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1． “试管婴儿技术”不仅使一部分不能生育的男女重新获得了生育的机会，也为人类的优生优育开辟了新的途径。据此回答：
(1)在体外受精时，精子首先要进行________处理；卵细胞则要培养到________(时期)才能与精子结合。
(2)采用________技术，能得到“同卵双胞胎”。
(3)如果滥用试管婴儿技术设计婴儿性别，将会破坏人类正常的________。
(4)要培育高产奶率的转基因牛，如建立生产生长激素的乳腺生物反应器，科学家将________和乳腺蛋白基因的________、终止子等重组在一起，通过显微注射等方法导入牛的受精卵中。
(5)动物细胞工程中，重组细胞在体外培养时，培养液中除了加入诱导物外，还应加入水、无机盐、维生素、葡萄糖、氨基酸、________等物质，恒温箱中加入CO2的作用是________________________________________________________________________。
【答案】(1)获能　减数第二次分裂中期(或MⅡ中期)
(2)胚胎分割(移植)
(3)性别比例
(4)生长激素基因　启动子
(5)动物血清　维持细胞培养液的pH
2．基因疫苗是指将编码外源性抗原的基因导入人和动物体内，让其在宿主细胞中表达抗原蛋白，诱导机体产生免疫应答。某科研所计划采用基因工程和胚胎工程技术培育具有口蹄疫免疫特性的高产奶牛。请回答下列问题：
(1)基因表达载体的构建是基因工程的核心，一个完整的基因表达载体至少包括启动子、________、________、________。启动子位于基因的________，有了它才可以驱动基因转录。
(2)制备基因疫苗的基因可以从基因文库中获取，基因文库实际上是含有某种生物不同基因的许多DNA片段的________群体。
(3)检测高产奶牛体内是否出现口蹄疫病毒的抗原蛋白，在分子水平上的检测方法是________。
(4)胚胎工程最后一道工序的实质是________________。
(5)为提高胚胎的利用率，可以采用胚胎分割技术，应该选用________的桑椹胚或囊胚进行分割。
【解析】(1)一个完整的基因表达载体至少包括启动子、终止子、标记基因和目的基因。启动子位于基因的首端，它驱动基因的转录。(2)基因文库实际上是含有某种生物不同基因的许多DNA片段的受体菌群体。(3)检测奶牛体内是否出现抗原蛋白，在分子水平上的检测方法是抗原—抗体杂交，如果出现杂交带说明目的基因表达成功。(4)胚胎工程最后一道工序是胚胎移植，实质是早期胚胎在相同生理环境条件下空间位置的转移。(5)胚胎分割应采用发育良好、形态正常的桑椹胚或囊胚进行分割，要注意均等分割。
【答案】(1)目的基因　标记基因　终止子(顺序可颠倒)　首端
(2)受体菌
(3)抗原—抗体杂交
(4)早期胚胎在相同生理环境条件下空间位置的转移
(5)发育良好、形态正常
3．中科院动物研究所已培育出中国首例转基因猕猴。这一研究成果标志着中国科学家在灵长类转基因动物研究方面达到世界领先水平。如图是转基因猕猴培育过程，据图回答下列问题：
(1)过程②中常用________技术将目的基因导入受精卵，在体外培养受精卵时，为了维持无菌环境，通常向培养液中添加________。
(2)如果⑤过程在体外进行，那么卵母细胞需要培养到________期，精子需要获能。受精过程中通过________________反应，以防止多精入卵。
(3)受精卵发育到________期，开始发生分化。
(4)图中⑦过程称为________，胚胎在代孕雌猴子宫中能够存活的原因是________________________________________________________________________。
(5)若要同时获得多只与此转基因猕猴相同的小猴，可采用________技术。
【答案】(1)显微注射　抗生素
(2)MⅡ中　透明带反应和卵细胞膜
(3)囊胚
(4)胚胎移植　受体对移入子宫的外来胚胎基本不发生免疫排斥反应
(5)胚胎分割
4．杜泊羊以其生长速度快、肉质好等优点，被称为“钻石级”肉用绵羊。科研工作者通过胚胎工程快速繁殖杜泊羊的流程如图所示，请据图回答问题：
(1)此过程用到的生物技术有______________(答出两个即可)。
(2)为了获得更多的卵母细胞，需用__________对雌性杜泊羊进行处理。进行体外受精前，需将卵母细胞培养到__________期；精子需进行__________处理。受精时防止多精入卵的两道屏障分别是____________和____________。
(3)生产上常用________期的胚胎进行胚胎移植，移植的胚胎在受体绵羊体内存活的生理基础是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
【答案】(1)体外受精技术、早期胚胎培养技术、胚胎移植等
(2)促性腺激素　MⅡ中　获能　透明带反应　卵细胞膜反应
(3)桑椹胚或囊胚　受体对移入子宫的外来胚胎基本不发生免疫排斥反应
5．如图是通过胚胎工程培育试管牛的过程。据图回答以下关于细胞工程和胚胎工程的问题：
(1)在牛体细胞培养过程中，当贴壁细胞分裂生长到细胞表面相互接触时，细胞会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的________。此时，瓶壁上形成的细胞层数是________。要使贴壁的细胞从瓶壁上分离下来，需要用酶处理，可用的酶是________。
(2)随着细胞传代次数的增多，绝大部分细胞分裂停止；但极少数细胞可以连续增殖，其中有些细胞会因遗传物质发生改变而变成不死的细胞，该种细胞的黏着性降低，这是由细胞膜表面________的量减少造成的。
(3)从良种母牛采集的卵母细胞，都需要进行体外培养，其目的是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________；
从良种公牛采集的精子需________后才能进行受精作用。
(4)在体外培养受精卵时，除了给予一定量的氧气以维持细胞呼吸外，还需要提供二氧化碳气体以维持________，图中过程A称为________。
(5)如暂时不进行A过程，通常在________条件下保存受精卵。因为在这种条件下，细胞中________的活性降低，细胞新陈代谢的速率降低。
【答案】(1)接触抑制　单层(或一层)　胰蛋白酶(或胶原蛋白酶)
(2)糖蛋白
(3)使卵母细胞成熟(或使卵母细胞获得受精能力)　获能
(4)培养液(基)的pH　胚胎移植
(5)冷冻(或超低温、液氮)　酶
6．Leigh氏综合征是一种攻击神经系统的严重神经障碍，其致病基因位于线粒体DNA中。一位母亲约有1/4的线粒体携带这种致病基因，她的前两个孩子因为患有Leigh氏综合征而夭亡。她的第三个孩子因为接受另一名女性捐赠的健康基因而成为全球首个拥有“三个父母”的男婴。请根据男婴孕育过程回答下面的问题：
(1)该母亲的前两个孩子患病夭亡的原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________，
该健康男婴孕育过程中依次使用了______________、早期胚胎培养和胚胎移植等技术。
(2)图示过程中代表该母亲卵母细胞的是______(填“A”或“B”)。取卵之前，该母亲需要注射______激素。
(3)早期胚胎需经过________(水平)检测合格后才能植入母亲的子宫继续发育。
(4)在胚胎孕育过程中，医疗团队特意选择了男性胚胎移入子宫发育，原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
【答案】(1)该母亲可能产生含较多缺陷线粒体的卵细胞，而受精卵的线粒体几乎全都来自卵细胞，导致前两个孩子患病夭亡　核移植、体外受精
(2)B　促性腺
(3)DNA分子水平
(4)男性的线粒体不会遗传给后代
7．(1)下列有关现代生物技术的叙述正确的是(　　)
A．DNA连接酶和DNA聚合酶都能使核苷酸之间形成磷酸二酯键，属于同一种酶
B．体外培养杂交瘤细胞需要在培养液中添加动物血清和抗生素
C．动物细胞培养时一定都需要添加血清
D．作为运载体必备的条件之一是具有多个相同的限制酶切割位点
(2)植物组织培养的主要原理是植物细胞具有________，具体过程是在________和人工控制条件下，将离体的植物器官、组织、细胞培养在人工配制的培养基上，给予适宜的条件，诱导其组织经过________产生愈伤组织进而长出丛芽、生根，最终形成完整的植株。植物体细胞杂交过程中，诱导原生质体融合的化学试剂一般是________。
(3)试管动物技术是指通过人工操作使卵子和精子在体外条件下成熟和受精，并通过培养发育为________后，再经过________产生后代的过程。
(4)生态工程是实现循环经济最重要的手段之一，请写出与沼气工程结合的生态农业遵循的主要基本原理(至少答两项)：_______________________________________________
________________________________________________________________________。
【答案】(1)B
(2)全能性　无菌　脱分化　聚乙二醇
(3)早期胚胎　胚胎移植
(4)物质循环再生原理(必答)、协调与平衡原理(或物种多样性原理)(必须答全两个)
8．我国是受荒漠化危害最为严重的国家之一。近年来，京津冀地区频受沙尘暴之苦，故保护生态环境，大力开展植树种草活动，治理水土流失，防止土地沙漠化等是当前的紧要任务。
(1)据研究，形成京津冀沙尘暴的沙主要来自黄土高原和内蒙古高原，西部生态环境的改变首先要解决的非生物因素是________。
(2)在退耕还林、还草过程中，要注意树种、草种不要过于单一。这种做法所依据的主要生态工程原理是________________________，其目的是提高生态系统的抵抗力稳定性。
(3)近年来大力推广的生态农业是一个自我维持的生态系统，其特点是保持和完善系统内的生态平衡，其设计的原则是能量的________和物质的________，以求得最大的生产力和可持续发展。我国农民收集一切可能的有机物质，使其转变为有机肥料，保持土壤肥力的做法称为________农业。
(4)某科研小组想利用基因工程技术培育抗旱植物用于治理水土流失。将抗旱基因导入植物细胞时采用最多的方法是________。要检测抗旱基因是否插入到受体细胞的DNA中，采用的是________技术。若检测结果表明抗旱基因已经插入到受体细胞的DNA中，则培育的植株________(填“一定”或“不一定”)具有抗旱性状。
【解析】(1)西部生态环境的改变首先要解决的非生物因素是水。(2)在退耕还林、还草过程中，要注意树种、草种不要过于单一。这种做法所依据的主要生态工程原理是物种多样性原理，其目的是提高生态系统的抵抗力稳定性。(3)生态农业设计的原则是能量的多级利用和物质的循环再生，以求得最大的生产力和可持续发展。我国农民收集一切可能的有机物质，使其转变为有机肥料，保持土壤肥力的做法称为无废弃物农业。(4)将抗旱基因导入植物细胞时采用最多的方法是农杆菌转化法，要检测抗旱基因是否插入到受体细胞的DNA中，采用的是DNA分子杂交技术；若检测结果表明抗旱基因已经插入到受体细胞的DNA中，但培育的植株不一定具有抗旱性状。
【答案】(1)水
(2)物种多样性原理
(3)多级利用　循环再生　无废弃物
(4)农杆菌转化法　DNA分子杂交　不一定
9．叶绿体转基因技术是将外源基因整合到叶绿体基因组中，该技术能有效改良植物的品质。请回答下列问题：
(1)转基因技术的核心步骤是________，完成该步骤所需要的酶有________。
(2)将植物体细胞处理得到原生质体，再通过________或________法，将目的基因导入原生质体，使原生质体再生细胞壁之后，通过________技术培养可得到相应的转基因幼苗。
(3)来自原核生物中有重要价值的外源基因，无需改造和修饰就可在叶绿体中高效表达，据此分析，原因是
________________________________________________________________________。
(4)对大多数高等植物而言，与传统的细胞核转基因相比，叶绿体转基因更稳定，其遗传方式________(填“遵循”或“不遵循”)孟德尔分离定律，不会随________(填“花粉”或“卵细胞”)传给后代，从而保持了________(填“父本”或“母本”)的遗传特性。
【答案】(1)构建基因表达载体　限制酶和DNA连接酶
(2)农杆菌转化法　基因枪　植物组织培养
(3)叶绿体DNA与原核生物DNA结构类似
