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专题11
基因工程
一、基因工程的原理及技术
1．基因工程的概念
（1）供体提供目的基因。
（2）操作环境体外。
（3）操作水平分子水平。
（4）原理基因重组。
（5）受体表达目的基因。
（6）本质性状在受体体内的表达。
（7）优点克服远缘杂交不亲和的障碍，定向改造生物的遗传性状。
2．DNA重组技术的基本工具
（1）限制性核酸内切酶（简称限制酶）
①来源主要是从原核生物中分离纯化出来的。
②作用识别特定的核苷酸序列并切开特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
③结果产生黏性末端或平末端。
（2）DNA连接酶
①种类按来源可分为E coli
DNA连接酶和T4DNA连接酶。
②作用将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
③DNA连接酶和限制酶的关系
（3）载体
①种类质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。
②质粒的特点能自我复制；有一个至多个限制酶切割位点；有特殊的标记基因。
3．基因工程的操作过程
（1）基因工程的操作步骤
①获取目的基因—a.从基因文库中获取；b.利用PCR技术扩增c.通过化学方法人工合成。
②基因表达载体的构建—a.目的基因；b.启动子；c.终止子；d.标记基因。
③将目的基因导入受体细胞—a.植物农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法；b.动物显微注射技术；c.微生物感受态细胞法。
④目的基因的检测与鉴定—a.利用DNA分子杂交技术检测目的基因的有无；b.利用分子杂交技术检测目的基因的转录；c.利用抗原—抗体杂交技术检测目的基因的翻译；d.利用个体生物学水平的鉴定检测重组性状的表达。
2017全国Ⅱ卷，38题
[生物——选修3现代生物科技专题]（15分）
几丁质是许多真菌细胞壁的重要成分，几丁质酶可催化几丁质水解。通过基因工程将几丁质酶基因转入植物体内，可增强其抗真菌病的能力。回答下列问题
（1）在进行基因工程操作时，若要从植物体中提取几丁质酶的mRNA，常选用嫩叶而不选用老叶作为实验材料，原因是__________________________。提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是__________________________。
（2）以mRNA为材料可以获得cDNA，其原理是__________________________。
（3）若要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是__________________________（答出两点即可）。
（4）当几丁质酶基因和质粒载体连接时，DNA连接酶催化形成的化学键是__________________________。
（5）若获得的转基因植株（几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中）抗真菌病的能力没有提高，根据中心法则分析，其可能的原因是__________________________。
【答案】（1）嫩叶组织细胞易破碎
防止RNA降解（2）在逆转录酶的作用下，以mRNA为模板按照碱基互补配对的原则可以合成cDNA（3）目的基因无复制原点；目的基因无表达所需启动子
（4）磷酸二酯键（5）目的基因的转录或翻译异常
答题思路
【解析】（1）在进行基因工程操作时，若要从植物体中提取几丁质酶的mRNA，常选用嫩叶而不选用老叶作为实验材料，原因是嫩叶组织细胞易破碎。提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是防止RNA降解。（2）以mRNA为材料可以获得cDNA，其原理是在逆转录酶的作用下，以mRNA为模板按照碱基互补配对的原则可以合成cDNA。（3）若要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是目的基因无复制原点、目的基因无表达所需启动子。（4）当几丁质酶基因和质粒载体连接时，DNA连接酶催化形成的化学键是磷酸二酯键。（5）若获得的转基因植株（几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中）抗真菌病的能力没有提高，根据中心法则分析，其可能的原因是目的基因的转录或翻译异常。
【考点】基因工程
【点拨】
【命题意图】本题考查基因工程相关知识，要求学生能够明确DNA重组技术基本工具用途和特点，基因工程的基本操作程序。
【命题规律】通常在选做题以非选择题形式出现，主要考查DNA重组技术基本工具用途和特点，基因工程的基本操作程序，也经常结合细胞工程和胚胎工程考查。
【方法点拨】1.DNA重组技术的基本工具
限制酶
DNA连接酶
载体
作用
切割目的基因和载体
连接DNA片段，形成重组DNA
携带目的基因进入受体细胞
作用部位
两核苷酸的脱氧核糖与磷酸间形成的磷酸二酯键
作用特点（条件）
①识别特定的核苷酸序列②在特定位点上切割
①E coli
DNA连接酶连接黏性末端②T4DNA连接酶连接黏性末端和平末端
