资源简介

微生物的培养与利用
考点分析
高考考点
考查内容
三年高考探源
考查频率
培养基及微生物的纯化培养技术
1．掌握培养基及微生物的纯化培养技术；
2．掌握微生物的计数方法；
3．掌握微生物的筛选与鉴别的步骤和所用试剂；
4．理解微生物的利用；
2018·全国Ⅰ卷·37
2018·全国Ⅱ卷·37
2018·全国Ⅲ卷·37
2018·海南卷·30
2018·江苏卷·31
2018江苏卷·16
2017新课标Ⅰ·37
2017新课标II·37
2016全国卷Ⅰ·39
2016全国卷Ⅱ·39
2016全国卷Ⅲ·39
★★★★☆
微生物的计数方法
★★★★☆
微生物的筛选与鉴别
★★★★☆
微生物的利用
★★★★★
考点1 培养基及微生物的纯化培养技术
一、微生物的培养基
1．微生物的培养基
营养要素
来源
功能
碳源
无机碳源
CO2、NaHCO3、CaCO3等含碳无机物
①构成细胞物质和一些代谢产物
②既是碳源又是能源（有机碳源）
有机碳源
糖类、脂质、蛋白质、有机酸、石油、花生粉饼等
氮源
无机氮源
无机氮：NH3、铵盐、硝酸盐、N2等
合成含氮的代谢产物
有机氮源
牛肉膏、蛋白胨、核酸、尿素、氨基酸
合成蛋白质、核酸及含氮的代谢产物
生长因子
维生素、氨基酸、碱基
①酶和核酸的组成成分
②参与代谢过程中的酶促反应
2．按物理状态分类
培养基种类
特点
用途
液体培养基
不加凝固剂
工业生产
固体培养基
加凝固剂（如琼脂）
微生物分离、鉴定，活菌计数，菌种保藏
半固体培养基
观察微生物的运动、分类、鉴定
3．按功能分类
种类
制备方法
原理
用途
举例
选择培养基
培养基中加入某些化学物质
依据某些微生物对某些物质的特殊需求或抗性而设计
从众多微生物中分离所需的微生物
加入青霉素分离得到酵母菌和霉菌
鉴别培养基
培养基中加入某种指示剂或化学药品
产生特定的颜色或其他变化
鉴别不同种类的微生物
用伊红—美蓝培养基鉴别大肠杆菌
二、消毒与灭菌
条件
结果
常用方法
应用范围
消毒
较为温和的物理或化学方法
仅杀死物体表面或内部的部分对人体有害的微生物
煮沸消毒法
日常用品
巴氏消毒法
不耐高温的液体
化学药剂消毒法
用酒精擦拭双手，用氯气消毒水源
灭菌
强烈的理化因素
杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子
燃烧灭菌法
接种工具
干热灭菌法
玻璃器皿、金属工具
高压蒸汽灭菌法
培养基及容器
三、大肠杆菌的纯化
1．原理：在培养基上将细菌稀释或分散成单个细胞，使其长成单个的菌落，这个菌落就是纯化的细菌菌落。
2．纯化微生物的接种方法
比较项目
平板划线法
稀释涂布平板法
关键操作
接种环在固体平板培养基表面连续划线
①一系列的梯度稀释；
②涂布平板法操作
注意事项
每次划线前后均需灼烧接种环
稀释度要足够高，为确保实验成功可以增加稀释度
菌体获取
在具有显著的菌落特征的菌落中挑取菌体
从适宜稀释度的平板上的菌落中挑取菌体
优点
可以根据菌落的特点获得某种微生物的单细胞菌落
既可以获得单细胞菌落，又能对微生物计数
缺点
不能对微生物计数
操作复杂，需要涂布多个平板
3．平板划线操作的注意事项
（1）操作第一步即取菌种之前及每次划线之前都需要对接种环进行火焰灼烧灭菌，划线操作结束时，仍需灼烧接种环，每次灼烧目的如下表：
第一次操作
每次划线之间
划线结束
目的
杀死接种环上原有的微生物
杀死上次划线后接种环上残留的菌种，使下次划线的菌种直接来源于上次划线的末端，使每次划线菌种数目减少
杀死接种环上残存的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者