(4)不遵循　花粉　母本
10．将外源生长激素基因导入绵羊体内，转基因绵羊的生长速度比一般绵羊提高30%，体型增大50%。回答下列问题：
(1)外源生长激素基因除可以从基因组文库中获取外，还可通过以下途径合成：利用从供体动物的________细胞中提取的mRNA，在________酶催化下合成；二是通过分析生长激素________的序列推测基因的结构，进而人工合成。这两种途径合成的生长激素基因________(填“是”或“否”)一定相同，原因是________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________。
(2)外源生长激素基因导入绵羊体内并成功表达，其核心步骤是______________。
(3)转基因绵羊胚胎的早期培养时添加血清的原因是__________________。为让移植胚胎容易成活，应对受体绵羊进行________处理。
【解析】(1)生长激素是垂体合成分泌的，故只有在垂体细胞中才能提取到生长激素基因转录形成的mRNA，再在逆转录酶的催化作用下合成生长激素基因。也可以通过分析生长激素的氨基酸序列，推测出其对应mRNA中的碱基序列，进而推测出生长激素基因中的碱基序列，最后人工化学合成。因为决定氨基酸的密码子具有简并性，因而这两种方法合成的生长激素基因结构不一定相同。(2)基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建。(3)因为血清中含有细胞分裂、分化所必需的生长因子，早期胚胎进行培养时添加血清或血浆可促进胚胎细胞的分裂和分化。为让供体胚胎容易成活，需用一定的激素对受体进行同期发情处理。
【答案】(1)垂体　逆转录　氨基酸　否　一种氨基酸可能不止由一种密码子决定(密码子的简并性)(答案合理即可)
(2)基因表达载体的构建
(3)血清中含有细胞分裂、分化所必需的生长因子(答案合理即可)　同期发情
11．科学家将鱼的抗冻蛋白基因转入番茄，使番茄的耐寒能力大大提高。回答下列相关问题：
(1)在该过程中，研究人员首先获取目的基因，并采用________技术对目的基因进行扩增，该技术需要的条件是：引物、酶、原料和________。
(2)为了在番茄中获得抗冻蛋白必须将抗冻蛋白基因连接在质粒中的________之后。
(3)研究人员通常采用________法将鱼的抗冻蛋白基因导入番茄细胞内，通常采用________技术，在分子水平检测目的基因是否翻译成了相应的蛋白质。
(4)抗冻番茄的获得要经过脱分化和再分化过程，通过脱分化过程形成________组织，该组织在再分化过程中细胞分裂的方式是________。
【答案】(1)PCR　模板　(2)启动子
(3)农杆菌转化　抗原—抗体杂交
(4)愈伤　有丝分裂
12．为增加油菜种子的含油量，科研人员将酶D基因与位于叶绿体膜上的转运肽基因相连，导入油菜细胞并获得了转基因油菜品种。
(1)研究人员采用PCR技术获取酶D基因和转运肽基因，该技术是利用________的原理，使相应基因呈指数增加。所含三种限制酶(XbaⅠ、ClaⅠ、SacⅠ)的切点如图所示，则用________和________处理两个基因后，可得到酶D基因和转运肽基因的融合基因。
(2)将上述融合基因插入上图所示Ti质粒的________中，构建基因表达载体并导入农杆菌中。为了获得含融合基因的单菌落，应进行的操作是______________________________。随后再利用液体培养基将该单菌落菌株振荡培养，可以得到用于转化的侵染液。
(3)剪取油菜的叶片放入侵染液中一段时间的目的是________________，进一步筛选后获得转基因油菜细胞，提取上述转基因油菜的mRNA，在逆转录酶的作用下获得cDNA，再依据________的DNA片段设计引物进行扩增，对扩增结果进行检测，可判断融合基因是否完成________。最后采用抗原—抗体杂交法可检测转基因油菜植株中的融合基因是否成功表达。
【答案】(1)DNA双链复制　ClaⅠ　DNA连接酶
(2)T-DNA　将获得的农杆菌接种在含四环素的固体培养基上培养
(3)利用农杆菌将融合基因导入油菜细胞　融合基因　转录
13．如图是植物细胞杂交过程示意图，请据图回答：
(1)植物体细胞杂交的第①步是去掉细胞壁，分离出有活力的原生质体。目前此步骤最常用的方法是酶解法，也就是在温和的条件下用________等分解植物的细胞壁。
(2)人工诱导②过程原生质体融合的物理方法是：利用________(至少写出两种)等促使原生质体融合；化学方法是用________等试剂作为诱导剂诱导融合。动物细胞融合与植物原生质体融合的诱导方法类似，动物细胞的融合还常用到________作为诱导剂。
(3)③表示融合后的原生质体再生细胞壁，新细胞壁的产生与细胞内________(细胞器)有密切关系。
(4)图中④过程表示________，⑤过程表示________，由杂种细胞培育成杂种植株所依据的原理是____________________。
(5)植物体细胞杂交在育种工作中具有广泛的应用价值，其突出的优点是________________________________________________________________________。
【答案】(1)纤维素酶、果胶酶
(2)离心、振动、电激　聚乙二醇　灭活的病毒
(3)高尔基体
(4)脱分化　再分化　植物细胞的全能性
(5)克服远缘杂交不亲和的障碍
14．如图是某实验室做的通过动物纤维母细胞等获得单克隆抗体的实验研究。据图回答相关问题：
(1)过程①实施前需将诱导基因与________相连接构建________，在导入小鼠成纤维细胞时一般采用________法导入，此步骤中用到的工具酶有________。
(2)过程②的实质是________。甲细胞是________细胞，乙细胞是________细胞。
(3)过程③一般用________诱导，丙细胞的特点是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
【解析】(1)基因工程操作过程中需要将目的基因与运载体连接构建基因表达载体，将目的基因导入动物细胞常用显微注射法。基因工程中的工具酶是限制酶和DNA连接酶。(2)过程②是干细胞的分化过程，实质是基因的选择性表达。由图可知，病毒注入小鼠体内获得的乙细胞是浆细胞(已免疫的B细胞)，所以甲是骨髓瘤细胞。(3)诱导动物细胞融合用灭活的病毒或PEG，丙细胞是杂交瘤细胞，其特点是既能迅速大量繁殖，又能产生专一的抗体。
【答案】(1)载体　基因表达载体　显微注射　限制酶、DNA连接酶
(2)基因的选择性表达　骨髓瘤　B(淋巴)
(3)灭活的病毒(或聚乙二醇)　既能迅速大量繁殖，又能产生专一的抗体
15．克隆猪成功率较低，与早期胚胎细胞异常凋亡有关。Bcl?2基因是细胞凋亡抑制基因，用PCR技术可以检测该基因转录水平，进而了解该基因与不同胚胎时期细胞凋亡的关系。克隆猪的培育及该基因转录水平检测流程如图。
请回答：
(1)图中重组细胞的细胞核来自________细胞，早期胚胎移入受体子宫继续发育，经桑椹胚、囊胚和________胚最终发育为克隆猪。
(2)在PCR过程中可检测出cDNA中Bcl?2 cDNA的分子数，进而计算总mRNA中Bcl?2 mRNA的分子数，从而反映出Bcl?2基因的转录水平。
①图中X表示________过程。
②在PCR过程中利用________技术可检测出cDNA中Bcl?2 cDNA的分子数。
(3)该过程所涉及的现代生物技术有早期胚胎培养、胚胎移植、________和________。
(4)目前使用的供体细胞一般都选择传代10代以内的细胞，原因为________________________________________________________________________。
【答案】(1)体　原肠
(2)①反转录　②DNA分子杂交
(3)动物细胞培养　核移植技术
(4)传代10代以内的细胞保持正常的二倍体核型
16.蓝莓中富含的花青素能有效地改善视力，下图为科学家利用植物组织培养的方法，大量培养蓝莓具体流程的文字图解。请回答下列问题：
生根
(1)用于离体培养的蓝莓组织叫作_____________，该技术的原理是_______________。
(2)配制MS培养基时，应加入一定量的琼脂、蔗糖、无机盐、维生素、有机物等营养物质，蔗糖除作为碳源外，还具有_________________________的功能。常用的培养基有脱分化培养基、生根培养基和生芽培养基，这三种培养基的主要差异是________________。
(3)图中蓝莓组织要经过消毒处理后才能进行培养。其①过程中，细胞的分化程度会__________(填“升高”“降低”或“不变”)。
(4)愈伤组织经过②③过程重新分化成根或丛芽的过程叫_____________。
(5)蓝莓花青素在60 ℃以下的热稳定性较好，将含花青素的粗品经真空干燥(可使水的沸点降低40 ℃)制成成品。采用该方法的主要原因是___________________________。
【答案】(1)外植体　(植物)细胞全能性　(2)提供能量和维持渗透压　生长素和细胞分裂素的用量及比例不同　(3)降低　(4)再分化　(5)避免(干燥时温度过高导致)花青素分解
17．Rag2基因缺失小鼠不能产生成熟的淋巴细胞。科研人员利用胚胎干细胞(ES细胞)对Rag2基因缺失小鼠进行基因治疗。其技术流程如图：
(1)步骤①中所选的卵母细胞应处于______________期。
(2)步骤②中，重组胚胎培养到囊胚期时，可从其________________分离出ES细胞，ES细胞在形态上表现为________________________的特点。
(3)步骤③中，需要构建含有Rag2基因的______________________。可以根据Rag2基因的核苷酸序列设计合成________，利用________技术扩增Rag2基因片段。用HindⅢ和PstⅠ限制酶分别在目的基因所在DNA片段两侧进行酶切获得Rag2基因片段。为将该片段直接连接到表达载体，所选择的表达载体上应具有_________________酶的酶切位点。
【解析】(1)步骤①为核移植，所选的卵母细胞应处于减数第二次分裂中(MⅡ)期。(2)重组胚胎培养到囊胚期时，可从其内细胞团中分离出ES细胞，ES细胞在形态上表现为体积小、细胞核大、核仁明显。(3)步骤③中表示将Rag2基因(目的基因)导入ES细胞(受体细胞)，此过程需要构建含有Rag2基因的表达载体(重组质粒)。设计引物要遵循碱基互补配对原则，所以根据Rag2基因的核苷酸序列进行设计，可利用PCR技术扩增Rag2基因片段。Rag2基因片段是用HindⅢ和PstⅠ限制酶切割获得，所以表达载体上应具有HindⅢ和PstⅠ酶的酶切位点。
【答案】(1)减数第二次分裂中(MⅡ)　(2)内细胞团　体积小、细胞核大、核仁明显　(3)表达载体(重组质粒)　引物　PCR　Hind Ⅲ和PstⅠ
18．早早孕试纸是人们设计出来的一种方便女性检测自己是否怀孕的产品。人绒毛膜促性腺激素(HCG)是由受孕妇女体内胎盘产生的一种糖蛋白类激素，在孕妇的尿液中大量存在，而非妊娠孕妇尿液中几乎不含有该激素。回答下列问题：
(1)HCG在胎盘细胞的_________合成，然后在_________上进一步合成加工，最后经_______进一步的修饰加工然后分泌到细胞外。
(2)HCG单克隆抗体是由__________细胞产生的，由于单克隆抗体具有____________、_____________的特点，所以能准确地识别各种抗原物质的细微差异，并跟一定抗原发生特异性结合。
(3)制备HCG单克隆抗体的过程中，可能运用到了____________________和动物细胞培养等技术，其中后者需要置于95%空气加5%的CO2的混合气体的培养箱中进行培养，CO2的作用是__________________。
【答案】(1)核糖体　内质网　高尔基体　(2)杂交瘤　纯度高　特异性强(灵敏度高)　(3)动物细胞融合技术　 维持培养液的pH
19.哺乳动物单倍体胚胎干细胞技术是遗传学研究的新手段，该项技术为研究隐性基因功能提供了理想的细胞模型。如图表示研究人员利用小鼠获取单倍体胚胎干细胞的方法。请分析回答：
(1)方法一中，研究人员需对实验小鼠注射_______________，使其_________________，从而获得更多的卵母细胞。用SrCl2溶液处理激活卵母细胞，在体外选用特制的培养液培养至____________期，从内细胞团中分离、筛选出胚胎干细胞。采用这种方法获得的单倍体胚胎干细胞称为孤雌单倍体胚胎干细胞。
