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第46讲 微生物的培养与应用（原卷版）
本模块是微生物的培养与应用，通过本模块，了解培养基的成分及其作用，比较分析平板划线法和稀释涂布平板法异同，了解选择培养基和鉴别培养基的区别，探究微生物培养的条件及如何分离某种微生物，微生物的控制及宣传健康生活方式。考纲对本模块内容的具体要求如下：
1. 微生物的分离和培养(理解水平)
2. 培养基对微生物的选择作用(理解应用水平)
3. 某种微生物数量的测定(应用水平)
4. 微生物在其他方面的应用（理解应用水平）
从近年的高考情况看，高考命题时往往从实验细节入手，比较注重对实验基本操作方法的考查，从考查内容上看，主要考查微生物的纯化培养操作与应用、传统发酵技术。从考查角度上看，联系生产生活实际考查微生物的计数、分离和纯化培养：结合发酵食品制作过程考查传统发酵技术原理及基本操作。
　一、　微生物的实验室培养
1.培养基
(1)概念：人们按照微生物对 的不同需求，配制出供其 的营养基质。
(2)营养组成：一般都含有 和无机盐。此外，还需要满足微生物生长对 、氧气以及 的要求。
(3)种类：按照物理性质可分为 培养基和固体培养基。
2.无菌技术
(1)含义：指在培养微生物的操作中，所有防止 的方法。
(2)关键：防止 的入侵。
(3)不同对象的无菌操作方法(连线)
3.大肠杆菌的纯化培养
(1)制备牛肉膏蛋白胨固体培养基
①操作步骤
→→→→
②倒平板的方法及注意事项
a.请用文字和箭头写出正确的倒平板操作流程： 。
b.甲、乙、丙中的灭菌方法是 。
c.丁中的操作需要等待 才能进行。
(2)纯化大肠杆菌的方法
①纯化培养原理：想方设法在培养基上得到 的肉眼可见的 ，即可获得较纯的菌种。
②纯化大肠杆菌的关键步骤： 。
③常用的微生物接种方法有两种
a.平板划线法：是通过 在琼脂固体培养基表面 的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。
b. 法：是将菌液进行一系列的 ，然后将 的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。
(3)菌种的保存方法
①对于频繁使用的菌种，可以采用 的方法。
②对于需要长期保存的菌种，可以采用 的方法。
【巧学助记】
1.无菌技术
条件
结果
常用方法
应用范围
消毒
较为温和的物理或化学方法
仅杀死物体表面或内部的部分微生物
煮沸消毒法
日常用品
巴氏消毒法
不耐高温的液体
化学药剂消毒法
用酒精擦拭双手，用氯气消毒水源
灭菌
强烈的理化因素
杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子
灼烧灭菌法
接种工具
干热灭菌法
玻璃器皿、金属用具
高压蒸汽灭菌法
培养基及容器
2.两种纯化细菌的方法的比较
项目
优点
缺点
适用范围
平板划线法
可以观察菌落特征，对混合菌进行分离
不能计数
适用于好氧菌
稀释涂布平板法
可以计数，可以观察菌落特征
吸收量较少，较麻烦，平板不干燥效果不好，容易蔓延
适用于厌氧菌和兼性厌氧菌
二、微生物的筛选和计数
1.土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
项目
详细内容
实验原理
(1)能合成 的细菌才能分解尿素
(2)配制以 为唯一氮源的培养基，能够生长的细菌就是能分解尿素的细菌
数量统计
(1) 法(显微镜下用特定细菌计数板或血细胞计数板)
(2)间接计数法： 法
实验流程
土壤取样→配制土壤溶液和制备培养基→ →涂布平板与培养→菌落
2.分解纤维素的微生物的分离
(1)纤维素酶
①组成：纤维素酶是一种 ，一般认为它至少包括三种组分，即
。
②作用
纤维素 
(2)纤维素分解菌的筛选
①原理
　　　　　　 　 纤维素分解菌
　　　　　　 　　　 ↓
→ 红色消失，出现
②筛选方法： 染色法，即通过是否产生 来筛选纤维素分解菌。
③培养基：以 为唯一碳源的选择培养基。
④实验流程
土壤取样：富含 的环境
↓
选择培养：用 培养，以增加纤维素分解菌的浓度
↓
：制备系列稀释液
↓
涂布平板：将样品涂布到 的培养基上
↓
挑选产生 的菌落
(3)分离纤维素分解菌所用的两种培养基比较
分离纤维素分解菌的实验中先用 培养基，再用 培养基。
①选择培养基为 培养基，以纤维素作为碳源和能源的微生物可以正常生长，而其他绝大多数微生物不能正常生长。
