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2019届 二轮复习 基因工程与细胞工程 学案
考点一　基因工程
强化学思知能　　　学有所思，思有深度
[知识·核心·热点]
熟记基因工程的四个操作步骤(填空)
1．目的基因的获取途径：
2.基因表达载体的构建——重组质粒的构建：
①表达载体的组成：目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因＋复制原点。
②启动子和终止子：启动子是RNA聚合酶结合位点，启动转录；终止子是终止转录的位点。
3．将目的基因导入受体细胞：
4.目的基因的检测与鉴定：
①导入检测：DNA分子杂交技术(使用DNA探针)
③个体生物学水平鉴定：如对转基因作物进行抗虫或抗病等接种实验。
[范例·调研·方法]
【典例1】　(2016·江苏卷)下表是几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中标注了相关限制酶的酶切位点，其中切割位点相同的酶不重复标注。请回答下列问题：
(1)用图中质粒和目的基因构建重组质粒，应选用BclⅠ和Hind_Ⅲ两种限制酶切割，酶切后的载体和目的基因片段，通过(DNA)连接酶作用后获得重组质粒。为了扩增重组质粒，需将其转入处于感受态的大肠杆菌。
(2)为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加四环素，平板上长出的菌落，常用PCR鉴定，所用的引物组成为图2中引物甲和引物丙。
(3)若BamH Ⅰ酶切的DNA末端与Bcl Ⅰ酶切的DNA末端连接，连接部位的6个碱基对序列为，对于该部位，这两种酶都不能(填“都能”“都不能”或“只有一种能”)切开。
(4)若用Sau3A Ⅰ酶切图1质粒最多可能获得7种大小不同的DNA片段。

1．抓信息：限制酶、识别序列、重组质粒、PCR、引物。
2．点思路：
【学发挥】——高考大题长句表达专项练
利用农杆菌转化水稻受体细胞的过程中，需添加酚类物质，其目的是吸引农杆菌移向水稻受体细胞，有利于目的基因成功转化。
题组冲关调研　　　练有所得，得有高度
1．知识性失误(判断正误)
(1)启动子和终止密码子均在胰岛素基因的转录中起作用(　×　)
提示：启动子在转录过程中起作用，终止密码子在翻译过程中起作用。
(2)携带链霉素抗性基因受体菌的筛选必须通过分子检测(　×　)
提示：携带链霉素抗性基因受体菌的筛选，可用含链霉素的培养基进行培养，能存活的受体菌即含有相应的抗性基因。
(3)用限制性核酸内切酶切割烟草花叶病毒的核酸(　×　)
提示：限制性核酸内切酶只能切割特定的脱氧核苷酸序列，而烟草花叶病毒的核酸是核糖核苷酸。
(4)自然界中天然存在的噬菌体自行感染细菌后其DNA整合到细菌DNA上，属于基因工程(　×　)
提示：噬菌体自行感染细菌后其DNA整合到细菌DNA上属于基因重组。
(5)构建人胰岛素基因表达载体，表达载体的复制和胰岛素基因的表达均启动于复制原(起)点(　×　)
提示：表达载体的复制启动于复制原点，胰岛素基因的表达启动于启动子。
(6)重组质粒与探针能进行分子杂交是因为DNA分子脱氧核糖和磷酸交替连接(　×　)
提示：重组质粒与探针能进行分子杂交是因为DNA分子的碱基能够互补配对。
(7)应用DNA探针技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其完全表达(　×　)
提示：应用DNA探针技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在，但不能检测基因的表达。
(8)动物的生长激素基因转入植物后不能表达(　×　)
提示：不同生物共用一套遗传密码，所以动物生长激素基因转入植物后也能表达。
(9)从某海洋动物中获得一基因，其表达产物为一种抗菌性和溶血性均较强的多肽P1。目前在P1的基础上研发抗菌性强但溶血性弱的多肽药物，首先要做的是依据P1氨基酸序列设计多条模拟肽(　√　)
(10)采用蛋白质工程进一步改造AFB1解毒酶的基本途径是：从提高酶的活性出发，设计预期的蛋白质结构，推测应有的氨基酸序列，找到相对应的脱氧核苷酸序列(　√　)
2．(2018·新课标全国卷Ⅰ)回答下列问题：
(1)博耶(H.Boyer)和科恩(S.Cohen)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达。该研究除证明了质粒可以作为载体外，还证明了体外重组的质粒可以进入受体细胞；真核生物基因可在原核细胞中表达(答出两点即可)。
(2)体外重组的质粒可通过Ca2＋参与的转化方法导入大肠杆菌细胞；而体外重组的噬菌体DNA通常需与外壳蛋白(或答噬菌体蛋白)组装成完整噬菌体后，才能通过侵染的方法将重组的噬菌体DNA导入宿主细胞。在细菌、心肌细胞、叶肉细胞中，可作为重组噬菌体宿主细胞的是细菌。
(3)真核生物基因(目的基因)在大肠杆菌细胞内表达时，表达出的蛋白质可能会被降解。为防止蛋白质被降解，在实验中应选用蛋白酶缺陷型的大肠杆菌作为受体细胞，在蛋白质纯化的过程中应添加蛋白酶的抑制剂。
解析：本题主要考查基因工程的相关知识。(1)体外重组的质粒可以进入受体细胞，且重组质粒在不同细胞中能正常表达，说明目的基因在不同细胞中的表达机制相同，生物界共用一套遗传密码。(2)基因工程中，受体细胞为大肠杆菌细胞时，常用Ca2＋处理大肠杆菌，使之处于感受态，即Ca2＋参与的转化法。噬菌体DNA与外壳蛋白组装成完整噬菌体。因噬菌体的宿主是细菌，故只有细菌可作为重组噬菌体的宿主细胞。(3)为防止目的基因表达的蛋白质被破坏，可选用不能合成蛋白酶的大肠杆菌作为受体细胞，在蛋白质纯化过程中加入蛋白酶的抑制剂可以保护蛋白质不被水解。