(2)采用方法二可获得孤雄单倍体胚胎干细胞。受精阶段，防止多精入卵的第一道屏障是__________________。研究人员用特定方法去除细胞M中的________原核，再对处理后的细胞进行进一步的培养、分离和筛选。
(3)研究发现，小鼠单倍体胚胎干细胞存在自发二倍体化的现象。可以通过测定并分析细胞内DNA分子的含量，或利用显微镜观察细胞中的染色体数目进行确定，最好选择处于________________(写出分裂类型及时期)的细胞进行观察。
【答案】(1)促性腺激素　超数排卵　囊胚　 (2)透明带反应　雌　(3)有丝分裂中期
20．干扰素是抗病毒的特效药，干扰素基因缺失的个体，免疫力严重下降。科学家设计了以下流程，利用胚胎干细胞(ES细胞)对干扰素基因缺失的患者进行基因治疗，根据所学的知识，结合图中相关信息，回答以下问题：
(1)上图中进行的是_________(填“体内”或“体外”)基因治疗，该过程中利用的生物工程技术手段有动物细胞培养技术、早期胚胎培养技术、转基因技术和 _________________等。　
(2)ES细胞是由早期胚胎或_____________中分离出来的一类细胞。
(3)步骤③中，需要构建含有干扰素基因的__________，该结构除了复制原点外，至少包含___________________________和干扰素基因等；为检测干扰素基因是否表达，可以采用 _________________的方法。
(4)为了快速获得更多的目的基因常常采用__________技术进行扩增。
【解析】(1)分析图解可知，上图中进行的是体外基因治疗，该过程利用的生物工程技术手段有动物细胞培养技术、早期胚胎培养技术、转基因技术和核移植技术等。(2)ES细胞是由早期胚胎或原始性腺中分离出来的一类细胞，利用其具有(发育的)全能性，可以将其培养成人体各种组织器官。(3)步骤③中，需要构建含有干扰素基因的基因表达载体，基因表达载体除了复制原点外，至少包含启动子、终止子、标记基因和干扰素基因等；为检测目的基因的表达情况，可采用抗原－抗体杂交技术，若有杂交带出现，表明目的基因已成功表达。(4)可以利用PCR技术对体外基因进行大量扩增。
【答案】(1)体外　核移植技术　(2)原始性腺　(3)基因表达载体　启动子、终止子、标记基因　抗原—抗体杂交　(4)PCR
21．科学家应用现代生物技术培育出了荧光转基因克隆兔，培育过程如下，回答下列问题：
(1)上述过程中运用的生物技术有_____________________________(写出两个即可)。将重组质粒导入甲兔的成纤维细胞时，通常用____________法。
(2)为避免杂菌污染，②过程要求______________的培养环境，培养的空气中通常需含5%的CO2，目的是________________________。培养基中除加入一些基本的营养成分外，通常需加入血清等一些天然成分。对重组细胞中荧光蛋白基因进行检测的方法是________________。
(3)胚胎移植前必须对代孕母兔和供体母兔用激素进行___________处理。如果想获得核基因型相同的多个胚胎，常采用的方法是___________，处理的时期是__________________。
【答案】(1)基因工程、动物细胞培养、动物体细胞核移植或胚胎工程(写出其中任意两个均可)　显微注射
(2)无菌、无毒　维持培养基的pH　DNA分子杂交技术
(3)同期发情　胚胎分割技术　桑椹胚或囊胚期
22．我国研究人员创造出一种新型干细胞——异种杂合二倍体胚胎干细胞，具体研究过程如下图所示，请据图回答问题：
(1)图中的单倍体囊胚1最可能是由小鼠的__________发育而来，所采用的技术应为________________，培养过程中使用的培养液除含有一些无机盐和有机盐外，还需添加维生素、激素、________________以及血清等物质。
(2)图中的单倍体ES应取自囊胚的____________细胞，ES在形态上表现为________。
(3)由于物种间存在________，因此自然情况下哺乳动物远亲物种间的配子往往无法完成________作用，或者即便能完成也不能发育。但是人们为了生物学研究的便利，创造出了各类远亲物种间的杂合细胞，如小鼠—大鼠、人—鼠等杂交细胞，由于这些细胞都是由体细胞融合产生，因此杂交细胞中通常含有________【答案】(1)卵子(卵细胞)　早期胚胎培养技术　氨基酸、核苷酸　(2)内细胞团　体积小、细胞核大、核仁明显　(3)生殖隔离　受精　4
23．抗凝血酶Ⅲ蛋白是一种血浆糖蛋白，临床上主要用于血液性疾病的治疗。凝乳酶是奶酪生产中的关键性酶。下列是生产这两种酶的相关思路，请回答下列问题：
(1)图1为通过培育转基因奶牛获得抗凝血酶Ⅲ蛋白的流程。
①图中过程a指的是利用________法将目的基因导入受精卵，受体细胞不选用体细胞的理由是____________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
②在胚胎移植前，需进行____________，目的是确定要培育的个体能产奶。
③可采用________________法来鉴定牛奶中是否含有抗凝血酶Ⅲ蛋白。
(2)从牛胃液中分离得到的凝乳酶以其催化能力强而被广泛应用，研究人员运用基因工程技术，将编码该酶的基因转移到了微生物细胞中。
①从牛胃细胞中提取mRNA，再通过____________形成cDNA。以此cDNA为模板通过PCR扩增目的基因，有时需要在引物的5′端设计________(填“限制酶”“DNA连接酶”或“RNA聚合酶”)识别序列，以便构建重组DNA分子。
②为提高重组DNA分子的比例，在构建重组DNA分子(如图2所示)时最好选用__________________作限制酶。
③经研究发现，如果将该凝乳酶的第20位和24位氨基酸变为半胱氨酸，则其催化能力将提高2倍。现已知通过蛋白质工程可生产高效凝乳酶，请写出有关制备步骤：
__________________________________________________________________________。
【答案】(1)①显微注射　动物体细胞的全能性一般不能表现　②性别鉴定　③抗原—抗体杂交　(2)①逆转录　限制酶　②BamHⅠ和PstⅠ　③找到相对应的脱氧核苷酸序列→定向改造凝乳酶基因→将改造后的凝乳酶基因导入受体细胞等(合理即可)
24．科研人员利用胚胎干细胞(ES细胞)对干扰素基因缺失小鼠进行基因治疗，其技术流程如图1。图2表示目的基因及限制酶切点，图3表示质粒，据图回答：
(1)重组细胞的细胞核来自______________细胞。
(2)将基因导入ES细胞而不是导入上皮细胞是因为ES细胞具有______________。
(3)步骤③导入的目的基因是________________________________________________。
(4)从基因组数据库中查询干扰素基因的核苷酸序列，以便根据其序列设计合成引物用于PCR扩增，PCR扩增过程至少第____________轮循环后才能获得纯目的基因片段(仅含引物之间的序列)。
(5)对于干扰素基因片段和质粒进行双酶切时，可选用限制酶的组合为____________或____________。
(6)将步骤③获得的ES细胞在荧光显微镜下观察，选择发___________色荧光的细胞进行体外诱导。为检测干扰素基因是否表达，可以采用________________的方法。
【答案】(1)(干扰素基因缺失小鼠的)上皮细胞　(2)全能性　(3)干扰素基因　(4)3　(5)HindⅢ和PstⅠ
EcoRⅠ和PstⅠ　(6)绿　抗原—抗体杂交
25.科学家运用基因工程技术将结核杆菌MPT64基因(能控制合成MPT64蛋白)成功导入胡萝卜细胞，最终表达出肺结核疫苗。请回答下列问题：
(1)为获取MPT64基因，可从结核杆菌的细胞中提取对应mRNA，在________________的作用下合成双链cDNA片段，获得的cDNA片段与结核杆菌中该基因碱基序列______________(填“相同”或“不同”)。
(2)通常采用PCR技术扩增MPT64基因，前提是要有一段已知MPT64基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成______________，在操作步骤中需要加热至90～95 ℃的目的是________________________________________________________________________。
(3)根据农杆菌的特点，如果将MPT64基因插入到_______________上，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入胡萝卜细胞，并将其插入到植物细胞中的______________上。要确认MPT64基因是否在胡萝卜植株中表达，应检测胡萝卜植株中是否含有________________________________________________________________________。
(4)研究发现，如果将MPT64蛋白20位和24位的氨基酸改变为半胱氨酸，其保存时间将大大延长，科学家可以生产上述耐储存的MPT64蛋白的现代生物工程技术是________________________________。
【解析】(1)以mRNA为模板合成cDNA的过程是逆转录，需要逆转录酶的催化。由于DNA转录形成的mRNA过程中非编码序列不转录，所以形成的cDNA与结核杆菌中该基因碱基序列不同。(2)在PCR技术中，以已知一段MPT64基因的核苷酸序列为模板，合成引物。在操作步骤中需要加热至90～95 ℃，以打开DNA的双链。(3)在农杆菌转化法中，将MPT64基因插入到农杆菌的Ti质粒的T-DNA上，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入胡萝卜细胞，并将其插入到植物细胞中的染色体的DNA上。基因的表达产物是蛋白质，要确认MPT64基因是否在胡萝卜植株中表达，应检测胡萝卜植株中是否含有MPT64蛋白。(4)利用蛋白质工程可以通过设计改造原有蛋白质的结构和功能。
【答案】(1)逆转录酶　不同　(2)引物　目的基因DNA受热变性解链为单链　(3)Ti质粒的T-DNA　染色体的DNA　MPT64蛋白　(4)蛋白质工程
26．油菜中油酸为不饱和脂肪酸，能降低人体血液的胆固醇含量，减少人体患心血管病的风险。F基因控制合成的油酸酯氢酶催化油酸形成饱和脂肪酸，转反义F基因油菜能提高菜籽油的油酸含量。请分析回答下列问题：
(1)从油菜细胞的染色体DNA获取F基因后进行大量扩增的方法为___________。
(2)构建反义F基因表达载体时，需要用到的工具酶有_____________________；农杆菌可用来将反义F基因表达载体导入油菜细胞，从分子角度分析，其具有的特点是______________________________________________。构建反义F基因表达载体时没有设计标记基因，其可能的原因是_______________________________________________。
(3)Le启动子为种子特异性启动子，将F基因反向连接在Le启动子之后构建了反义F基因。检测转反义F基因油菜细胞内F基因转录的mRNA含量，结果表明，因杂交形成双链RNA，细胞内F基因的mRNA水平下降。由此推测，反义F基因的转录抑制了F基因的________(填“复制”“转录”或“翻译”)过程。若F基因转录时，两条单链(a1、a2)中a1为转录的模板链，则反义F基因转录时的模板链为__________。
【答案】(1)PCR技术　(2)限制酶、DNA连接酶　其Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上　无标记基因表达产物，有利于食品安全　(3)翻译　a2
27．科学家通过利用PCR定点突变技术改造Rubisco酶基因，提高了光合作用过程中Rubisco酶对CO2的亲和力，从而显著提高了植物的光合速率。请回答下列问题：
(1)PCR过程所依据的原理是________________，该过程需要加入的酶是_____________。
(2)该技术不直接改造Rubisco酶，而通过对Rubisco酶基因进行改造，从而实现对Rubisco酶的改造，其原因是_______________________________。与传统基因工程技术相比较，定点突变技术最突出的优点是_______________________，PCR定点突变技术属于_______________的范畴。
(3)可利用定点突变的DNA构建基因表达载体，常用__________________将基因表达载体导入植物细胞，将该细胞利用植物组织培养技术培育成幼苗，从细胞水平分析所依据的原理是____________。
