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第十三单元 现代生物科技专题(选修3)
第一讲 基因工程
考点一
基因工程的操作工具
[重难深化类]
重温教材·自学区
大肠杆菌
磷酸二酯键
黏性
黏性
种类 E·coli DNA连接酶 T4DNA连接酶
来源 _____________ T4噬菌体
特点 只缝合____末端 缝合____末端和末端
作用 恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的___________
基 础 自 测
核心素养·提能区
作用结果
作用底物
作用部位
名称
将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端
脱氧核苷酸
磷酸二酯键
DNA聚合酶或热稳定DNA聚合酶
将两个DNA片段连接为一个DNA分子
DNA片段
磷酸二酯键
DNA连接酶
将DNA切成两个片段
DNA
磷酸二酯键
限制酶
对 点 落 实

限制酶 BamHⅠ BclⅠ Sau3AⅠ HindⅢ
识别序
列及切
割位点




考点二
基因工程的基本操作程序
重温教材·自学区
农杆菌转化法
显微注射技术
受体细胞类型 方法
植物细胞 ____________、基因枪法、花粉管通道法
动物细胞 ________________(注射到受精卵内)
微生物细胞 感受态细胞法(Ca2＋处理法)
DNA分子杂交
抗原—抗体杂交
杂交带
检测目的 检测方法 判断标准
目的基因是否插入转基因生物的DNA ______________技术 是否出现杂交带
检测目的 检测方法 判断标准
目的基因是否转录出了mRNA 分子杂交技术 是否出现______
目的基因是否翻译出蛋白质 ______________技术 是否出现杂交带
个体水平的检测 如抗虫、抗病的接种实验 是否表现出相应的特性
基 础 自 测
核心素养·提能区
过程
方法
逆转
录法
化学
合成法
从部分基因文
库中获取，如
cDNA文库
从基因组文
库中获取
人工合成
从基因文库中获取
图解
说明
过程
温度上升到72 ℃左右，Taq酶从引物起始合成互补链，可使新链由5′端向3′端延伸
延伸
温度下降到55 ℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
复性
温度上升到90 ℃左右，双链DNA解聚为单链
变性
对 点 落 实
缓冲液 50 mmol/L Na2HPO4?KH2PO4 50 mmol/L
Tris?HCl 50 mmol/L
Gly?NaOH
pH 6.0 6.5 7.0 7.5 7.5 8.0 8.5 9.0 9.0 9.5 10.0 10.5
酶相对
活性(%) 25.4 40.2 49.8 63.2 70.1 95.5 99.5 85.3 68.1 63.7 41.5 20.8
考点 三
基因工程的应用与蛋白质工程
重温教材·自学区
基 础 自 测
核心素养·提能区
体内基因治疗
体外基因治疗
　 方法
比较　　
都是将外源基因导入靶细胞，以纠正缺陷基因，目前两种方法都处于临床试验阶段
相同点
方法较简单，但效果难以控制
操作复杂，但效果可靠
特点
直接向患者体内组织细胞中转移基因
从患者体内获得某种细胞→体外完成基因转移→筛选、细胞扩增→输入体内
途径
不
同
点
进展
操作过程
原理
临床
应用
制作特定DNA探针与病人样品DNA混合，分析杂交带情况
碱基互
补配对
基因诊断
临床
试验
利用正常基因导入有基因缺陷的细胞中，以表达出正常性状来治疗(疾病)
基因
表达
基因
治疗
基因工程
蛋白质工程
项目
区别
与联系
只能生产自然界已有的蛋白质
可生产自然界没有的蛋白质
结果
定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的类型或生物产品
定向改造或生产人类所需的蛋白质
实质
获取目的基因→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定
预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列
过程
区别
①蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出来的第二代基因工程
②基因工程中所利用的某些酶需要通过蛋白质工程进行修饰、改造
联系
基因工程
蛋白质工程
项目
区别
与联系
对 点 落 实
考点四
DNA的粗提取与鉴定
基 础 自 测
核心素养·提能区
0.14 mol/L NaCl溶液
2 mol/L
NaCl溶液
溶解规律
DNA
溶解
部分发生
盐析沉淀
NaCl溶液物质的量浓度从2 mol/L逐渐降低的过程中，溶解度逐渐增大
蛋白质
析出
溶解
用NaCl
溶液4次
用纱布
过滤4次
加蒸馏
水2次
①加2 mol/L的NaCl溶液，溶解提取的细胞核物质；
②用0.14 mol/L的NaCl溶液使DNA析出；
③用2 mol/L的NaCl溶液，溶解滤取的DNA黏稠物；
④用2 mol/L的NaCl溶液，溶解丝状物用于鉴定DNA
①过滤血细胞破裂液，得到含细胞核物质的滤液；
②过滤溶有DNA的2 mol/L的NaCl溶液；
③滤取0.14 mol/L的NaCl溶液中析出的DNA(黏稠物)；
④再次过滤溶有DNA的2 mol/L的NaCl溶液
①加到鸡血细胞液中，使血细胞吸收水破裂；
②加到含DNA的2 mol/L的NaCl溶液中，使NaCl溶液的物质的量浓度下降到0.14 mol/L，使DNA析出
对 点 落 实
课堂一刻钟
易错探因——审题不细
解答本小题可因审题不细致，误认为是XhoⅠ和SalⅠ两种限制酶同时作用于DNA片段，而不能得出正确答案。这要求学生在平时的练习中养成仔细审题的习惯，必要时可在关键部位进行标注。　
解题关键——归纳整合
本题综合了必修①还原糖和蛋白质的鉴定与选修①DNA的提取与鉴定的相关实验的原理与步骤，意在考查考生的归纳整合和辨别能力。这也启示我们在复习选修内容时要注意与必修部分的知识相联系，多进行归纳整合。
易错探因——知识不全
本题考查对“DNA的粗提取和鉴定”实验的原理、实验材料的选择、实验采用的试剂及试剂的作用等的记忆，需要考生识记的细节较多，考生在平时的学习过程中要注意积累。　　　
解题关键——信息获取
解答本小题应先根据“蛋白质会被降解”的信息，再根据酶的专一性原理可推测大肠杆菌体内含有分解该蛋白质的酶，以此作为突破口即可成功解答本小题。　
解题关键——信息获取
本题结合新情景、新材料考查考生从题干及题图中获取信息的能力。在解答此类问题时应注重信息获取和结合已有的知识理解、应用信息。
解题关键——理解应用
本题主要考查PCR技术的相关知识，要求考生理解PCR的具体过程，以及引物的作用，学会分析引物或温度改变对PCR结果的影响。
学情考情 ? 了然于胸
1.识记能力：主要考查对基因工程操作工具的种类、作用和特点及基本操作程序等的记忆。
2.读图能力：如限制酶的选择及基因表达载体的构建常以图示为载体进行考查。
3.实验操作能力：DNA的粗提取的原理、方法、操作步骤等。
4.综合应用能力：如第3、4、5题，考查考生综合运用基因工程的相关知识解决相关生物学问题的能力。
考查能力
2.获取目的基因的方法、限制酶的选择及基因表达载体的构建是高频考点，也是难点、易错点。
3.DNA的粗提取与鉴定。
1.基因工程三种操作工具的特点及作用、基因工程的基本操作程序是常规考点，难度一般。
考查知识






基因工程
考点一　基因工程的操作工具


1．限制性核酸内切酶(简称限制酶)
(1)来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。
(2)作用：识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列并切开特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
(3)结果：产生黏性末端或平末端。
2．DNA连接酶
种类 E·coli DNA连接酶 T4DNA连接酶
来源 大肠杆菌 T4噬菌体
特点 只缝合黏性末端 缝合黏性末端和末端
作用 恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键

3．载体
(1)作用：携带外源DNA片段进入受体细胞。
(2)种类：质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。
(3)条件
[基础自测]
1．判断下列叙述的正误
(1)切割质粒的限制性核酸内切酶均能特异性地识别6个核苷酸序列(×)
(2)载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因(×)
(3)限制酶只能用于切割目的基因(×)
(4)DNA连接酶能将两碱基间通过氢键连接起来(×)
(5)限制性核酸内切酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具酶(×)
(6)E·coli DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端(×)
(7)用于载体的质粒DNA分子上至少含一个限制酶识别位点(√)
(8)载体的作用是携带目的基因导入受体细胞中，使之稳定存在并表达(√)
2．载体需具备的条件及其作用(连线)

3．据两种限制酶的作用图示填空
(1)已知限制酶EcoRⅠ和SmaⅠ识别的碱基序列和酶切位点分别为G↓AATTC和CCC↓GGG，在图中画出两种限制酶切割DNA后产生的末端。

(2)写出产生的末端的种类：①产生的是黏性末端；②产生的是平末端。
(3)EcoRⅠ限制酶和SmaⅠ限制酶识别的碱基序列不同，切割位点不同(填“相同”或“不同”)，说明限制酶具有专一性。
4．学透教材、理清原因、规范答题用语专练