3．(2018·新课标全国卷Ⅱ)某种荧光蛋白(GFP)在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光，这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达。某科研团队将某种病毒的外壳蛋白(L1)基因连接在GFP基因的5′末端，获得了L1-GFP融合基因(简称为甲)，并将其插入质粒P0，构建了真核表达载体P1，其部分结构和酶切位点的示意图如下，图中E1～E4四种限制酶产生的黏性末端各不相同。
回答下列问题：
(1)据图推断，该团队在将甲插入质粒P0时，使用了两种限制酶，这两种酶是E1和E4。使用这两种酶进行酶切是为了保证甲的完整，也是为了保证甲与载体正确连接。
(2)将P1转入体外培养的牛皮肤细胞后，若在该细胞中观察到了绿色荧光，则说明L1基因在牛的皮肤细胞中完成了转录和翻译过程。
(3)为了获得含有甲的牛，该团队需要做的工作包括：将能够产生绿色荧光细胞的细胞核移入牛的去核卵母细胞中、体外培养、胚胎移植等。
(4)为了检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，某同学用PCR方法进行鉴定，在鉴定时应分别以该牛不同组织细胞中的核DNA(填“mRNA”“总RNA”或“核DNA”)作为PCR模板。
解析：(1)构建基因表达载体时，使用的限制酶不能破坏融合基因。选用产生不同黏性末端的两种限制酶，可以防止自身环化，并且保证融合基因和质粒正确连接。(2)在牛的皮肤细胞中观察到绿色荧光，说明L1基因已经表达，即在该皮肤细胞中完成了转录和翻译过程。(3)培育转基因的克隆牛需将含目的基因的细胞的细胞核移入牛的去核卵母细胞中。(4)为检测克隆牛的不同组织细胞中是否含有融合基因，需提取不同组织细胞的核DNA作为PCR模板，用PCR方法进行鉴定。
4．(2018·江苏卷)为生产具有特定性能的α-淀粉酶，研究人员从某种海洋细菌中克隆了α-淀粉酶基因(1 656个碱基对)，利用基因工程大量制备α-淀粉酶，实验流程见图。请回答下列问题：
(1)利用PCR技术扩增α-淀粉酶基因前，需先获得细菌的基因组DNA。
(2)为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的5′端加上限制性酶切位点，且常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，主要目的是使DNA片段能定向插入表达载体，减少自连。
(3)进行扩增时，反应的温度和时间需根据具体情况进行设定，下列选项中②的设定与引物有关，⑥的设定与扩增片段的长度有关。(填序号)
①变性温度　②退火温度　③延伸温度　④变性时间　⑤退火时间　⑥延伸时间
(4)下图表示筛选获得的工程菌中编码α-淀粉酶的mRNA的部分碱基序列：
图中虚线框内mRNA片段包含8个密码子，如虚线框后的序列未知，预测虚线框后的第一个密码子最多有13种。
(5)获得工程菌表达的α-淀粉酶后，为探究影响酶活性的因素，以浓度为1%的可溶性淀粉为底物测定酶活性，结果如下：
根据上述实验结果，初步判断该α-淀粉酶活性最高的条件为pH为8.5，缓冲液为50_mmol/L_Tris-HCl。
解析：(1)由题干信息可知某种海洋细菌含有α-淀粉酶基因，因此在扩增α-淀粉酶基因前需先从细菌中提取细菌的基因组DNA。(2)由于引物的作用是引导子链的延伸，将脱氧核苷酸连接到引物上时，是与引物的3′端相连的，由此确定需在引物的5′端加上限制性酶切位点。常在两条引物上加入不同的限制酶切位点的主要目的是使DNA片段能定向插入表达载体，防止自身相连。(3)进行PCR扩增时，退火的温度与引物长短和碱基种类有关。延伸时间长短的设定与扩增片段的长度有关。(4)密码子是指mRNA上决定一个氨基酸的三个相邻的碱基，该mRNA上5′端为AUG(起始密码子)，因此可依据三个碱基是一个密码子来分析图中虚线框中的碱基，可得出共有8个密码子。由于虚线框后的第一个密码子已经固定为U，因此还有2个碱基未知，共可能有的种数为4×4＝16，又因为UAG、UGA、UAA为终止密码子，因此决定氨基酸的密码子最多有13种。(5)据表格数据可知：α-淀粉酶在pH为8.5、缓冲液为50 mmol/L Tris-HCl的条件下相对活性为99.5%，初步判断此条件下酶活性最高。
5．(2018·天津卷)甲型流感病毒为RNA病毒，易引起流感大规模流行。我国科学家在2017年发明了一种制备该病毒活疫苗的新方法，主要环节如下。
(1)改造病毒的部分基因，使其失去在正常宿主细胞内的增殖能力。以病毒RNA为模板，逆转录成对应DNA后，利用PCR技术扩增，并将其中某些基因(不包括表面抗原基因)内个别编码氨基酸的序列替换成编码终止密码子的序列。与改造前的基因相比，改造后的基因表达时不能合成完整长度的多肽(或蛋白质)，因此不能产生子代病毒。将该改造基因、表面抗原等其他基因分别构建重组质粒，并保存。
(2)构建适合改造病毒增殖的转基因宿主细胞。设计合成一种特殊tRNA的基因，其产物的反密码子能与(1)中的终止密码子配对结合，并可携带一个非天然氨基酸(Uaa)。将该基因与载体连接后导入宿主细胞。提取宿主细胞的总RNA进行分子杂交鉴定，筛选获得成功表达上述tRNA的转基因宿主细胞。
(3)利用转基因宿主细胞制备疫苗。将(1)中的重组质粒导入(2)中的转基因宿主细胞，并在补加非天然氨基酸(Uaa)的培养基中进行培养，则该宿主细胞能利用上述特殊tRNA，翻译出改造病毒基因的完整蛋白，产生大量子代病毒，用于制备疫苗。
特殊tRNA基因转录时，识别其启动子的酶是D(单选)。
A．病毒的DNA聚合酶 B．宿主的DNA聚合酶
C．病毒的RNA聚合酶 D．宿主的RNA聚合酶
(4)上述子代病毒不能在正常宿主细胞中增殖，没有致病性，因此不经灭活或减毒即可制成疫苗。与不具侵染性的流感病毒灭活疫苗相比，该病毒活疫苗的优势之一是可引起细胞免疫，增强免疫保护效果。