【解析】(1)PCR技术是一种体外扩增DNA片段的技术，其原理是DNA双链复制，该过程需要耐高温的DNA聚合酶(或Taq酶)的催化。(2)由于蛋白质空间结构较为复杂，改造困难，所以该技术不直接改造Rubisco酶，而通过对Rubisco酶基因进行改造，从而实现对Rubisco酶的改造；和传统基因工程技术相比较，定点突变技术最突出的优点是能生产出自然界不存在的蛋白质，PCR定点突变技术属于蛋白质工程的范畴。(3)将基因表达载体导入植物细胞常用农杆菌转化法；植物组织培养技术的原理是植物细胞的全能性。
【答案】(1)DNA双链复制　耐高温的DNA聚合酶(或Taq酶)　(2)蛋白质空间结构较为复杂，改造困难　能生产出自然界不存在的蛋白质　蛋白质工程　(3)农杆菌转化法　植物细胞的全能性
28．在植物抗病毒基因工程中，利用植物病毒复制酶基因是一种常见的方法，某实验小组将芜菁花叶病毒复制酶(TuMV-Nib)反义基因导入大白菜中，经检测表明TuMV-Nib反义基因不仅整合到大白菜的染色体中，还获得表达，而且转基因植株的接种测试表明转基因植株具有明显的抗病性。TuMV-Nib反义基因的作用过程如下图所示，请回答下列问题：
(1)实验室大量扩增TuMV-Nib反义基因常用的技术为___________，该技术需要加入的原料是____________，利用该技术扩增目的基因时_________(填“需要”或“不需要”)知道该基因的全部碱基序列。
(2)将目的基因导入植物细胞的常用方法是_________，该方法常将目的基因导入Ti质粒的T-DNA分子中，其原因是_______________________________________。
分析图示可知，TuMV-Nib反义基因主要通过影响图中的_________(填序号)过程，影响TuMV-Nib基因的表达。
(3)对已经被病毒感染的植株，可选取该植株的茎尖通过_________________技术获得脱毒苗，利用茎尖作为材料的原因是____________________________________________。
【答案】(1)PCR　四种脱氧核糖核苷酸(或dATP、dTTP、dCTP、dGTP)　不需要　(2)农杆菌转化法　T-DNA能主动转移并整合到宿主细胞染色体的DNA分子中　②
(3)植物组织培养　茎尖很少或没有被病毒感染
29．科学家将人的生长激素基因与pBR322质粒进行重组，将得到的重组质粒导入牛的受精卵，再通过细胞工程培育为转基因克隆牛。pBR322质粒含有2个抗生素抗性基因和5个限制酶切点(如图2)。请据图回答问题：
(1)图1中显示的人的生长激素基因是通过人工合成的，图中①过程需要的酶是_____________。该过程所依据的碱基互补配对原则是____________________________(用字母和箭头表示)。
(2)图1中的mRNA是从人体的____________细胞中获取的。
(3)重组质粒形成与否需要鉴定和筛选，方法是将重组质粒的DNA分子导入大肠杆菌，通过含抗生素的培养基进行培养，观察大肠杆菌的生长、繁殖情况进行判断。如图3所示：
①如果受体菌在培养基A上能生长、繁殖形成菌落，而不能在培养基B上生长、繁殖，则使用限制酶a的切点是图2中的___________________，即目的基因插入了_____________________中。
②如果受体菌在培养基A上不能生长、繁殖形成菌落，而在培养基B上能生长、繁殖，则使用限制酶a的切点是图2中的_________，即目的基因插入了______________中。
③如果受体菌在培养基A和培养基B上都能生长、繁殖形成菌落，则使用限制酶a的切点是图2中的_________。
【答案】(1)逆转录酶　A→T、U→A、G→C、C→G
(2)垂体　(3)①切点3或切点4或切点5　 抗四环素基因　②切点1　　抗氨苄青霉素基因　③切点2
【考向解读】
1.基因工程的诞生(Ⅰ)
2.基因工程的原理及技术(Ⅱ)
3.基因工程的应用(Ⅱ)
4.蛋白质工程(Ⅰ)
5.植物的组织培养(Ⅱ)
6.动物的细胞培养与体细胞克隆(Ⅰ)
7.细胞融合与单克隆抗体(Ⅱ)
8.动物胚胎发育的基本过程与胚胎工程的理论基础(Ⅰ)
9.胚胎干细胞的移植(Ⅰ)
10.胚胎工程的应用(Ⅱ)
11.转基因生物的安全性(Ⅰ)
12.生物武器对人类的威胁(Ⅰ)
13.生物技术中的伦理问题(Ⅰ)
14.简述生态工程的原理(Ⅱ)
15.生态工程的实例(Ⅰ)
高频考点：基因工程的原理、操作步骤及操作工具；动物的细胞培养与体细胞克隆、
胚胎移植的基本技术、过程及其应用
中频考点：植物组织培养与植物体细胞杂交的原理及应用、胚胎干细胞的移植及其应用
低频考点：蛋白质工程及应用、结合生态系统的知识考查生态工程的原理
【命题热点突破一】综合考查基因工程的原理及应用
1．目的基因应插入启动子与终止子之间的部位。
2．将目的基因导入受体细胞没有碱基互补配对现象。
3．原核生物作为受体细胞的优点：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少。
4．一般情况下，用同一种限制酶切割质粒和含有目的基因的片段，但有时可用两种限制酶分别切割质粒和目的基因，以避免质粒和质粒之间、目的基因和目的基因之间的连接。
5．标记基因的作用——筛选、检测目的基因是否导入受体细胞。
6．受体细胞常用植物受精卵或体细胞(经组织培养)、动物受精卵(一般不用体细胞)、微生物(大肠杆菌、酵母菌)等。
7．启动子(DNA片段)≠起始密码子(RNA)；终止子(DNA片段)≠终止密码子(RNA)。
例1．（2017年北京卷，5）为了增加菊花花色类型，研究者从其他植物中克隆出花色基因C（图1），拟将其与质粒（图2）重组，再借助农杆菌导入菊花中。
　　　　　
下列操作与实验目的不符的是（　　）
A．用限制性核酸内切酶EcoRI和连接酶构建重组质粒
B．用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织，将C基因导入细胞
C．在培养基中添加卡那霉素，筛选被转化的菊花细胞
D．用分子杂交方法检测C基因是否整合到菊花染色体上
【答案】C
【变式探究】（2016新课标Ⅲ卷.40）图（a）中的三个DNA片段上依次表示出了EcoR I、BamH I和Sau3A I三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图（b）为某种表达载体示意图（载体上的EcoR I、Sau3A I的切点是唯一的）。
根据基因工程的有关知识，回答下列问题：
（1）经BamH I酶切割得到的目的基因可以与上述表达载体被____________酶切后的产物连接，理由是____________。
（2）若某人利用图（b）所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图（c）所示。这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有____________，不能表达的原因是____________。
（3）DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有____________和____________，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是____________。
【答案】（1）Sau3AⅠ 两种梅切割后产生的片段具有相同的黏性末端
（2）甲和丙 甲中目的基因插入在启动子的上游， 丙中目的基因插入在终止子的下游，两者目的基因均不能转录
（3）E·coliDNA连接酶 T4DNA连接酶 T4DNA连接酶
【变式探究】(2015·广东高考)下图为培育转基因山羊生产人β-酪蛋白的流程图。
下列叙述正确的是(　　)
A．过程①所用的人β-酪蛋白基因可从人cDNA文库中获得
B．过程②可选用囊胚期或原肠胚期的胚胎进行移植
C．过程③可使用胚胎分割技术扩大转基因山羊群体
D．过程④人β-酪蛋白基因只能在细胞核内进行转录、翻译
【答案】　A
【变式探究】
(2015·全国卷Ⅰ)HIV属于逆转录病毒，是艾滋病的病原体。回答下列问题：
(1)用基因工程方法制备HIV的某蛋白(目的蛋白)时，可先提取HIV中的________，以其作为模板，在________的作用下合成________，获取该目的蛋白的基因，构建重组表达载体，随后导入受体细胞。
(2)从受体细胞中分离纯化出目的蛋白，该蛋白作为抗原注入机体后，刺激机体产生的可与此蛋白结合的相应分泌蛋白是________，该分泌蛋白可用于检测受试者血清中的HIV，检测的原理是__________________________________。
(3)已知某种菌导致的肺炎在健康人群中罕见，但是在艾滋病患者中却多发。引起这种现象的根本原因是HIV主要感染和破坏了患者的部分________细胞，降低了患者免疫系统的防卫功能。
(4)人的免疫系统有________癌细胞的功能。艾滋病患者由于免疫功能缺陷，易发生恶性肿瘤。
【解析】　(1)HIV的遗传物质是RNA，所以要想获得相应的目的基因，应以HIV的RNA为模板，在逆转录酶的作用下合成cDNA(或DNA)。
(2)目的蛋白注入机体后相当于抗原。在抗原的刺激下，机体进行体液免疫，由浆细胞产生相应抗体(分泌蛋白)，由于该抗体能与目的蛋白(抗原)发生特异性结合，所以可通过抗体检测出有无目的蛋白，从而确定体内有无HIV。
(3)HIV主要攻击人体的T(或T淋巴)细胞，从而降低机体免疫系统的防卫功能。
(4)癌细胞在机体中属于抗原，人体的免疫系统能够监控和清除癌细胞。
【答案】　(1)RNA　逆转录酶　cDNA(或DNA)　(2)抗体　抗原抗体特异性结合　(3)T(或T淋巴)　(4)监控和清除
【命题热点突破二】综合考查蛋白质工程的原理及应用
基因工程和蛋白质工程的比较
比较项目
基因工程
蛋白质工程
原理
基因重组
中心法则的逆转
区别
过程
获取目的基因―→构建表达载体―→导入受体细胞―→目的基因的检测与鉴定
预期蛋白质功能―→设计预期的蛋白质结构―→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列―→合成DNA―→表达出蛋白质
区别
实质
定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需要的生物类型或生物产品(基因的异体表达)
定向改造或生产人类所需要的蛋白质
结果
生产自然界中已经有的蛋白质
生产自然界中没有的蛋白质
联系
蛋白质工程是在基因工程的基础上延伸出来的第二代基因工程，对现有蛋白质的改造或制造新的蛋白质必须通过基因修饰或基因合成来实现
例2、 （2016天津卷.7） (12分)人血清白蛋白(HSA) 具有重要的医用价值，只能从血浆中制备。下图是以基因工程技术获取重组HSA（rHSA）的两条途径。
（1）获取HSA基因，首先需采集人的血液，提取_____________合成总cDNA，然后以cDNA为模板，采用PCR技术扩增HSA基因。下图中箭头表示一条引物结合模板的位置及扩增方向，请用箭头在方框内标出标出另一条引物的位置及扩增方向。

（2）启动子通常具有物种及组织特异性，构建在水稻胚乳细胞内特异表达rHSA的载体，需要选择的启动子是_____________（填写字母，单选）。
A.人血细胞启动子 B.水稻胚乳细胞启动子 C.大肠杆菌启动子 D.农杆菌启动子
（3）利用农杆菌转化水稻受体细胞的过程中，需添加酚类物质，其目的是__________________________。
（4）人体合成的初始HSA多肽，需要经过膜系统加工形成正确的空间结构才能有活性。与途径II相比，选择途径I获取rHSA的优势是_______________________________________。
（5）为证明rHSA具有医用价值，须确认rHSA与_________________的生物学功能一致。
【答案】（12分）（1）总RNA （或mRNA）
（2）B
（3）吸引农杆菌移向水稻受体细胞，有利于目的基因成功转化
（4）水稻是真核生物，具有膜系统，能对初始rHSA多肽进行高效加工
（5）HAS
【变式探究】(2015·全国卷Ⅱ)已知生物体内有一种蛋白质(P)，该蛋白质是一种转运蛋白，由305个氨基酸组成。如果将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸，240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸，改变后的蛋白质(P1)不但保留P的功能，而且具有了酶的催化活性。回答下列问题：