(1)①是________酶，②是____________酶，二者的作用部位都是______________。
(2)限制酶不切割自身DNA的原因：__________________________________________。
答案：(1)限制　DNA连接　磷酸二酯键　(2)自身DNA不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰



1.与DNA有关的酶的比较
名称 作用部位 作用底物 作用结果
限制酶 磷酸二酯键 DNA 将DNA切成两个片段
DNA连接酶 磷酸二酯键 DNA片段 将两个DNA片段连接为一个DNA分子
DNA聚合酶或热稳定DNA聚合酶 磷酸二酯键 脱氧核苷酸 将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端
DNA(水解)酶 磷酸二酯键 DNA 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
解旋酶 碱基对之间的氢键 DNA 将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链
RNA聚合酶 磷酸二酯键 核糖核苷酸 将单个核糖核苷酸依次连接到单链末端
2．限制酶的特点与使用
(1)限制酶具有特异性，即一种限制酶只能识别特定的核苷酸序列，并在特定的位点上进行切割；限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
(2)在获取目的基因和切割载体时通常用同一种限制酶，以获得相同的黏性末端。但如果用两种不同限制酶切割后形成的黏性末端相同，在DNA连接酶的作用下目的基因与载体也可以连接起来。
(3)为了防止载体或目的基因的黏性末端自己连接即所谓“环化”，可用不同的限制酶分别处理含目的基因的DNA和载体，使目的基因两侧及载体上各自具有两个不同的黏性末端。
[对点落实]
1．(2016·全国卷Ⅲ)图(a)中的三个DNA片段上依次表示出了EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ和Sau3AⅠ三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图(b)为某种表达载体的示意图(载体上的EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切点是唯一的)。
↓　　　　　　　　↓　　　　　　　↓
——GAATTC——　——GGATCC——　——GATC——
——CTTAAG——　——CCTAGG——　——CTAG——
　　　　　↑　　　　　　　　↑　　　　　　　↑
图(a)
根据基因工程的有关知识，回答下列问题：
(1)经BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被________酶切后的产物连接，理由是____________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(2)若某人利用图(b)所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图(c)所示。这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有________，不能表达的原因是_______________________________________________________________________
________________________________________________________________________。

图(b)　　　　　　　　　　图(c)
(3)DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有________________和________________，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是______________。
解析：(1)由题图可知，BamHⅠ和Sau3AⅠ两种限制性内切酶的共同识别序列是，二者切割可以形成相同的黏性末端，因此经BamHⅠ酶切得到的目的基因可以与图(b)所示表达载体被Sau3AⅠ酶切后的产物连接。(2)在基因表达载体中，启动子应位于目的基因的首端，终止子应位于目的基因的尾端，这样目的基因才能顺利地转录，再完成翻译过程，即顺利表达。图中甲所示的目的基因插入在启动子的上游，丙所示目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录，因此目的基因不能表达。(3)常见的DNA连接酶有E·coli DNA连接酶和T4DNA连接酶，其中T4DNA连接酶既能连接黏性末端又能连接平末端。
答案：(1)Sau3AⅠ　两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端　(2)甲和丙　甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录(其他合理答案也可)　(3)E·coli DNA连接酶　T4DNA连接酶　T4DNA连接酶(其他合理答案也可)
2．(2016·江苏高考，有改动)下表是几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中标注了相关限制酶的酶切位点，其中切割位点相同的酶不重复标注。请回答下列问题：
限制酶 BamHⅠ BclⅠ Sau3AⅠ Hind Ⅲ
识别序 列及切 割位点



(1)用图中质粒和目的基因构建重组质粒，应选用__________________两种限制酶切割，酶切后的载体和目的基因片段，通过________酶作用后获得重组质粒。为了扩增重组质粒，需将其转入处于________态的大肠杆菌。
(2)为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加________，平板上长出的菌落，常用PCR鉴定，所用的引物组成为图2中________________________________________________________________________。
(3)若BamHⅠ酶切的DNA末端与BclⅠ酶切的DNA末端连接，连接部位的6个碱基对序列为________________________，对于该部位，这两种酶________(填“都能”“都不能”或“只有一种能”)切开。
(4)若用Sau3AⅠ切图1质粒最多可能获得________种大小不同的DNA片段。
解析：(1)基因工程中选择合适的限制酶切割质粒和目的基因时，应保留目的基因和至少一个标记基因结构的完整性，即遵循“目的基因切两侧，标记基因留一个”的基本原则，最好选择切割产生不同末端的两种限制酶同时切割质粒和目的基因，以避免目的基因的反向插入带来的不正常表达，因此据图分析应选择的限制酶为BclⅠ和HindⅢ，切割后质粒上保留的四环素抗性基因作为标记基因。酶切后的载体和目的基因通过DNA连接酶的作用形成重组质粒，重组质粒需要导入Ca2＋处理后的处于感受态的大肠杆菌(处于感受态的大肠杆菌细胞膜的通透性大大增加，便于重组质粒进入)。(2)由上述分析可知，为了筛选出导入重组质粒的大肠杆菌，应先配制含四环素的选择培养基，平板上长出的菌落为导入普通质粒或重组质粒的大肠杆菌菌落，进一步鉴定出导入重组质粒的大肠杆菌，可利用PCR扩增的方式，结合电泳技术来分析处理。DNA的两条链是反向平行的，在PCR过程中，当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶只能从引物的3′端延伸DNA链，因此应选择引物甲和引物丙。(3)因为BclⅠ和BamHⅠ酶切产生的黏性末端相同，所以可以被DNA连接酶连接，连接部位的6个碱基对序列为，但是连接后形成的DNA中不再具有BclⅠ和BamHⅠ的识别序列，连接部位不能被这两种酶切开。(4)由图可知，能被限制酶BclⅠ和BamHⅠ切割的序列也能被Sau3AⅠ识别并切割，因此图中质粒上存在3个Sau3AⅠ的切割位点，若将3个切割位点之间的DNA片段分别编号为a、b和c，则完全酶切(3个切割位点均被切割)会产生3种大小的DNA片段，即为a、b和c；考虑只切1个切割位点，有3种情况，都产生1种大小的DNA片段，即大小均为a＋b＋c；考虑切2个切割位点，则会产生a＋b、c、a＋c、b、b＋c、a几种不同大小的DNA片段。综上所述，若用Sau3AⅠ识别并切割图中质粒，最多可获得7种大小的DNA片段，即为a＋b＋c、a＋b、a＋c、b＋c、a、b、c。
答案：(1)BclⅠ和HindⅢ　连接　感受　(2)四环素　引物甲和引物丙　(3)　都不能　(4)7
[类题通法]
选择限制酶的技巧

(1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类
①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。
②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。
③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。
(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类
①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶一致，以确保具有相同的黏性末端。
②质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶SmaⅠ会破坏标记基因。







考点二　基因工程的基本操作程序

　基因工程的基本操作程序
―→―→―→
1．目的基因的获取
(1)目的基因：主要是指编码蛋白质的基因，也可以是具有调控作用的因子。
(2)获取方法
2．基因表达载体的构建
(1)构建基因表达载体的目的
①使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。
②使目的基因能够表达和发挥作用。
(2)基因表达载体的组成：目的基因、启动子、终止子及标记基因等。
3．目的基因导入受体细胞
受体细胞类型 方法
植物细胞 农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法
动物细胞 显微注射技术(注射到受精卵内)
微生物细胞 感受态细胞法(Ca2＋处理法)

4．目的基因的检测与鉴定
检测目的 检测方法

目的基因是否插入转基因生物的DNA DNA分子杂交技术 是否出现杂交带
目的基因是否转录出了mRNA 分子杂交技术 是否出现杂交带
目的基因是否翻译出蛋白质 抗原—抗体杂交技术 是否出现杂交带
个体水平的检测 如抗虫、抗病的接种实验 是否表现出相应的特性

[基础自测]
1．判断下列叙述的正误
(1)表达载体的复制和胰岛素基因的表达均启动于复制原点(×)
(2)转基因抗虫棉植株抗虫效果的鉴定必须通过分子检测(×)
(3)PCR反应中温度的周期性改变是为了DNA聚合酶催化不同的反应(×)
(4)抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体上也未必能正常表达(√)
(5)用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列(√)
(6)PCR体系中一定要添加从受体细胞中提取的DNA聚合酶(×)
(7)外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制(×)
(8)目的基因导入双子叶植物一般采用农杆菌转化法(√)
(9)为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体(×)
(10)检测目的基因是否导入受体细胞可用抗原－抗体杂交技术(×)
2．基因表达载体的组成及各部分的作用(连线)

3．学透教材、理清原因、规范答题用语专练

(1)从图中可以看出，目的基因是________________，使用的载体是________，将基因表达载体导入受体细胞的方法是________________。
(2)请写出两种检测目的基因是否表达的方法：__________________________________。
答案：(1)Bt毒蛋白基因　Ti质粒　农杆菌转化法　(2)抗原—抗体杂交法、用棉叶饲喂棉铃虫








