物体内外所有微生物(包括芽孢和孢子)。本题中真空包装、添加防腐剂、用保鲜膜密闭都起到了抑菌作用，紫外线照射使细菌的蛋白质变性，核酸受破坏，是灭菌方法。
10．下列关于统计菌落数目方法的叙述，错误的是(　　)
A．采用平板计数法获得的菌落数往往少于实际的活菌数
B．当样品的稀释度足够高时，一个活菌会形成一个菌落
C．为了保证结果准确，一般采用密度较大的平板进行计数
D．在某一浓度下涂布三个平板，若三个平板统计的菌落数差别不大，则应以它们的平均值作为统计结果
解析：选C　当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，因此统计的菌落数往往比活菌的实际数目少。一般选择菌落数在30～300的平板计数，密度过大会使计数结果偏小，影响结果的准确性。涂布3个平板，作为重复组，取其平均值计数能增强实验的说服力和准确性。
11．在培养微生物的培养基中加入某些物质能分离出所需的微生物。下列前项是在培养基中加入的物质，后项是能分离出的微生物，正确的是(　　)
A．氢氧化钠；酵母菌
B．盐酸；放线菌
C．适量的青霉素；霉菌
D．适量的伊红和美蓝；大肠杆菌
解析：选C　氢氧化钠、盐酸为强碱、强酸，酵母菌和放线菌都不能生存；加入伊红和美蓝的培养基是鉴定大肠杆菌，但不能分离出大肠杆菌；适量的青霉素对原核生物有抑制作用，对真核生物的生命活动并不影响，霉菌为真核生物，因此可利用加入青霉素的培养基分离霉菌。
12．下列与生物技术实践相关实验的叙述，正确的是(　　)
A．制作果酒的温度一般要略高于果醋的制作温度
B．制作固定化酵母细胞实验中，需将凝胶珠置于CaCl2溶液中处理适宜的时间
C．制作固定化酶的最佳方法是采用海藻酸钠溶液进行包埋固定
D．腐乳制作的全过程都离不开以毛霉为主的微生物发挥作用
解析：选B　制作果酒的温度一般要低于果醋的制作温度；由于细胞较大，适于用包埋法固定，而酶分子较小，故制作固定化酶的最佳方法用吸附法或交联法；腐乳制作的过程中密封腌制时毛霉不再发挥作用，起作用的是前期产生的各种酶。
二、非选择题(共52分)
13．(16分)无菌操作是微生物接种技术的关键。传统发酵技术和微生物分离、纯化、应用过程及植物组织培养和动物细胞培养过程中，均要无菌操作。回答下列相关问题：
(1)消毒和灭菌是两个不同的概念，灭菌是指彻底杀灭微生物使其永远丧失生长繁殖的能力，消毒仅指杀死一部分对人体有害的病原菌而对被消毒的物体基本无害。下列哪些事物适用于消毒处理(　　)
①皮肤　　②饮用水　　③牛奶　　④注射器
⑤培养皿　　⑥接种环　　⑦培养基　　⑧果汁　　⑨酱油　　⑩手术刀
A．①②③⑧⑨　　　　　　
B．④⑤⑥⑦⑩
C．①②③④⑤⑥⑧
D．以上全部
(2)配制培养基时各种成分在溶化后分装前必须进行____________，接种前要进行____________，在整个微生物的分离和培养中，一定要注意在无菌条件下进行。
(3)
在微生物的实验室培养中，获得纯净培养物的关键是
____________________________________________________
__________________________________________________。
如图是利用________法进行大肠杆菌接种，把聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。为达到这一目的，操作上应注意：
①每次划线前要________________________________________；
②冷却后从上一区划线末端开始划；
③首尾区______________________。
(4)培养大肠杆菌时，在接种前需要检测培养基是否被污染。对固体培养基应采用的检测方法是__________________________________________________________，
观察培养基上是否有菌落产生。
(5)利用培养基不仅可以分离培养大肠杆菌，也可以进行植物组织培养。与大肠杆菌培养明显不同的是，用于组织培养的培养基中还需要加入
________________________________________________________________________。
(6)有位同学在家制作泡菜时，为避免杂菌污染而向泡菜坛中加入了青霉素，结果发酵失败，原因可能是__________________________________________________________。
解析：(1)皮肤、饮用水、牛奶、果汁、酱油应消毒处理，注射器、培养皿、接种环、培养基、手术刀应灭菌处理。(2)配制培养基时各种成分在溶化后分装前必须进行调整pH，接种前要进行高压蒸汽灭菌，在整个微生物的分离和培养中，一定要注意在无菌条件下进行。(3)在微生物的实验室培养中，获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵。微生物的接种方法有平板划线法和稀释涂布平板法。平板划线进行时应每次划线前要灼烧接种环，冷却后从上一区划线末端开始划，首尾区不连接。(4)接种前检测培养基是否被污染的方法为将未接种(接种等量无菌水)的培养基在适宜的温度下放置适当时间，观察培养基上是否有菌落产生。(5)与大肠杆菌培养明显不同的是，用于组织培养的培养基中还需要加入植物激素(或生长素和细胞分裂素)。(6)制作泡菜利用的是乳酸菌的乳酸发酵，但乳酸菌对青霉素敏感，会导致死亡。
答案：(1)A　(2)调整pH　高压蒸汽灭菌
(3)防止外来杂菌的入侵　平板划线　灼烧接种环　不连接(不重叠)　(4)将未接种(接种等量无菌水)的培养基在适宜的温度下放置适当时间
　(5)植物激素(或生长素和细胞分裂素)　(6)青霉素杀死了乳酸菌
14．(20分)某小组同学为了调查湖水中细菌的污染情况而进行了实验。实验包括制备培养基、灭菌、接种及培养、菌落观察计数。请回答与此实验相关的问题：
(1)培养基中含有蛋白胨、淀粉，分别为细菌培养提供了氮源和________。除此之外，培养基还必须含有的基本成分是________和________。
(2)对培养基进行灭菌，应该采用的方法是______________________________________________________________________。
(3)为了尽快观察到细菌培养的实验结果，应将接种了湖水样品的平板置于________中培养，培养的温度设定在37
℃。要使该实验所得结果可靠，还应该同时在另一平板上接种________作为对照进行实验。
(4)培养20
h后，观察到平板上有形态和颜色不同的菌落，这说明湖水样品中有________种细菌。一般说来，菌落总数越多，湖水遭受细菌污染的程度越________。
(5)如果提高培养基中NaCl的浓度，可以用于筛选耐____________细菌，这种培养基(按功能分)被称为____________。
(6)从以下哪些微生物中可以提取到能够分解玉米秸秆的酶？________。(多选)
A．酿制果醋的醋酸菌
B．生长在腐木上的霉菌
C．制作酸奶的乳酸菌