(1)从上述资料可知，若要改变蛋白质的功能，可以考虑对蛋白质的________进行改造。
(2)以P基因序列为基础，获得P1基因的途径有修饰________基因或合成________基因。所获得的基因表达时是遵循中心法则的，中心法则的全部内容包括________的复制，以及遗传信息在不同分子之间的流动，即：__________________________________________________________________。
(3)蛋白质工程也被称为第二代基因工程，其基本途径是从预期蛋白质功能出发，通过________和________，进而确定相对应的脱氧核苷酸序列，据此获得基因，再经表达、纯化获得蛋白质，之后还需要对蛋白质的生物________进行鉴定。
【答案】　(1)氨基酸序列(或结构)(其他合理答案也可)
(2)P　P1　DNA和RNA(或遗传物质)　DNA→RNA、RNA→DNA、RNA→蛋白质(或转录、逆转录、翻译)
(3)设计蛋白质的结构　推测氨基酸序列　功能
【命题热点突破三】植物细胞工程及应用
有关植物细胞工程的几个关键问题
1．植物细胞A和植物细胞B杂交获得的杂种细胞的类型有三种：AA型、BB型、AB型，符合要求的只有AB型，需要进行筛选。
2．杂种细胞形成的标志：新的细胞壁的生成。
3．杂种植株遗传物质的变化：杂种植株的变异类型属于染色体变异，杂种植株的染色体数通常是两亲本细胞染色体数目之和，杂种植株属于异源多倍体。
4．植物组织培养时植物激素和光照的使用
(1)植物激素的使用
脱分化阶段细胞分裂素比例较高，以促进细胞的分裂；再分化阶段生长素比例较高，以促进芽与根的形成。
(2)光照的使用
脱分化阶段不需要给予光照，再分化阶段需要给予光照，以利于叶绿素的形成。
例3．（2016海南卷.31）基因工程又称为DNA重组技术，回答相关问题：
（1）在基因工程中，获取目的基因主要有两大途径，即______和从_______中分离。
（2）利用某植物的成熟叶片为材料，同时构建cDNA文库和基因组文库，两个文库相比，cDNA文库中含有的基因数目比基因组文库中的少，其原因是______。
（3）在基因表达载体中，启动子是______聚合酶识别并结合的部位。若采用原核生物作为基因表达载体的受体细胞，最常用的原核生物是______。
（4）将目的基因通过基因枪法导入植物细胞时，常用的携带目的基因的金属颗粒有_____和______颗粒。
【答案】（15分）
（1）人工合成 生物材料（每空2分，共4分，其他合理答案可酌情给分）
（2）cDNA文库中只含有叶细胞已转录（或已表达）的基因，而基因组文库中含有该植物的全部基因（5分，其他合理答案可酌情给分）
（3）RNA（2分） 大肠杆菌（或答细菌）（2分）
（4）金粉 钨粉（每空1分，共2分）
【变式探究】
植物细胞工程包括植物组织培养和植物细胞杂交等技术。植物组织培养是克隆植物的一种方法，回答相关问题：
(1)植物组织培养依据的生物学原理是植物细胞的全能性，在一定的________等条件下，植物细胞可以脱分化形成愈伤组织，将愈伤组织转接到含有________成分的培养基上，就可以诱导其________生成胚状体或丛芽。
(2)植物组织培养过程需要植物生长和繁殖的最适条件，否则在光学显微镜下可观察到发生________异常，进而使植株出现遗传不稳定或不育。
(3)在植物组织培养过程中，愈伤组织的成功诱导至关重要，科学家研究了植物生长调节剂对某药用植株愈伤组织的影响，实验结果如下表：
培养基代号
2，4-D/mg·L－1
6-BA/mg·L－1
愈伤组织诱导率/%
L1
1.0
0
65.41
L2
2.0
0
68.76
L3
3.0
0
91.01
L4
3.0
0.2
54.48
L5
3.0
0.5
57.35
L6
3.0
1.0
51.71
注：愈伤组织诱导率(%)＝产生愈伤组织的外植体数/接种外植体总数×100%
①诱导形成愈伤组织________(填“需要”或“不需要”)光照的条件。
②从上表可以得出的结论是______________________________________
______________________________________________________________。
(4)植物体细胞杂交技术的关键环节有____________________________、__________________和植物组织培养。
【答案】　(1)营养和激素　不同激素　再分化　(2)染色体(数目或结构)　(3)①不需要　②在基本培养基中添加较高浓度的2，4-D有利于形成愈伤组织，而添加6-BA则不利于形成愈伤组织　(4)用酶解法(纤维素酶和果胶酶)去除细胞壁，获得有活力的原生质体　(诱导)原生质体间的融合
【命题热点突破四】动物细胞工程及应用
有关动物细胞工程的答题要素
1．动物细胞培养：
(1)培养基的特有成分：动物血清。
(2)培养过程：原代培养、传代培养。
(3)制备悬液的酶：胰蛋白酶或胶原蛋白酶。
2．未受精卵细胞作细胞核移植受体细胞的理由：
(1)营养丰富。
(2)体积大，易操作。
(3)含有刺激已分化的细胞核恢复分裂能力的物质。
3．单克隆抗体制备中2次筛选目的不同：
(1)第1次：得到既能分泌抗体又能大量增殖的杂交瘤细胞。
(2)第2次：筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞。
4．克隆动物的4种技术手段：
动物细胞培养、核移植、早期胚胎培养和胚胎移植。
5．相比植物体细胞杂交，动物细胞融合特有的诱导方法是用灭活的病毒处理，其他物理、化学诱导融合的手段与植物体细胞杂交过程中原生质体诱导融合的方法相同。
例4．（2017年江苏卷，11）牛雄性胚胎中存在特异性H-Y 抗原，可在牛早期胚胎培养液中添加H-Y 单克隆抗体，筛选胚胎进行移植，以利用乳腺生物反应器进行生物制药。下列相关叙述正确的是（　　）
A．H-Y 单克隆抗体由骨髓瘤细胞分泌 B．应选用原肠胚做雌雄鉴别
C．鉴别后的雄性胚胎可直接做胚胎移植 D．用H-Y 抗原免疫母牛可获得相应抗体
【答案】D
【变式探究】（2016新课标2卷.40)（15分）下图表示通过核移植等技术获得某种克隆哺乳动物（二倍体）的流程。
回答下列问题：
（1）图中A表示正常细胞核，染色体数为2n，则其性染色体的组成可为____________。过程①表示去除细胞核，该过程一般要在卵母细胞培养至适当时期再进行，去核时常采用_______的方法。②代表的过程是__________。
（2）经过多次传代后，供体细胞中______的稳定性会降低，因此，选材时必须关注传代次数。
（3）若获得的克隆动物与供体动物性状不完全相同，从遗传物质的角度分析其原因是______。
（4）与克隆羊“多莉（利）”培养成功一样，其他克隆动物的成功获得也证明了__________。
【答案】（15分）（1）XX或XY 显微操作（去核法） 胚胎移植
（2）遗传物质
（3）卵母细胞的细胞质中的遗传物质会对克隆动物的形状产生影响
（4）已经分化的动物体细胞核具有全能性。
【变式探究】(2015·天津高考)2015年2月3日，英国议会下院通过一项历史性法案，允许以医学手段培育“三亲婴儿”。三亲婴儿的培育过程可选用如下技术路线。
据图分析，下列叙述错误的是(　　)
A．该技术可避免母亲的线粒体遗传病基因传递给后代
B．捐献者携带的红绿色盲基因不能遗传给三亲婴儿
C．三亲婴儿的染色体全部来自母亲提供的细胞核
D．三亲婴儿的培育还需要早期胚胎培养和胚胎移植等技术
【答案】　C
【变式探究】
单克隆抗体的特点是特异性强、灵敏度高、可以大量制备，已被广泛应用于疾病的诊断和治疗。用H7N9病毒制备单克隆抗体的流程如下图所示：
(1)过程③常用的方法是___________________________________________。
(2)向小鼠体内注射抗原蛋白，使小鼠产生________免疫。从小鼠体内分离的细胞Ⅰ是___________，细胞Ⅱ应具有的特点是______________________。
(3)体外培养细胞Ⅱ，首先应保证其处于________的环境，其次需要提供充足的营养和适宜的温度。培养箱充入二氧化碳的作用是_________________。
(4)对于转基因成功的细胞Ⅱ还要进行克隆化培养和________检测。
(5)若要预防H7N9禽流感，可用图中的______________作为疫苗。
【解析】　(1)基因工程中将目的基因导入动物细胞，常用显微注射法。
(2)向小鼠体内注射了抗原后，刺激小鼠将发生特异性免疫中的体液免疫。从小鼠体内分离出能产生抗体的细胞，即已免疫的B细胞，也称浆细胞。通过基因工程技术导入了无限增殖调控基因后，再经过检测，得到的该细胞既能无限增殖，又能产生特异性抗体。
(3)动物细胞培养需要满足无菌无毒的环境，充足营养和适宜的pH，其中二氧化碳的作用就是维持培养液的pH。
(4)细胞Ⅱ要大量培养，对其产生的抗体进行检测、筛选，以便获得能产生针对H7N9抗原的特定抗体的细胞Ⅱ。
(5)传统的疫苗是脱毒或减毒的病原体，通过图示过程可知，抗原蛋白就可以刺激机体产生相应的特异性免疫，即抗原蛋白可作为预防H7N9禽流感的疫苗。
【答案】　(1)显微注射法　(2)体液(只答特异性不得分)　B细胞(浆细胞或已免疫B细胞)　既能无限增殖，又能产生特异性抗体　(3)无菌、无毒(缺一不得分)　维持培养液的pH　(4)(专一)抗体　(5)抗原蛋白
【命题热点突破五】从胚胎移植的基本程序、生理学基础及应用等角度命题
胚胎移植的几个易错点
1．实质：早期胚胎在相同生理环境条件下空间位置的转换。
2．优势：充分发挥雌性优良个体的繁殖潜能。
3．两次使用激素：
第一次：同期发情处理；
第二次：促性腺激素，供体超数排卵处理。
4．“冲卵”的不同：
①胚胎移植过程冲出的是早期胚胎。
②体外受精过程冲出的是卵子。
5．两次检查：第一次对收集的胚胎进行检查；第二次对受体是否妊娠进行检查。
6．可移植时期：桑椹胚或囊胚。
例5．（2017年江苏卷，14）下列关于小鼠体外受精及胚胎发育的叙述，错误的是（　　）
A．精子在获能液中于37℃、5% CO2条件下培养的目的是使精子获能
B．小鼠在特定光控周期条件下饲养，注射相关激素有促进超数排卵的作用
C．分割的胚胎细胞有相同的遗传物质，因此发育成的个体没有形态学差异
D．注射到囊胚腔中的胚胎干细胞可以参与个体器官的发育
【答案】C
【解析】精子在获能液中于37 ℃、5% CO2条件下培养，可使精子获能，A正确；给小鼠注射促性腺激素可促进其超数排卵，B正确；分割的胚胎细胞具有相同的遗传物质，但发育过程中基因突变或环境因素影响等，最终发育成的个体可能会有形态学差异，C错误；胚胎干细胞具有发育的全能性，能分化成各种组织器官，D正确。
【变式探究】(2016·高考全国甲卷)下图表示通过核移植等技术获得某种克隆哺乳动物(二倍体)的流程。
回答下列问题：
(1)图中A表示正常细胞核，染色体数为2n，则其性染色体的组成可为________。过程①表示去除细胞核，该过程一般要在卵母细胞培养至适当时期再进行，去核时常采用________的方法。②代表的过程是________。
(2)经过多次传代后，供体细胞中________的稳定性会降低。因此，选材时必须关注传代次数。
(3)若获得的克隆动物与供体动物性状不完全相同，从遗传物质的角度分析其原因是
________________________________________________________________________。
(4)与克隆羊“多莉(利)”培育成功一样，其他克隆动物的成功获得也证明了_______。
【答案】(1)XX或XY　显微操作　胚胎移植　(2)遗传物质　(3)卵母细胞的细胞质中的遗传物质会对克隆动物的性状产生影响　(4)动物已分化体细胞的细胞核具有全能性
【变式探究】(2015·重庆高考)某课题组为解决本地种奶牛产奶量低的问题，用A(含高产奶基因但对本地适应性差的纯种公牛)与C(适应性强但产奶量不高的母牛)这样的最佳组合，按以下流程可加速获得优良个体。
(1)精子要具有受精能力，需对其进行________处理；卵子的成熟在过程________中完成。在过程④的培养基中含有葡萄糖，其作用是________。为筛选出具有优良性状的母牛，过程⑤前应鉴定胚胎的________。
(2)为了提高已有胚胎的利用率，可采用________技术。
【答案】　(1)获能或增强活力　③　供能　性别、高产奶和适应生长的基因　(2)胚胎分割
【变式探究】
部分哺乳动物的繁殖能力相对比较低，要提高繁殖能力，可利用胚胎工程。请回答以下问题：
(1)利用胚胎移植快速繁殖一些大型优良雌性哺乳动物的步骤包括：