1．获取目的基因的方法比较
方法 从基因文库中获取 人工合成
从基因组文 库中获取 从部分基因文 库中获取，如 cDNA文库 化学 合成法 逆转 录法
过程
2．PCR反应的过程
过程 说明 图解
变性 温度上升到90 ℃左右，双链DNA解聚为单链
复性 温度下降到55 ℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
延伸 温度上升到72 ℃左右，Taq酶从引物起始合成互补链，可使新链由5′端向3′端延伸







3．目的基因检测与鉴定的方法


[对点落实]
1．(2018·海南高考)甜蛋白是一种高甜度的特殊蛋白质。为了改善黄瓜的品质，科学家采用农杆菌转化法将一种甜蛋白基因成功导入黄瓜细胞，得到了转基因植株。回答下列问题：
(1)用农杆菌感染时，应优先选用黄瓜________(填“受伤的”或“完好的”)叶片与含重组质粒的农杆菌共培养，选用这种叶片的理由是_____________________________________
___________________________________________________________________________。
(2)若在转基因黄瓜中检测到这种甜蛋白，则表明该重组质粒中____________已转移到植物细胞中且能够表达；用该转基因黄瓜的某一植株与一株非转基因植株杂交，发现子代中含甜蛋白个体数与不含甜蛋白个体数之比为1∶1，则说明甜蛋白基因已经整合到________________(填“核基因组”“线粒体基因组”或“叶绿体基因组”)中。
(3)假设某种转基因作物因为受到病毒感染而减产，若要以该转基因作物为材料获得脱毒苗，应选用________作为外植体进行组织培养。
(4)通常，基因工程操作主要有4个步骤，即目的基因获取、重组表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。因此，基因工程的含义可概括为________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
解析：(1)用农杆菌感染时，应优先选用黄瓜受伤的叶片与含重组质粒的农杆菌共培养，理由是叶片伤口处的细胞释放出大量酚类物质，可吸引农杆菌移向这些细胞。(2)若在转基因黄瓜中检测到这种甜蛋白，则表明该重组质粒中甜蛋白基因已转移到植物细胞中且能够表达；用该转基因黄瓜的某一植株与一株非转基因植株杂交，发现子代中含甜蛋白个体数与不含甜蛋白个体数之比为1∶1，则说明甜蛋白基因已经整合到核基因组中。(3)假设某种转基因作物因为受到病毒感染而减产，若要以该转基因作物为材料获得脱毒苗，应选用茎尖作为外植体进行组织培养。(4)通常，基因工程操作主要有4个步骤，即目的基因获取、重组表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。因此，基因工程的含义可概括为按照人们的愿望进行设计，并通过体外重组和转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出符合人们需要的新生物类型。
答案：(1)受伤的　叶片伤口处的细胞释放出大量酚类物质，可吸引农杆菌移向这些细胞　(2)甜蛋白基因　核基因组　(3)茎尖　(4)按照人们的愿望进行设计，并通过体外重组和转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出符合人们需要的新生物类型
2．(2018·江苏高考有改动)为生产具有特定性能的α?淀粉酶，研究人员从某种海洋细菌中克隆了α?淀粉酶基因(1 656个碱基对)，利用基因工程大量制备α?淀粉酶，实验流程见下图。请回答下列问题：

(1)利用PCR技术扩增α?淀粉酶基因前，需先获得细菌的________________。
(2)为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的________端加上限制性酶切位点，且常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，主要目的是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)进行扩增时，反应的温度和时间需根据具体情况进行设定，下列选项中________的设定与引物有关，________的设定与扩增片段的长度有关。(填序号)
①变性温度　②退火(复性)温度　③延伸温度　④变性时间　⑤退火(复性)时间　⑥延伸时间
(4)下图表示筛选获得的工程菌中编码α?淀粉酶的mRNA 的部分碱基序列：

图中虚线框内mRNA片段包含________个密码子，如虚线框后的序列未知，预测虚线框后的第一个密码子最多有________种。
(5)获得工程菌表达的α?淀粉酶后，为探究影响酶活性的因素，以浓度为1%的可溶性淀粉为底物测定酶活性，结果如下：
缓冲液 50 mmol/L Na2HPO4?KH2PO4 50 mmol/L Tris?HCl 50 mmol/L Gly?NaOH
pH 6.0 6.5 7.0 7.5 7.5 8.0 8.5 9.0 9.0 9.5 10.0 10.5
酶相对活性(%) 25.4 40.2 49.8 63.2 70.1 95.5 99.5 85.3 68.1 63.7 41.5 20.8

根据上述实验结果，初步判断该α?淀粉酶活性最高的条件为________________________________________________________________________。

解析：(1)利用PCR技术扩增α?淀粉酶基因前，需先获得细菌的基因组DNA作为模板，并依据α?淀粉酶基因两端的部分核苷酸序列合成两条引物。(2)利用PCR技术扩增DNA时，只能从3′端延伸DNA子链，为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的5′端加上限制性酶切位点，并且要注意在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，这样既能防止目的基因、载体的自身连接，又能确保目的基因与表达载体的定向连接。(3)PCR技术包括变性、退火(复性)和延伸三步，变性温度决定PCR反应中双链DNA的解链，且时间很短；退火(复性)时引物结合到互补的DNA单链上，退火(复性)温度由引物复性温度决定，其温度设定与引物的长度、碱基组成及浓度等有关；延伸时间与产物片段的长度有关，产物在1 kb以内的延伸时间为1 min左右，3～4 kb的延伸时间为3～4 min。(4)图中虚线框内共含有24个碱基，mRNA上3个相邻的碱基编码1个氨基酸，故共包含8个密码子。虚线框后的第1个密码子的第1个碱基是U，第2和第3个碱基各有4种可能性，因此共有16种可能性。题干表明控制α?淀粉酶的基因有1 656个碱基对，说明图中虚线框后的第1个密码子肯定不是终止密码子(3种终止密码子为UAA、UAG、UGA)，故虚线框后第1个密码子实际最多可能性有16－3＝13(种)。(5)分析表格中的数据，酶相对活性最高为99.5%，对应的条件是pH为8.5，缓冲液为50 mmol/L Tris?HCl。
答案：(1)基因组DNA　(2)5′　使DNA片段能定向插入表达载体，减少自连　(3)②　⑥　(4)8　13　(5)pH为8.5，缓冲液为50 mmol/L Tris?HCl


考点三　基因工程的应用与蛋白质工程

一、基因工程的应用
1．植物基因工程：培育抗虫转基因植物、抗病转基因植物和抗逆转基因植物；利用转基因改良植物的品质；利用植物生产药物等。
2．动物基因工程：用于提高动物生长速度；用于改善畜产品品质；用转基因动物生产药物；用转基因动物作器官移植的供体等。
3．基因工程药物
(1)来源：利用转基因的“工程菌”来生产的药物。
(2)种类：细胞因子、抗体、疫苗、激素等。
4．基因治疗
(1)概念：把正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能， 从而达到治疗疾病的目的，这是治疗遗传病的最有效的手段。
(2)类型：体外基因治疗和体内基因治疗。
二、蛋白质工程
(1)操作手段：基因修饰或基因合成。
(2)结果：对现有蛋白质进行改造或制造出新的蛋白质。
(3)设计流程
―→―→―→
[基础自测]
1．判断下列叙述的正误
(1)将人的干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌，获得能产生人干扰素的菌株(√)
(2)利用乳腺生物反应器能够获得一些重要的医药产品，如人的血清白蛋白，这是因为将人的血清白蛋白基因导入了动物的乳腺细胞中(×)
(3)由大肠杆菌工程菌获得人的干扰素后可直接应用(×)
(4)蛋白质工程的目的是改造或合成人类需要的蛋白质(√)
(5)蛋白质工程可以合成自然界中不存在的蛋白质(√)
(6)蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作，定向改变分子的结构(×)
2．填写蛋白质工程流程图中字母代表的含义


A．转录，B.翻译，C.分子设计，D.氨基酸序列，E.预期功能。

1．体外基因治疗与体内基因治疗的区别

方法比较　　 体外基因治疗 体内基因治疗
不同点 途径 从患者体内获得某种细胞→体外完成基因转移→筛选、细胞扩增→输入体内 直接向患者体内组织细胞中转移基因
特点 操作复杂，但效果可靠 方法较简单，但效果难以控制
相同点 都是将外源基因导入靶细胞，以纠正缺陷基因，目前两种方法都处于临床试验阶段