D．生产味精的谷氨酸棒状杆菌
E．反刍动物瘤胃中生存的某些微生物
答案：(1)碳源　无机盐　水　(2)高压蒸汽灭菌
(3)恒温培养箱　无菌水　(4)多　高
(5)盐(或NaCl)　选择培养基　(6)B、E
15．(16分)利用微生物分解淀粉生产糖浆具有广阔的应用前景。某研究所为了从长期种植马铃薯的土壤中分离出能够高效分解淀粉的细菌，进行了如下实验。请进一步完善实验内容并回答相关问题：
(1)实验步骤：
①配制以____________为碳源的固体培养基，为了使培养基凝固成固体，应该向培养基中加入的物质是________。
②将土壤样品接种到已灭菌的培养基上，在恒温培养箱中培养一段时间后，培养基上会出现________。
③将接种针用________法灭菌后，从②中培养基上挑取一定量细菌，接种至________(填“固体”“半固体”或“液体”)培养基，在恒温摇床上培养24
h，使细菌大量繁殖。
④取与①培养基中相同的成分及配比，并加入少量碘液，使制作的培养基呈蓝紫色，灭菌并调节pH，用______________法将③过程所获得大量繁殖的细菌接种到该培养基上。
⑤培养一段时间后，观察菌落周围培养基的颜色变化及其范围的大小，周围出现__________的菌落即为初选菌落，经进一步分离、纯化后即可达到实验目的。
(2)上述实验步骤中，倒平板和接种的操作都应在超净台上的__________________附近进行。
(3)上述实验步骤中，从用途看，①所用培养基属于____________培养基，④和⑤所用培养基属于________培养基。
解析：(1)①欲筛选出能高效分解淀粉的菌株，培养基中应只有淀粉一种碳源，而无其他碳源。②将土壤样品接种到已灭菌的培养基上，在恒温培养箱中培养一段时间后，培养基上会出现菌落。③为了避免杂菌的污染，接种过程中要进行无菌操作，如对接种针进行灼烧处理。从②中的培养基上挑取一定量细菌，接种至液体培养基进行有氧发酵。④用稀释涂布平板法将③过程所获得大量繁殖的细菌接种到该培养基上。⑤培养一段时间后，淀粉分解菌菌落周围会出现透明圈。(2)整个实验操作应是无菌的，倒平板和接种的操作都应在超净台上的酒精灯火焰附近进行。(3)从用途看，①所用培养基属于选择培养基，④和⑤所用培养基属于鉴别培养基。
答案：(1)①淀粉　琼脂　②菌落　③灼烧　液体
④稀释涂布平板(涂布分离)　⑤较大透明圈(浅色范围大)　(2)酒精灯火焰　(3)选择　鉴别(鉴定)阶段质量检测(二)　微生物的培养与应用
(A卷　学业水平达标)
(满分：100分　时间：40分钟)
一、选择题(每小题4分，共48分)
1．平板冷凝后，要将平板倒置，其原因是(　　)
A．接种时再拿起来方便
B．在皿底上标记日期等方便
C．正着放置容易破碎
D．防止皿盖上的冷凝水珠落入培养基造成污染
解析：选D　平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面湿度也比较高。将平板倒置，可以使培养基表面的水分更好地挥发，防止皿盖上水珠落入培养基，造成污染。
2．产生标准形态菌落的细菌的最初数目和培养基分别是(　　)
A．一个细菌、液体培养基
B．许多细菌、液体培养基
C．一个细菌、固体培养基
D．许多细菌、固体培养基
解析：选C　菌落是一个或几个细菌的子细胞群体，在固体培养基上有一定的形态，肉眼可见，而液体培养基不具备该条件。
3．需要在火焰旁操作的有(　　)
①土壤取样　②称取土壤　③稀释土壤溶液
④涂布平板　⑤微生物的培养
A．①②③④⑤　　　
B．②③④⑤
C．③④⑤
D．②③④
解析：选D　为了防止杂菌污染，称取土壤、稀释土壤和涂布平板均应在酒精灯火焰旁进行，土壤取样不用在火焰旁进行，但所用器具均应先灭菌再使用；微生物的培养在恒温箱中进行，无需灭菌。
4．下列关于微生物培养的叙述，错误的是(　　)
A．获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌入侵
B．高温灭菌的目的是杀死微生物的细胞、孢子、芽孢
C．划线分离可在培养基上获得均匀分布的单菌落
D．稀释涂布平板法易获得单菌落和计数活菌数目
解析：选C　获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌入侵；高温灭菌的目的是杀死微生物的细胞、孢子、芽孢；稀释涂布平板法易获得单菌落和计数活菌数目；划线分离可在培养基上获得单菌落，但不是均匀分布的。
5．下列有关平板划线接种法的操作错误的是(　　)
A．将接种环放在火焰上灼烧
B．将已冷却的接种环伸入菌液中蘸取一环菌液
C．在挑取菌种前和接种完毕后均要将试管口通过酒精灯火焰
D．划线时要将最后一区的划线与第一区的划线相连
解析：选D　划线时最后一区的划线与第一区的划线不能相连。
6．制备各种牛肉膏蛋白胨固体培养基，倒平板的具体描述正确的是(　　)
①待培养基冷却至40
℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板
②将灭过菌的培养皿放在桌面上，左手拔出棉塞
③右手拿锥形瓶，使瓶口迅速通过火焰
④用左手的拇指和食指打开皿盖
⑤右手将锥形瓶中培养基倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖
⑥等待平板冷却5～10
s，将平板倒过来放置，使皿盖在下，皿底在上
A．①③④⑤
B．④⑤⑥
C．③⑤
D．①②④⑥
解析：选C　待培养基冷却至50
℃左右，在酒精灯火焰附近倒平板；将灭过菌的培养皿放在火焰旁的桌面上，左手拔出棉塞，用左手将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，等待平板冷却凝固5～10
min后，将平板倒过来放置。
7．在农田土壤的表层自生固氮菌较多。将用表层土制成的稀泥浆接种到特制的培养基上培养，可将自生固氮菌与其他细菌分开，对培养基的要求是(　　)
①加抗生素　②不加抗生素　③加氮素　④不加氮素　⑤加葡萄糖　⑥不加葡萄糖　⑦37
℃恒温箱中培养　⑧28～30
℃温度下培养
A．①③⑤⑦
B．②④⑥⑧
C．②④⑤⑧
D．①④⑥⑦
解析：选C　自生固氮菌有固氮功能，因此培养基中不需要加氮素；细菌对抗生素敏感，因此，不能加抗生素；自生固氮菌是异养型的，应加葡萄糖；其生长繁殖的适宜温度是28～30
℃。
8．若将酵母菌和圆褐固氮菌混合在一起，可采用下列哪组培养基将它们分开(　　)
A．加食盐的培养基和牛肉膏、蛋白胨培养基
B．固体培养基和液体培养基
C．加伊红—美蓝的培养基和含硝酸盐的培养基
D．加青霉素的培养基和无氮培养基
解析：选D　青霉素可杀死原核生物如细菌，酵母菌为真菌，因而不会被杀死。圆褐固氮菌是固氮菌，无氮源也能存活，但酵母菌无法存活，借此可分离两种微生物。
9．细菌分离与计数实验操作过程应注意(　　)
①无菌操作　②做好标记　③规划时间　④土样灭菌
A．①②③④
B．②③④
C．①②③
D．①②