（2）灼烧接种环，待其冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种。
（3）第二次及其以后的划线操作总是从上一次划线末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐渐减少，最终得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
（4）划线时最后一区不要与第一区相连。
（5）划线用力大小要适当，防止用力过大将培养基划破。
调研1 甲、乙两同学学习完微生物的实验室培养后，要利用所学知识研究水中微生物的情况。
Ⅰ．甲同学为了检测饮用水中是否含有某种细菌，配制如下培养基进行培养：
蛋白胨
10 g
乳糖
5 g
蔗糖
5 g
K2HPO4
2 g
蒸馏水
1 000 mL
将pH调到7.2
（1）该培养基所含有的碳源有________，其功能是_________________________________________。
（2）该培养基所含有的氮源有________，其功能是_____________________________。
（3）该培养基除含碳源、氮源外，还有微生物需要的其他营养物质是____________________。
（4）用该培养基培养微生物时，还需要控制哪些理化条件？_______________________。
Ⅱ．乙同学为了调查湖水中细菌的污染情况而进行了实验。实验包括制备培养基、灭菌、接种及培养、菌落观察。请回答与此实验相关的问题。
（1）乙同学配制的培养基为________（物理性质）培养基，其中含有的蛋白胨、淀粉分别为细菌提供了________和________。
（2）对培养基进行灭菌时，应该采用的方法是______________________________。
（3）为了尽快观察到细菌培养的实验结果，应将接种了湖水样品的平板置于______________中培养，培养的温度设定在37 ℃。要使该实验所得结果可靠，还应该同时在另一平板上接种______________作为对照进行实验。
【答案】Ⅰ.（1）蔗糖、乳糖、蛋白胨 主要用于提供能量以及构成微生物的细胞物质和代谢产物
（2）蛋白胨 主要用于合成蛋白质、核酸及含氮的代谢产物
（3）水、无机盐
（4）温度、氧气浓度等
Ⅱ.（1）固体 氮源（碳源不作要求） 碳源
（2）高压蒸汽灭菌
（3）恒温培养箱 无菌水
考点2 微生物的计数方法
1．两种计数方法的比较
比较项目
间接计数法（稀释涂布平板法）
直接计数法（显微计数法）
原理
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌
利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量
公式
每克样品中的菌落数＝（C÷V）×M
C：某稀释度下平板上生长的平均菌落数；
V：涂布平板时所用的稀释液的体积（mL）；
M：稀释倍数
每毫升原液所含细菌数：每小格平均细菌数×400×104×稀释倍数
缺点
当两个或多个菌体连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落
不能区分细胞死活
结果
比实际值偏小
比实际值偏大
2．设置对照和重复
比较项目
对照
重复
目的
排除非测试因素对实验结果的影响
排除偶然因素对实验结果的影响
实例
空白对照：确定培养基制作是否合格
同一稀释度涂布至少3个平板
【易混易错】
“选择菌落数在30～300的平板”的两个提醒
用稀释涂布平板法计数微生物时，要求选择菌落数在30～300的平板进行计数。解题时易出现以下误解：