2．基因治疗与基因诊断的比较
原理 操作过程 进展
基因治疗 基因表达 利用正常基因导入有基因缺陷的细胞中，以表达出正常性状来治疗(疾病) 临床试验
基因诊断 碱基互补配对 制作特定DNA探针与病人样品DNA混合，分析杂交带情况 临床应用
3.蛋白质工程与基因工程的关系
项目区别与联系 蛋白质工程 基因工程
区别 过程 预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列 获取目的基因→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定
实质 定向改造或生产人类所需的蛋白质 定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的类型或生物产品
结果 可生产自然界没有的蛋白质 只能生产自然界已有的蛋白质
联系 ①蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出来的第二代基因工程②基因工程中所利用的某些酶需要通过蛋白质工程进行修饰、改造



[对点落实]
1．(2019·大庆质检)镰刀型细胞贫血症是一种单基因遗传病，患者的血红蛋白分子β?肽链第6位氨基酸谷氨酸被缬氨酸代替，导致功能异常。回答下列问题：
(1)异常血红蛋白的氨基酸序列改变的根本原因是编码血红蛋白基因的________________序列发生改变。
(2)将正常的血红蛋白基因导入患者的骨髓造血干细胞中，可以合成正常的血红蛋白达到治疗的目的。此操作________(填“属于”或“不属于”)蛋白质工程，理由是该操作________________________________。
(3)用基因工程方法制备血红蛋白时，可先提取早期红细胞中的________，以其作为模板，在________酶的作用下反(逆)转录合成cDNA。cDNA与载体需在限制酶和________酶的作用下，构建基因表达载体，导入受体菌后进行表达。
(4)检测受体菌是否已合成血红蛋白，可从受体菌中提取____________，用相应的抗体进行________________杂交，若出现杂交带，则表明该受体菌已合成血红蛋白。
解析：(1)编码血红蛋白的基因中碱基对的替换导致编码的氨基酸种类改变。(2)蛋白质工程通过基因修饰或基因合成，实现对现有蛋白质的改造或制造新蛋白质，由于该操作中没有对蛋白质或基因进行改造，因此不属于蛋白质工程。(3)因血红蛋白基因只在早期红细胞中表达，所以可从其中提取mRNA，以mRNA为模板，在逆转录酶的作用下，反(逆)转录合成cDNA。构建基因表达载体需要限制酶和DNA连接酶。(4)目的基因是否表达可以通过从受体菌中提取蛋白质，进行抗原－抗体杂交实验加以判断。
答案：(1)碱基对(或脱氧核苷酸)　(2)不属于　没有对现有的蛋白质进行改造(或没有对基因进行修饰)　(3)mRNA(或RNA)　逆转录　DNA连接　(4)蛋白质　抗原—抗体
2．(2015·全国卷Ⅱ)已知生物体内有一种蛋白质(P)，该蛋白质是一种转运蛋白，由305个氨基酸组成。如果将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸，240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸，改变后的蛋白质(P1)不但保留P的功能，而且具有了酶的催化活性。回答下列问题：
(1)从上述资料可知，若要改变蛋白质的功能，可以考虑对蛋白质的____________进行改造。
(2)以P基因序列为基础，获得P1基因的途径有修饰________基因或合成________基因。所获得的基因表达时是遵循中心法则的，中心法则的全部内容包括________的复制，以及遗传信息在不同分子之间的流动，即：____________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)蛋白质工程也被称为第二代基因工程，其基本途径是从预期蛋白质功能出发，通过____________________和________________，进而确定相对应的脱氧核苷酸序列，据此获得基因，再经表达、纯化获得蛋白质，之后还需要对蛋白质的生物________进行鉴定。

解析：(1)从题中所述资料可知，将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸，240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸后，该蛋白质的功能发生了改变，此过程是通过对构成蛋白质的氨基酸的排列顺序进行改造，进而改变了蛋白质的结构，从而改变了蛋白质的功能。(2)在蛋白质工程中，目的基因可以以P基因序列为基础，对生物体内原有P基因进行修饰，也可以通过人工合成法合成新的P1基因。中心法则的内容如下图所示：

由图可知，中心法则的全部内容包括：DNA以自身为模板进行的复制，DNA通过转录将遗传信息传递给RNA，最后RNA通过翻译将遗传信息表达成蛋白质；在某些病毒中RNA可自我复制(如烟草花叶病毒)，在某些病毒中能以RNA为模板逆转录合成DNA(如HIV)，这是对中心法则的补充。(3)蛋白质工程的基本途径是预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→合成DNA→表达出蛋白质，经过该过程得到的蛋白质，需要对其生物功能进行鉴定，以保证其发挥正常作用。
答案：(1)氨基酸序列(或结构)(其他合理答案也可)
(2)P　P1　DNA和RNA(或遗传物质)　DNA→RNA、RNA→DNA、RNA→蛋白质(或转录、逆转录、翻译)
(3)设计蛋白质的结构　推测氨基酸序列　功能

考点四　DNA的粗提取与鉴定

1．实验原理
(1)提取原理
①DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同。
②DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性。
③DNA不溶于酒精溶液。
(2)鉴定原理： DNA＋二苯胺试剂蓝色。
2．实验流程

[基础自测]
1．判断下列叙述的正误
(1)用兔的成熟红细胞可提取DNA(×)
(2)进行DNA粗提取和鉴定实验时，加入洗涤剂后用力进行快速、充分地研磨(×)
(3)洗涤剂能瓦解细胞膜并增加DNA在NaCl溶液中的溶解度(×)
(4)在溶有DNA的 NaCl溶液中，加入二苯胺试剂即呈蓝色(×)
(5)在DNA的粗提取与鉴定实验中，用菜花替代鸡血作为实验材料，其实验操作步骤相同(×)
(6)实验中两次使用蒸馏水的目的不同(√)
2．学透教材、理清原因、规范答题用语专练
(1)分析DNA在NaCl溶液中的溶解度曲线，思考如何通过控制NaCl溶液的浓度将DNA与蛋白质等杂质分离。

提示：NaCl溶液浓度为2 mol/L时，DNA溶解，而部分蛋白质发生盐析生成沉淀，通过过滤可除去部分蛋白质及不溶于NaCl溶液的杂质。当NaCl溶液稀释至0.14 mol/L时，DNA析出，过滤可除去溶于NaCl溶液中的部分蛋白质和其他杂质。
(2)下图为“DNA粗提取和鉴定”实验的相关操作，请仔细观察并分析①～④操作的目的分别是什么？


①_______________________________________________________________________；
②_______________________________________________________________________；
③_______________________________________________________________________；
④_______________________________________________________________________。
提示：①是使鸡血细胞吸水涨破释放出核物质　②是析出DNA，去除溶于酒精的杂质　③是使DNA溶解在2 mol/L NaCl溶液中　④是稀释NaCl溶液使其浓度接近0.14 mol/L，去除溶于低浓度NaCl溶液的杂质

1．DNA与蛋白质在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同
溶解规律 2 mol/L NaCl溶液 0.14 mol/L NaCl溶液
DNA 溶解 析出
蛋白质 NaCl溶液物质的量浓度从2 mol/L逐渐降低的过程中，溶解度逐渐增大 部分发生盐析沉淀 溶解

2．DNA粗提取与鉴定实验中的“2、4、4”
加蒸馏 水2次 ①加到鸡血细胞液中，使血细胞吸收水破裂； ②加到含DNA的2 mol/L的NaCl溶液中，使NaCl溶液的物质的量浓度下降到0.14 mol/L，使DNA析出
用纱布 过滤4次 ①过滤血细胞破裂液，得到含细胞核物质的滤液； ②过滤溶有DNA的2 mol/L的NaCl溶液； ③滤取0.14 mol/L的NaCl溶液中析出的DNA(黏稠物)； ④再次过滤溶有DNA的2 mol/L的NaCl溶液
用NaCl 溶液4次 ①加2 mol/L的NaCl溶液，溶解提取的细胞核物质； ②用0.14 mol/L的NaCl溶液使DNA析出； ③用2 mol/L的NaCl溶液，溶解滤取的DNA黏稠物； ④用2 mol/L的NaCl溶液，溶解丝状物用于鉴定DNA

3．注意事项
(1)本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核(无DNA)。可选用鸡血细胞作材料。
(2)加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫。加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。
(3)二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。
(4)提取植物细胞的DNA时，加入的洗涤剂能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；加入食盐(主要成分是NaCl)的目的是溶解DNA。
(5)在DNA进一步提纯时，选用冷却的95%的酒精的作用是溶解杂质和析出DNA。