解析：本题主要考查基因工程的相关知识。(1)利用PCR技术体外扩增DNA。若将基因中个别编码氨基酸的序列替换为编码终止密码子的序列，则改造后的基因转录合成的mRNA中，终止密码子提前出现，将不能控制合成完整长度的多肽(或蛋白质)。(2)目的基因只有与载体连接后才能导入宿主细胞。可提取宿主细胞的总RNA进行分子杂交鉴定，以筛选获得成功表达题述tRNA的转基因宿主细胞。(3)由(2)知，转基因宿主细胞含有的特殊tRNA基因转录的tRNA，该tRNA的反密码子可与终止密码子配对，并可携带非天然氨基酸(Uaa)，所以培养基中需补加非天然氨基酸(Uaa)。病毒中的基因进行转录时，识别其启动子的酶是宿主的RNA聚合酶。(4)因该病毒疫苗具有侵染性，故可引起细胞免疫。
6．(2017·新课标全国卷Ⅰ)真核生物基因中通常有内含子，而原核生物基因中没有，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。已知在人体中基因A(有内含子)可以表达出某种特定蛋白(简称蛋白A)。回答下列问题：
(1)某同学从人的基因组文库中获得了基因A，以大肠杆菌作为受体细胞却未得到蛋白A，其原因是基因A有内含子，在大肠杆菌中，其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除，无法表达出蛋白A。
(2)若用家蚕作为表达基因A的受体，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用噬菌体作为载体，其原因是噬菌体的宿主是细菌，而不是家蚕。
(3)若要高效地获得蛋白A，可选用大肠杆菌作为受体。因为与家蚕相比，大肠杆菌具有繁殖快、容易培养(答出两点即可)等优点。
(4)若要检测基因A是否翻译出蛋白A，可用的检测物质是蛋白A的抗体(填“蛋白A的基因”或“蛋白A的抗体”)。
(5)艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明DNA是遗传物质做出了重要贡献，也可以说是基因工程的先导，如果说他们的工作为基因工程理论的建立提供了启示， 那么，这一启示是DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体。
解析：本题主要考查基因工程的相关知识。(1)从人的基因组文库中获得的基因A中含有内含子，而大肠杆菌属于原核生物，故大肠杆菌不能切除基因A初始转录产物中与内含子对应的RNA序列，故基因A在大肠杆菌中无法表达出蛋白A。(2)由于病毒对宿主细胞的感染具有特异性，噬菌体只能寄生在细菌细胞中，不能感染家蚕细胞，故应选用可感染家蚕的昆虫病毒作为载体。(3)与真核生物相比，大肠杆菌等原核生物具有繁殖快、容易培养、遗传物质相对较少等优点。(4)检测基因A是否翻译出蛋白A，一般用抗原—抗体杂交的方法，即用蛋白A的抗体与从细胞中提取的蛋白质进行杂交，观察是否出现杂交带。(5)肺炎双球菌转化实验的实质是S型菌的DNA进入R型菌体内，并可在R型菌体内完成表达，这证明了DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体，为基因工程奠定了基础。
7．(2017·新课标全国卷Ⅱ)几丁质是许多真菌细胞壁的重要成分，几丁质酶可催化几丁质水解。通过基因工程将几丁质酶基因转入植物体内，可增强其抗真菌病的能力。回答下列问题：
(1)在进行基因工程操作时，若要从植物体中提取几丁质酶的mRNA，常选用嫩叶而不选用老叶作为实验材料，原因是嫩叶组织细胞易破碎。提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是防止RNA降解。
(2)以mRNA为材料可以获得cDNA，其原理是在逆转录酶的作用下，以mRNA为模板按照碱基互补配对的原则可以合成cDNA。
(3)若要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是目的基因无复制原点；目的基因无表达所需启动子(答出两点即可)。
(4)当几丁质酶基因和质粒载体连接时，DNA连接酶催化形成的化学键是磷酸二酯键。
(5)若获得的转基因植株(几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中)抗真菌病的能力没有提高，根据中心法则分析，其可能的原因是目的基因的转录或翻译异常。
解析：本题考查基因工程的相关知识。(1)由于嫩叶组织细胞比老叶细胞易破碎，所以适于作为提取几丁质酶的mRNA的实验材料。由于植物组织中存在的RNA酶能将RNA分解，所以实验过程中要添加RNA酶抑制剂以降低RNA酶的活性，保护提取的RNA不被分解。(2)以mRNA为材料获得cDNA的过程为逆转录，即以mRNA为模板、以4种脱氧核糖核苷酸为原料，在逆转录酶的催化下，遵循碱基互补配对原则，合成cDNA的过程。(3)由于目的基因无复制原点，也无基因表达所需的启动子和终止子，所以需与质粒构建重组质粒后再导入受体细胞。(4)DNA连接酶可以催化两个DNA片段的黏性末端或平末端连接形成磷酸二酯键。(5)几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中，但是植株抗真菌病的能力没有提高，从中心法则角度分析，可能是转基因植株细胞中几丁质酶基因不能转录或不能进行翻译导致的。
8．(2017·新课标全国卷Ⅲ)编码蛋白甲的DNA序列(序列甲)由A、B、C、D、E五个片段组成，编码蛋白乙和丙的序列由序列甲的部分片段组成，如图1所示。
回答下列问题：
(1)现要通过基因工程的方法获得蛋白乙，若在启动子的下游直接接上编码蛋白乙的DNA序列(TTCGCTTCT……CAGGAAGGA)，则所构建的表达载体转入宿主细胞后不能翻译出蛋白乙，原因是编码乙的DNA序列起始端无ATG，转录出的mRNA无起始密码子。