（1）只得到1个菌落数在30～300的平板是错误的。错误的原因是不符合实验的重复原则，易受到偶然因素的影响。
（2）得到3个或3个以上菌落数在30～300的平板，也不一定正确，这可能有两种情况：
①不同平板间差异较大，如得到3个平板，菌落数分别为230、34、240，虽然菌落数均在“30～300”，这也是不正确的，因为“34”与“230”“240”差异太大，应重新实验找出原因。
②不同平板之间差异不大，是符合要求的，用其平均值作为估算的最终结果。可见，并不是只要得到3个“菌落数在30～300的平板”即可，而应该是涂布的同一稀释度的平板均符合“菌落数在30～300的平板”且无较大差异，说明实验操作合格，才能按照计算公式进行计算。
调研1 自然界中的微生物往往是混杂生长的。人们在研究微生物时一般要将它们分离提纯，然后进行数量的测定。下面是有关土壤中分解尿素的细菌分离和计数的实验过程，请回答有关问题。
（1）为分离出土壤中分解尿素的细菌，应该用_______________________的培养基进行分离，这种培养基属于______培养基（按功能分类）。可在培养基中加入_________指示剂鉴别该类微生物。
（2）若取土样6 g，应加入_______mL的无菌水配制成稀释10倍土壤溶液。因土壤中细菌密度很大，需要不断加以稀释，配制成101~107不同浓度的土壤溶液。将103~107倍的稀释液分别吸取0.2 mL加入到固体培养基上，用涂布器将菌液铺平，每个稀释度下至少涂布3个平板，这种接种方法称为_______________。将接种的培养皿放置在37 ℃恒温培养箱中培养24~48 h，观察并统计菌落数，结果如下表，其中_______倍的稀释比较合适，由此计算出每克土壤中的菌落数为__________。这种方法测定的菌落数往往比活菌的实际数目_______（低/高）。
稀释倍数
103
104
105
106
107
菌落数（个）
1号平板
478
367
277
26
5
2号平板
496
354
261
20
8
3号平板
509
332
254
29
3
（3）若研究尿素分解菌的群体生长规律，可采用平板划线法分离土壤中的尿素分解菌。操作时，接种环通过灼烧灭菌，在第二次及以后划线时，总是从上一次的末端开始划线。这样做的目的是_______________________。将分离纯化后的单个菌落进行液体培养，可采用定期取样的方法进行计数。若以一个大方格（体积为0.1 mm3）有25个中方格的计数板为例进行计算，设五个中方格中总菌数为45，菌液稀释倍数为102，那么原菌液的菌群密度为________个/mL。
【答案】（1）尿素作为唯一的氮源 选择培养基 酚红
（2）54 稀释涂布平板法 105 2.2×107 低
（3）将聚集的菌体逐步稀释以便获得（不连续）单个菌落 2.25×108
【解析】（1）分解尿素的细菌，其氮源是尿素，而其他微生物的氮源是有机氮，所以欲分离分解尿素的细菌，应用以尿素为唯一氮源的选择培养基进行分离，并加入酚红指示剂进行鉴别。（2）根据题意（3）用平板划线法分离土壤中的尿素分解菌时，为了将聚集的菌体逐步稀释以便获得（不连续）单个菌落，在第二次及以后划线时，总是从上一次的末端开始划线。若以一个大方格（体积为0.1 mm3）有25个中方格的计数板为例进行计算，设五个中方格中总菌数为45，菌液稀释倍数为102，那么原菌液的菌群密度=45×5÷0.1÷10-3×102=2.25×108个/mL。
考点3 微生物的筛选与鉴别
1．微生物的鉴别方法
（1）菌落特征鉴别法：根据微生物在固体平板培养基表面形成的菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等特征进行鉴别。