[对点落实]
1．(2019·南通模拟)对利用鸡血进行“DNA的粗提取与鉴定”的实验，下列叙述正确的是(　　)
A．用蒸馏水将NaCl溶液浓度调至0.14 mol/L，滤去析出物
B．可用木瓜蛋白酶纯化过滤后研磨液中的DNA
C．由于DNA对高温耐受性较差，故需向DNA滤液中加入冷酒精
D．将丝状物溶解在2 mol/L NaCl溶液中，加入二苯胺试剂即呈蓝色
解析：选B　DNA在浓度为0.14 mol/L NaCl溶液中的溶解度最低，因此用蒸馏水将NaCl溶液浓度调至0.14 mol/L时，DNA析出，应该去除滤液；木瓜蛋白酶能分解蛋白质，但不能分解DNA，因此可用木瓜蛋白酶纯化过滤后研磨液中的DNA；由于DNA不溶于酒精，蛋白质溶于酒精，因此可向DNA滤液中加入冷酒精以进一步纯化DNA；将丝状物溶解在2 mol/L NaCl溶液中，加入二苯胺试剂后要经过沸水浴才能呈现蓝色。
2．图1、2分别为“DNA的粗提取与鉴定”实验中部分操作步骤示意图，下列叙述错误的是(　　)

A．图1、2中加入蒸馏水稀释的目的相同
B．图1中完成过滤之后保留滤液
C．图2中完成过滤之后弃去滤液
D．在图1鸡血细胞液中加入少许嫩肉粉有助于去除杂质
解析：选A　图1中加入蒸馏水的目的是使鸡血细胞吸水涨破，图2中加入蒸馏水的目的是稀释NaCl溶液，使DNA析出；图1中加入蒸馏水后，DNA存在于滤液中；图2中加入蒸馏水后，NaCl溶液浓度降低，DNA析出，所以弃去滤液；嫩肉粉主要成分是蛋白酶，鸡血细胞液中加入少许嫩肉粉可将蛋白质水解成小分子肽或氨基酸，有利于除去蛋白质。



　 　　　课堂一刻钟
1．(2018·北京高考)用Xho Ⅰ和Sal Ⅰ两种限制性核酸内切酶同一DNA片段，酶切位点及酶切产物分离结果如图。以下叙述不正确的是(　　)

易错探因——审题不细
解答本小题可因审题不细致，误认为是XhoⅠ和SalⅠ两种限制酶同时作用于DNA片段，而不能得出正确答案。这要求学生在平时的练习中养成仔细审题的习惯，必要时可在关键部位进行标注。 　
A．图1中两种酶识别的核苷酸序列不同
B．图2中酶切产物可用于构建重组DNA
C．泳道①中是用SalⅠ处理得到的酶切产物
D．图中被酶切的DNA片段是单链DNA
解析：选D　通过图1可知，两种限制性核酸内切酶切割DNA分子的不同部位，说明两种限制性核酸内切酶识别的核苷酸序列不同；图2中的酶切产物是DNA分子片段，可用于构建重组DNA；观察图1可知，该DNA片段有3个SalⅠ酶切位点，故用SalⅠ处理后，可形成4个DNA分子片段，电泳后出现4条电泳带，与电泳条带①对应；限制性核酸内切酶作用的是双链DNA片段，因此图中被酶切的DNA片段应是双链DNA。
2．(2017·北京高考)为了增加菊花花色类型，研究者从其他植物中克隆出花色基因C(图1)，拟将其与质粒(图2)重组，再借助农杆菌导入菊花中。

下列操作与实验目的不符的是(　　)
A．用限制性核酸内切酶EcoRⅠ和连接酶构建重组质粒
B．用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织，将C基因导入细胞
C．在培养基中添加卡那霉素，筛选被转化的菊花细胞
D．用分子杂交方法检测C基因是否整合到菊花染色体上

解析：选C　目的基因C和质粒都有可被EcoRⅠ切割的酶切位点，另外需要DNA连接酶将切好的目的基因和质粒连接起来；愈伤组织全能性较高，是理想的植物受体细胞，将目的基因导入植物受体细胞的方法通常为农杆菌转化法；质粒中含有潮霉素抗性基因，因此选择培养基中应该加入潮霉素；使用分子杂交方法可检测目的基因是否整合到受体染色体上。
3．(2018·江苏高考)，下列叙述正确的是(　　)
A．在甘蔗茎的组织样液中加入双缩脲试剂，温水浴后液体由蓝色变成砖红色
B．在大豆种子匀浆液中加入斐林试剂，液体由蓝色变成紫色
C．提取DNA时，在切碎的洋葱中加入适量洗涤剂和食盐，充分研磨，过滤并弃去滤液
D．将DNA粗提物溶解在2 mol/L NaCl溶液中，加入二苯胺试剂，沸水浴后液体由无色变成蓝色
解题关键——归纳整合
本题综合了必修①还原糖和蛋白质的鉴定与选修①DNA的提取与鉴定的相关实验的原理与步骤，意在考查考生的归纳整合和辨别能力。这也启示我们在复习选修内容时要注意与必修部分的知识相联系，多进行归纳整合。　　　　　 　　　　　　　　　　　　　　 　　
解析：选D　甘蔗茎的组织样液中含有大量的蔗糖，蔗糖属于非还原糖，与斐林试剂在50～65 ℃的水浴加热条件下不会产生砖红色沉淀；大豆种子的匀浆液中含有大量的蛋白质，鉴定蛋白质时应使用双缩脲试剂，双缩脲试剂在常温下能与蛋白质发生反应，生成紫色的络合物；提取DNA时，在切碎的洋葱中加入适量的洗涤剂和食盐，进行充分地研磨，过滤后收集滤液；在沸水浴条件下，DNA与二苯胺试剂反应呈现蓝色。
4．(2014·江苏高考)下列，错误的是(　　)
A．酵母和菜花均可作为提取DNA的材料
B．DNA既溶于2 mol/L NaCl溶液也溶于蒸馏水
C．向鸡血细胞液中加蒸馏水搅拌，可见玻棒上有白色絮状物
D．DNA溶液加入二苯胺试剂沸水浴加热，冷却后变蓝
易错探因——知识不全
本题考查对“DNA的粗提取和鉴定”实验的原理、实验材料的选择、实验采用的试剂及试剂的作用等的记忆，需要考生识记的细节较多，考生在平时的学习过程中要注意积累。　　　　　　　　　　　　　 　　　　　　　　 　　
解析：选C　原则上含DNA的生物材料都可用来提取DNA，只是选用DNA含量高的生物组织，成功的可能性更大；DNA在2 mol/L NaCl溶液和蒸馏水中溶解度都较大；向鸡血细胞液中加蒸馏水搅拌，鸡血细胞会吸水破裂，但在蒸馏水中不会析出DNA；DNA溶液加入二苯胺试剂后需沸水浴加热，待冷却后溶液变蓝。
5．(2018·全国卷Ⅰ)回答下列问题：
(1)博耶(H.Boyer)和科恩(S.Cohen)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达。该研究除证明了质粒可以作为载体外，还证明了________________________________________________________________________
____________________________________________________(答出两点即可)。
(2)体外重组的质粒可通过Ca2＋参与的________方法导入大肠杆菌细胞；而体外重组的噬菌体DNA通常需与______________组装成完整噬菌体后，才能通过侵染的方法将重组的噬菌体DNA导入宿主细胞。在细菌、心肌细胞、叶肉细胞中，可作为重组噬菌体宿主细胞的是________。
(3)真核生物基因(目的基因)在大肠杆菌细胞内表达时，表达出的蛋白质可能会被降解。，在实验中应选用________________的大肠杆菌作为受体细胞，在蛋白质纯化的过程中应添加________的抑制剂。
解题关键——信息获取
解答本小题应先根据“蛋白质会被降解”的信息，再根据酶的专一性原理可推测大肠杆菌体内含有分解该蛋白质的酶，以此作为突破口即可成功解答本小题。　　　　　　 　　　　　　　　　　　　　　　　　　
解析：(1)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌中，该过程利用的技术是转基因技术。该研究除了证明质粒可作为载体外，还证明了体外重组的质粒可以进入受体细胞，真核生物的基因可在原核细胞中表达等。(2)重组质粒导入大肠杆菌细胞可采用Ca2＋参与的转化方法；体外重组噬菌体要通过将体外重组的噬菌体DNA和外壳蛋白(或噬菌体蛋白)进行组装获得；因为噬菌体是专门寄生在细菌中的病毒，所以宿主细胞应选用细菌。(3)为防止蛋白质被降解，在实验中应选用蛋白酶缺陷型的大肠杆菌作为受体细胞；在蛋白质纯化过程中，为防止目的蛋白质被降解，需要添加蛋白酶的抑制剂。
答案：(1)体外重组的质粒可以进入受体细胞；真核生物基因可在原核细胞中表达　(2)转化　外壳蛋白(或答噬菌体蛋白)　细菌　(3)蛋白酶缺陷型　蛋白酶
6．(2018·全国卷Ⅱ)某种荧光蛋白(GFP)在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光，这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达。某科研团队甲)，并将其插入质粒P0，构建了真核表达载体P1，其部分结