解析：选C　由于本实验操作复杂，目的是对细菌进行分离和计数，整个过程需要无菌操作，如取土样时用到的小铁铲和盛土样的信封及容器等均需灭菌，土样称量、样品稀释及涂布平板等操作均在火焰旁进行；本实验用到的平板和试管比较多，为避免混淆，最好在使用前就做好标记；本实验耗时较长，需事先规划好时间，以便提高工作效率，在操作时更加有条不紊。
10.在涂布有大肠杆菌的培养基上进行抑菌实验，在a、b、c处分别贴浸有不同抗生素(浓度相同)的无菌滤纸片，d处滤纸片浸有无菌水。培养后的结果如图所示。以下判断错误的是(　　)
A．a处抑菌效果小于b处
B．b处的滤纸片没有沥干
C．c处抗生素无效
D．d为对照
解析：选A　培养皿中不同滤纸片四周透明圈的大小不同，透明圈越大，说明浸有的抗生素抑菌效果越好。a处的透明圈并不小于b处；b处不是圆形的透明圈，可能是滤纸片没有沥干，抗生素流出滤纸片；c处无透明圈，说明c处抗生素对大肠杆菌无效；d为空白对照。
11．做“微生物的分离与培养”实验时，下列叙述正确的是(　　)
A．高压灭菌加热结束时，打开放气阀使压力表指针回到零后，开启锅盖
B．倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上
C．为了防止污染，接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落
D．用记号笔标记培养皿中菌落时，应标记在皿底上
解析：选D　在高压灭菌的操作过程中，加热结束后应让灭菌锅内温度自然下降，待压力表的指针指到零时，打开放气阀，旋松螺栓，打开盖子。倒平板时，用左手将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，而不是完全取下放到一边。接种环经火焰灼烧灭菌后应在火焰旁冷却后，再用其挑取菌落。在微生物的培养中，一般将培养皿倒置，在皿底上用记号笔做标记。
12．漆酶属于木质素降解酶类，在环境修复、农业生产等领域有着广泛用途。下图是分离、纯化和保存漆酶菌株的过程，相关叙述错误的是(　　)
A．生活污水中含有大量微生物，是分离产漆酶菌株的首选样品
B．筛选培养基中需要加入漆酶的底物，通过菌落特征挑出产漆酶的菌落
C．在涂布平板上长出的菌落，再通过划线进一步纯化
D．若要长期保存菌株可采用甘油管藏的方法
解析：选A　生活污水中含木质素的物质相对较少，产漆酶菌株也较少，不宜作为分离产漆酶菌株的样品；产漆酶菌株可降解木质素，在筛选培养基中加入木质素可筛选产漆酶的菌株，筛选时可通过菌落特征挑出产漆酶的菌落；在涂布平板上生长的菌落可能还有其他杂菌，可再通过平板划线法进一步纯化；对于需要长期保存的菌种，可以采用甘油管藏的方法，即在－20
℃的冷冻箱中保存。
二、非选择题(共52分)
13．(16分)莠去津是一种含氮农药，在土壤中不易降解，为修复被其污染的土壤，可按下面程序选育能降解莠去津的细菌(目的菌)。请据图回答(已知莠去津在水中溶解度低，含过量莠去津的固体培养基不透明)。
(1)由图推断，从A瓶到C瓶液体培养的过程称为______________，目的是__________________________。
(2)在将C瓶菌种接种到固体培养基之前通常要进行________________，将菌种接种到固体培养基的方法有平板划线法和__________________法，从图中看本实验采用的是__________(填“前者”或“后者”)。
(3)一段时间后，培养基出现无透明圈和有透明圈两种菌落，我们筛选的目的菌是菌落中________的细菌，该菌落生长所需的氮元素主要来自__________。
(4)为弄清固体培养基中的非目的菌落来自C瓶菌种还是培养基，应如何设置对照组？__________________________________________________________________________。
解析：(1)图中从A瓶到C瓶液体培养的过程称为选择培养，目的是初步选择能降解莠去津的细菌(目的菌)并提高其密度。(2)将菌种接种到固体培养基的方法有平板划线法和稀释涂布平板法两种，由图中固体培养基上的菌落分布可知，该接种方法是稀释涂布平板法，包括梯度稀释操作和涂布平板操作。(3)根据题目信息“莠去津在水中溶解度低，含过量莠去津的固体培养基不透明”可知，能够降解莠去津的目的菌会使菌落周围出现透明圈，因此可以选择菌落周围存在透明圈的细菌。由于培养基中只有莠去津一种氮源，因此分解莠去津的微生物所需的氮元素主要由莠去津提供。(4)为弄清固体培养基中的非目的菌落来自C瓶菌种还是培养基，应设置灭菌后不接种菌种的培养基，与实验组放在相同条件下培养，若培养基上无菌落出现，则非目的菌落一定来自C瓶菌种，若培养基上出现菌落，则说明非目的菌落可能来自培养基。
答案：(1)选择培养　初步选择能降解莠去津的细菌(目的菌)并提高其密度　(2)梯度稀释　稀释涂布平板　后者　(3)有透明圈　莠去津　(4)配制的培养基灭菌后不接种菌种，与实验组放在相同条件下培养
14．(16分)临床使用抗生素前，有时需要做细菌耐药实验。实验时，首先要从病人身上获取少量样本，然后按照一定的实验步骤操作，以确定某致病菌对不同抗生素的敏感性。回答下列问题：
(1)为了从样本中获取致病菌单菌落，可用______法或__________________________________法将样本接种于固体培养基表面，经过选择培养、鉴别等步骤获得。
(2)取该单菌落适当稀释，用________法接种于固体培养基表面，在37
℃培养箱中培养24
h，使其均匀生长，布满平板。
(3)为了检测该致病菌对于抗生素的敏感性，将分别含有A、B、C、D四种抗生素的滤纸片均匀置于该平板的不同位置上，培养一段时间后，含A的滤纸片周围出现透明圈，说明该致病菌对抗生素A________；含B的滤纸片周围没有出现透明圈，说明该致病菌对抗生素B__________；含C的滤纸片周围的透明圈比含A的小，说明________________________________；含D的滤纸片周围的透明圈也比含A的小，且透明圈中出现了一个菌落，在排除杂菌污染的情况下，此菌落很可能是抗生素D的________。
(4)根据上述实验结果，为达到抗菌目的，最好选用抗生素________。
解析：(1)微生物的常用分离方法为划线法和稀释涂布平板法。(2)能够使菌落均匀生长、布满平板的接种方法为涂布法。(3)(4)含A的滤纸片周围出现透明圈，说明该致病菌对抗生素A敏感；含B的滤纸片周围没有出现透明圈，说明该致病菌对抗生素B不敏感；含C的滤纸片周围的透明圈比含A的小，说明该致病菌对C的敏感性比对A的弱；含D的滤纸片周围的透明圈比含A的小，且透明圈中出现了一个菌落(排除杂菌污染)，说明该致病菌可能对抗生素D产生了抗药性。
答案：(1)划线　稀释涂布平板(或涂布)　(2)涂布　(3)敏感　不敏感　该致病菌对C的敏感性比对A弱　耐药菌　(4)A
15．(20分)人工瘤胃模仿了牛羊等反刍动物的胃，可用来发酵处理秸秆，提高秸秆的营养价值。为了增强发酵效果，研究人员从牛胃中筛选纤维素酶高产菌株，并对其降解纤维素能力进行了研究。请回答下列问题：
(1)在样品稀释和涂布平板步骤中，下列选项不需要的是________(填序号)。