②鉴别培养基含琼脂，为 培养基，细菌可在培养基上形成肉眼可见的菌落。刚果红染色法应用的就是鉴别培养基。
3.结果分析与评价
内容
现象
结论
有无杂菌污染的判断
对照的培养皿中无菌落生长
未被杂菌污染
培养物中菌落数偏
被杂菌污染
菌落 ，菌落数偏高
培养物中混入其他氮源
选择培养基的筛选作用
牛肉膏培养基上的菌落数目大于选择培养基上的数目
选择培养基具 作用
样品的稀释操作
得到2个或2个以上菌落数目在30～300的平板
操作成功
重复组的结果
若选取同一种土样，统计结果应接近
【巧学助记】
1.菌株筛选原理的比较
土壤中分解尿素的细菌
分解纤维素的微生物
①选择培养基的成分：尿素作为唯一的氮源
②鉴定方法：在培养基中加入酚红指示剂，若pH升高，指示剂变红，说明细菌能分解尿素
①选择培养基的成分：纤维素作为唯一的碳源
②鉴定方法：刚果红染色法，即刚果红与纤维素形成红色复合物，当纤维素被分解后，培养基出现以纤维素分解菌为中心的透明圈
2.选择培养基与鉴别培养基的比较
种类
制备方法
原理
用途
举例
选择培养基
培养基中加入某些化学物质
依据某些微生物对某些物质或环境条件的嗜好、抗性而设计
从众多微生物中分离所需的微生物
加入青霉素分离得到酵母菌和霉菌
鉴别培养基
培养基中加入某种指示剂或化学药品　
依据微生物产生的某种代谢产物与培养基中的特定试剂或化学药品反应，产生明显的特征变化而设计
鉴别不同种类的微生物　
伊红?美蓝培养基可以鉴别大肠杆菌
判断下列说法的对错：
1.高压灭菌加热结束时，打开放气阀使压力表指针回到零后，开启锅盖(　 　)
2.倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上(　 　)
3.为了防止污染，接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落(　 　)
4.某研究小组从有机废水中分离微生物用于废水处理。接种后的培养皿须放在光照培养箱中培养(　 　)
5.纯化菌种时，为了得到单菌落，常采用的接种方法有平板划线法和稀释涂布平板法(　 　)
6.在琼脂固体培养基上长出的单个菌落含有多种细菌(　 　)
7.检测土壤中细菌总数实验操作中，确定对照组无菌后，选择菌落数在300以上的实验组平板进行计数(　 　)
8.培养微生物的培养基分装到培养皿后进行灭菌(　 　)
一　微生物的培养和无菌技术
例1：下表为某培养基的配方，下列叙述正确的是(　　)
成分
蛋白胨
葡萄糖
K2HPO4
伊红
美蓝
蒸馏水
含量
10 g
10 g
2 g
0.4 g
0.065 g
1 000 mL
A.从物理性质看该培养基属于液体培养基，从用途看该培养基属于选择培养基
B．该培养基中属于碳源的物质主要是葡萄糖，属于氮源的物质是蛋白胨
C．该培养基缺少提供生长因子的物质
D．该培养基调节合适的pH后就可以接种使用
【答案】　B
【解析】分析表中成分可知，该培养基中没有凝固剂，为液体培养基，该培养基的营养成分齐全，但存在伊红、美蓝等鉴别物质，属于鉴别培养基，A项错误；该培养基中的蛋白胨既是唯一的氮源，也是碳源，而葡萄糖是绝大多数生物最常利用的碳源，B项正确；该培养基中存在的无机盐和蛋白胨中的某些物质可以看作是生长因子，C项错误；培养基调节完pH还要进行灭菌等操作后才能使用，D项错误。
变式训练1：微生物培养过程中，要十分重视无菌操作。现代生物学实验中的许多方面也要进行无菌操作，防止杂菌污染。请分析下列操作中错误的是(　　)
①煮沸消毒可以杀死微生物的营养细胞和部分芽孢
②接种操作要在酒精灯火焰附近进行
③无菌繁殖脱毒苗时，植物的外植体要进行消毒
④家庭制作葡萄酒时要将容器和葡萄进行灭菌
⑤培养基要进行高压蒸汽灭菌
⑥加入培养基中的指示剂和染料不需要灭菌
A．①③ B．②④ C．③⑤ D．④⑥
【答案】　D
【解析】　无菌操作包括消毒和灭菌。需进行消毒处理的有植物的外植体及操作人员的双手等，需进行灭菌的有器皿、培养基、添加剂(指示剂或染色剂)等。煮沸可以杀死微生物的营养细胞和一部分芽孢，属于消毒；为防止空气中杂菌污染，接种操作要在酒精灯火焰附近进行；家庭制作葡萄酒时所利用的微生物是葡萄表面的酵母菌，故不能灭菌；培养基常进行高压蒸汽灭菌。故④⑥操作错误。
二、　大肠杆菌的纯化方法及过程分析
例2：下图中甲是稀释涂布平板法中的部分操作，乙是平板划线法的操作结果。
下列叙述中错误的是(　　)
A．甲中涂布前要将涂布器灼烧，冷却后才能取菌液
B．对于浓度较高的菌液，如甲中的稀释倍数仅为102，则所得的菌落不一定是由单一的细胞或孢子繁殖而成
