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专题12
微生物的培养与应用
微生物的实验室培养
1．培养基的概念、种类及营养构成
(1)概念人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出的供其生长繁殖的营养基质。
(3)营养构成各种培养基一般都含有水、碳源、氮源、无机盐，此外还要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。
2．无菌技术
(1)关键防止外来杂菌的入侵。
(2)具体操作
①对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒。
②将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。
③为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。
④实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品接触。
(3)消毒和灭菌
消毒
灭菌
概念
使用较为温和的物理或化学方法杀死物体表面或内部的部分微生物（不包芽孢和孢子）
使用强烈的理化因素杀死物体内外所用的微生物（包括芽孢和孢子）
常用方法
煮沸消毒法、巴氏消毒法、化学药剂消毒法、紫外线消毒法
灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌
适用对象
操作空间、某些液体、双手等
接种环、接种针、玻璃器皿、培养基等
3、制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的方法计算、称量、溶化、灭菌、倒平板。
4、接种方法平板划线法和稀释涂布法。
（1）平板划线操作
①挑取他含菌样品选用平整、圆滑的接种环，按无菌操作法挑取少量菌种。
②划A区将平板倒置于煤气（酒精）灯旁,左手拿出皿底并尽量使平板垂直于桌面，有培养基一面向着煤气灯（这时皿盖朝上，仍留在煤气灯旁)，右手拿接种环先在A区划3—4条连续的平行线(线条多少应依挑菌量的多少面定）。划完A区后应立即烧掉环上的残菌，以免因菌过多而影响后面各区的分离效果。在烧接种环时，左手持皿底并将其覆盖在皿盖上方(不要放入皿盖内)，以防止杂菌的污染。
③划其他区将烧去残菌后的接种环在平板培养基边缘冷却一下，并使B区转到上方，接种环通过A区（菌源区）将菌带到B区，随即划数条致密的平行线。再从B区作C区的划线。最后经C区作D区的划线，D区的线条应与A区平行，但划D区时切勿重新接触A、B区，以免极该两区中浓密的菌液带到D区，影响单菌落的形成。随即将皿底放入皿盖中。烧去接种环上的残菌。
④等平板凝固后，将平板倒置。
（2）稀释涂布法是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，在适宜条件下培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。能够测定样品中活菌数的方法是稀释涂布平板法。
2017全国Ⅰ卷理综，37题
[生物——选修1生物技术实践]（15分）
某些土壤细菌可将尿素分解成CO2和NH3，供植物吸收和利用。回答下列问题
（1）有些细菌能分解尿素，有些细菌则不能，原因是前者能产生________________________。能分解尿素的细菌不能以尿素的分解产物CO2作为碳源，原因是________________________，但可用葡萄糖作为碳源，进入细菌体内的葡萄糖的主要作用是________________________（答出两点即可）。
（2）为了筛选可分解尿素的细菌，在配制培养基时，应选择____________________（填“尿素”“NH4NO3”或“尿素+NH4NO3”）作为氮源，不选择其他两组的原因是________________________。