①酒精灯　②培养皿　③显微镜　④无菌水
(2)在涂布平板时，滴加到培养基表面的菌悬液量不宜过多的原因是________________________________________________________________________
________________________。
(3)向试管内分装含琼脂的培养基时，若试管口粘附有培养基，需要用酒精棉球擦净的原因是________________________________________________________________________
________________________。
(4)刚果红可以与纤维素形成红色复合物，但并不与纤维素降解产物纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。研究人员在刚果红培养基平板上，筛到了几株有透明降解圈的菌落(见右图)。图中降解圈大小与纤维素酶的____________有关。图中降解纤维素能力最强的菌株是______(填图中序号)。
(5)研究人员用筛选到的纤维素酶高产菌株J1和J4，在不同温度和pH条件下进行发酵，测得发酵液中酶活性的结果见下图，推测菌株________更适合用于人工瘤胃发酵，理由是
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
解析：(1)在样品稀释和涂布平板过程中，需要在酒精灯火焰附近进行操作，培养皿用于盛放培养基并培养细菌，无菌水做稀释的溶剂，此处唯一用不到的是显微镜。(2)在涂布平板时，要取少量菌悬液滴加到培养基表面，因为如果滴加菌悬液量过多，菌悬液就会堆积在培养基表面，影响分离效果。(3)在向试管内分装含琼脂的培养基时，如果试管口粘附有培养基，就很容易使棉塞受到污染，因此，需要用无菌的酒精棉球将试管口擦拭干净。(4)因为刚果红可以与纤维素形成红色复合物，且不与纤维素降解产物反应。所以在刚果红培养基平板上，菌落周围有透明降解圈是纤维素被降解的结果，降解圈大小由纤维素酶的活性和量决定。图中菌落①周围的降解圈最大，因此其降解纤维素的能力最强。(5)考虑到人工瘤胃的发酵过程会使发酵液酸性增加，温度升高，在这个前提下观察在不同温度和pH条件下测得的发酵液中酶活性的结果图，从图中可以看出，在高温和低pH条件下都是J4菌株中的纤维素酶的活性较高，因而该菌株更适合用于人工瘤胃发酵。
答案：(1)③　(2)培养基表面的菌悬液会出现积液，导致菌体堆积，影响分离效果　(3)避免培养基污染棉塞　(4)量与活性　①　(5)J4　发酵过程会产热和产酸，J4菌株在较高温度和酸性环境下酶的活性更高专题2
微生物的培养与应用
专题
培养基与微生物的分离
一、培养基的类型和作用
划分标准
培养基种类
特点
用途
物理性质
液体培养基
不加凝固剂
工业生产
半固体培养基
加凝固剂，如琼脂
观察微生物的运动、分类、鉴定
固体培养基
微生物分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种
化学成分
天然培养基
含化学成分不明确的天然物质
工业生产
合成培养基
培养基成分明确(用化学成分已知的化学物质配成)
微生物的分类、鉴别
用途
选择培养基
允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他微生物生长
培养、分离出特定微生物，如培养酵母菌或霉菌，可在培养基中加入青霉素；培养金黄色葡萄球菌，可在培养基中加入高浓度食盐
鉴别培养基
根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品
鉴别不同种类的微生物，如用伊红—美蓝培养基鉴别饮用水或乳制品中是否有大肠杆菌(若有，菌落呈深紫色，并带有金属光泽)
二、微生物的分离与鉴定
微生物的分离方法有很多种，本专题中常用的是：平板划线法、稀释涂布平板法、微生物的选择培养等。针对不同微生物的特点选择不同的方法，对目的微生物进行筛选。以下是尿素分解菌和纤维素分解菌的分离与鉴定比较。
项目
尿素分解菌的分离与鉴定
纤维素分解菌的分离与鉴定
分离选择条件
利用尿素为唯一氮源
利用纤维素为唯一碳源
鉴定原理
细菌等微生物合成脲酶，将尿素分解产生NH3，使pH升高，加入酚红变红色
分解纤维素的微生物产生纤维素酶，将纤维素分解为纤维二糖或葡萄糖，使纤维素—刚果红复合物降解而出现透明圈
步骤
土壤取样→制备培养基→样品梯度稀释→涂布平板→培养观察→进一步鉴定
土壤取样→制备培养基→选择培养→富集培养→梯度稀释→涂布培养→刚果红染色→挑取菌落→进一步鉴定
1．下列有关细菌培养的叙述，正确的是(　　)
A．在琼脂固体培养基上长出的单个菌落含有多种细菌
B．在培养基中加入青霉素可抑制真菌而促进细菌生长
C．向液体培养基中通入氧气能促进破伤风杆菌的生长
D．在半固体培养基中接种细菌培养后可以观察其运动
解析：选D　单个菌落中只含有一种细菌；青霉素抑制细菌生长，而对真菌没有影响；破伤风杆菌是厌氧型细菌，通入氧气会抑制其生长。
2．生物乙醇是以生物为原料生产的可再生能源。我国利用农作物废弃物(秸秆)生产乙醇，其技术流程为纤维素酶分解―→酵母菌发酵―→蒸馏―→成品。纤维素酶可以从能分解纤维素的细菌培养液中提取。某同学设计了从土壤中分离纤维素分解菌的实验流程：土壤取样―→选择培养―→梯度稀释―→鉴别培养。请分析回答下列问题。
(1)最好选择________________环境采集土样。
(2)配制培养基时，各种成分在分装前必须进行________，接种前要进行____________。在整个微生物的分离和培养过程中，一定要注意在无菌条件下进行。在制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的倒平板操作时，平板冷凝后，应将平板________放置，这样做的目的是_________________________________________________________。
(3)以下是两种培养基配方：
A．培养基配方：
KH2PO4
Na2HPO4
MgSO4·7H2O
纤维素酶
葡萄糖
尿素
琼脂
1.4
g
2.1
g
0.2
g
1
g
10.0
g
1.0
g
15.0
g
B．培养基配方：
KH2PO4
NaNO3
Na2HPO4·7H2O
MgSO4·7H2O
KCl
纤维素粉
酵母膏
水解酪素
0.9
g
1
g
1.2
g
0.5
g
0.5
g
5
g
0.5
g
0.5
g
如果要分离提纯土壤中的纤维素分解菌，应选择________(填编号)培养基配方，从功能看该培养基属于________培养基。
(4)为了鉴别纤维素分解菌和进一步纯化菌种，可以在鉴别培养基中加入__________，将筛选获得的菌液稀释后用__________法接种到鉴别培养基上，然后挑选产生________的菌落作为菌种进行进一步的扩大培养。