C．乙培养皿中所得的菌落都符合要求
D．乙中的连续划线的起点是上一次划线的末端
【答案】　C
【解析】灼烧后的涂布器如果没有冷却就接触菌种，会将菌体杀死，A项正确；稀释倍数过低会导致多个菌体聚集在一起繁殖成菌落，B项正确；平板划线法中最后一次划线的末端处形成的菌落才是由单一的细胞或孢子繁殖而成，这种菌落才符合要求，C项错误；连续划线中，除了第一次划线外，每一次划线的起点是上一次划线的末端，目的是使得菌体的密度越来越小，保证最后划线末端处的菌落是由单一的细胞或孢子繁殖而成的，D项正确。
变式训练2：牛奶是微生物培养的良好培养基，牛奶在饮用前都要经过巴氏消毒，以杀死有害微生物，为检测消毒前后牛奶中细菌含量变化情况，做如图1所示操作。用无菌吸管从锥形瓶中吸取1 mL生牛奶稀释液至盛有9 mL无菌水的试管中，混合均匀，如此再重复2次。请回答下列有关问题：
(1)巴氏消毒的方法是__________________，使用这种方法对生鲜牛奶进行消毒的好处是__________________。
(2)取最终的牛奶稀释液0.1 mL滴在培养基上进行涂布，应选择的涂布工具是图2中的__________________。
(3)图1中所示方法为稀释涂布平板法，理想情况下，培养一段时间后可在培养基表面形成菌落。若用该方法培养设置了3个培养皿，菌落数分别为35个、33个、34个，则可以推测生牛奶中每毫升含细菌数为__________个，运用这种方法统计的结果往往较实际值______________(填“偏大”或“偏小”)，原因是________________________________。
(4)消毒后的牛奶中绝大部分细菌被杀死，若继续用该方法检测消毒后的牛奶中细菌的数量，则在操作步骤上应做什么改动？__________________。
(5)从生牛奶取样培养得到的菌落中混有各种杂菌，从中检测出大肠杆菌的方法是在培养基中加入__________，菌落具有____________________特征的可以认定为大肠杆菌。
【答案】(1)在70～75 ℃煮30 min(或在80 ℃煮15 min)　牛奶的营养成分不被破坏　(2)B　(3)3.4×106　偏小　个别菌落可能是由2个或多个细菌形成的　(4)减少稀释次数　(5)伊红美蓝　(金属光泽的紫)黑色
【解析】　(1)巴氏消毒的方法是在70～75 ℃煮30 min或在80 ℃煮15 min，可以杀死牛奶中的微生物，并且使牛奶的营养成分不被破坏。(2)涂布使用的工具是涂布器，图B正确。(3)菌落的平均数是34个，生牛奶中每毫升含细菌数＝菌落平均数/涂布量×稀释倍数＝34个/0.1mL×104＝3.4×106个/mL。在统计菌落时，当两个或多个菌落连在一起时，平板上观察到的只是单个菌落，所以运用这种方法统计的结果往往比实际值偏小。(4)由于消毒后牛奶中绝大部分细菌被杀死，所以可减少稀释次数。(5)大肠杆菌的代谢产物会使伊红美蓝鉴别培养基出现金属光泽的紫黑色。
三、　选择培养基成分及配制方法
例3：选择培养基是根据某一种或某一类微生物的特殊营养要求或对一些物理、化学抗性而设计的培养基。利用这种培养基可以将所需要的微生物从混杂的微生物中分离出来。为选择酵母菌和硝化细菌，应选用的培养基分别为(　　)
A．伊红美蓝培养基、含青霉素的培养基
B．含青霉素的培养基、含氨的无机培养基
C．含氨的无机培养基、含青霉素的培养基
D．含青霉素的培养基、伊红美蓝培养基
【答案】　B
【解析】　酵母菌是真菌，通常可以用含青霉素的培养基进行选择培养，因为青霉素抑制细菌生长，但不能抑制真菌生长。硝化细菌为自养型生物，能够利用氨转变为亚硝酸和硝酸过程所释放的能量，把无机物转变为有机物以维持自身生命活动，利用含氨的无机培养基可进行硝化细菌的选择培养。
变式训练3：苯酚是工业生产排放的有毒污染物质，自然界中存在着降解苯酚的微生物。某工厂产生的废水中含有苯酚，为了降解废水中的苯酚，研究人员从土壤中筛选获得了只能降解利用苯酚的细菌菌株，筛选的主要步骤如图所示，①为土壤样品。请据图回答下列问题：
(1)②中培养目的菌株的选择培养基中应加入________作为碳源，②中不同浓度碳源的培养基______________(填“影响”或“不影响”)细菌的数量，如果要测定②中活细菌数量，常采用______________________法。