（2）指示剂鉴别法：如以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种微生物后，培养基变红说明该种微生物能够分解尿素。
（3）染色鉴别法：如利用刚果红染色法，根据培养基中出现以纤维素分解菌为中心的透明圈来筛选分解纤维素的微生物。
2．筛选微生物的三种方法
（1）单菌落挑取法：利用平板划线法或稀释涂布平板法接种到固体平板培养基表面，直接根据微生物菌落的特征利用单菌落挑取的方法获得目的微生物。
（2）选择培养法：利用选择培养基对微生物进行选择培养，直接获得目的微生物。
（3）鉴定培养法：利用鉴别培养基使目的微生物菌落呈现特有的特征，然后筛选目的微生物。
3．筛选微生物的两个实例比较
比较项目
土壤中分解尿素的细菌的分离
分解纤维素的微生物的分离
方法
利用以尿素为唯一氮源的选择培养基进行选择培养
利用富含纤维素的选择培养基进行选择培养
原理
只有分解尿素的细菌能够合成脲酶，才能在以尿素为唯一氮源的培养基上生长
因为培养基中含有丰富的纤维素，因此能够分解纤维素的微生物具有更多的生存机会而大量繁殖
鉴别
在培养基中加入酚红指示剂，指示剂变红说明菌落中的菌体为分解尿素的细菌
刚果红染色法，周围出现透明圈的菌落为分解纤维素的微生物的菌落
调研1 某化工厂的污水池中，含有一种有害的、难于降解的有机化合物A。研究人员用化合物A、磷酸盐、镁盐以及微量元素配制的培养基，成功地筛选到能高效降解化合物A的细菌（目的菌）。实验的主要步骤如下图所示。请分析回答问题。
（1）接种前需要对培养基及培养皿等进行灭菌，常用的灭菌方法是____________。培养基中加入化合物A的目的是筛选________。
（2）实验需要振荡培养，由此推测“目的菌”的代谢类型是____________。
（3）培养若干天后，应选择培养瓶中化合物A含量________的培养液，接入新的培养液中连续培养，使“目的菌”的数量________。
（4）转为固体培养时，为获得单菌落进行继续筛选，常采用平板划线法或____________法，接种后，应将培养皿________（填“正放”或“倒置”）
（5）平板划线法操作在做第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？______________________________________________________。
【答案】（1）高压蒸汽灭菌法 目的菌
（2）异养需氧型
（3）减少 增加
（4）稀释涂布平板 倒置
（5）线条末端细菌数目比起始处少，从末端开始划线能使细菌数目随划线次数增加而逐渐减少，最后得到由单个细菌繁殖形成的菌落
考点4 微生物的利用
1．果酒和果醋制作步骤的比较
制果酒
制果醋
相同过程
（1）选材和材料处理：选择新鲜的葡萄，先用清水冲洗葡萄1～2遍除去污物后，再去枝梗；
（2）制作发酵液，防止杂菌污染；
（3）发酵：将葡萄汁注入发酵瓶，注意液体量不要超过发酵瓶总体积的2/3
不同过程
（1）将温度严格控制在18～25 ℃，时间控制在10～12 d左右。发酵旺盛期的CO2产量非常大，要及时排气，防止发酵瓶爆裂；
（2）检测指标：7～10 d以后，可以开始进行取样检验工作。例如，可以嗅味和品尝、用重铬酸钾检验酒精含量，进行酵母菌的镜检，测定pH等工作
（1）将温度严格控制在30～35 ℃，并注意适时通过充气口充气；
（2）检测指标：果醋的制作是否成功可以通过观察菌膜的形成、嗅味和品尝初步鉴定，再通过检测和比较醋酸发酵前后的pH进一步鉴定。还可以在显微镜下观察发酵液中是否有醋酸菌，并统计其数量作进一步鉴定
2．果酒和果醋的发酵装置及各个部件的作用
装置图
结构或操作
目的
充气口