（3）用来筛选分解尿素细菌的培养基含有KH2PO4和Na2
HPO4，其作用有________________________（答出两点即可）。
【答案】（1）脲酶
分解尿素的细菌是异养型生物，不能利用CO2来合成有机物
为细胞生物生命活动提供能量，为其他有机物的合成提供原料
（2）尿素
其他两组都含有NH4NO3，能分解尿素的细菌和不能分解尿素的细菌都能利用NH4NO3，不能起到筛选作用
（3）为细菌生长提供无机营养，作为缓冲剂保持细胞生长过程中pH稳定
答题思路
【考点】微生物分离，培养，培养基中物质作用
【点拨】本题考查分解尿素的微生物的分离、培养及培养基中物质的作用，要求考生掌握微生物分离须用微生物特定需要的培养基来培养，微生物培养中必须有碳源、氮源、能源、生长因子、水和无机盐等。
2017江苏卷，37题
（7
分）苯酚及其衍生物广泛存在于工业废水中，对环境有严重危害。小明同学准备依据下图操作步骤，从处理废水的活性污泥中分离筛选酚降解高效菌株。请回答下列问题
（1）酚降解菌富集培养基含有蛋白胨、K2HPO4、MgSO4、苯酚和水，其中可作为碳源的有_____________。
（2）将采集到的样品接种培养，苯酚用量应随转接次数增加而逐渐_____________。以达到富集酚降解菌的目的。若上图平板中菌落过于密集，应进一步_____________，以便于菌落计数与分离。制备平板培养基时除了需要水、营养物质外，还必须添加_____________。
（3）下图为连续划线法示意图，在图中_____________
（填图中序号）区域更易获得单菌落。
（4）采用比色测定法（使用苯酚显色剂）检测降解后的废水中苯酚残留量。先制作系列浓度梯度并进行显色反应，下表中1
~5号比色管的苯酚浓度应分别为_____________。
管号
1
2
3
4
5
6
苯酚浓度（mg/
）
1
如果废水为50
mg/
L
苯酚溶液，降解后约有21%的苯酚残留，则需将残留液稀释_____________
（填序号①5
②10
③20）倍后，再进行比色。
【答案】（1）蛋白胨、苯酚
（2）增加
稀释涂布
凝固剂
（3）③
（4）
0、0.2、0.4、0.6、0.8
③
答题思路
【解析】（1）碳源是微生物生长的一类营养物，是含碳化合物，其中可作为碳源的有蛋白胨和苯酚。（2）将采集到的样品接种培养的目的是富集酚降解菌，则苯酚用量应随转接次数增加而逐渐增加。平板中【考点】微生物的培养。
【点拨】本题主要考查微生物培养的相关知识，要求学生理解培养基的基本成分，理解微生物的分离纯化。
【命题意图】本题考查微生物的培养与应用相关知识，要求考生掌握微生物分离须用微生物特定需要的培养基来培养，理解微生物的分离纯化。
【命题规律】通常在选做题部分以非选择题形式出现，是选修1主要考查内容，要求学生熟悉培养基成分相关知识，掌握微生物培养和分离技术。
【方法点拨】1.培养基的配制原则
(1)目的要明确配制时应根据微生物的种类、培养目的等确定配制的培养基种类。
(2)营养要协调注意各种营养物质的浓度和比例。
(3)pH要适宜细菌为6.5～7.5，放线菌为7.5～8.5，真菌为5.0～6.0，培养不同微生物所需pH不同。
2.微生物对主要营养物质的需求特点
不同种类的微生物代谢特点不同，因此对培养基中营养物质的需求也不同。
(1)自养型微生物所需的主要营养物质是无机盐，碳源可来自大气中的CO2，氮源可由含氮无机盐提供。
(2)异养型微生物所需的营养物质主要是有机物，即碳源必须由含碳有机物提供，氮源也主要是由有机物提供，部分异养型微生物也可以利用无机氮源。
3.两种微生物筛选方法的比较
项目
土壤中分解尿素的细菌的分离
分解纤维素的微生物的分离
方法
使用以尿素为唯一氮源的选择培养基进行培养
利用富含纤维素的选择培养基进行培养
原理
土壤中不能分解尿素的微生物因缺乏脲酶而不能正常生长，能够分解尿素的微生物能利用尿素为氮源正常生长，从而起到选择作用