解析：纤维素分解菌生活在纤维素丰富的土壤环境，故应选择这样的环境采集土样。B培养基中纤维素是主要碳源，有利于纤维素分解菌生长，同时抑制其他微生物生长，能够分离提纯纤维素分解菌。在鉴别培养基上加入刚果红染液，可鉴别纤维素分解菌和进一步纯化菌种。将筛选获得的菌液稀释后用涂布平板法方法接种到鉴别培养基上，然后挑选产生透明圈的菌落作为菌种进行扩大培养。
答案：(1)纤维素含量丰富的土壤　(2)调整pH　高压蒸汽灭菌　倒过来　防止冷凝水污染培养基　(3)B　选择　(4)刚果红染液　涂布平板　透明圈
3．下面的甲图表示酵母菌、硝化细菌和乳酸菌在半固体培养基中的生长情况，乙图表示这三种菌的增殖速度与氧气浓度之间的关系，请据图回答：
(1)乙图中a、b、c三条曲线依次表示甲图________号试管中微生物在不同氧气浓度中的增殖速度。
(2)研究发现，青霉素能破坏细菌的细胞壁并在细菌细胞的繁殖期起杀菌作用。如果培养基中混杂了这三类微生物，请设计实验，利用改变培养基成分等培养条件，将酵母菌和硝化细菌分离出来。
①主要步骤：
a．分别配制不含____________的培养基(A)和加入____________的培养基(B)，分别灭菌。
b．分别接种混合液放在适宜条件下培养。
c．观察结果。
②结果：在A培养基上生存的是________，在B培养基上生存的是________。
(3)微生物培养过程中，获得纯净培养物的关键是________________________。
(4)若想对初步筛选得到的目的菌进行纯化并计数，可采用的接种方法是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
解析：从甲图试管中微生物的分布和数量分析，乳酸菌分布在缺氧的下层，酵母菌在缺氧的底部和氧含量高的上层均匀分布，而硝化细菌主要分布在上层，因此可以判断出a、b、c曲线表示3、2、1号试管中的微生物增殖速度。青霉素破坏细菌的细胞壁，而酵母菌属于真菌，青霉素不能起到杀灭的作用，硝化细菌属于自养生物，不需要添加葡萄糖作为能源物质和碳源。
答案：(1)3、2、1　(2)①有机碳源　青霉素　②硝化细菌　酵母菌　(3)防止杂菌污染(无菌技术)　(4)稀释涂布平板法
培养基与微生物的分离
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-课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
筛选菌株的思路及计数
[自读教材·夯基础]
1．筛选菌株的思路
(1)自然界中目的菌株的筛选：
①依据：根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。
②实例：PCR技术过程中用到的耐高温的Taq
DNA聚合酶，就是从热泉中筛选出来的Taq细菌中提取出来的。
(2)实验室中目的菌株的筛选：
①原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物的生长。
②方法：利用选择培养基分离。
a．选择培养基：允许特定微生物生长，同时阻止或抑制其他种类微生物生长的培养基。
b．实例：选择分解尿素的细菌的培养基，以尿素作为唯一氮源，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。
2．统计菌落数目
(1)常用方法：稀释涂布平板法。
①原理
②计数原则：一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。
③结果分析：统计的菌落数往往比活菌的实际数目低。原因是当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
(2)其他方法：利用显微镜直接计数。
1．阅读教材P22第一段旁栏中的相关内容，并思考回答下列问题。
(1)从物理性质上划分，此培养基属于哪类培养基？从功能上划分呢？
提示：固体培养基，因为加入了凝固剂琼脂。从功能上看属于选择培养基。
(2)在培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是什么物质？
提示：碳源主要是葡萄糖，氮源是尿素。
(3)该培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，是如何进行选择的？
提示：该培养基对微生物有选择作用。该培养基以尿素为唯一氮源，只允许能以尿素作为氮源的微生物生长。
2．阅读教材P22中部楷体字部分，思考：
哪位同学的结果更接近真实值？他们的实验需要改进吗？如果需要，如何改进？
提示：第一位同学只涂布了1个平板，没有设置重复组，因此结果不具有说服力。第二位同学考虑到设置重复组的问题，涂布了3个平板，但是，其中1个平板的计数值结果与另2个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值，这两位同学的实验都需要改进。在设计实验时，一定要涂布至少3个平板作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性。在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致。结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验。
3．阅读教材P23上部的楷体字部分，请帮助A同学设置对照实验，以排除其他同学所质疑的可能影响实验结果的因素。
提示：
可能原因
实验验证
结　论
所取土样不同
其他同学用与A同学一样的土样进行实验
若结果与A同学的一致，则说明A无误；若结果与A同学的不一致，则说明A同学操作失误或培养基配制有问题
培养基污染或操作失误
将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作空白对照
若有菌落出现，则说明培养基污染；若无菌落出现，则说明未被污染
[跟随名师·解疑难]
1．选择培养基的类型及作用
(1)在培养基中加入某种化学物质。如加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌；加入高浓度的食盐可得到金黄色葡萄球菌。这里的加入指的是在培养基的培养成分的基础上加入。
(2)改变培养基中的营养成分。如培养基中缺乏氮源时，可以分离固氮微生物，因为非固氮微生物不能在此培养基上生存。当培养基的某种营养成分为特定化学成分时，也具有分离效果。
(3)改变微生物的培养条件。如将培养基放在高温环境中培养只能得到耐高温的微生物。
2．统计菌落数目
(1)稀释涂布平板法：
①原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。
②注意事项：
a．设置重复组：同一稀释度下，至少涂布3个平板作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性。分析结果时，需考虑重复组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验。