解题关键——信息获取
本题结合新情景、新材料考查考生从题干及题图中获取信息的能力。在解答此类问题时应注重信息获取和结合已有的知识理解、应用信息。　　　　　 　　　　　　　　　　　　　 　　
回答下列问题：
(1)据图推断，该团队在将甲插入质粒P0时，使用了两种限制酶，这两种酶是______________。使用这两种酶进行酶切是为了保证______________，也是为了保证____________________。
(2)将P1转入体外培养的牛皮肤细胞后，若在该细胞中观察到了绿色荧光，则说明L1基因在牛的皮肤细胞中完成了________和________过程。
(3)为了获得含有甲的牛，该团队需要做的工作包括：将能够产生绿色荧光细胞的________移入牛的______________中、体外培养、胚胎移植等。
(4)为了检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，某同学用PCR方法进行鉴定，在鉴定时应分别以该牛不同组织细胞中的________(填“mRNA”“总RNA”或“核DNA”)作为PCR模板。
解析：(1)由题意可知，L1基因和GFP基因形成了L1?GFP融合基因(简称为甲)，题图中显示了四个酶切位点，当将L1?GFP融合基因插入质粒P0时，可用E1和E4限制酶进行酶切，用这两种酶进行酶切不会破坏甲的完整性，同时能保证甲按照正确的方向与载体连接。(2)若在牛皮肤细胞中观察到了绿色荧光，则说明L1?GFP融合基因得到表达，即目的基因在受体细胞中通过转录和翻译合成了荧光蛋白。(3)为了获得含有甲的牛，可将含有目的基因的细胞的细胞核移入牛的去核卵母细胞中，然后进行体外培养、胚胎移植等。(4)利用PCR技术扩增目的基因，可以检测目的基因是否存在，PCR扩增的模板是DNA。
答案：(1)E1和E4　甲的完整　甲与载体正确连接　(2)转录　翻译　(3)细胞核　去核卵母细胞　(4)核DNA
7．(2017·江苏高考)金属硫蛋白(MT)是一类广泛存在的金属结合蛋白，某研究小组计划通过多聚酶链式反应(PCR)扩增获得目的基因，构建转基因工程菌，用于重金属废水的净化处理。PCR扩增过程示意图如下，请回答下列问题：

(1)从高表达MT蛋白的生物组织中提取mRNA，通过________获得________用于PCR扩增。
(2)设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物(引物1和引物2)，为方便构建重组质粒，在引物中需要增加适当的____________位点。设计引物时需要避免引物之间形成________________，而造成引物自连。
(3)图中步骤1代表________，步骤2代表退火(复性)，步骤3代表延伸，这三个步骤组成一轮循环。
(4)PCR扩增时，退火(复性)温度的设定是成败的关键。退火温度过高会破坏________________的碱基配对。退火(复性)温度的设定与引物长度、碱基组成有关，长度相同但____________的引物需要设定更高的退火(复性)温度。
(5)如果PCR反应得不到任何扩增产物，则可以采取的改进措施有________[填序号：①升高退火(复性)温度　②降低退火(复性)温度　③重新设计引物]。
解题关键——理解应用
本题主要考查PCR技术的相关知识，要求考生理解PCR的具体过程，以及引物的作用，学会分析引物或温度改变对PCR结果的影响。
解析：(1)PCR技术可在体外对DNA进行扩增，模板可以是mRNA经过逆转录获得的cDNA。(2)设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物(引物1和引物2)时，需在引物中增加适当的限制性核酸内切酶的识别序列，便于目的基因与质粒的连接。为了避免引物自连，设计引物时需要避免引物之间形成碱基互补配对。(3)根据PCR的过程可知，图中步骤1为变性，步骤2为退火(复性)，步骤3为延伸，这三个步骤构成一个循环。(4)退火(复性)温度的设定与引物长度、碱基组成有关，过高的退火(复性)温度会破坏引物与模板的碱基配对。因G、C之间的氢键数多于A、T之间的氢键数，故GC含量高的引物需要设定更高的退火(复性)温度。(5)如果PCR反应得不到任何扩增产物，可能的原因是退火(复性)温度过高使扩增效率降低，也可能是未按照目的基因两端的核苷酸序列来设计引物，因此可以采取的措施是降低退火(复性)温度、重新设计引物等。
答案：(1)逆转录　cDNA　(2)限制性核酸内切酶　碱基互补配对　(3)变性　(4)引物与模板　GC含量高　(5)②③
[学情考情·了然于胸]
一、明考情·知能力——找准努力方向
考查知识 1.基因工程三种操作工具的特点及作用、基因工程的基本操作程序是常规考点，难度一般。 2.获取目的基因的方法、限制酶的选择及基因表达载体的构建是高频考点，也是难点、易错点。3.DNA的粗提取与鉴定。
考查能力 1.识记能力：主要考查对基因工程操作工具的种类、作用和特点及基本操作程序等的记忆。 2.读图能力：如限制酶的选择及基因表达载体的构建常以图示为载体进行考查。 3.实验操作能力：DNA的粗提取的原理、方法、操作步骤等。 4.综合应用能力：如第3、4、5题，考查考生综合运用基因工程的相关知识解决相关生物学问题的能力。

二、记要点·背术语——汇总本节重点
1．DNA重组技术的基本工具
(1)基因工程操作的基本工具有限制性核酸内切酶、DNA连接酶和使目的基因进入受体细胞的载体。
(2)限制酶具有特异性，即一种限制酶只能识别DNA分子中某种特定的碱基序列，并在特定的位点上进行切割。
(3)E·coli DNA连接酶只能连接黏性末端，而T4DNA连接酶既能连接黏性末端也能连接平末端。
(4)质粒是基因工程常用的载体，需具备的条件有：能在宿主细胞内稳定保存并自我复制；具有一个或多个限制酶切割位点；具有标记基因。
2．基因工程的基本操作程序
(1)基因工程的基本操作程序：目的基因的获取→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定。
(2)基因表达载体的构建是基因工程的核心，基因表达载体的组成包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
(3)目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法，导入动物细胞常用显微注射法，导入微生物细胞常用感受态细胞法(Ca2＋处理法)。
(4)培育转基因动物时，受体细胞必须是受精卵；培育转基因植物时，受体细胞可以是受精卵，也可以是体细胞。
(5)检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因常用DNA分子杂交技术，检测目的基因是否转录出了mRNA同样是采用分子杂交技术，检测目的基因是否翻译成蛋白质常用抗原－抗体杂交技术。
(6)启动子≠起始密码子，终止子≠终止密码子
①启动子和终止子位于DNA片段上，分别控制转录过程的启动和终止。
②起始密码子和终止密码子位于mRNA上，分别控制翻译过程的启动和终止。

3．基因工程的应用和蛋白质工程
(1)基因治疗是把正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗疾病的目的，这是治疗遗传病最有效的手段。
(2)蛋白质工程的操作过程：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列(基因)→基因表达→产生需要的蛋白质。
4．DNA的粗提取与鉴定
(1)DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，在浓度为0.14 mol/L的NaCl溶液中溶解度最低。
(2)DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质可溶于酒精，可利用冷却的酒精对提取的DNA进行纯化。
(3)在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。
(4)哺乳动物成熟的红细胞不含细胞核，不能作为提取DNA的实验材料。若选取肝脏细胞或植物细胞，则必须充分研磨。


一、基础题点练
1．(2019·徐州模拟)已知限制性内切酶XmaⅠ和SmaⅠ的识别序列分别为C↓CCGGG和CCC↓GGG。有关这两种酶及应用的叙述，错误的是(　　)
A．这两种酶作用的底物都是双链DNA
B．DNA中出现这两种酶识别序列的几率不同
C．XmaⅠ切割DNA形成的黏性末端是—GGCC
D．使用这两种酶时需注意控制反应温度、时间等
解析：选B　限制酶作用的底物是双链DNA分子；这两种限制酶作用的核苷酸序列相同，所以这两种识别序列在DNA中出现的的几率相同；根据碱基互补配对原则，CCCGGG的互补链是GGGCCC，并根据XmaⅠ的切割位点可知，切割后的黏性末端是—CCGG；温度能影响酶的活性，所以使用酶时需要注意控制反应温度和时间等。
2．如图表示的是三种黏性末端，下列说法正确的是(　　)

A．图中所示黏性末端是由同种限制酶切割形成
B．若图甲中的G碱基处发生突变，限制酶可能无法识别该切割位点
C．图中所示黏性末端是限制酶断开氢键形成
D．目前常用的运载体有质粒、噬菌体和动植物病毒等几类原核生物