因为培养基中含有丰富的纤维素，因此能够分解纤维素的微生物具有更多的生存机会而大量繁殖
特有代表过程
CO(NH2)2＋H2OCO2＋2NH3
纤维素纤维二糖葡萄糖
1．【2016年江苏卷，10】定量分析是科学研究的重要方法。下列能用血细胞计数板直接计数的是（　　）
A．海拉细胞悬液
B．浓缩培养的噬菌体
C．自来水中大肠杆菌
D．蛙卵
【答案】A
2．【2016年江苏卷，25】漆酶属于木质降解酶类，在环境修复、农业生产等领域有着广泛用途。下图是分离、纯化和保存漆酶菌株的过程，相关叙述正确的是（　　）
A．生活污水中含有大量微生物，是分离产漆酶菌株的首选样品
B．筛选培养基中需要加入漆酶的底物，通过菌落特征挑出产漆酶的菌落
C．在涂布平板上长出的菌落，在通过划线进一步纯化
D．斜面培养基中含有大量营养物，可在常温下长期保存菌株
【答案】BC
【解析】生活污水中含有大量微生物，但不一定含有产漆酶的菌株，A错误；筛选生活污水中含有大量微生物，B正确；在涂布平板上长出的菌落，在通过划线进一步纯化，C正确；斜面培养基中含有大量营养物，可在低温下长期保存菌株，D错误。
3．【2015年江苏卷，19】做“微生物的分离与培养”实验时，下列叙述正确的是（　　）
A．高压灭菌加热结束时，打开放气阀使压力表指针回到零后，开启锅盖
B．倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上
C．为了防止污染，接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落
D．用记号笔标记培养皿中菌落时，应标记在皿底上
【答案】D
4．【四川省绵阳中学实验学校2017届高三5月模拟理综生物试题】下面是有关土壤中分解尿素的细菌分离和计数的实验过程，请根据图回答相关问题
（1）为分离出土壤中分解尿素的细菌，应该用________________________的培养基进行分离，并加入________指示剂进行鉴别。
（2）若取土样5g，应加入____________ml的无菌水配制成稀释10倍土壤溶液。因土壤中细菌密度很大，需要不断加以稀释，配制成如图所示的不同浓度的土壤溶液，分别吸取0.1mL的稀释液涂布到固体培养基上，这种接种方法称为________________。某同学用该方法接种后，在某个平板上没有得到菌落，可能的原因是_______________________________________
（3）将接种的培养皿放置在37℃恒温培养箱中培养24h～48h，观察并统计符合要求的菌落数，结果如下表，其中_______________倍的稀释比较合适。
稀释倍数
103
104
105
106
107
菌落数
>500
367
248
36
18
（4）若需要将分离的菌种进行长期保藏，应使用的方法是_______________________。
【答案】（1）
以尿素为唯一氮源
酚红
（2）
45
稀释涂布平板法
涂布器灼烧后未冷却就用于涂布，杀死了菌种
（3）
105和106
（4）
甘油管藏的方法
【解析】（1）为分离出土壤中分解尿素的细菌，应该用以尿素为唯一氮源的培养基进行分离，并加入酚红指示剂进行鉴别。尿素分解产生的NH3使指示剂表现为红色。
5．【河南省2017年高考（全国1卷）诊断卷（B）理综生物试题】
LB液体培养基和LB固体培养基是微生物实验室中较常用的一种培养基，其配方为10g蛋白胨、10g/L酵母提取物、5g/L氯化钠等，主要用于培养细菌、扩增菌种数量。某研究组开展了氧气对微生物生长、繁殖的影响实验，请回答下列问题
（1）要配制供微生物生长、繁殖的培养基，其中一般都含有________________________________和无机盐等。有些微生物对某些特殊营养物质及____________等条件有特殊要求。
（2）将各类微生物用____________从斜面培养基接种于灭菌过的LB液体培养基中，进行扩大化培养。