b．设置对照：目的是排除实验中非测试因素对实验结果的影响，提高实验的可信度。
③计算公式：每克样品中的菌株数＝(C÷V)×M。
C：代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数。
V：代表涂布平板时所用的稀释液的体积。
M：代表稀释倍数。
(2)显微镜直接计数法：
①原理：此法利用特定细菌计数板或血球计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。
②缺点：不能区分细菌的死活。
③方法：用计数板计数。计数板是一块特制的载玻片，上面有一个特定的面积为1
mm2和高为0.1
mm的计数室，在1
mm2的面积里又被划分成25个(或16个)中格，每个中格进一步划分成16个(或25个)小格，但计数室都是由400个小格组成的。如下图所示：
④计算公式：每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400×10
000×稀释倍数。
实验设计及操作提示
[自读教材·夯基础]
1．实验设计流程
2．菌种鉴定
(1)原理：分解尿素的细菌合成的脲酶将尿素分解为氨，使培养基的碱性增强。
(2)方法：在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂培养细菌，若指示剂变红，可确定该种细菌能够分解尿素。
1．为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？
提示：土壤中各类微生物的数量不同，因此，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。
2．当第一次测定时为什么要将稀释的范围放宽一些？
提示：为确保能从中选择出菌落数在30～300之间的平板进行计数。
3．为什么要选取菌落数目稳定时的记录作为结果？
提示：防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。
[跟随名师·解疑难]
1．操作中的注意事项
(1)无菌操作：铁铲和信封都要灭菌。称取土壤、将称好的土样倒入锥形瓶、稀释土壤溶液，每一步都要在酒精灯的火焰旁进行。
(2)做好标记：如在培养皿上注明培养基种类、培养日期以及培养样品的稀释度等。
2．结果分析与评价
内　容
现　象
结　论
有无杂菌污染的判断
未接种的培养基上无菌落生长
未被杂菌污染
选择培养基的筛选作用
牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数大于选择培养基上的菌落数
选择培养基具有筛选作用
样品的稀释操作
得到2个或2个以上菌落数目在30～300的平板
操作成功
重复组的结果
若选择同一种土样，统计结果应接近
选择培养基的特点和应用
　　[例1]　下表是某微生物培养基的配方。请分析回答下列问题：
编号
①
②
③
④
⑤
成分
(NH4)2SO4
KH2PO4
FeSO4
CaCl2
H2O
含量
0.4
g
4.0
g
0.5
g
0.5
g
100
mL
(1)从培养基的营养成分看，此培养基可用来培养的微生物同化作用类型是________。利用该培养基培养微生物时，微生物所需要的碳源来自__________________________。
(2)此表中含有的微生物的营养成分包括________________________。
(3)若除去该培养基中的①后再加入不含氮元素的有机物，则此培养基可培养的微生物种类是________________________。
(4)培养基若加入氨基酸，则它可充当的营养成分是_________________________。
(5)若要观察微生物的菌落的特点，培养基中还应添加的成分是____________________。
[解析]　自养型微生物可以利用空气中的二氧化碳作为碳源，故培养基中可以不含碳源；自生固氮微生物则可以利用空气中的氮气作为氮源，培养基中可以不含氮源；氨基酸中含碳元素和氮元素，可作为微生物的碳源和氮源，还可以满足微生物对特殊营养物质的需求；若要观察微生物的菌落特点，必须使用固体培养基，因此培养基中还应添加凝固剂，如琼脂。
[答案]　(1)自养型　空气中的CO2　(2)水、无机盐、氮源　(3)自生固氮微生物　(4)碳源、氮源和特殊营养　(5)凝固剂(琼脂)
归纳拓展　几种常见微生物的分离方法
根据选择培养的菌种的生理代谢特点，加入某种物质或不加入某种物质以达到选择的目的。常见微生物的分离举例如下：
①酵母菌、霉菌等真菌：用含青霉素的培养基分离；
②金黄色葡萄球菌：用含高浓度食盐水的培养基分离；
③固氮微生物：用缺乏氮源的培养基分离；
④自养型微生物：用含无机碳源的培养基分离；
⑤厌氧型和兼性厌氧型微生物：用普通培养基在无氧条件下分离。
微生物的分离与计数
[例2]
自然界中的微生物往往是混杂生长的。人们在研究微生物时一般要将它们分离提纯，然后进行数量的测定。下面是对大肠杆菌进行数量测定的实验，请回答有关问题。
实验步骤：
(1)制备稀释倍数为102、103、104、105、106的系列稀释液。
(2)选用______________法接种样品。
(3)适宜温度下培养。
结果分析：
(1)测定的大肠杆菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下几种统计结果，正确可信的是(　　)
A．一个平板，统计的菌落数是23
B．两个平板，统计的菌落数分别是22和26，取平均值24
C．三个平板，统计的菌落数分别是21、5和52，取平均值26
D．四个平板，统计的菌落数分别是21、30、24和25，取平均值25
(2)一同学在稀释倍数为105的培养基中测得平板上菌落数的平均值为23.4，那么每毫升样品中的菌株数是(涂布平板时所用稀释液的体积为0.2
mL)____________。
(3)用这种方法测定密度，实际活菌数量要比测得的数量________，因为________________________________________________________________________。
(4)某同学在测定大肠杆菌的密度时发现，在培养基上还有其他杂菌的菌落，能否肯定该大肠杆菌的品系被污染了？为什么？
[解析]　实验步骤：(2)若要对大肠杆菌进行计数，常用稀释涂布平板法接种样品。
结果分析：(1)在选取样品时，应选取多个菌落数相差不大的平板计数，取其平均值。
(2)每毫升样品中菌株数＝×稀释倍数，
即23.4÷0.2×106＝1.17×108。
(3)由于菌落可能由1个或多个细菌连在一起生长而成的，所以实际活菌数量比测得数量多。
(4)污染的原因可能是菌种不纯，也可能是培养基灭菌不彻底或接种过程操作不当。
[答案]　实验步骤：(2)稀释涂布平板
结果分析：(1)D　(2)1.17×108　(3)多　当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察的是一个菌落　(4)不能。因为不能排除杂菌来自培养基或培养过程。