(2)某同学在用PCR技术获取DNA片段B或D的过程中，在PCR反应体系中加入了DNA聚合酶、引物等，还加入了序列甲作为模板，加入了dNTP作为合成DNA的原料。
(3)现通过基因工程方法获得了甲、乙、丙三种蛋白，要鉴定这三种蛋白是否具有刺激T淋巴细胞增殖的作用，某同学做了如下实验：将一定量的含T淋巴细胞的培养液平均分成四组，其中三组分别加入等量的蛋白甲、乙、丙，另一组作为对照，培养并定期检测T淋巴细胞浓度，结果如图2。
①由图2可知：当细胞浓度达到a时，添加蛋白乙的培养液中T淋巴细胞浓度不再增加，此时若要使T淋巴细胞继续增殖，可采用的方法是进行细胞传代培养。细胞培养过程中，培养箱中通常要维持一定的CO2浓度，CO2的作用是维持培养液的pH。
②仅根据图1、图2可知，上述甲、乙、丙三种蛋白中，若缺少C(填“A”“B”“C”“D”或“E”)片段所编码的肽段，则会降低其刺激T淋巴细胞增殖的效果。
解析：本题主要考查基因工程技术和动物细胞培养技术的原理。(1)分析编码蛋白乙的DNA序列可知，起始端无ATG，转录出的mRNA不含起始密码子，所以直接利用该DNA片段构建的表达载体在宿主细胞中不能翻译出蛋白乙。(2)进行PCR扩增时，需要在反应体系中加入热稳定DNA聚合酶、引物、模板DNA、原料dNTP(dCTP、dATP、dGTP、dTTP)等。(3)①因为动物细胞培养具有细胞贴壁和接触抑制的现象，当细胞浓度达到a时，若要使T淋巴细胞继续增殖，则需分瓶进行细胞传代培养；在培养箱中培养细胞时需提供一定的气体环境，其中CO2的作用是维持培养液的pH。②由图2可知，加入蛋白丙刺激T淋巴细胞增殖的效果明显比蛋白甲、乙低；结合图1中蛋白丙与蛋白甲、乙的DNA序列可知，缺少C片段所编码的肽段，会降低蛋白刺激T淋巴细胞增殖的效果。
9．(2017·天津卷节选)玉米自交系(遗传稳定的育种材料)B具有高产、抗病等优良性状，但难以直接培育成转基因植株，为使其获得抗除草剂性状，需依次进行步骤Ⅰ、Ⅱ试验。
Ⅰ.获得抗除草剂转基因玉米自交系A，技术路线如下图。
(1)为防止酶切产物自身环化，构建表达载体需用2种限制酶，选择的原则是A(单选)。
①Ti质粒内，每种限制酶只有一个切割位点
②G基因编码蛋白质的序列中，每种限制酶只有一个切割位点
③酶切后，G基因形成的两个黏性末端序列不相同
④酶切后，Ti质粒形成的两个黏性末端序列相同
A．①③　　　　　　　　 B．①④
C．②③ D．②④
(2)下表是4种玉米自交系幼胚组织培养不同阶段的结果。据表可知，细胞脱分化时使用的激素是2,4-D，自交系乙的幼胚最适合培养成愈伤组织作为转化受体。
(3)农杆菌转化愈伤组织时，T-DNA携带插入其内的片段转移到受体细胞。筛选转化的愈伤组织，需使用含除草剂的选择培养基。
(4)转化过程中，愈伤组织表面常残留农杆菌，导致未转化愈伤组织也可能在选择培养基上生长。含有内含子的报告基因只能在真核生物中正确表达，其产物能催化无色物质K呈现蓝色。用K分别处理以下愈伤组织，出现蓝色的是BD(多选)。
A．无农杆菌附着的未转化愈伤组织
B．无农杆菌附着的转化愈伤组织
C．农杆菌附着的未转化愈伤组织
D．农杆菌附着的转化愈伤组织
(5)组织培养获得的转基因植株(核DNA中仅插入一个G基因)进行自交，在子代含G基因的植株中，纯合子占。继续筛选，最终选育出抗除草剂纯合自交系A。
Ⅱ.略
解析：Ⅰ.(1)利用双酶切可有效防止出现限制酶切割后的产物(目的基因、载体)发生自身环化及目的基因与载体的任意连接现象。这要求每种限制酶在Ti质粒内只有一个切割位点，含目的基因的DNA片段被两种限制酶切割形成的黏性末端碱基序列不同。(2)细胞脱分化形成愈伤组织。表格信息显示，使用了2,4-D促使细胞脱分化。作为转化受体的幼胚，不仅要易脱分化，而且还要易再分化生芽、生根，故乙的幼胚最适合培养成愈伤组织作为转化受体。(3)构建的基因表达载体中有抗生素抗性基因和除草剂抗性基因(除草剂抗性基因位于T-DNA片段上)，因利用农杆菌转化法转基因时，只有T-DNA整合到植物细胞染色体DNA上，故需使用含除草剂的培养基筛选转化的愈伤组织。(4)因“含有内含子的报告基因只能在真核生物中正确表达”，只有细胞内含有报告基因(成功转化)的愈伤组织，用K处理后出现蓝色，故选BD。(5)转基因植株相当于携带G基因的杂合子，转基因植株自交，后代有3/4植株携带G基因，其中纯合子占1/3。
10．(2017·江苏卷)金属硫蛋白(MT)是一类广泛存在的金属结合蛋白，某研究小组计划通过多聚酶链式反应(PCR)扩增获得目的基因，构建转基因工程菌，用于重金属废水的净化处理。PCR扩增过程示意图如下，请回答下列问题：
(1)从高表达MT蛋白的生物组织中提取mRNA，通过逆转录获得cDNA用于PCR扩增。
(2)设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物(引物1和引物2)，为方便构建重组质粒，在引物中需要增加适当的限制性核酸内切酶位点。设计引物时需要避免引物之间形成碱基互补配对，而造成引物自连。
(3)图中步骤1代表变性，步骤2代表退火，步骤3代表延伸，这三个步骤组成一轮循环。
(4)PCR扩增时，退火温度的设定是成败的关键。退火温度过高会破坏引物与模板的碱基配对。退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关，长度相同但GC含量高的引物需要设定更高的退火温度。
(5)如果PCR反应得不到任何扩增产物，则可以采取的改进措施有②③(填序号：①升高退火温度　②降低退火温度　③重新设计引物)。