醋酸发酵时连接充气泵，输入无菌空气；制酒时关闭充气口
排气口
用来排出CO2
长而弯曲的胶管
防止空气中微生物的污染
出料口
便于取料，及时监测发酵进行的情况
3．发酵后酒精的检验及对照原则
（1）检验
（2）对照
两种对照方式都必须遵循单一变量原则：前者是标准对照，后者是自身对照。
4．果酒、果醋制作的注意事项
（1）材料的选择与处理
选择新鲜的葡萄，榨汁前先冲洗后除去枝梗，以避免去除枝梗时引起葡萄破损，增加被杂菌污染的机会。
（2）防止发酵液被污染
需要从发酵制作的过程进行全面的考虑，因为操作的每一步都可能混入杂菌。为避免杂菌污染，榨汁机要洗净并晾干；发酵装置要洗净并用70%的酒精消毒；封闭充气口；若用简易的发酵装置；每隔一定时间排气时只需拧松瓶盖，不要完全揭开瓶盖等。
（3）控制好发酵时间与温度、果醋制作时适时充气。
【特别提醒】
氧气供应状况对酒精发酵结果影响的分析方法
（1）酒精发酵所需的氧气供应条件
①发酵前期：需要通入空气或在发酵瓶中留有一定的空间，可以给酵母菌提供氧气以利于酵母菌通过有氧呼吸大量增殖。②发酵后期：要通过密封严格控制无氧环境，以利于酵母菌通过无氧呼吸产生酒精。
（2）酒精发酵异常的情况
①酒精发酵的前期如果供氧不足，酵母菌数量少，产生的酒精少。②酒精发酵后期如果密封不严，则酵母菌数量充足，但是不能产生酒精。
5．腐乳的制作
（1）豆腐的选取：豆腐含水量以70%为宜，若含水量过高，豆腐块不易成形；若含水量过低，则不利于毛霉的生长。
（2）控制好材料的用量
①盐的用量：豆腐毛坯∶盐＝5∶1，盐的浓度过低，不足以抑制微生物生长，可能导致豆腐腐败变质；盐的浓度过高，会影响腐乳的口味。
②酒的用量：卤汤中酒的含量控制在12%左右为宜。酒精含量的高低与腐乳后期发酵时间的长短有很大关系：酒精含量越高，对蛋白酶的抑制作用也越大，会使腐乳成熟时间延长；酒精含量过低，蛋白酶的活性高，加快蛋白质的水解，但杂菌繁殖快，豆腐易腐败，难以成块。
（3）防止杂菌的污染
①用来腌制腐乳的玻璃瓶，洗刷干净后要用沸水消毒。
②装瓶腌制时，操作要迅速小心，且要逐层加盐，离瓶口表面的盐要铺厚一些。
③加入卤汤后，要用胶条将瓶口密封。封瓶时，最好将瓶口通过酒精灯的火焰，防止瓶口被污染。
（4）发酵温度：前期发酵温度应保持在15～18 ℃，如温度过低，则菌丝生长缓慢，不能进入豆腐块的深层；温度过高，菌丝易老化和死亡，影响腐乳的品质。
（5）发酵时间：发酵时间影响生化反应速度及生化产物的量。
6．泡菜的制作
a．泡菜制作成功的关键点
（1）材料的选择及用量
①蔬菜应新鲜，若放置时间过长，蔬菜中的硝酸盐易被还原成亚硝酸盐。
②清水和盐的质量比为4∶1，盐水要煮沸后冷却。煮沸有两大作用，一是除去水中氧气，二是杀灭盐水中其他细菌。
（2）防止杂菌污染：每次取样用具要洗净，要迅速封口。
（3）氧气需求
①泡菜坛要选择透气性差的容器，以创造无氧环境，有利于乳酸菌发酵，防止蔬菜腐烂。
②泡菜坛坛盖边沿的水槽内要注满水，以保证乳酸菌发酵所需要的无氧环境，并注意在发酵过程中经常补水。
（4）温度：发酵温度控制在室温即可，最好在26～36 ℃。温度过高，则易滋生杂菌，温度过低则发酵时间延长。
b．泡菜腌制过程中乳酸菌、乳酸和亚硝酸盐的变化
发酵时期
乳酸菌
乳酸
亚硝酸盐
发酵初期
少（有O2，乳酸菌活动受抑制）
少
增加（硝酸盐还原菌的作用）
发酵中期
最多（乳酸抑制其他菌活动）
积累、增多、pH下降
下降（硝酸盐还原菌受抑制，部分亚硝酸盐被分解）
发酵
后期
减少（乳酸继续积累，pH继续下降，抑制其活动）
继续增多，pH继续下降
下降至相对稳定（硝酸盐还原菌被完全抑制）
含量变化曲线
时期
乳酸菌
乳酸
亚硝酸盐
注意
亚硝酸盐是硝酸盐还原菌促进硝酸盐还原形成的，而不是硝化细菌氧化氨形成的