①能在宿主细胞内稳定存在并大量复制②有多个限制酶切割位点③具有特殊的标记基因
常用类型
EcoRⅠ限制酶SmaⅠ限制酶
E coli
DNA连接酶T4DNA连接酶
质粒、噬菌体、动植物病毒
2.基因工程中的几种检测方法
1．【2017年北京理综卷，5】为了增加菊花花色类型，研究者从其他植物中克隆出花色基因C（图1），拟将其与质粒（图2）重组，再借助农杆菌导入菊花中。
下列操作与实验目的不符的是
A．用限制性核酸内切酶EcoRI和连接酶构建重组质粒
B．用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织，将C基因导入细胞
C．在培养基中添加卡那霉素，筛选被转化的菊花细胞
D．用分子杂交方法检测C基因是否整合到菊花染色体上
【答案】C
2．【2015年天津卷，6】2015年2月3日，英国议会下院通过一项历史性法案，允许以医学手段培育“三亲婴儿”。三亲婴儿的培育过程可选用如下技术路线。
据图分析，下列叙述错误的是（
）
A．该技术可避免母亲的线粒体遗传病基因传递给后代
B．捐献者携带的红绿色盲基因不能遗传给三亲婴儿
C．三亲婴儿的染色体全部来自母亲提供的细胞核
D．三亲婴儿的培育还需要早期胚胎培养和胚胎移植等技术
【答案】C
【解析】受体母亲提供细胞核，供体提供去核卵母细胞，这样就可避免受体母亲的线粒体遗传物质（线粒体中的致病基因）传递给子代；A正确。红绿色盲属于核基因控制的遗传病，而由图示可知捐献者提供的是去核的卵细胞，因此不会把其携带的红绿色盲基因传递给三亲婴儿；B正确。由图示可知三亲婴儿的的染色体来自于母亲和父亲；C错误。由图示可知三亲婴儿的获得运用了动物细胞培养、核移植技术，体外受精形成早期胚胎需要进行早期胚胎培养等；D正确。
3．【2015年重庆卷，6】下列有关人胰岛素基因表达载体的叙述，正确的是（　　）
A．表达载体中的胰岛素基因可通过人肝细胞mRNA反转录获得
B．表达载体的复制和胰岛素基因的表达均启动于复制原（起）点
C．借助抗生素抗性基因可将含胰岛素基因的受体细胞筛选出来
D．启动子和终止密码子均在胰岛素基因的转录中起作用
【答案】C
4.【2017全国Ⅰ卷，38题】真核生物基因中通常有内含子，而原核生物基因中没有，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。已知在人体中基因A（有内含子）可以表达出某种特定蛋白（简称蛋白A）。回答下列问题
（1）某同学从人的基因组文库中获得了基因A，以大肠杆菌作为受体细胞却未得到蛋白A，其原因是_____________________。
（2）若用家蚕作为表达基因A的受体，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用____________________作为载体，其原因是_____________________。
（3）若要高效地获得蛋白A，可选用大肠杆菌作为受体。因为与家蚕相比，大肠杆菌具有_________________（答出两点即可）等优点。
（4）若要检测基因A是否翻译出蛋白A，可用的检测物质是___________________（填“蛋白A的基因”或“蛋白A的抗体”）。
（5）艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明DNA是遗传物质做出了重要贡献，也可以说是基因工程的先导，如果说他们的工作为基因工程理论的建立提供了启示，那么，这一启示是________________________。
【答案】（1）基因A有内含子，在大肠杆菌中，其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除，无法表达出蛋白A
（2）噬菌体
噬菌体的宿主是细菌，而不是家蚕（3）繁殖快、容易培养
（4）蛋白A的抗体（5）DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体
（3）大肠杆菌作为受体菌具有繁殖周期短、易培养。
（4）检测目的基因是否表达通常用抗原－抗体杂交技术。
（5）艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明DNA是遗传物质做出了重要贡献，证明了生物的遗传物质是DNA，还为基因工程理论的建立提供了启示，这一启示是DNA可以从一种生物转移到另一种生物个体。
5．【2017江苏理综卷，33】金属硫蛋白（MT）是一类广泛存在的金属结合蛋白，某研究小组计划通过多聚酶链式反应（PCR）扩增获得目的基因，构建转基因工程菌，用于重金属废水的净化处理。PCR扩增过程示意图如下，请回答下列问题
（1）从高表达MT
蛋白的生物组织中提取mRNA，通过______________获得______________用于PCR扩增。
（2）设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物（引物1和引物2），为方便构建重组质粒，在引物中需要增加适当的______________位点。设计引物时需要避免引物之间形成______________，而造成引物自连。
（3）图中步骤1代表______________，步骤2代表退火，步骤3代表延伸，这三个步骤组成一轮循环。