解析：本题主要考查目的基因的获取及PCR技术的有关知识。(1)依据题中表述现象分析，mRNA合成目的基因的过程应为逆转录过程，由mRNA直接逆转录形成的DNA为cDNA。(2)构建重组质粒时需要限制酶和DNA连接酶，因此推测在引物中需要增加适当的限制酶识别的位点。设计引物时需要注意避免引物1和引物2之间形成碱基互补配对。(3)图中步骤1代表变性。(4)退火温度过高会破坏引物与模板链之间的碱基互补配对。由于含G/C碱基对多的DNA稳定性强，因此在PCR过程中设置的温度应视G/C的含量而定。(5)温度过高不利于引物与模板结合；引物设计不合理也会影响PCR扩增反应。
11．(2016·新课标全国卷Ⅰ)某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamHⅠ酶切后，与用BamHⅠ酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌。结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：
(1)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有能自我复制、具有标记基因(答出两点即可)，而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。
(2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长；并且含有质粒载体和含有插入了目的基因的重组质粒(或答含有重组质粒)的细胞也是不能区分的，其原因是二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含有四环素的固体培养基。
(3)基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自于受体细胞。
解析：(1)质粒作为载体应具备的基本条件有：能自我复制、具有标记基因、含有一至多个限制酶切割位点等。(2)由题意可知，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞中均不含有氨苄青霉素抗性基因，所以在含有氨苄青霉素的培养基上均不能生长。质粒载体上含有氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因，插入了目的基因的重组质粒中仅含有氨苄青霉素抗性基因，所以含有质粒载体和含有插入了目的基因的重组质粒的细胞均能在含有氨苄青霉素的培养基上生长，但前者可以在含有四环素的培养基上生长而后者不能，所以可用含有四环素的培养基，筛选出含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落。(3)噬菌体属于病毒，病毒增殖过程中所需的原料、酶等均来自于受体细胞。
12．(2016·课标全国卷Ⅲ)图(a)中的三个DNA片段上依次表示出了EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ和Sau3A Ⅰ三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图(b)为某种表达载体的示意图(载体上的EcoR Ⅰ、Sau3A Ⅰ的切点是唯一的)。
根据基因工程的有关知识，回答下列问题：
(1)经BamH Ⅰ酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被Sau3AⅠ酶切后的产物连接，理由是两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端。
(2)若某人利用图(b)所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图(c)所示。这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有甲和丙，不能表达的原因是甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录。
(3)DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是T4DNA连接酶。
解析：(1)分析图(a)可知，限制酶Sau3AⅠ与BamHⅠ切割DNA后形成的黏性末端相同，故经这两种酶切割得到的产物可以用DNA连接酶进行连接。(2)构建基因表达载体时，为保证目的基因能在宿主细胞中成功表达，目的基因应插入在启动子和终止子之间，据此可判断甲、丙均不符合要求，目的基因均不能被转录。(3)常见的DNA连接酶有E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶，其中T4DNA连接酶既能连接黏性末端又能连接平末端。
13．(2016·天津卷)人血清白蛋白(HSA)具有重要的医用价值，只能从人血浆中制备。下图是以基因工程技术获取重组HSA(rHSA)的两条途径。
(1)为获取HSA基因，首先需采集人的血液，提取总RNA(或mRNA)合成总cDNA，然后以cDNA为模板，使用PCR技术扩增HSA基因。下图中箭头表示一条引物结合模板的位置及扩增方向，请用箭头在方框内标出另一条引物的位置及扩增方向。
答案：
(2)启动子通常具有物种及组织特异性，构建在水稻胚乳细胞内特异表达rHSA的载体，需要选择的启动子是B(填写字母，单选)。
A．人血细胞启动子
B．水稻胚乳细胞启动子
C．大肠杆菌启动子
D．农杆菌启动子
(3)利用农杆菌转化水稻受体细胞的过程中，需添加酚类物质，其目的是吸引农杆菌移向水稻受体细胞，有利于目的基因成功转化。
(4)人体合成的初始HSA多肽，需要经过膜系统加工形成正确空间结构才有活性。与途径Ⅱ相比，选择途径Ⅰ获取rHSA的优势是水稻是真核生物，具有膜系统，能对初始rHSA多肽进行高效加工。
(5)为证明rHSA具有医用价值，须确认rHSA与HSA的生物学功能一致。