①对供、受体的选择和处理。对供体的处理方法是________________________，该处理能使供体进行超数排卵。
②配种或人工授精。如受精作用在体外进行，则精子必须进行获能处理，通常采用的方法是________和________。获能后的精子与卵子相互识别后，首先发生________反应，使顶体内的酶释放出来。为防止多精子入卵受精的两道屏障依次________________________________。
③对胚胎的收集、检查、培养或保存。对胚胎进行培养时，所用的培养基为________(填“固体”或“液体”)培养基，其中有一种天然成分，即________________，为了保证被培养的胚胎处于无菌无毒的环境，要在培养基中添加________，并进行灭菌处理。胚胎保存的方法是___________________。
④对胚胎进行移植，以及移植后的检查等步骤。
(2)在培养试管动物和克隆动物时，都需要把卵母细胞培养到______________，所不同的是在培养克隆动物时要对卵母细胞进行______处理。
【解析】　(1)①胚胎移植时，对供体注射促性腺激素可促使其进行超数排卵。
②精子进行获能处理通常采用的方法是培养法和化学诱导法。获能后的精子与卵子相互识别后，首先发生顶体反应，使顶体内的酶释放出来。防止多精入卵受精的两道屏障依次是透明带反应和卵细胞膜反应。
③对胚胎进行培养时，所用的培养基为液体培养基；培养基中除了必要的营养成分，还需要加入一种天然成分，即动物血清或血浆；为了保证被培养的胚胎处于无菌、无毒的环境，要在培养基中添加抗生素，并进行灭菌处理。胚胎保存的方法是在冷冻保存或者－196 ℃的液氮中保存。
(2)在培养试管动物和克隆动物时，都需要把卵母细胞培养到减数第二次分裂中期，所不同的是在培养克隆动物时要对卵母细胞进行去核处理。
【答案】　(1)①注射促性腺激素　②培养法　化学诱导法　顶体　透明带反应和卵细胞膜反应　③液体　动物血清或血浆　抗生素　冷冻保存或者－196 ℃的液氮中保存　(2)减数第二次分裂中期　去核
【命题热点突破六】基因工程、细胞工程及胚胎工程的综合考查
例6．(2015·山东高考)治疗性克隆对解决供体器官缺乏和器官移植后免疫排斥反应具有重要意义。流程如下：
(1)过程①采用的是细胞工程中的________技术，过程②采用的是胚胎工程中的________技术。
(2)体细胞进行体外培养时，所需气体主要有O2和CO2，其中CO2的作用是维持培养液(基)的________。
(3)如果克隆过程中需进行基因改造，在构建基因表达载体(重组载体)时必须使用________和________两种工具酶。基因表达载体上除目的基因外，还需有________基因，以便选出成功导入基因表达载体的细胞。
(4)胚胎干细胞可以来自于囊胚中的________。在一定条件下，胚胎干细胞可以分化形成不同的组织器官。若将图中获得的组织器官移植给个体________(填“A”或“B”)，则不会发生免疫排斥反应。
【答案】　(1)(体细胞)核移植　(早期)胚胎培养　(2)pH(或：酸碱度)　(3)限制性(核酸)内切酶(或：限制酶)　DNA连接酶(注：两空可颠倒)　标记　(4)内细胞团　B
【变式探究】
组织型纤溶酶原激活剂(tPA)在人体纤溶和凝血的平衡调节中发挥着关键性的作用，如图是利用奶牛乳汁生产组织型纤溶酶原激活剂(tPA)的图解，据图回答下列问题：
(1)过程①在构建的基因表达载体中，应将tPA基因首端与________________基因的启动子等调控组件结合，③过程常用的方法是____________________。
(2)要获得单个成纤维细胞，过程②需用________处理奶牛胎儿皮肤组织块。在单个组织细胞的培养过程中，为了防止杂菌污染，通常还要在细胞培养液中添加一定量的____________。
(3)成功进入成纤维细胞的tPA基因，最终在转基因牛C中维持稳定和表达的过程称为________，④涉及到的生物技术为________，得到的转基因牛C称之为转基因克隆动物。
(4)从A到B过程中所用的胚胎工程技术是________。从个体水平上看，若____________________________，则可确定转基因牛培育成功。
【答案】　(1)乳腺蛋白　显微注射法　(2)胰蛋白酶或胶原蛋白酶(只答一个也得分)　抗生素　(3)转化　细胞核移植技术　(4)早期胚胎培养　转基因牛的乳汁中分泌组织型纤溶酶原激活剂(tPA)
【命题热点突破七】从生态工程的原理及应用等方面进行考查
生态工程设计的常用方法
1．生态工程设计的常用方法之一是食物链(网)的“相接”。例如，在稻田养鱼的农业生态工程中，鱼与稻原属于不同生态系统的食物链(网)，但在人为调控下，将一些草食性鱼、滤食性鱼和杂食性鱼(如草鱼、鲢鱼和罗非鱼等)的鱼苗放养在稻田中，使稻田生态系统的结构有所改变，物质循环和能量流动更为合理。这表现在鱼类摄食杂草，减少了杂草在阳光、养分方面与水稻的竞争；鱼粪中含有丰富的氮、磷，增加了水稻的肥源；滤食性和杂食性鱼能摄食稻田中的浮游生物、底栖动物等。
2．生态工程设计的常用方法之二是食物链(网)的“加环”。“加环”可为未被利用的部分找到出路。例如，用玉米的副产品玉米芯生产木糖醇等，其残余物用来培养食用菌，栽培食用菌后的残余物再用来养殖蛆蛹，蛆蛹粪再作为优良有机肥还田等。
例7、柴静的纪录片《穹顶之下》引发了全国人民对雾霾的关注和讨论。生态环境与生态经济再次推上舆论的焦点。建设社会主义新农村的关键是构建和谐社会，发展生态农业，走可持续发展之路。下图为某地一生态工程建设模式图，请据图回答有关问题：
(1)生态经济：使一个系统产出的污染物，能够成为本系统或另一个系统的生产原料，从而实现废弃物的资源化。“无废弃物农业”体现了生态工程的________________原理。
(2)该生态工程模式的最大优点是________________________。该生态工程种植不同的农作物、果树、苗木，饲养牛、猪、鸡等多种畜禽，这体现了生态工程的________________原理。
(3)该生态工程中，处于第二营养级的生物除鸡、奶牛、鱼外还有________(写全才能给分)，该生态工程建设中，鱼塘中每一种鱼苗的投放量都不宜超过其________。
【解析】　(1)无废弃物农业体现的是物质循环再生原理。
(2)以沼气工程为中心的生态工程，各类植物的秸秆、枝叶用来生产饲料养畜、禽、鱼，人、畜、禽的粪便作为原料生产沼气，最大的优点是充分利用了废弃物中的物质和能量，实现了物质和能量的分级多层次利用，同时又减少了环境污染。生态工程中，适当增加农作物、饲养畜禽等生物种类，使生态系统营养结构复杂，自我调节能力增强，抵抗力稳定性增加，这体现了生态工程的物种多样性原理。
(3)读图可知，处于第二营养级的生物除鸡、奶牛、鱼外还有猪、人。鱼塘中养鱼时要考虑环境容纳量，投放的鱼苗量不能太多。
【答案】　(1)物质循环再生　(2)实现能量和物质的分层次多级利用(或提高物质和能量的利用率)，减少环境污染　物种多样性　(3)猪、人　环境容纳量(K值)
【变式探究】
我国珠江三角洲地区，为充分利用土地，创造了一种挖深鱼塘、垫高基田、塘基植桑、塘内养鱼的高效人工生态系统——桑基鱼塘，如图所示。据图回答有关问题。
(1)生态工程遵循的基本原理有________、________、________、整体性原理和系统学与工程学原理等。
(2)该生态工程能将蚕沙、蔗叶、滤泥等变成鱼类的饵料，塘泥中的微生物能将有机物转化成无机物，为甘蔗、桑树的光合作用提供无机营养，这一过程不但实现了废弃物的________________，而且体现了________________的“循环经济”原则。
(3)蚕沙是蚕食桑叶后排泄出来的粪便，蚕沙富含粗蛋白质、粗脂肪、粗纤维等营养物质，是上等的肥料，也是猪、鱼、羊的理想饲料。某种鱼专以蚕沙为食，假设某一时间段蚕从上一个营养级固定的能量为1.5×105 kJ，那么这部分能量最多有________kJ被这种鱼所同化。
(4)该生态系统向外输出的物质主要有___________________________
___________________________________________________________。
(5)该生态系统与一般的自然生态系统相比较，________________稳定性较低，所以需要人们不断输入物质与能量。
(6)桑基鱼塘的生产方式与改造前的传统耕作方式比较，主要的优点有________________________________________________________(至少答2点)。
【答案】　(1)物质循环再生原理　物种多样性原理　协调与平衡原理　(2)资源化　生态经济　(3)0　(4)蚕丝、鱼、糖等　(5)抵抗力　(6)减轻水患、提高经济效益、减少环境污染等(答案合理即可)
【高考真题解读】
1．（2017年江苏卷，11）牛雄性胚胎中存在特异性H-Y 抗原，可在牛早期胚胎培养液中添加H-Y 单克隆抗体，筛选胚胎进行移植，以利用乳腺生物反应器进行生物制药。下列相关叙述正确的是（　　）
A．H-Y 单克隆抗体由骨髓瘤细胞分泌 B．应选用原肠胚做雌雄鉴别
C．鉴别后的雄性胚胎可直接做胚胎移植 D．用H-Y 抗原免疫母牛可获得相应抗体
【答案】D
2．（2017年新课标Ⅱ卷，38）几丁质是许多真菌细胞壁的重要成分，几丁质酶可催化几丁质水解。通过基因工程将几丁质酶基因转入植物体内，可增强其抗真菌病的能力。回答下列问题：
（1）在进行基因工程操作时，若要从植物体中提取几丁质酶的mRNA，常选用嫩叶而不选用老叶作为实验材料，原因是__________________________。提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是__________________________。
（2）以mRNA为材料可以获得cDNA，其原理是__________________________。
（3）若要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是__________________________（答出两点即可）。
（4）当几丁质酶基因和质粒载体连接时，DNA连接酶催化形成的化学键是__________________________。
（5）若获得的转基因植株（几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中）抗真菌病的能力没有提高，根据中心法则分析，其可能的原因是__________________________。
【答案】（1）嫩叶组织细胞易破碎 防止RNA降解
（2）在逆转录酶的作用下，以mRNA为模板按照碱基互补配对的原则可以合成cDNA
（3）目的基因无复制原点；目的基因无表达所需启动子
（4）磷酸二酯键
（5）目的基因的转录或翻译异常
【解析】（1）在进行基因工程操作时，若要从植物体中提取几丁质酶的mRNA，常选用嫩叶而不选用老叶作为实验材料，原因是嫩叶组织细胞易破碎。提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是防止RNA降解。（2）以mRNA为材料可以获得cDNA，其原理是在逆转录酶的作用下，以mRNA为模板按照碱基互补配对的原则可以合成cDNA。（3）若要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是目的基因无复制原点、目的基因无表达所需启动子。（4）当几丁质酶基因和质粒载体连接时，DNA连接酶催化形成的化学键是磷酸二酯键。（5）若获得的转基因植株（几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中）抗真菌病的能力没有提高，根据中心法则分析，其可能的原因是目的基因的转录或翻译异常。
3．（2017年北京卷，5）为了增加菊花花色类型，研究者从其他植物中克隆出花色基因C（图1），拟将其与质粒（图2）重组，再借助农杆菌导入菊花中。
　　　　　
下列操作与实验目的不符的是（　　）
A．用限制性核酸内切酶EcoRI和连接酶构建重组质粒
B．用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织，将C基因导入细胞
C．在培养基中添加卡那霉素，筛选被转化的菊花细胞
D．用分子杂交方法检测C基因是否整合到菊花染色体上
【答案】C
4．（2017年新课标Ⅲ卷，38）编码蛋白甲的DNA序列（序列甲）由A、B、C、D、E五个片段组成，编码蛋白乙和丙的序列由序列甲的部分片段组成，如图1所示。
　　　　
回答下列问题：