解析：选B　产生甲黏性末端的限制酶的识别序列为，产生乙黏性末端的限制酶的识别序列为，产生丙黏性末端的限制酶的识别序列为，可见甲、乙、丙黏性末端是由3种限制酶作用产生的；限制酶具有专一性，能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，如果甲中的G发生突变，限制酶可能无法识别该切割位点；图中所示黏性末端是限制酶断开磷酸二酯键形成的；质粒是环状DNA分子，噬菌体和动植物病毒都没有细胞结构，它们都不属于原核生物。
3．下列关于蛋白质工程的叙述，错误的是(　　)
A．蛋白质工程的基础是基因工程
B．蛋白质工程遵循的原理包括中心法则
C．蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作，定向改变分子的结构
D．蛋白质工程能产生出自然界中不曾存在过的新型蛋白质分子
解析：选C　蛋白质工程是通过基因修饰或基因合成对现有蛋白质进行改造，或合成新的蛋白质，故蛋白质工程的基础是基因工程；蛋白质工程遵循的原理包括中心法则；蛋白质工程是通过改造基因来实现对蛋白质分子的改造的；蛋白质工程能产生出自然界中不曾存在过的新型蛋白质分子。
4．(2019·南通模拟)下列关于“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是(　　)
A．鸡的红细胞和菜花均可作为提取DNA的材料，处理方法有所不同
B．在切碎的菜花中加入一定量的洗涤剂和食盐，充分研磨，过滤收集滤液
C．将NaCl溶液浓度调至2 mol/L，用单层滤纸过滤获取析出物
D．利用某些蛋白质在酒精中的溶解度大于DNA在酒精中的溶解度的原理，可以提纯DNA
解析：选C　鸡的红细胞和菜花均可作为提取DNA的材料，处理方法有所不同，动物细胞只要加蒸馏水使细胞吸水破裂，植物细胞需要加洗涤剂和食盐研磨；在切碎的菜花中加入一定量的洗涤剂和食盐，充分研磨，过滤收集滤液；将NaCl溶液浓度调至2 mol/L，用多层纱布过滤获取滤液；利用某些蛋白质在酒精中的溶解度大于DNA在酒精中的溶解度的原理，可以提纯DNA。
5．下列是利用肝脏细胞粗提取DNA实验的两个关键操作步骤，相关叙述错误的是(　　)
步骤1：向8 g猪肝中加入25 mL 0.1 mol/L NaCl、0.05 mol/L柠檬酸钠缓冲液→冰浴、研磨、离心

步骤2：取沉淀，加入40 mL缓冲液、20 mL异戊醇，振匀后，缓慢加固体NaCl使溶液浓度达到2 mol/L，再离心

A．步骤1中，加入柠檬酸钠缓冲液的目的是维持pH的稳定
B．步骤1中，冰浴处理的主要原理是低温下DNA水解酶容易变性
C．步骤2中，异戊醇的作用可能是使与DNA结合的蛋白质因变性而沉淀
D．步骤2中，离心后应取上清液，因为DNA在2 mol/L NaCl溶液中溶解度比较大
解析：选B　步骤1中，加入柠檬酸钠缓冲液的目的是维持pH的稳定；低温不会使酶变性失活，只能降低酶的活性；步骤2中，DNA在2 mol/L NaCl溶液中溶解度比较大，因此异戊醇的作用可能是使与DNA结合的蛋白质因变性而沉淀；步骤2中，离心后应取上清液，因为DNA在2 mol/L NaCl溶液中溶解度比较大。
6．限制酶MunⅠ和限制酶EcoRⅠ的识别序列及其切割位点分别如下：
—C↓AATTG—和—G↓AATTC—
如图表示某一目的基因片段与质粒拼接形成重组质粒的过程，相关叙述错误的是(　　)

A．用限制酶EcoRⅠ切割目的基因，同时用限制酶MunⅠ切割质粒
B．两种限制酶切割后形成的黏性末端的碱基可以互补配对
C．限制酶能使特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开
D．将重组质粒同时用2种限制酶切割则会形成2种DNA片段
解析：选D　由图可知，目的基因两侧都是限制酶EcoRⅠ的切割位点，因此应选用限制酶EcoRⅠ切割含有目的基因的外源DNA分子，质粒中含有限制酶MunⅠ和限制酶EcoRⅠ的切割位点，但EcoRⅠ的切割位点位于标记基因中，用其切割会破坏标记基因，因此为保证重组质粒表达载体的准确构建，应选用限制酶MunⅠ切割质粒；图中两种限制酶切割后形成的黏性末端的碱基可以互补配对；限制酶的作用是使特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开；将重组质粒同时用2种限制酶切割则会形成3种DNA片段。
二、高考题型练
7．(2019·成都模拟)如图1所示为用PvuⅠ限制酶切下的某目的基因及其上DNA片段示意图；图2所示为三种质粒示意图。图中Ap为氨苄青霉素抗性基因，Tc为四环素抗性基因。EcoRⅠ、PvuⅠ等为限制酶及其切割的位点。复制原点是在基因组上复制起始的一段序列，是指质粒在受体细胞中复制时的起点。


(1)组成片段D的基本骨架与细胞膜的基本骨架相同的元素是____________。
(2)图2中质粒A、质粒C能否作为目的基因运载体最理想的质粒？________(填“能”或“否”)，请说明理由________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)重组质粒成功导入受体细胞的概率一般仅为10－7，用质粒B构建重组质粒，为了筛选出导入了重组质粒的大肠杆菌，在导入完成后，将所有大肠杆菌分别在含有四环素和氨苄青霉素的培养基中培养，大肠杆菌在两种培养基的生长状况不可能的是__________________________________________________，可能性最大的是________________________________________________。
(4)若想在山羊的乳汁中收获上述目的基因的表达产物，则需要将重组质粒导入至山羊的________(细胞)中。
解析：(1)脱氧核糖和磷酸交替连接构成DNA片段D的基本骨架，脱氧核糖由C、H、O三种元素组成，组成磷酸的元素是H、P、O；磷脂双分子层构成细胞膜的基本骨架，磷脂分子是由C、H、O、N、P组成，可见组成片段D的基本骨架与细胞膜的基本骨架相同的元素是C、H、O、P。(2)分析图2可知：质粒A缺少标记基因，质粒C在用和目的基因相同的限制酶切割时，复制原点会被限制酶切割，进而影响重组质粒的自主复制，所以质粒A、质粒C均不能作为目的基因运载体最理想的质粒。(3)用质粒B构建重组质粒，当用和目的基因相同的限制酶(PvuⅠ)切割时，Tc(四环素抗性基因)遭到破坏，而Ap(氨苄青霉素抗性基因)结构完好，因此在重组质粒导入完成后，将所有大肠杆菌分别在含有四环素和氨苄青霉素的培养基中培养，大肠杆菌在两种培养基的生长状况不可能的是在含四环素的培养基上能正常生长，在含氨苄青霉素的培养基上不能正常生长。因重组质粒成功导入受体细胞的概率一般仅为10－7，所以可能性最大的是在含氨苄青霉素的培养基和含四环素的培养基上都不能正常生长。(4)若想在山羊的乳汁中收获上述目的基因的表达产物，则需要将重组质粒导入山羊的受精卵中。
答案：(1)C、H、O、P　(2)否　质粒A缺少标记基因，质粒C在用和目的基因相同的限制酶切割时，复制原点会被限制酶切割，会影响重组质粒的自主复制　(3)在含四环素的培养基上能正常生长，在含氨苄青霉素的培养基上不能正常生长　在含氨苄青霉素的培养基和含四环素的培养基上都不能正常生长　(4)受精卵
8．水稻是一种重要的粮食作物，选育高抗性良种是有效防治病虫危害、增加水稻单位面积产量的关键措施。转基因技术为得到抗病虫水稻种子开辟了一条新路。下面是水稻某抗性基因获得的过程。据图回答下面的问题：

(1)cDNA文库中的基因在基因组文库中____________。(填“都有”“都没有”或“有一部分”)。
(2)B过程需要的酶________(填“存在”或“不存在”)于正常真核生物体内，图示中含目的基因的细胞群________(填“是”或“不是”)水稻的体细胞。
(3)如果不建基因文库，但需要大量的目的基因Ⅰ和Ⅱ，可分别利用图中________和________为模板直接进行PCR扩增。进行扩增时所使用酶的显著特点是__________。
(4)抗性基因导入受体细胞后，仅一条染色体含抗性基因，该基因的传递________(填“遵循”或“不遵循”)孟德尔分离定律，试说明判断依据：________________________________
________________________________________________________________________。
解析：(1)cDNA文库是部分基因文库，基因组文库是全部基因文库，所以cDNA文库中的基因在基因组文库中都有。(2)B过程是由mRNA获取cDNA的过程，需要逆转录酶的催化，逆转录酶在正常真核细胞中不存在，图示中含目的基因的细胞群不是水稻的体细胞。(3)如果不建基因文库，但需要大量的目的基因Ⅰ和Ⅱ，可分别利用图中DNA和cDNA为模板直接进行PCR扩增。进行扩增时所使用酶的显著特点是耐高温。(4)抗性基因导入受体细胞后，仅一条染色体含抗性基因，该基因的传递遵循孟德尔分离定律，因为仅一条染色体含抗性基因，另一条没有其等位基因，相当于杂合子。
答案：(1)都有　(2)不存在　不是　(3)DNA　cDNA　耐高温　(4)遵循　仅一条染色体含抗性基因，另一条没有其等位基因
9．(2019·太原模拟)为增加菊花的花色类型，研究者从其他植物的cDNA文库中提取出花色基因C(图1)，拟将其与质粒(图2)重组，再借助农杆菌导入菊花细胞中。图3表示EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三种限制酶的识别序列与切割位点。请分析回答：