（4）PCR扩增时，退火温度的设定是成败的关键。退火温度过高会破_________的碱基配对。退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关，长度相同但____________的引物需要设定更高的退火温度。
（5）如果PCR反应得不到任何扩增产物，则可以采取的改进措施有___________（填序号①升高退火温度
②降低退火温度
③重新设计引物）。
【答案】（1）逆转录
cDNA
（2）限制性核酸内切酶
碱基互补配对
（3）变性
（4）引物与模板
GC含量高
（5）②③
6．【湖南省长郡中学2017年高考模拟卷二理科综合生物试题】
囊性纤维病适宜一种单基因遗传病，患者的跨膜结构蛋白改变，导致肺功能受损。据此分析回答
（1）患者跨膜结构蛋白改变的根本原因是编码跨膜结构蛋白的_____________序列发生改变。
（2）用基因治疗方法时，可先提取正常人细胞中编码跨膜结构蛋白的______________，以其作为模板，在__________的作用下反转录合成cDNA。cDNA与载体需在限制酶和________酶的作用下，拼接构建基因表达载体后，导入患者_______组织中。
（3）检测患者是否已合成正常的跨膜结构蛋白，可从患者细胞中提取_______，用相应的抗体进行_____杂交，若出现杂交带，则表明患者已合成正常的跨膜结构蛋白。
【答案】
（1）
基因中的碱基对（或脱氧核苷酸）
（2）
mRNA（或RNA）
逆转录酶
DNA连接
肺
（3）
蛋白质
抗原—抗体
【解析】（1）蛋白质是由基因控制合成的，患者跨膜结构蛋白改变的根本原因是编码跨膜结构蛋白的基因发生基因突变，即基因中的碱基对（或脱氧核苷酸）序列发生改变。
（2）cDNA是逆转录形成的，因此用基因治疗方法时，可先提取正常人细胞中编码跨膜结构蛋白的mRNA（或RNA），以其作为模板，在逆转录酶的作用下反转录合成cDNA。构建基因表达载体时，首先需要限制酶切割cDNA与载体，其次还需DNA连接酶将目的基因运载体连接形成重组DNA。基因治疗把正常基因导入病人体内有缺陷的细胞中，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗疾病的目的。患者肺功能受损，因此基因表达载体构建好以后，应该导入肺组织中。
（3）检测患者是否已合成正常的跨膜结构蛋白，可采用抗原-抗体杂交技术，即从患者细胞中提取蛋白质（抗原），用相应的抗体进行抗原-抗体杂交，若出现杂交带，则表明患者已合成正常的跨膜结构蛋白。
7．【吉林省吉林大学附属中学2017届高三第八次模拟考试理综生物试题】
复合型免疫缺陷症（SCID）患者缺失ada基因，利用现代生物工程技术将人正常ada基因转入患者自身T细胞，可改善患者的免疫功能。如图显示该过程的主要步骤，回答下列问题
（1）图中所示获取正常ada基因的方法是从基因文库中获取目的基因，基因文库包括基因组文库和___________。若要大量获取该目的基因，可通过PCR技术进行扩增。PCR技术是利用___________的原理，将基因的核苷酸序列不断加以复制。
（2）与细胞内DNA复制过程相比，PCR技术的不同点有需要___________DNA聚合酶，另一个不同之处表现在温度控制方面，在PCR中先用90～95℃左右高温处理的目的是__________，而这一过程在细胞内是通过___________的催化作用实现的。
（3）将人正常ada基因转入患者自身T细胞进行治病的方法叫做___________。
（4）在该治疗方案中，病毒DNA起___________作用，ada基因整合到病毒核酸上需使用的工具酶有_______________________。
【答案】
（1）
部分基因文库（cDNA文库）
DNA双链复制
（2）
热稳定
使DNA变性（解旋）
解旋酶
（3）基因治疗
（4）
运载体（载体）
限制酶和DNA连接酶
8．【2017届河北省衡水中学高考押题理科综合生物试题（一）】[生物——选修3现代生物科技专题]
细胞的种类不同，特异性表达的蛋白质也不同，如效应T细胞可以产生干扰素，乳腺细胞可以分泌乳腺蛋白，膀胱壁细胞可分泌尿血小板溶素膜蛋白。其中效应T细胞产生的干扰素（IFN）具有抑制细胞分裂、调节免疫、抗病毒、抗肿瘤等多种作用。请回答下列问题。
（1）通过分析干扰素的氨基酸序列，可人工合成编码干扰素的__________序列，该序列_______(填“是”或“不是”）唯一的。利用PCR的方法对人工合成的干扰素基因扩增时，用___________方法使DNA变性。
（2）若将干扰素基因导入癌细胞，在________的环境，一定的营养，适宜的温度和pH，气体环境等条件下，可从体外培养的培养液中源源不断地提取得到干扰素。
（3）目的基因在血液中表达的转基因动物叫做血液反应器。由于某些物质进入血液会影响动物的健康，因此血液生物反应器比较适合生产__________（选填“胰岛素”“抗体”或“干扰素”中的一种或多种）。
（4）乳腺生物反应器的原理是外源基因与_________的启动子构建成基因表达载体，使干扰素基因在乳腺中表达，通过回收乳汁获得干扰素。
（5）膀胱反应器可将干扰素基因插入________________基因中，使干扰素分泌到尿液中。与乳腺反应器相比，膀胱反应器的优势表现在__________________。
【答案】
（1）
脱氧核苷酸
不是
加热
（2）
无菌、无毒
（3）
抗体、干扰素
（4）
乳腺蛋白基因
（5）尿血小板溶素膜蛋白
周期短、不受性别和年龄的限制