（1）现要通过基因工程的方法获得蛋白乙，若在启动子的下游直接接上编码蛋白乙的DNA序列（TTCGCTTCT……CAGGAAGGA），则所构建的表达载体转入宿主细胞后不能翻译出蛋白乙，原因是_____________________________________。
（2）某同学在用PCR技术获取DNA片段B或D的过程中，在PCR反应体系中加入了DNA聚合酶、引物等，还加入了序列甲作为_____________________，加入了________________作为合成DNA的原料。
（3）现通过基因工程方法获得了甲、乙、丙三种蛋白，要鉴定这三种蛋白是否具有刺激T淋巴细胞增殖的作用，某同学做了如下实验：将一定量的含T淋巴细胞的培养液平均分成四组，其中三组分别加入等量的蛋白甲、乙、丙，另一组作为对照，培养并定期检测T淋巴细胞浓度，结果如图2。
①由图2 可知，当细胞浓度达到a时，添加蛋白乙的培养液中T淋巴细胞浓度不再增加，此时若要使T淋巴细胞继续增殖，可采用的方法是__________________。细胞培养过程中，培养箱中通常要维持一定的CO2浓度，CO2的作用是__________________。
②仅根据图、图2可知，上述甲、乙、丙三种蛋白中，若缺少______________（填“A”“B”“C”“D”或“E”）片段所编码的肽段，则会降低其刺激T淋巴细胞增殖的效果。
【答案】（1）编码乙的DNA序列起始端无ATG，转录出的mRNA无起始密码子
（2）模板 dNTP
（3）①进行细胞传代培养 维持培养液是的pH ② C
1．（2017年江苏卷，14）下列关于小鼠体外受精及胚胎发育的叙述，错误的是（　　）
A．精子在获能液中于37℃、5% CO2条件下培养的目的是使精子获能
B．小鼠在特定光控周期条件下饲养，注射相关激素有促进超数排卵的作用
C．分割的胚胎细胞有相同的遗传物质，因此发育成的个体没有形态学差异
D．注射到囊胚腔中的胚胎干细胞可以参与个体器官的发育
【答案】C
【解析】精子在获能液中于37 ℃、5% CO2条件下培养，可使精子获能，A正确；给小鼠注射促性腺激素可促进其超数排卵，B正确；分割的胚胎细胞具有相同的遗传物质，但发育过程中基因突变或环境因素影响等，最终发育成的个体可能会有形态学差异，C错误；胚胎干细胞具有发育的全能性，能分化成各种组织器官，D正确。
1.（2016江苏卷.33）（9分）下表是几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中标注了相关限制酶的酶切位点，其中切割位点相同的酶不重复标注。请回答下列问题：
（1）用图中质粒和目的基因构建重组质粒，应选用______两种限制酶切割，酶切后的载体和目的基因片段，通过__________酶作用后获得重组质粒。为了扩增重组质粒，需将其转入处于__________________态的大肠杆菌。
（2）为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加__________，平板上长出的菌落，常用PCR鉴定，所用的引物组成为图2中_____________。
（3）若BamH I酶切的DNA末端与Bcl I酶切的DNA末端连接，连接部位的6个碱基对序列为 ，对于该部位，这两种酶 （填“都能”、“都不能”或“只有一种能”）切开。
（4）若用Sau3A I切图1质粒最多可能获得 种大小不同的DNA片段。
【答案】（1）BclI和HindⅢ 连接 感受 （2）四环素 引物甲和引物丙
（3） 都不能 （4）7
【解析】（1）选择的限制酶应在目的基因两端存在识别位点，但BamHI可能使质粒中启动子丢失，因此只能选BclI和HindⅢ。酶切后的载体和目的基因片段，通过DNA连接酶作用后获得重组质粒。为了扩增重组质粒，需将其转入处于感受态的大肠杆菌。
（2）为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，根据质粒上的抗性基因，应在筛选平板培养基中添加四环素。PCR技术要求两种引物分别和目的基因的两条单链结合，沿相反的方向合成子链。
（3）根据BamHI和Bcl I的酶切位点，BamHI酶切的DNA末端与Bcl I酶切的DNA末端连接，连接部位的6个碱基对序列为，与两种酶的酶切位点均不同。
（4）根据BamH、Bcl I和Sau3A I的酶切位点，Sau3A I在质粒上有三个酶切位点，完全酶切可得到记为A、B、C三种片段，若部分位点被切开，可得到AB、AC、BC、ABC四种片段，所以用Sau3A I切图1质粒最多可能获得7种大小不同的DNA片段。
【考点定位】基因工程，限制酶，连接酶，重组质粒
2.（2016课标1卷.40）某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活（Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因）。有人将此质粒载体用BamHI酶切后，与用BamHI酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：

（1）质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有______________（答出两点即可）。
而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。
（2）如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含有环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是______________；并且______________和______________的细胞也是不能区分的，其原因是_____________。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落，还需使用含有是_____________的固体培养基。
（3）基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自于_____________
【答案】（1）能够自我复制、具有标记基因、具有一个至多个限制酶切割位点（答出两点即可）
（2）二者均不含氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上都不能生长 含有质粒载体 含有插入了目的基因的重组质粒（或答含有重组质粒） 二者都含氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长 四环素
（3）受体细胞
【解析】（1）质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有：能够自我复制、具有标记基因、具有一个至多个限制酶切割位点等。
（2）依题意可知，目的基因插入后，导致四环素抗性基因（Tetr ）失活，而氨苄青霉素抗性基因（Ampr）仍能行使正常功能。如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含有环状目的基因的细胞，因二者均不含氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上都不能生长，所以是不能区分的；含有质粒载体和含有插入了目的基因的重组质粒的细胞，因二者都含氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上都能生长，因此也是不能区分的。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落，还需使用含有四环素的固体培养基；因目的基因插入后，导致四环素抗性基因（Tetr ）失活，含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌在该培养基中不能生长，而含有质粒载体的则能正常生长。
（3）噬菌体是专门寄生在细菌细胞中的病毒，在侵染细菌时，噬菌体的DNA进入到细菌细胞中，而蛋白质外壳仍留在细胞外；在噬菌体的DNA的指导下，利用细菌细胞中的物质来合成噬菌体的组成成分，据此可推知：基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自于受体细胞。
【考点定位】基因工程
3.（2016新课标Ⅲ卷.40）图（a）中的三个DNA片段上依次表示出了EcoR I、BamH I和Sau3A I三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图（b）为某种表达载体示意图（载体上的EcoR I、Sau3A I的切点是唯一的）。
根据基因工程的有关知识，回答下列问题：
（1）经BamH I酶切割得到的目的基因可以与上述表达载体被____________酶切后的产物连接，理由是____________。
（2）若某人利用图（b）所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图（c）所示。这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有____________，不能表达的原因是____________。
（3）DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有____________和____________，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是____________。
【答案】（1）Sau3AⅠ 两种梅切割后产生的片段具有相同的黏性末端
（2）甲和丙 甲中目的基因插入在启动子的上游， 丙中目的基因插入在终止子的下游，两者目的基因均不能转录
（3）E·coliDNA连接酶 T4DNA连接酶 T4DNA连接酶
【考点定位】基因工程的原理及技术
4.（2016天津卷.7） (12分)人血清白蛋白(HSA) 具有重要的医用价值，只能从血浆中制备。下图是以基因工程技术获取重组HSA（rHSA）的两条途径。
（1）获取HSA基因，首先需采集人的血液，提取_____________合成总cDNA，然后以cDNA为模板，采用PCR技术扩增HSA基因。下图中箭头表示一条引物结合模板的位置及扩增方向，请用箭头在方框内标出标出另一条引物的位置及扩增方向。

（2）启动子通常具有物种及组织特异性，构建在水稻胚乳细胞内特异表达rHSA的载体，需要选择的启动子是_____________（填写字母，单选）。
A.人血细胞启动子 B.水稻胚乳细胞启动子 C.大肠杆菌启动子 D.农杆菌启动子
（3）利用农杆菌转化水稻受体细胞的过程中，需添加酚类物质，其目的是__________________________。
（4）人体合成的初始HSA多肽，需要经过膜系统加工形成正确的空间结构才能有活性。与途径II相比，选择途径I获取rHSA的优势是_______________________________________。
（5）为证明rHSA具有医用价值，须确认rHSA与_________________的生物学功能一致。
【答案】（12分）（1）总RNA （或mRNA）
（2）B
（3）吸引农杆菌移向水稻受体细胞，有利于目的基因成功转化
（4）水稻是真核生物，具有膜系统，能对初始rHSA多肽进行高效加工
（5）HAS
【考点定位】基因工程
5.（2016新课标2卷.40)（15分）下图表示通过核移植等技术获得某种克隆哺乳动物（二倍体）的流程。
回答下列问题：
（1）图中A表示正常细胞核，染色体数为2n，则其性染色体的组成可为____________。过程①表示去除细胞核，该过程一般要在卵母细胞培养至适当时期再进行，去核时常采用_______的方法。②代表的过程是__________。
（2）经过多次传代后，供体细胞中______的稳定性会降低，因此，选材时必须关注传代次数。
（3）若获得的克隆动物与供体动物性状不完全相同，从遗传物质的角度分析其原因是______。
（4）与克隆羊“多莉（利）”培养成功一样，其他克隆动物的成功获得也证明了__________。
【答案】（15分）（1）XX或XY 显微操作（去核法） 胚胎移植
（2）遗传物质
（3）卵母细胞的细胞质中的遗传物质会对克隆动物的形状产生影响
（4）已经分化的动物体细胞核具有全能性。
【考点定位】核移植技术、动物细胞培养技术、胚胎移植
6.（2016海南卷.31）基因工程又称为DNA重组技术，回答相关问题：
（1）在基因工程中，获取目的基因主要有两大途径，即______和从_______中分离。