解析：本题主要考查基因工程的相关知识。(1)总cDNA是以mRNA为模板逆转录合成的，所以需要提取人的总RNA或mRNA；PCR扩增的原理是DNA复制，DNA复制时，两条子链的延伸方向相反，所以引物的位置及方向如答案所示。(2)要使rHSA基因在水稻胚乳细胞内特异性表达，需要选择水稻胚乳细胞的启动子。(3)酚类物质可吸引农杆菌移向水稻受体细胞，使农杆菌Ti质粒上的T-DNA转移到受体细胞并整合到受体细胞染色体的DNA上，有利于目的基因成功转化。(4)大肠杆菌为原核生物，无内质网和高尔基体，不能对多肽进行高效加工，而水稻是真核生物，具有内质网和高尔基体，可对多肽链进行高效加工。(5)要证明rHSA具有医用价值，须确认rHSA与HSA的生物学功能一致。
14．在体内，人胰岛素基因表达可合成出一条称为前胰岛素原的肽链，此肽链在内质网中经酶甲切割掉氨基端一段短肽后成为胰岛素原，进入高尔基体的胰岛素原经酶乙切割去除中间片段C后，产生A、B两条肽链，再经酶丙作用生成由51个氨基酸残基组成的胰岛素。目前，利用基因工程技术可大量生产胰岛素。回答下列问题：
(1)人体内合成前胰岛素原的细胞是胰岛B细胞，合成胰高血糖素的细胞是胰岛A细胞。
(2)可根据胰岛素原的氨基酸序列， 设计并合成编码胰岛素原的DNA序列，用该序列与质粒表达载体构建胰岛素原基因重组表达载体，再经过细菌转化、筛选及鉴定，即可建立能稳定合成胰岛素原的基因工程菌。
(3)用胰岛素原抗体检测该工程菌的培养物时，培养液无抗原抗体反应，菌体有抗原抗体反应，则用该工程菌进行工业发酵时，应从菌体中分离、纯化胰岛素原。胰岛素原经酶处理便可转变为胰岛素。
解析：(1)人体合成前胰岛素原的细胞是胰岛B细胞，合成胰高血糖素的细胞是胰岛A细胞。(2)蛋白质工程生产胰岛素时，需根据胰岛素原的氨基酸序列，设计并合成编码胰岛素原的脱氧核苷酸序列(目的基因)，然后再构建胰岛素原基因重组表达载体，导入细菌细胞内，再经过细菌转化、筛选及鉴定，即可建立能稳定合成胰岛素原的工程菌。(3)运用抗原—抗体检测法检测胰岛素原时，培养液无抗原抗体反应，菌体有抗原抗体反应，故应从菌体中分离、纯化胰岛素原。
15．已知生物体内有一种蛋白质(P)，该蛋白质是一种转运蛋白，由305个氨基酸组成。如果将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸，240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸，改变后的蛋白质(P1)不但保留P的功能，而且具有了酶的催化活性。回答下列问题：
(1)从上述资料可知，若要改变蛋白质的功能，可以考虑对蛋白质的氨基酸序列(或结构)(其他合理答案亦可)进行改造。
(2)以P基因序列为基础，获得P1基因的途径有修饰P基因或合成P1基因。所获得的基因表达时是遵循中心法则的，中心法则的全部内容包括DNA和RNA(或遗传物质)的复制；以及遗传信息在不同分子之间的流动，即：DNA→RNA、RNA→DNA、RNA→蛋白质(或转录、逆转录、翻译)。
(3)蛋白质工程也被称为第二代基因工程，其基本途径是从预期蛋白质功能出发，通过设计蛋白质的结构和推测氨基酸序列，进而确定相对应的脱氧核苷酸序列，据此获得基因，再经表达、纯化获得蛋白质，之后还需要对蛋白质的生物功能进行鉴定。
解析：(1)蛋白质的功能与结构相关，若要改变蛋白质的功能，需要对其结构进行改造。(2)确定目的基因的碱基序列后，可通过对现有基因进行改造或者重新合成来获得目的基因。中心法则的内容包括遗传信息的复制、转录、逆转录和翻译。(3)蛋白质工程的基本途径是从预期蛋白质功能出发，通过设计蛋白质的结构和推测氨基酸序列，进而确定相对应的脱氧核苷酸序列。获得蛋白质之后要对蛋白质的生物功能进行鉴定。
16．GDNF是一种神经营养因子，对损伤的神经细胞具有营养和保护作用。研究人员构建了含GDNF基因的表达载体(如图(1)所示)，并导入到大鼠神经干细胞中，用于干细胞基因治疗的研究。请回答：
(1)在分离和培养大鼠神经干细胞的过程中，使用胰蛋白酶的目的是使细胞分散开。
(2)构建含GDNF基因的表达载体时，需选择图(1)中的XhoⅠ限制酶进行酶切。
(3)经酶切后的载体和GDNF基因进行连接，连接产物经筛选得到的载体主要有3种：单个载体自连、GDNF基因与载体正向连接、GDNF基因与载体反向连接(如图(1)所示)。为鉴定这3种连接方式，选择HpaⅠ酶和BamHⅠ酶对筛选得到的载体进行双酶切，并对酶切后的DNA片段进行电泳分析，结果如图(2)所示。图中第②泳道显示所鉴定的载体是正向连接的。
(4)将正向连接的表达载体导入神经干细胞后，为了检测GDNF基因是否成功表达，可用相应的抗体与提取的蛋白质杂交。当培养的神经干细胞达到一定密度时，需进行传代培养以得到更多数量的细胞，用于神经干细胞移植治疗实验。
解析：(1)因动物细胞体外培养时有接触抑制现象，故需用胰蛋白酶处理动物组织，使细胞分散开。(2)目的基因两端及载体DNA分子中均有XhoⅠ酶识别的核苷酸序列，故构建基因表达载体时，应用XhoⅠ酶切割DNA分子。(3)图示可知载体中酶HpaⅠ与XhoⅠ切割点距离为100 bp，GDNF基因切割成600 bp和100 bp两种DNA片段，由正向连接的重组载体中GDNF基因方向与HpaⅠ、XhoⅠ酶切割结果可知，正向连接的重组载体被酶HpaⅠ和酶XhoⅠ切割后，将得到6 000 bp和700 bp两种DNA片段，即为②。(4)可用抗原—抗体杂交原理，对目的基因是否表达进行检测。当培养液中的细胞达到一定密度后，可分瓶进行传代培养，以获得更多数量的细胞。
17．植物甲具有极强的耐旱性，其耐旱性与某个基因有关。若从该植物中获得该耐旱基因，并将其转移到耐旱性低的植物乙中，有可能提高后者的耐旱性。
回答下列问题：
(1)理论上，基因组文库含有生物的全部基因；而cDNA文库中含有生物的部分(其他合理答案也可)基因。