（3）将含有LB固体培养基（LB液体培养基中加15g琼脂粉，刚配好，尚未凝固）的锥形瓶放入____________中进行灭菌。灭菌完成后将锥形瓶取出，待温度下降到60℃（不烫手的温度）时，用____________擦拭桌面和双手，在超净工作台中的____________旁将锥形瓶中的LB培养基分装到一系列试管，并做标记。
（4）当试管温度下降到40
℃（培养基还是液态）时，用灭菌过的移液器吸取0.1mL的各类微生物悬液加入相应试管中并封口，双手快速搓动试管，使菌种均匀分布于培养基内后迅速将封口的试管放置在___条件下使培养基凝固。
（5）将上述试管放置于常温条件下培养48小时后观察实验结果，下图中可表示制作果酒的菌种的分布图的是____________。
【答案】
（1）
水、碳源、氮源
pH、氧气
（2）
接种环
（3）高压蒸汽灭菌锅
酒精
酒精灯火焰
（4）低温
（5）
B
擦拭桌面和双手，在超净工作台中的酒精灯火焰旁将锥形瓶中的LB培养基分装到一系列试管，以防止杂菌污染。
（4）培养基凝固需要放置在低温条件下。
（5）参与果酒制作的菌种是酵母菌，其新陈代谢类型是异养兼性厌氧型，因此图中表示果酒制作菌种的图是B。
6．【湖南省长郡中学2017年高考模拟卷二理科综合生物试题】
水污染是全球性的环境问题，微生物降解是水污染治理的有效手段之一。聚乙烯醇（PVA）是存在于化工污水中的一种难以降解的大分子有机物，PVA分解菌能产生PVA酶分解PVA，PVA与碘作用时能产生蓝绿色复合物，当PVA被分解时蓝绿色复合物消失，形成白色透明斑，请回答下列问题
（1）下表是筛选出能高效分解PVA的细菌的培养基配方，表中X物质最可能为_______________。实验中还应设置完全培养液对照组，将菌液稀释相同的倍数，对照组培养基上生长的菌落数
目应明显__________（填“多于”或“少于”选择培养基上的数目，从而说明选择培养基具有筛选作用。）
成分
MgSO4
蛋白质
X物质
水
琼脂
用量
5g
10g
1000mL
7g
20g
（2）要测定土壤稀释液中微生物的数目，可在显微镜下用___________计数板直接计数。若将100mL含有PVA分解菌的土壤样品溶液稀释104倍后，取0.1mL稀释液均匀涂布在选择培养基表面，测得菌落数的平均值为160个，空白对照组平板上未出现菌落，则100mL原菌液中有PVA分解菌_______个，该方法的测量值与实际值相比一般会______________________（填“偏大”、“偏小”或“相等”）。
（3）要鉴定分离出的细菌是否为PVA分解菌，培养PVA分解菌的培养基中除了加入必需的营养物质外还需要加入_________________用于鉴别PVA分解菌。若用上述培养基比较不同菌株降解PVA能力的大小，请用简洁的语言写出设计思路___________________________________。
【答案】
（1）聚乙烯醇（或PVA）
多于
（2）
血细胞（血球）
1.6×109
偏小
（3）
碘
用含相同PVA浓度的上述培养基来培养不同菌株，一定时间后，通过测定白色透明斑的大小（或直径）来确定不同菌株降解PVA能力的大小
（2）要测定土壤稀释液中微生物的数目，可在显微镜下用血细胞（血球）计数板直接计数。若将100mL含有PVA分解菌的土壤样品溶液稀释104倍后，取0.1mL稀释液均匀涂布在选择培养基表面，测得菌落数的平均值为160个，空白对照组平板上未出现菌落，则100mL原菌液中有PVA分解菌=160÷0.1×104×100=1.6×109个；由于两个或多个细菌聚集在一起只能产生一个菌落，因此该方法的测量值与实际值相比一般会偏小。
7．【广东省中山市2017届高三5月模拟生物试题】
【生物-选修1生物技术实践】毒死蜱(C9H11C13NO3PS)是一种有机磷杀虫剂，长期使用将导致土壤中农药残留严重。某研究小组从长期施药的韭菜温室土壤（偏酸性）里分离出能降解毒死蜱的木霉，并对其降解特性进行初步研究。请回答