调研1 下面是果酒和果醋制作的实验流程和某同学设计的果酒和果醋的发酵装置。根据图示回答下列问题。
（1）完成图1中的实验流程，则矩形框内应为_______。
（2）果酒和果醋的制作分别利用了________和______(填生物名称)两种微生物的发酵原理。由果酒转变成果醋的制作时，需要改变的环境条件是________和_________，主要原因是_____________(答出两点)。
（3）图2装置中的充气口在_______过程中要关闭，而排气口在该过程中应不时开放，目的是用来排出_____产生的______。
（4）果汁发酵后是否有酒精产生，可用________来检测，在酸性条件下呈现出___色证明有酒精产生。
（5）葡萄酒自然发酵时，作为原料的葡萄是否需要灭菌?为什么?______________。
【答案】（1）醋酸发酵
（2）酵母菌 醋酸菌 通入氧气 提高温度 醋酸菌是好氧细菌，只有在氧气充足时，才能进行旺盛的生命活动；醋酸菌的最适生长温度是30~35 ℃
（3）酒精发酵 酵母菌无氧呼吸 二氧化碳
（4）重铬酸钾 灰绿
（5）不需要，在葡萄酒的自然发酵过程中，起主要作用的是附着在葡萄皮上的野生型酵母菌。灭菌会杀死葡萄皮上附着的酵母菌，使发酵不能进行
【解析】（1）果酒和果醋制作的实验流程是；挑选葡萄→冲洗→榨汁→酒精发酵→醋酸发酵→醋酸。（2）果酒和果醋的制作分别利用了酵母菌和醋酸菌两种微生物的发酵原理；酵母菌在无氧条件下进行酒精发酵，最适温度在20 ℃左右；醋酸菌是好氧性细菌，只有在氧气充足时，才能进行旺盛的生命活动，温度为30 ~35 ℃；因此由果酒转变成果醋的制作时，需要改变的环境条件是持续通入氧气并提高温度。（3）酒精发酵利用酵母菌的无氧呼吸，醋酸菌是好氧菌，因此图2装置中的充气口在酒精发酵中关闭，在醋酸发酵时应打开；酵母菌进行呼吸产生二氧化碳，因此酒精发酵过程中排气口在该过程中应打开。（4）酸性条件下，重铬酸钾与酒精反应呈现灰绿色，因此可以用酸性重铬酸钾溶液检测发酵过程是否产生酒精。（5）在葡萄酒的自然发酵过程中，起主要作用的是附着在葡萄皮上的野生型酵母菌。灭菌会杀死葡萄皮上附着的酵母菌，使发酵不能进行，因此葡萄酒自然发酵时，作为原料的葡萄不需要灭菌。
调研2 农村中泡菜的制作方法：将新鲜的蔬菜经过整理、清洁后，放入彻底清洗并用白酒擦拭过的泡菜坛中，然后加入盐水、香料及一些“陈泡菜水”。密封后置于阴凉处，最适环境温度为28～30 ℃。有时制作的泡菜会“咸而不酸”或“酸而不咸”，前者是用盐过多，后者用盐过少。
（1）用白酒擦拭泡菜坛的目的是________________________________________。
（2）菜坛要密封的原因是____________________________________。若菜坛有裂缝，可能会出现的结果是__________________________。
（3）若制作的泡菜“咸而不酸”，最可能的原因是________________________________________。
（4）加入一些“陈泡菜水”的作用是______________________________________________。
（5）制作泡菜的过程中，有机物的干重如何变化？菜坛内有机物的种类如何变化？______________。
【答案】（1）消毒
（2）乳酸菌为厌氧微生物，密封后造成缺氧环境 将导致乳酸菌不能正常生长，而一些杂菌大量繁殖，泡菜会变质
（3）盐过多，抑制了乳酸菌的发酵
（4）提供乳酸菌菌种
（5）有机物的干重减少，种类增加

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