(1)利用PCR技术扩增目的基因C的原理是__________。
(2)图2所示质粒被________________切割获得的产物可与图1所示基因C连接，理由是________________________________________________。
(3)经BamHⅠ处理后构建的重组质粒导入菊花细胞后，基因C不能表达，原因是质粒酶切部位的两端无________________，导致基因C不能________。
(4)在添加四环素的固体培养基上，________(填“能”或“不能”)筛选出含有插入基因C的重组质粒的农杆菌单菌落，原因是______________________________________________
________________________________________________________________________。
解析：(1)利用PCR技术扩增目的基因C的原理是DNA双链复制。(2)据图3可知，由于BamHⅠ和Sau3AⅠ两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端，因此图2所示质粒被BamHⅠ和Sau3AⅠ切割获得的产物可与图1所示基因C连接。(3)据图可知，经BamHⅠ处理后构建的重组质粒导入菊花细胞后，基因C不能表达，原因是质粒酶切部位的两端无启动子和终止子，导致基因C不能转录。(4)由于含质粒的农杆菌和含重组质粒的农杆菌均含有抗四环素基因，在含四环素的培养基上均能生长，所以在添加四环素的固体培养基上，不能筛选出含有插入基因C的重组质粒的农杆菌单菌落。
答案：(1)DNA双链复制　(2)BamHⅠ和Sau3AⅠ　两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端　(3)启动子和终止子　转录　(4)不能　含质粒的农杆菌和含重组质粒的农杆菌均含有抗四环素基因，在含四环素的培养基上均能生长
10.人胰岛素基因的克隆操作过程如图所示，其中mRNA逆转录形成的DNA称为cDNA。回答下列问题：
(1)提取分离组织细胞中的人胰岛素mRNA时，最应选择________细胞，过程①②需要原料是__________________。
(2)通过将所有的cDNA构建基因表达载体，去感染细菌，可以建立包括目的基因在内的________，若使用质粒载体，其上存在________________基因，有助于质粒进入受体细胞中。此过程还可以使用________作为载体。(A.动物病毒 B．植物病毒　C．噬菌体)。
(3)除了上述方法外，还可以使用____________方法扩增目的基因。不同的是，后者的目的基因若为人胰岛素原基因，需要导入________(填“真核”或“原核”)受体细胞中。
解析：(1)人体细胞中只有胰岛B细胞可表达胰岛素基因，提取人胰岛素mRNA时，最应选择胰岛B细胞，过程①②为合成DNA的过程，需要(四种)脱氧核糖核苷酸为原料。(2)通过将所有的cDNA构建基因表达载体，去感染细菌，可以建立包括目的基因在内的基因(cDNA)文库；若使用质粒载体，其上应存在控制质粒DNA转移的基因，有助于质粒进入受体细胞中。噬菌体可侵染细菌，动物病毒、植物病毒不能侵染细菌，此过程还可以使用噬菌体作为载体。(3)用PCR技术可扩增目的基因。PCR扩增的人胰岛素原基因含有内含子序列，原核细胞中缺少转录后切除内含子对应序列的机制，因此应将人胰岛素原基因，导入真核受体细胞中。
答案：(1)胰岛B　(四种)脱氧核糖核苷酸　(2)基因文库　控制质粒DNA转移的　C　(3)PCR　真核
11．如图表示生物实验中通过研磨提取有关物质的操作过程，请回答下列问题：

(1)若图示为“DNA的粗提取与鉴定”的实验操作：
①图中实验材料A可以是下面的________(填字母)。
a．花菜　b．香蕉　c．猪肝　d．猪血
②若选用植物组织，研磨前加入的B一般为________和洗涤剂，前者的作用是____________。
③实验中，将含有一定杂质的DNA丝状物分别放入2 mL如表所示的3种溶液中，经搅拌后过滤，获得相应的3种滤液，含DNA最少的是滤液________。
溶液种类 滤液
1 2 mol/L的NaCl溶液 D
2 0.14 mol/L的NaCl溶液 E
3 体积分数为95%的冷酒精溶液 F
(2)若图示为“叶绿体色素的提取和分离”的实验操作：
①研磨前加入的B应包括________________________________________。
②将研磨液进行过滤时，需要在漏斗基部放上________。
解析：(1)①DNA的粗提取和鉴定实验中，原则上只要含有DNA的生物材料都可以作为实验材料，花菜、香蕉、猪肝都含有DNA，都可以作为该实验的材料，而猪为哺乳动物，其成熟的红细胞中不含细胞核和细胞器，即不含DNA，因此不能作为该实验的材料。②若选用植物组织，研磨前需加入食盐和洗涤剂，其中食盐能溶解DNA，洗涤剂能瓦解细胞膜。③DNA能溶解在2 mol/L的NaCl溶液中，滤液D中含较多的DNA，在0.14 mol/L的NaCl溶液中大部分DNA析出，滤液E中DNA较少，DNA不溶于体积分数为95%的冷酒精溶液，滤液F中含DNA最少。(2)①叶绿体中色素的提取和分离实验中，研磨前需加入无水乙醇(溶解色素)、二氧化硅(使研磨更充分)和碳酸钙(防止色素被破坏)。②将研磨液进行过滤时，需要在漏斗基部放上尼龙布。
答案：(1)①abc　②食盐　溶解DNA　③F　(2)二氧化硅、碳酸钙和无水乙醇(或丙酮)　(一层)尼龙布
12.L?肉碱具有参与脂肪氧化、抗疲劳、延迟患阿尔茨海默综合征等功能。据报道大肠杆菌能将巴豆甜菜碱转化成L?肉碱，但效率较低。科研人员通过基因工程将BCD基因、F基因以及T基因导入到大肠杆菌细胞内以提高L?肉碱的转化率。实验过程及结果如图所示，分析并回答下列问题：

(1)实验过程中用PCR技术获得目的基因，PCR反应体系需要加入的有机物有DNA模板、dNTP、耐高温DNA聚合酶和________。实验过程中不能将BCD基因、F基因以及T基因直接导入大肠杆菌细胞内，而是构建重组质粒后再导入大肠杆菌，原因是__________________________________________，并能遗传给下一代。图中两个重组质粒目的基因的首端都含有启动子T7，T7是_____________识别和结合的部位，能驱动基因转录。
(2)将重组质粒1和重组质粒2导入大肠杆菌时，应用________处理大肠杆菌，使细胞处于______________________的感受态。
(3)为了筛选出同时含有BCD基因、F基因以及T基因的大肠杆菌，实验的思路是__________________________________________________________。
(4)研究发现巴豆甜菜碱转化成L?肉碱是一个可逆反应过程，得到的工程菌在含有巴豆甜菜碱培养基中培养2小时后，L?肉碱的含量基本稳定，此时可以________________________________，以提高产量。
解析：(1)多聚酶链式反应(PCR)，是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。它可看作生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。PCR反应体系需要加入的有机物有DNA模板、dNTP、耐高温DNA聚合酶和(两种)引物。由于目的基因无法直接在受体细胞中表达，因此为了使目的基因在受体细胞中稳定存在并能够表达，实验过程中不能将BCD基因、F基因以及T基因直接导入大肠杆菌细胞内，而是构建重组质粒后再导入大肠杆菌，使其能遗传给下一代。图中两个重组质粒目的基因的首端都含有启动子T7，T7是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录。(2)使体外重组的DNA分子转移到受体细胞内，主要是借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。一般将受体大肠杆菌用Ca2＋处理，使细胞处于易于吸收周围环境中DNA分子的感受态，有利于含有目的基因的重组质粒容易进入受体细胞。(3)重组质粒1上含有BCD基因、卡那霉素抗性基因，重组质粒2上含有F基因、T基因及氯霉素抗性基因，因此在同时含有卡那霉素和氯霉素培养基上挑选单克隆大肠杆菌，就是同时含有BCD基因、F基因以及T基因的大肠杆菌。(4)研究发现巴豆甜菜碱转化成L?肉碱是一个可逆反应过程，在可逆反应中，减少生成物浓度，可使反应向正方向进行。因此得到的工程菌在含有巴豆甜菜碱培养基中培养2小时后，L?肉碱的含量基本稳定，此时可以及时移除产物(更换培养液)，使反应向生成L?肉碱的方向进行，以提高产量。
答案：(1)(两种)引物　使目的基因在受体细胞中稳定存在，能够表达(使目的基因在受体细胞中完成转化)　RNA聚合酶　(2)Ca2＋(CaCl2)　易于吸收周围环境中DNA分子　(3)在同时含有卡那霉素和氯霉素培养基上挑选单克隆大肠杆菌　(4)及时移除产物(更换培养液)，使反应向生成L?肉碱的方向进行


















































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