易错提醒　本题易错原因是不理解菌落数目的统计规则。实验时，每一个浓度至少涂布三个平板，以增强实验的说服力和准确性。当样品的稀释倍数足够高时，培养基表面生长的一个菌落来源于样品稀释液中的一个活菌。计数时选择菌落数在30～300的平板计数，若某两个或多个稀释浓度下获得的菌落数符合条件时，再看两者菌落数的比值：若小于2，则取两者的平均值；若大于2，则取小者。
[随堂基础巩固]
1．在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基称作(　　)
A．鉴别培养基　　　　　　
　B．加富培养基
C．选择培养基
D．基础培养基
解析：选C　鉴别培养基是在培养基中加入某种特殊化学物质，微生物的代谢产物与特殊化学物质发生特定化学反应，产生明显特征变化；加富培养基一般用来培养营养要求比较苛刻的异养型微生物；基础培养基是含有一般微生物生长繁殖所需的基本营养物质的培养基，例如牛肉膏蛋白胨培养基；选择培养基是在培养基中加入特殊营养物质或化学物质，抑制不需要微生物的生长，有利于所需微生物生长的培养基。
2．请选出下列正确的操作步骤(　　)
①土壤取样　②称取10
g土壤，加入盛有90
mL无菌水的锥形瓶中　③吸取0.1
mL进行平板涂布　④依次稀释至101、102、103、104、105、106、107稀释度
A．①→②→③→④
D．①→③→②→④
C．①→②→④→③
D．①→④→②→③
解析：选C　在分离土壤中某细菌时，应先选取土样(10
g)，然后加无菌水获得土壤浸出液，并进行不同倍数稀释，最后将稀释液涂布到培养基表面进行培养，并分离和计数。
3．某研究小组欲研究被石油污染过的土壤中细菌的数量，并从中筛选出能分解石油的细菌。下列操作错误的是(　　)
A．称取和稀释被污染的土壤时应在火焰旁
B．用以石油为唯一碳源的培养基进行筛选
C．分离菌种时可采用稀释涂布平板法接种
D．对细菌进行计数时宜采用平板划线法接种
解析：选D　微生物的分离和培养的关键技术是无菌操作，因此在微生物的分离和培养的过程中称取和稀释土壤时应在火焰旁进行；阅读题干可知实验目的是筛选出能分解石油的细菌，培养基的配方应以石油为唯一碳源；对微生物进行分离和计数，应该用稀释涂布平板法；分离菌种常用的接种方法是平板划线法和稀释涂布平板法，但对活菌进行计数常用稀释涂布平板法而不能用平板划线法。
4．(2014·新课标Ⅱ)为了调查某河流的水质状况，某研究小组测定了该河流水样中的细菌含量，并进行了细菌分离等工作。回答下列问题：
(1)该小组采用稀释涂布平板法检测水样中的细菌含量。在涂布接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先行培养了一段时间，这样做的目的是________________________________；然后，将1
mL水样稀释100倍，在3个平板上用涂布法分别接入0.1
mL稀释液；经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为39、38和37。据此可得出每升水样中的活菌数为________________________________________________________________________。
(2)该小组采用平板划线法分离水样中的细菌。操作时，接种环通过________灭菌，在第二次及以后的划线时，总是从上一次划线的末端开始划线。这样做的目的是_________
________________________________________________________________________。
(3)示意图A和B中，________表示的是用稀释涂布平板法接种培养后得到的结果。
(4)该小组将得到的菌株接种到液体培养基中并混匀，一部分进行静置培养，另一部分进行振荡培养。结果发现：振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。分析其原因是：振荡培养能提高培养液中____________的含量，同时可使菌体与培养液充分接触，提高________的利用率。
解析：(1)为了检测培养基平板灭菌是否合格，可在涂布接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先行培养一段时间。0.1
mL稀释液中平均有38个活菌，可推测每升水样中的活菌数＝38×10×100×1
000＝3.8×107(个)。(2)接种环、接种针或其他金属用具直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧，可以迅速彻底地灭菌。在第二次及以后的划线时，总是从上一次划线的末端开始划线，其目的是将聚集的菌体逐步稀释以便获得单个菌落。(3)比较两图可以看出，A是用平板划线法接种培养后得到的结果，B是用稀释涂布平板法接种培养后得到的结果。(4)由于振荡培养可以提高培养液中溶解氧的含量，还可以使菌体与培养液充分接触，提高营养物质的利用率，因此振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。
答案：(1)检测培养基平板灭菌是否合格　3.8×107　(2)灼烧　将聚集的菌体逐步稀释以便获得单个菌落　(3)B　(4)溶解氧　营养物质
[课时跟踪检测]
(满分50分　时间25分钟)
一、选择题(每小题3分，共24分)
1．下列关于土壤取样的叙述错误的是(　　)
A．土壤取样，应选取肥沃、湿润的土壤
B．先铲去表层土3
cm左右，再取样
C．取样用的小铁铲和信封在使用前不用灭菌
D．应在火焰旁称取土壤
解析：选C　微生物的培养要注意无菌操作，土壤取样用的小铁铲和信封在使用前需灭菌，后续稀释等操作均需在火焰旁进行。
2．可以鉴定出分解尿素的细菌的方法是(　　)
A．以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂
B．以尿素为唯一氮源的培养基中加入二苯胺试剂
C．以尿素为唯一氮源的培养基中加入苏丹Ⅲ试剂
D．以尿素为唯一氮源的培养基中加入双缩脲试剂
解析：选A　在以尿素为唯一氮源的培养基中，不能分解尿素获得氮源的细菌不能生长，而分解尿素的细菌能以尿素为氮源，将尿素分解为氨，使pH升高。若培养基中加入酚红指示剂，指示剂将变红。此培养基既属于选择培养基，又属于鉴别培养基。
3．用来判断选择培养基是否起到了选择作用需要设置的对照是(　　)
A．未接种的选择培养基
B．未接种的牛肉膏蛋白胨培养基
C．接种了的选择培养基
D．接种了的牛肉膏蛋白胨培养基
解析：选D　选择的目的是为了分离、筛选，对照遵循的原则是单一变量，因此用接种了的普通培养基和选择培养基进行对照，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目。
4．在土壤中分解尿素的细菌的分离与计数实验操作中，对使用的平板和试管要进行标记，以下说法正确的是(　　)
A．对培养皿仅需注明培养基的种类即可
B．一般在使用之后进行标记