（2）利用某植物的成熟叶片为材料，同时构建cDNA文库和基因组文库，两个文库相比，cDNA文库中含有的基因数目比基因组文库中的少，其原因是______。
（3）在基因表达载体中，启动子是______聚合酶识别并结合的部位。若采用原核生物作为基因表达载体的受体细胞，最常用的原核生物是______。
（4）将目的基因通过基因枪法导入植物细胞时，常用的携带目的基因的金属颗粒有_____和______颗粒。
【答案】（15分）
（1）人工合成 生物材料（每空2分，共4分，其他合理答案可酌情给分）
（2）cDNA文库中只含有叶细胞已转录（或已表达）的基因，而基因组文库中含有该植物的全部基因（5分，其他合理答案可酌情给分）
（3）RNA（2分） 大肠杆菌（或答细菌）（2分）
（4）金粉 钨粉（每空1分，共2分）
【考点定位】基因工程
7.（2016上海卷.九）回答下列有关遗传信息传递与表达的问题。
在图27所示的质粒PZHZ11（总长为3.6kb，1kb=1000对碱基因）中，lacZ基因编码β-半乳糖苷酶，后者催化生成的化合物能将白色的大肠杆菌染成蓝色。
68.若先用限制酶BamHI切开pZHZ11，然后灭活BamHI酶，再加DNA连接酶进行连接，最后将连接物导入足够数量的大肠杆菌细胞中，则含3.1kb质粒的细胞颜色为；含3.6kb质粒的细胞颜色为。
69.若将两端分别用限制酶BamHI和BglHI切开的单个目的基因片段置换pZHZ11中0.5kb的BamHI酶切片段，形成4.9kb的重组质粒，则目的基因长度为kb。
70.上述4.9kb的重组质粒有两种形式，若用BamHI和EcoRI联合酶切其中一种，只能获得1.7kb和3.2kb两种DNA片段；那么联合酶切同等长度的另一种重组质粒，则可获得
kb和kb两种DNA片段。
71.若将人的染色体DNA片段先导入大肠杆菌细胞中克隆并鉴定目的基因，然后再将获得的目的基因转入植物细胞中表达，最后将产物的药物蛋白注入小鼠体内观察其生物功能是否发挥，那么上述过程属于。
A.人类基因工程 B.动物基因工程 C.植物基因工程 D.微生物基因工程
【答案】68.白色 白色和蓝色/白色或蓝色
69.1.8
70.1.4 3.5
71.C
【考点定位】基因工程
8．(2016·江苏单科，11，2分)印度沙漠猫是一种珍稀猫科动物，通过胚胎工程技术，可以让家猫代孕而繁育，主要步骤如图所示。下列相关叙述正确的是(　　)
A．步骤甲、乙分别是指精子获能、胚胎分割
B．诱导超数排卵所注射的激素只能作用于特定细胞
C．受精卵发育成早期胚胎所需营养主要来源于营养液
D．步骤甲使用的培养液和早期胚胎培养液成分基本相同
【答案】B　
【解析】步骤甲为体外受精，乙为胚胎移植，A错误；诱导超数排卵所注射的激素是促性腺激素，只能作用于卵巢细胞，B正确；受精卵发育成早期胚胎所需营养主要来源于卵黄，而不是外界营养液，C错误；步骤甲使用的培养液通常是专用的受精溶液，以利于完成受精，而早期胚胎培养液成分则比较复杂，二者的成分差别较大，D错误。
1.(2015·重庆卷，6)下列有关人胰岛素基因表达载体的叙述，正确的是(　　)
A.表达载体中的胰岛素基因可通过人肝细胞mRNA反转录获得
B.表达载体的复制和胰岛素基因的表达均启动于复制原(起)点
C.借助抗生素抗性基因可将含胰岛素基因的受体细胞筛选出来
D.启动子和终止密码子均在胰岛素基因的转录中起作用
【答案】C
2.(2015·江苏卷，33)荧光原位杂交可用荧光标记的特异DNA片段为探针，与染色体上对应的DNA片段结合，从而将特定的基因在染色体上定位。请回答下列问题：
图1
图2
(1)DNA荧光探针的制备过程如图1所示，DNA酶Ⅰ随机切开了核苷酸之间的________键从而产生切口，随后在DNA聚合酶Ⅰ作用下，以荧光标记的________为原料，合成荧光标记的DNA探针。
(2)图2表示探针与待测基因结合的原理。先将探针与染色体共同煮沸，使DNA双链中________键断裂，形成单链。随后在降温复性过程中，探针的碱基按照________原则，与染色体上的特定基因序列形成较稳定的杂交分子。图中两条姐妹染色单体中最多可有________条荧光标记的DNA片段。
(3)A、B、C分别代表不同来源的一个染色体组，已知AA和BB中各有一对同源染色体可被荧光探针标记。若植物甲(AABB)与植物乙(AACC)杂交，则其F1有丝分裂中期的细胞中可观察到________个荧光点；在减数第一次分裂形成的两个子细胞中分别可观察到________个荧光点。
【答案】(1)磷酸二酯　脱氧核苷酸　(2)氢　碱基互补配对　4　(3)6　2和4
3.(2015·江苏卷，32)胰岛素A、B链分别表达法是生产胰岛素的方法之一。图1是该方法所用的基因表达载体，图2表示利用大肠杆菌作为工程菌生产人胰岛素的基本流程(融合蛋白A、B分别表示β半乳糖苷酶与胰岛素A、B链融合的蛋白)。请回答下列问题：
图1
图2
(1)图1基因表达载体中没有标注出来的基本结构是________。
(2)图1中启动子是________酶识别和结合的部位，有了它才能启动目的基因的表达；氨苄青霉素抗性基因的作用是________。
(3)构建基因表达载体时必需的工具酶有________。
(4)β半乳糖苷酶与胰岛素A链或B链融合表达，可将胰岛素肽链上蛋白酶的切割位点隐藏在内部，其意义在于________。
(5)溴化氰能切断肽链中甲硫氨酸羧基端的肽键，用溴化氰处理相应的融合蛋白能获得完整的A链或B链，且β半乳糖苷酶被切成多个肽段，这是因为____________________________________________。
(6)根据图2中胰岛素的结构，请推测每个胰岛素分子中所含游离氨基的数量。你的推测结果是________，理由是______________________________________________________。
【答案】(1)终止子
(2)RNA聚合　作为标记基因，将含有重组质粒的大肠杆菌筛选出来
(3)限制酶和DNA连接酶
(4)防止胰岛素的A、B 链被菌体内蛋白酶降解
(5)β－半乳糖苷酶中含多个甲硫氨酸，而胰岛素A、B 链中不含甲硫氨酸
(6)至少2个　两条肽链的一端各有一个游离的氨基，氨基酸R 基团中可能还含有游离的氨基
4.(2015·福建卷，33)[生物－现代生物科技专题]
GDNF是一种神经营养因子，对损伤的神经细胞具有营养和保护作用。研究人员构建了含GDNF基因的表达载体(如图1所示)，并导入到大鼠神经干细胞中，用于干细胞基因治疗的研究。请回答：
(1)在分离和培养大鼠神经干细胞的过程中，使用胰蛋白酶的目的是
___________________________________________________________________。
(2)构建含GDNF基因的表达载体时，需选择图1中的________限制酶进行酶切。
(3)经酶切后的载体和GDNF基因进行连接，连接产物经筛选得到的载体主要有3种：单个载体自连、GDNF基因与载体正向连接、GDNF基因与载体反向连接(如图1所示)。为鉴定这3种连接方式，选择Hpa I酶和BamH I酶对筛选得到的载体进行双酶切，并对酶切后的DNA片段进行电泳分析，结果如图2所示。图中第________泳道显示所鉴定的载体是正向连接的。
(4)将正向连接的表达载体导入神经干细胞后，为了检测GDNF基因是否成功表达，可用相应的________与提取的蛋白质杂交。当培养的神经干细胞达到一定密度时，需进行________培养以得到更多数量的细胞，用于神经干细胞移植治疗实验。
【解析】本题考查基因工程和动物细胞工程相关知识，考查理解能力、获取信息能力和综合运用能力。难度适中。(1)动物细胞间的物质主要成分是蛋白质，用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理一段时间，目的是使组织中的细胞分散成单个细胞。
(2)据图1可知，GDNF基因两端和载体上都有Xho I限制酶的酶切位点。
(3)据图1可知，用Hpa I和 BamH I限制酶对三种载体进行酶切，单个载体自连只有Hpa I限制酶的酶切位点，得到6 000 bpDNA的片段；正向连接重组载体有Hpa I和 BamH I限制酶的酶切位点，得到700 bpDNA的片段和6 000 bpDNA的片段；反向连接重组载体有Hpa I和 BamH I限制酶的酶切位点，得到200 bpDNA的片段和6 500 bpDNA的片段。
(4)检测目的基因是否成功表达，可采用抗原－抗体杂交法。培养的原代细胞贴满瓶壁重新用胰蛋白酶等处理，然后分瓶继续培养，让细胞继续增殖，这样的培养过程通常称为传代培养。传代培养的细胞一般传至10代后就不易传下去，科研上使用的正常细胞通常为10代以内，以保持细胞正常的二倍体核型。
【答案】　(1)使细胞分散开　(2)Xho I　(3)②　(4)抗体　传代
5.(2015·北京卷，5)在应用农杆菌侵染植物叶片获得转基因植株的常规实验步骤中，不需要的是(　　)
A.用携带目的基因的农杆菌侵染植物细胞
B.用选择培养基筛选导入目的基因的细胞
C.用聚乙二醇诱导转基因细胞的原生质体融台
D.用适当比例的生长素和细胞分裂素诱导愈伤组织生芽
【答案】　C
6.(2015·天津卷，6)2015年2月3日，英国议会下院通过一项历史性法案，允许以医学手段培育“三亲婴儿”。三亲婴儿的培育过程可选用如下技术路线。
据图分析，下列叙述错误的是(　　)
A.该技术可避免母亲的线粒体遗传病基因传递给后代
B.捐献者携带的红绿色盲基因不能遗传给三亲婴儿
C.三亲婴儿的染色体全部来自母亲提供的细胞核
D.三亲婴儿的培育还需要早期胚胎培养和胚胎移植等技术
【解析】本题考查核移植、胚胎早期培养体外受精等生物技术的相关知识，考查理解能力及应用能力。难度中等。从图中可知，母亲卵母细胞只是提供了细胞核，而线粒体位于细胞质中，因此可以避免母亲的线粒体遗传病基因传递给后代，A正确；红绿色盲位于细胞核内的染色体上，捐献者只是提供了细胞质，所以捐献者携带的红绿色盲基因不能遗传给三亲婴儿，B正确；染色体全部位于细胞核内，从图中可知，三亲婴儿的染色体一半来自母亲、一半来自父亲，C错误；从图中可知，体外受精完成后，还需要进行早期胚胎培养，当培养到桑椹胚或囊胚时再通过胚胎移植，移植到母亲子宫内继续发育，D正确。
【答案】C
7.(2015·江苏卷，3)下列关于动物细胞工程和胚胎工程的叙述，正确的是(　　)
A.乳腺细胞比乳腺癌细胞更容易进行离体培养
B.细胞核移植主要在同种动物、同种组织的细胞之间进行
C.采用胚胎分割技术产生同卵多胚的数量是有限的
D.培养早期胚胎的培养液中含维生素、激素等多种能源物质
【答案】　C
8.(2015·天津卷，7)DHA对脑神经发育至关重要。以A、B两种单细胞真核藻为亲本，利用细胞融合技术选育高产DHA融合藻。两种藻特性如下表。
亲本藻
优势代
谢类型
固体培养基
上藻落直径
A藻
自养
0.06
小
0.7
B藻
异养
0.14
大
无
据表回答：
(1)选育的融合藻应具有A藻________与B藻________的优点。
(2)诱导融合前需用纤维素酶处理两种藻，其目的是获得
__________________________________________________________________。
(3)通过以下三步筛选融合藻，步骤________可淘汰B藻，步骤________可淘汰生长速率较慢的藻落，再通过步骤________生产所需的融合藻。
步骤a：观察藻落的大小
步骤b：用不含有机碳源(碳源——生物生长的碳素来源)的培养基进行光照培养
步骤c：测定DHA含量
(4)以获得的融合藻为材料进行甲、乙、丙三组试验，结果如下图。
①甲组条件下，融合藻产生[H]的细胞器是________；丙组条件下产生ATP的细胞器是________。
②与甲、丙两组相比，乙组融合藻生长速率较快，原因是在该培养条件下__________________________________________________________________。
甲、乙两组DHA产量均较高，但实际生产中往往采用甲组的培养条件，其原因是_______________________________________________________________
___________________________________________________________________。
【答案】　(1)产生DHA、自养特性　快速增长
(2)原生质体
(3)b　a　c
(4)①线粒体、叶绿体　线粒体　②融合藻既能光能自养又能异养　融合藻利用光能和简单的无机物能较快生长，不需要添加葡萄糖，既可降低成本，也可防止杂菌生长

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