（1）用于分离木霉菌种的培养基属于__________________培养基。配制此培养基时，应加入____________作为唯一碳源。接种前，将培养基在适宜温度下放置适当的时间，观察培养基__________________，以确定培养基是否被污染。
（2）纯化木霉时，统计出0.2
mL的稀释液在稀释倍数为105的平板上的平均菌落数为40个，则每mL样液中的菌落数为__________个。用此法测定木霉数量，实际活菌数量要比统计的菌落数量______，原因是________________________________________________。
（3）探究pH对木霉降解毒死蜱活性的影响
①研究小组向不同pH的培养基中分别加入100
mg/L
毒死蜱，5天后检测毒死蜱的残留量（图1）。由图可推知在偏酸性的土壤中，__________________________。
②研究小组向不同pH的培养基中分别加入100
mg/L
毒死蜱，再分别接种1
mL木霉悬液，混合均匀，5天后检测毒死蜱的残留量（图2）。在此韭菜温室土壤中，若要提高木霉对毒死蜱的降解活性，可对土壤作何处理？_____________________________。
【答案】
（1）
选择
毒死蜱
是否产生菌落
（2）
2×107
多
当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落
（3）
①毒死蜱稳定性较好②
适当提高土壤的pH至7左右
【解析】(1)要分离出能降解毒死蜱的木霉，需要以毒死蜱作为唯一碳源培养基，在该培养基上只有能降解毒死蜱的木霉能生存，其它微生物都不能生存，因此该培养基属于选择培养基。接种前，将培养基在适宜温度下放置适当的时间，观察培养基是否产生菌落，以确定培养基是否被污染。
8．【2016年全国Ⅰ卷，39】空气中的微生物在重力等作用下，可以一定程度地沉降。某研究小组欲用平板收集教室空气中的微生物，以了解教室内不同高度空气中微生物的分布情况。实验步骤如下
①配置培养基（成分牛肉膏、蛋白胨、NaCl、X、H2O）;
②制作无菌平板；
③设置空白对照组和若干实验组，进行相关操作；
④将各组平板置于37℃恒温箱中培养一段时间，统计各组平板上菌落的平均数。
回答下列问题
（1）该培养基中微生物所需的氮来源于_________________。若要完成步骤②，该培养基中的成分X通常是_________________。
（2）步骤③中，实验组的操作是_________________。
（3）若在某次调查中，某一实验组平板上菌落平均数为36个/平板，而空白对照组的一个平板上出现了6个菌落，这种结果说明在此次调查中出现了_________________现象。若将30（即36-6）个/平板作为本组菌落数的平均值，该做法_______________（填“正确”或“不正确”）。
【答案】（1）牛肉膏、蛋白胨
琼脂
（2）将各实验组平板分别放置在教室不同高度的位置上，开盖暴露一段时间
（3）污染
不正确
【解析】（1）依据配制培养基的成分可知该培养基中微生物所需的氮来源于牛肉膏、蛋白胨。因为该实验是
“用平板收集教室空气中的微生物”，所使用的培养基应为固体培养基，配制时，需加入凝固剂，据此推知该培养基中的成分X通常是琼脂。
（2）依题意可知，该实验的目的是用平板收集教室空气中的微生物，以了解教室内不同高度空气中微生物的分布情况。所以步骤③中，实验组的操作是将各实验组平板分别放置在教室不同高度的位置上，开盖暴露一段时间，以收集教室不同高度空气中的微生物。
（3）设置的空白对照组，在整个实验过程中没有用来收集空气中的微生物，若空白对照组的一个平板上出现了6个菌落，说明培养基的配制是不成功的，在此次调查中出现了污染现象，所以若将30（即36－6）/平板作为本组菌落的平板值，该做法不正确。
9．【2016年四川卷，10】图甲是从土壤中筛选产脲酶细菌的过程，图乙是脲酶基因转录的mRNA部分序列。