【解析】（1）目的基因的获取可以采用人工合成的方法，即通过分析干扰素的氨基酸序列，可人工合成编码干扰素的脱氧核苷酸序列，由于一种氨基酸可以由多种密码子决定，因此通过该方法获得的序列不是唯一的．利用PCR的方法对人工合成的干扰素基因扩增时，用加热方法使DNA变性。
（5）膀胱反应器可将干扰素基因插入尿血小板溶素膜蛋白基因中，使干扰素分泌到尿液中。与乳腺反应器相比，膀胱反应器的优势表现在周期短、不受性别和年龄的限制。
9．【2016年全国Ⅲ卷，40】图（a）中的三个DNA片段上依次表示出了EcoR
I、BamH
I和Sau3A
I三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图（b）为某种表达载体示意图（载体上的EcoR
I、Sau3A
I的切点是唯一的）。
根据基因工程的有关知识，回答下列问题
（1）经BamH
I酶切割得到的目的基因可以与上述表达载体被____________酶切后的产物连接，理由是____________。
（2）若某人利用图（b）所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图（c）所示。这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有_________，不能表达的原因是____________。
（3）DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有____________和____________，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是____________。
【答案】（1）Sau3AⅠ
两种梅切割后产生的片段具有相同的黏性末端
（2）甲和丙
甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，两者目的基因均不能转录
（3）E coliDNA连接酶
T4DNA连接酶
T4DNA连接酶
【解析】（1）由于限制酶Sau3AⅠ与BamHⅠ切割后产生的片段具有相同的黏性末端，所以经BamH
I酶切割得到的目的基因可以与上述表达载体被Sau3AⅠ酶切后的产物连接。
（3）常见DNA连接酶的有E coliDNA连接酶和T4DNA连接酶，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是T4DNA连接酶。
10．【2016年全国Ⅰ卷，40】某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活（Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因）。有人将此质粒载体用BamHI酶切后，与用BamHI酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题
　　　　　　　　　　　　
（1）质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有______________（答出两点即可）。而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。
（2）如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含有环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是______________；并且______________和______________的细胞也是不能区分的，其原因是_____________。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落，还需使用含有是_____________的固体培养基。
（3）基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自于_____________
【答案】（1）能够自我复制、具有标记基因、具有一个至多个限制酶切割位点（答出两点即可）
（2）二者均不含氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上都不能生长　　含有质粒载体　　含有插入了目的基因的重组质粒（或答含有重组质粒）
二者都含氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长　　四环素
（3）受体细胞
【解析】（1）质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有能够自我复制、具有标记基因、具有一个至多个限制酶切割位点等。
（3）噬菌体是专门寄生在细菌细胞中的病毒，在侵染细菌时，噬菌体的DNA进入到细菌细胞中，而蛋白质外壳仍留在细胞外；在噬菌体的DNA的指导下，利用细菌细胞中的物质来合成噬菌体的组成成分，据此可推知基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自于受体细胞。

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