(2)若要从植物甲中获得耐旱基因，可首先建立该植物的基因组文库，再从中筛选(其他合理答案也可)出所需的耐旱基因。
(3)将耐旱基因导入农杆菌，并通过农杆菌转化法将其导入植物乙的体细胞中，经过一系列的过程得到再生植株。要确认该耐旱基因是否在再生植株中正确表达，应检测此再生植株中该基因的表达产物(其他合理答案也可)，如果检测结果呈阳性，再在田间试验中检测植株的耐旱性是否得到提高。
(4)假如用得到的二倍体转基因耐旱植株自交，子代中耐旱与不耐旱植株的数量比为3?1时，则可推测该耐旱基因整合到了同源染色体的一条上(填“同源染色体的一条上”或“同源染色体的两条上”)。
解析：(1)基因组文库包含某种生物的全部基因，cDNA文库又称为部分基因文库，含有生物的部分基因。(2)植物甲基因组文库中有该种植物的全部基因，从中可筛选出耐旱基因。(3)植物乙的耐旱性低，所以植物乙体细胞作为受体细胞；要确定耐旱基因是否正确表达，应检测该基因的表达产物，对于个体水平的检测，应在干旱的田间进行试验，检验植物乙耐旱性是否得到了提高。(4)将耐旱基因看作A，不耐旱基因看作a，Aa×Aa→耐旱与不耐旱数量比为3?1，则耐旱基因整合到了同源染色体的一条上。
考点二　细胞工程
强化学思知能　　　学有所思，思有深度
[知识·核心·热点]
1．理清植物细胞工程两大技术
2．理清动物细胞培养的成分、过程及相关酶
(1)培养基的特有成分：动物血清。
(2)培养过程：原代培养、传代培养。
(3)制备悬液的酶：胰蛋白酶或胶原蛋白酶。
3．完善下面克隆动物培育流程图
4．把握动物细胞融合的原理、方法及应用
(1)原理：细胞膜的流动性。
(2)促融方法：灭活的病毒、物理法、化学法。
(3)应用：制备单克隆抗体。
5．理清单克隆抗体制备的过程
[范例·调研·方法]
【典例2】　(2016·新课标全国卷Ⅱ)下图表示通过核移植等技术获得某种克隆哺乳动物(二倍体)的流程。
回答下列问题：
(1)图中A表示正常细胞核，染色体数为2n，则其性染色体的组成可为XX或XY。过程①表示去除细胞核，该过程一般要在卵母细胞培养至适当时期再进行，去核时常采用显微操作的方法。②代表的过程是胚胎移植。
(2)经过多次传代后，供体细胞中遗传物质的稳定性会降低。因此，选材时必须关注传代次数。
(3)若获得的克隆动物与供体动物性状不完全相同，从遗传物质的角度分析其原因是卵母细胞的细胞质中的遗传物质会对克隆动物的性状产生影响。
(4)与克隆羊“多利”培育成功一样，其他克隆动物的成功获得也证明了动物已分化的体细胞的细胞核具有全能性。

1．抓信息：核移植、克隆、二倍体。
2．点思路：
(1)体细胞核移植过程：
【学发挥】——高考大题长句表达专项练
已免疫的B细胞和骨髓瘤细胞融合实验完成后，融合体系中除含有未融合的细胞和杂交瘤细胞外，可能还有B淋巴细胞相互融合形成的细胞、骨髓瘤细胞相互融合形成的细胞，体系中出现多种类型细胞的原因是细胞融合是随机的，且融合率达不到100%。
【典例3】　随着科学的发展，现代生物技术已经广泛应用于社会生产的方方面面。请回答下列相关问题：
(1)植物组织培养技术不仅可以保持优良品种的遗传特性，还可以高效快速地实现种苗的大量繁殖。若想获得脱毒苗，可以切取一定大小的茎尖等进行组织培养。
(2)在植物的组织培养过程中，一直处于不断的分生状态的培养细胞，容易受到培养条件和外界压力的影响而发生突变。
(3)科学家利用植物组织培养技术与基因工程技术结合，培育出抗虫棉。但由于抗虫基因插入宿主基因组的部位往往是随机的，有时候出现一些意想不到的结果。因此，需检测抗虫棉的抗虫特性，除进行分子水平检测外，有时还需要进行个体生物学水平的检测。

1．抓信息：植物组织培养技术、脱毒苗、抗虫棉。
2．点思路：
【学发挥】——高考大题长句表达专项练
经植物组织培养得到的胚状体、顶芽、不定芽、腋芽等材料用人工薄膜包装后可得到人工种子。
题组冲关调研　　　练有所得，得有高度
1．知识性失误(判断正误)
(1)去除植物细胞的细胞壁和将动物组织分散成单个细胞均需酶处理(　√　)
(2)产生抗人白细胞介素-8抗体的杂交瘤细胞的筛选必须通过分子检测(　√　)
(3)21三体综合征的诊断必须通过分子检测(　×　)
提示：21三体综合征也可通过显微镜观察。
(4)乳腺细胞比乳腺癌细胞更容易进行离体培养(　×　)
提示：癌细胞具有无限增殖的能力，因此乳腺癌细胞比乳腺细胞更容易进行离体培养。
(5)培养保留接触抑制的细胞在培养瓶壁上可形成多层细胞(　×　)
提示：由于接触抑制，动物细胞培养时只能形成单层细胞。
(6)动物杂交瘤细胞产生单克隆抗体体现了细胞的全能性(　×　)
提示：动物杂交瘤细胞能够产生单克隆抗体，但没有形成完整的个体，不能体现细胞的全能性。
(7)体细胞杂交技术可用于克隆动物和制备单克隆抗体(　×　)
提示：克隆动物利用了细胞核移植、早期胚胎培养和胚胎移植等技术，体细胞杂交技术目前主要用于制备单克隆抗体。
(8)细胞核移植主要在同种动物、同种组织的细胞之间进行(　×　)
提示：细胞核移植中，供体为胚胎干细胞的核，也可以是体细胞的核，受体大多是动物的卵子，所以不是同一种组织。
2．(2018·新课标全国卷Ⅲ)2018年《细胞》期刊报道，中国科学家率先成功地应用体细胞对非人灵长类动物进行克隆，获得两只克隆猴——“中中”和“华华”。回答下列问题：
(1)“中中”和“华华”的获得涉及核移植过程，核移植是指将动物的一个细胞核，移入一个已去掉细胞核的卵母细胞。通过核移植方法获得的克隆猴，与核供体相比，克隆猴体细胞的染色体数目不变(填“减半”“加倍”或“不变”)。
(2)哺乳动物的核移植可以分为胚胎细胞核移植和体细胞核移植，胚胎细胞核移植获得克隆动物的难度小于(填“大于”或“小于”)体细胞核移植，其原因是胚胎细胞分化程度低，恢复全能性相对容易。
(3)在哺乳动物核移植的过程中，若分别以雌性个体和雄性个体的体细胞作为核供体，通常，所得到的两个克隆动物体细胞的常染色体数目相同(填“相同”或“不同”)，性染色体组合不同(填“相同”或“不同”)。