（1）图中选择培养基应以＿＿＿＿＿＿＿＿为唯一氮源；鉴别培养基还需添加＿＿＿＿＿作指示剂，产脲酶细菌在该培养基上生长一段时间后，其菌落周围的指示剂将变成＿＿＿＿＿色。
（2）在5个细菌培养基平板上，均接种稀释倍数为105的土壤样品液0.1mL，培养一段时间后，平板上长出的细菌菌落数分别为13、156、462、178和191。
该过程采取的接种方法是＿＿＿＿＿，每克土壤样品中的细菌数量为＿＿＿＿＿×108个；与血细胞计数板计数法相比，此计数方法测得的细菌数较＿＿＿＿＿。
（3）现有一菌株的脲酶由于基因突变而失活，突变后基因转录的mRNA在图乙箭头所示位置增加了70个核苷酸，使图乙序列中出现终止密码（终止密码有UAG、UGA和UAA）。突变基因转录的mRNA中，终止密码为＿＿＿＿＿，突变基因表达的蛋白质含＿＿＿＿＿个氨基酸。
【答案】（1）尿素　　酚红　　红
（2）稀释涂布平板法　　1.75　　少
（3）UGA　　115
【解析】（1）由于筛选产脲酶，脲酶能够催化尿素分解为氨，故应以尿素为唯一氮源，培养基中可以加入酚红指示剂，产脲酶细菌在该培养基上生长一段时间后，其菌落周围的指示剂将变成红色。
（3）突变基因转录的mRNA中，终止密码为UGA，由于增加70个碱基，mRNA中碱基总数（由于终止密码子不编码氨基酸，故除去终止密码子的3个碱基）＝271＋2＋72＝345，由于mRNA上一个密码子含有的3个碱基决定一个氨基酸，故突变基因表达的蛋白质含345/3＝115个氨基酸。
10．【2015年江苏卷，31】人工瘤胃模仿了牛羊等反刍动物的胃，可用来发酵处理秸秆，提高秸秆的营养价值。为了增强发酵效果，研究人员从牛胃中筛选纤维素酶高产菌株，并对其降解纤维素能力进行了研究。
请回答下列问题
（1）在样品稀释和涂布平板步骤中，下列选项不需要的是＿＿＿＿＿＿（填序号）。
①酒精灯
②培养皿
③显微镜
④无菌水
（2）在涂布平板时，滴加到培养基表面的菌悬液量不宜过多的原因是＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿。
（3）向试管内分装含琼脂的培养基时，若试管口粘附有培养基，需要用酒精棉球擦净的原因是＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿。
（4）刚果红可以与纤维素形成红色复合物，但并不与纤维素降解产物纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。
研究人员在刚果红培养基平板上，筛到了几株有透明降解圈的菌落（见下图）。
图中降解圈大小与纤维素酶的＿＿＿＿＿有关。
图中降解纤维素能力最强的菌株是＿＿＿＿＿＿＿（填图中序号）。
　　　　　　　　　　　
（5）研究人员用筛选到的纤维素酶高产菌株
J1和J4，在不同温度和pH条件下进行发测得发酵液中酶活性的结果见下图，推测菌株＿＿＿＿＿更适合用于人工瘤胃发酵，理由是＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿。
【答案】（1）③
（2）培养基表面的菌悬液会出现积液，导致菌体堆积，影响分离效果
（3）避免培养基污染棉塞
（4）量与活性
①
（5）J4
发酵过程中会产热和产酸，J4菌株在较高温度和酸性环境下酶的活性更高
【解析】（1）稀释涂布平板中，培养基位于培养皿中，无菌水用于稀释，涂布在酒精灯火焰旁进行，以免杂菌污染，所以该过程不需要使用显微镜。
（2）若涂布平板时，滴加到培养基表面的菌悬液量过多，则会出现积液，导致菌体堆积，影响分离效果。
（3）若试管口粘附有培养基，则需用酒精棉球擦净，以免培养基污染棉塞。
（5）由于发酵过程中会产热和产酸，J4菌株在较高温度和酸性环境下酶的活性更高，所以菌株J4更适合用于人工瘤胃发酵。

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