C．由于试管用得较多，只需对试管进行标记即可
D．标记的目的主要是为了防止实验中平板、试管等的混淆
解析：选D　本实验使用的平板和试管较多，为避免混淆，应在使用前就做好标记。标记时要注明培养基种类、培养日期以及平板上培养样品的稀释度等。
5．下列关于“检测土壤中细菌总数”实验操作的叙述，错误的是(　　)
A．用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板
B．取104、105、106倍的土壤稀释液和无菌水各0.1
mL，分别涂布于各组平板上
C．将实验组和对照组平板倒置，37
℃恒温培养24～48
h
D．利用稀释涂布平板法只能分离微生物不能对微生物进行计数
解析：选D　检测土壤中细菌总数，用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板；取104、105、106倍的土壤稀释液和无菌水各0.1
mL，分别涂布于各组平板上；将实验组和对照组平板倒置，37
℃恒温培养24～48
h；用稀释涂布平板法可以分离微生物也可以对微生物进行计数。
6．通过选择培养基可以从混杂的微生物群体中分离出所需的微生物。在缺乏氮源的培养基上大部分微生物无法生长；在培养基中加入青霉素可以抑制细菌和放线菌的生长；在培养基中加入10%的酚可以抑制细菌和霉菌的生长。利用上述方法能从混杂的微生物群体中分别分离出(　　)
①大肠杆菌　②霉菌　③放线菌　④固氮细菌
A．④②③　　　　　
B．①②③
C．①③④
D．只有③④
解析：选A　缺乏氮源的培养基上大部分微生物无法生长，而固氮细菌能生长；在培养基中加青霉素可以抑制细菌和放线菌等原核生物细胞壁的合成，而霉菌属于真核生物，故能生长；在培养基中加入10%的酚可以抑制细菌和霉菌的生长，对放线菌的生长无影响。
7．分离土壤中分解尿素的细菌，对培养基的要求是(　　)
①加尿素　②不加尿素　③加琼脂　④不加琼脂
⑤加葡萄糖　⑥不加葡萄糖　⑦加硝酸盐
⑧不加硝酸盐
A．①③⑤⑦
B．②④⑥⑧
C．①③⑤⑧
D．①④⑥⑦
解析：选C　分离分解尿素的细菌，应该以尿素为唯一氮源，不能加硝酸盐来提供氮源。另外还要加葡萄糖提供碳源，加琼脂作为凝固剂，制成固体培养基，利于细菌的分离、鉴定、计数等。
8．实验测定链霉素对3种细菌的抗生素效应，用3种细菌在事先准备好的琼脂平板上画3条等长的平行线(3条线均与图中的链霉素带接触)，将平板置于37
℃条件下恒温培养3天，结果如图所示。从实验结果分析，以下叙述错误的是(　　)
A．链霉素能阻止结核菌的生长
B．链霉素对结核菌比对霍乱菌更有效
C．链霉素对结核菌比对伤寒菌更有效
D．链霉素可以用于治疗伤寒病人
解析：选D　图中细菌生长区离链霉素带越远，说明该菌对链霉素越敏感，即链霉素越能阻止该菌的生长。读题图可知伤寒菌生长区与链霉素带相连接，说明链霉素不能阻止伤寒菌的生长。
二、非选择题(共26分)
9．(12分)图甲是从土壤中筛选产脲酶细菌的过程，图乙是脲酶基因转录的mRNA部分序列。
(1)图中选择培养基应以________为唯一氮源；鉴别培养基还需添加________作指示剂，产脲酶细菌在该培养基上生长一段时间后，其菌落周围的指示剂将变成________色。
(2)在5个细菌培养基平板上，均接种稀释倍数为105的土壤样品溶液0.1
mL，培养一段时间后，平板上长出的细菌菌落数分别为13、156、462、178和191。
该过程采取的接种方法是__________________，每克土壤样品中的细菌数量为________×108个；与血细胞计数板计数法相比，此计数方法测得的细菌数较________。
解析：(1)脲酶能够催化尿素分解释放出氨和二氧化碳，因此选择培养基中应以尿素为唯一氮源。挑取单菌落接种到加有酚红指示剂的鉴别培养基中，培养一段时间后，菌落周围的氨增加，pH升高，酚红指示剂将变红。(2)该过程采取的接种方法为稀释涂布平板法。利用稀释涂布平板计数法对细菌进行计数时，应选择菌落数在30～300的平板，因此平板上长出的细菌菌落平均数为(156＋178＋191)÷3＝175个。每克土壤样品中的细菌数为175÷0.1×105＝1.75×108个。血细胞计数板计数法能将死细胞计算在内，而稀释涂布平板计数法只能计数活细胞(只有活细胞才能在平板上生长)，故一般血细胞计数板计数法要比稀释涂布平板计数法的结果大。
答案：(1)尿素　酚红　红　(2)稀释涂布平板法　1.75　少
10．(14分)尿素是一种重要的农业氮肥，不能直接被农作物吸收，只有当土壤中的微生物将尿素分解后才能被植物吸收利用。因此，对土壤中分解尿素的微生物进行分离和鉴定具有重要意义。回答下列问题：
(1)对土壤中分解尿素的微生物的分离过程如下：
第一步：土壤取样。取土样用的工具和盛土样的信封等在使用前都需要__________(填“消毒”或“灭菌”)。
第二步：样品稀释。通常分离不同种类的微生物要采用不同的稀释度，原因是________________________________________________________________________。
第三步：微生物的培养与观察。将一定稀释度的样品接种在以尿素为唯一氮源的培养基上，并在适宜的条件下培养。分解尿素的微生物能在该培养基上生长繁殖，而______________________则不能生长繁殖。
(2)若对土壤悬液进行梯度稀释时，未经振荡而直接取上层悬液进行梯度稀释，用稀释倍数为104的样液涂布到平板上进行培养和计数，统计出的菌落数往往比正确操作统计出的菌落数________。
(3)若要对上述初步筛选出的分解尿素的微生物作进一步的鉴定，需在如表所示培养基配方中添加的物质是________、________。若分离得到的是尿素分解菌，则培养基中pH升高使酚红指示剂变为红色，pH升高的原因是____________________________________________________________________　。
成分
KH2PO4
Na2HPO4
MgSO4·7H2O
酚红指示剂
尿素
蒸馏水
培养基(含量)
1.4
g
2.1
g
0.2
g
0.01
g
1.0
g
1
000
mL
答案：(1)灭菌　土壤中各类微生物的数量不同　不能利用尿素的微生物　(2)偏高　(3)葡萄糖　琼脂　尿素分解菌合成的脲酶将尿素分解成氨
1.测定微生物数量的常用方法有稀释涂布平板法和显微镜直接计数法。
2．稀释涂布平板法常用来统计活菌的数目，但统计结果往往比活菌数目低。
3．为确保结果准确，一般选择菌落数在30~300的平板上进行计数。
4．只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，因此可用尿素作唯一氮源的选择培养基分离该细菌。
5．鉴定分解尿素细菌的方法是在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，据是否变红进行判断。

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