解析：(1)核移植是指将动物的一个细胞核，移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，并最终发育为动物个体。克隆猴体细胞的染色体数等于重组细胞中的染色体数，等于供核细胞中的染色体数。(2)哺乳动物胚胎细胞分化程度低，恢复全能性相对容易，而哺乳动物体细胞分化程度高，恢复全能性十分困难，因此，动物体细胞核移植获得克隆猴的难度也就明显高于胚胎细胞核移植。(3)哺乳动物雌性个体和雄性个体的体细胞中常染色体数目相同，雌性性染色体组合为XX，雄性性染色体组合为XY，因此题中所得的两个克隆动物体细胞常染色体数目相同，性染色体组合不同。
3．科学家通过诱导黑鼠体细胞去分化获得诱导性多能干细胞(iPS)，继而利用iPS细胞培育出与黑鼠遗传特性相同的克隆鼠，流程如下：
(1)从黑鼠体内获得体细胞后，对其进行的初次培养称为原代培养，培养的细胞在贴壁生长至铺满培养皿底时停止分裂，这种现象称为接触抑制。
(2)图中2-细胞胚胎可用冲卵(或冲胚)方法从灰鼠输卵管内获得，也可从灰鼠体内取出卵子，通过体外受精(或核移植)后进行早期胚胎培养获得。
(3)图中重组囊胚通过胚胎移植技术移入白鼠子宫内继续发育，暂不移入的胚胎可使用冷冻(或低温)方法保存。
(4)小鼠胚胎干细胞(ES)可由囊胚的内细胞团分离培养获得，iPS与ES细胞同样具有诱导分化，有望在对人类iPS细胞进行定向诱导分化后用于疾病的细胞治疗。
解析：该题综合考查动物细胞工程和胚胎工程技术的原理和方法。(1)对动物细胞进行的初次培养为原代培养，动物细胞培养时具有细胞贴壁生长和接触抑制现象。(2)胚胎移植所需的胚胎可从供体输卵管中通过冲卵的方法获得，也可将卵子经体外受精或核移植后获得的受精卵或重组细胞进一步培养得到早期胚胎。(3)图中重组囊胚通过胚胎移植技术移入白鼠子宫内继续发育，暂不移入的胚胎可进行冷冻保存。(4)胚胎干细胞常由囊胚的内细胞团分离培养获得，由于iPS细胞具有发育的全能性，经定向诱导可分化形成特定组织细胞，因而在医学上具有广阔的应用前景。
4．(2018·石家庄三模)运用植物组织培养技术，可以实现优良品种的快速繁殖，培育出大量不含病毒的幼苗，实现花卉的连续生产，请回答下列有关问题：
(1)进行组织培养时，常用MS固体培养基，与微生物培养基相比，该培养基含有更多的无机盐，在应用时常常添加植物激素(或生长素和细胞分裂素)。
(2)愈伤组织细胞的特点：排列疏松无规则，高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细胞。
(3)培育被子植物花粉植株一般有两种途径：脱分化成胚状体或愈伤组织，经过诱导再分化出丛芽和根，进而发育成幼苗。
解析：(1)进行组织培养时，常用MS固体培养基，该培养基与微生物培养基的不同点在于其成分中含更多的无机盐。培养过程中在培养基中需要添加植物激素，最常用的植物激素是生长素和细胞分裂素。
(2)愈伤组织细胞的特点：排列疏松无规则，高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细胞。
(3)培育被子植物花粉植株一般有两种途径：脱分化形成胚状体或愈伤组织，经过诱导再分化出丛芽和根，进而发育成幼苗。
5．(2018·西安二模)自印度科学家培养曼陀罗花药获得单倍体植株后，花药离体培养技术发展迅速，据记载，现在已经有250多种高等植物的花药培养成功。
(1)植物组织培养中，常采用MS培养基，主要包括的成分有水、大量元素、微量元素、有机物，还需要添加植物激素。
(2)细胞分裂素和生长素的使用顺序和用量会影响到植物细胞的发育方向。如为了有利于细胞分裂而不分化，两种激素的使用顺序为：先使用生长素，后使用细胞分裂素。
(3)消毒后的花蕾，在无菌条件下除去萼片与花瓣，剥离花药时，尽量不要损伤花药，同时要将花丝彻底去除。
解析：(1)植物组织培养常采用的培养基为MS培养基；MS培养基的组成成分有水、大量元素、微量元素、有机物，还必须添加植物激素(生长素和细胞分裂素)。
(2)先加生长素，后加细胞分裂素可以使细胞分裂而不分化。
(3)花药离体培养时，剥离花药时，尽量不要损伤花药，同时要将花丝彻底去除，防止得到正常染色体数目的个体。
6．从黄花蒿中提取的青蒿素是当今最好的抗疟药物之一，黄花蒿的植物组织培养研究在我国已有数年历史。请回答下列相关问题：
(1)选取黄花蒿的茎段后，通常先用体积分数为70%的酒精对外植体进行消毒。
(2)黄花蒿的组织培养研究中需要(填“需要”或“不需要”)做重复实验，实验中可以取一个经过灭菌的只装有培养基的锥形瓶与接种操作后的锥形瓶一同培养，用来证明培养基没有被杂菌污染。
(3)在植物组织培养中常用到生长素和细胞分裂素。若要达到使细胞既分裂也分化的结果，两类激素的使用顺序应当是先使用细胞分裂素，后使用生长素。如果已经长出丛芽，最好同时使用上述两类激素，且生长素与细胞分裂素用量的比值高(填“高”“低”或“适中”)时，则有利于下一步的培养。
(4)有人在培养基中添加秋水仙素以诱导黄花蒿茎段细胞发生染色体数目变异，则秋水仙素的作用时期是有丝分裂的前期。
解析：(1)外植体是生物材料，应消毒，不能灭菌。
(2)组织培养实验通过设计空白对照组，可确定无菌技术是否合格，如果对照组长出菌落，则说明培养基被杂菌污染，反之，则没有。
(3)先使用生长素，后使用细胞分裂素，有利于细胞分裂，但细胞不分化；先使用细胞分裂素，后使用生长素，细胞既分裂也分化；同时使用，分化频率提高。同时使用，生长素用量与细胞分裂素用量比值高时，有利于根分化、抑制芽的形成；比值低时，有利于芽的分化、抑制根的形成；比值适中时，促进愈伤组织形成。
(4)秋水仙素作用于有丝分裂前期，抑制纺锤体的形成，使细胞染色体数目加倍。

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