(2)④为对照，微生物在④中不生长，在⑤中生长，④与⑤培养基的主要区别在于_________________________________________________________________________；使用__________________________法可以在⑥上获得单菌落。采用固体平板培养细菌时进行倒置培养的原因是______________________________________。
(3)实验过程中如何防止其他微生物的污染？
________________________________________________________________________。
【答案】(1)苯酚　影响　稀释涂布平板　(2)④的培养基中没有加入苯酚作为碳源，⑤的培养基中加入了苯酚作为碳源　稀释涂布平板法或平板划线　防止冷凝后形成的水珠滴落在培养基上污染培养基　(3)培养基灭菌，接种环境灭菌，接种过程进行无菌操作
【解析】(1)选择降解利用苯酚的细菌的培养基是以苯酚为唯一碳源的培养基；苯酚是唯一的碳源，当苯酚消耗尽时，菌株因缺少碳源而不能继续繁殖，所以②中不同浓度的碳源会影响细菌数量；一般采用稀释涂布平板法来测定②中活菌数目。
(2)④与⑤培养基的主要区别在于④的培养基中没有加入苯酚作为碳源，⑤的培养基中加入了苯酚作为碳源；使用稀释涂布平板法或平板划线法可以在⑥上获得单菌落。采用固体平板培养细菌时要倒置培养，以防止冷凝后形成的水珠滴落在培养基上污染培养基。
(3)从制备培养基到接种与培养等全部实验过程要无菌操作：无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵：a.实验操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒；b.将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌；c.为避免周围环境中微生物污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行；d.实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。
四、　微生物的分离与计数
例4：植物秸秆中的纤维素可被某些微生物分解。回答下列问题：
(1)分解秸秆中纤维素的微生物能分泌纤维素酶，该酶是由3种组分组成的复合酶，其中的葡萄糖苷酶可将________________分解成________。
(2)在含纤维素的培养基中加入刚果红(CR)时，CR可与纤维素形成________色复合物。用含有CR的该种培养基培养纤维素分解菌时，培养基上会出现以该菌的菌落为中心的______________。
(3)为从富含纤维素的土壤中分离获得纤维素分解菌的单菌落，某同学设计了甲、乙两种培养基(成分见下表)：
酵母膏
无机盐
淀粉
纤维素粉
琼脂
CR溶液
水
培养基甲
＋
＋
＋
＋
－
＋
＋
培养基乙
＋
＋
＋
－
＋
＋
＋
注：“＋”表示有，“－”表示无。
据表判断，培养基甲________(填“能”或“不能”)用于分离和鉴别纤维素分解菌，原因是________________________________；培养基乙________(填“能”或“不能”)用于分离和鉴别纤维素分解菌，原因是_______________________________________
________________________________________________________________________。
【答案】(1)纤维二糖　葡萄糖　(2)红　透明圈　(3)不能　液体培养基不能用于分离单菌落　不能　培养基中没有纤维素，不会形成CR-纤维素红色复合物，即使出现单菌落也不能确定其为纤维素分解菌
【解析】(1)纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶，前两种酶能使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶能将纤维二糖分解成葡萄糖。(2)刚果红是一种染料，可以与培养基中的纤维素形成红色复合物，当纤维素被纤维素酶分解后，红色复合物就无法形成，培养基中就会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，我们可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。(3)纤维素分解菌的选择培养基为液体培养基，而用于分离和鉴别纤维素分解菌的培养基为固体培养基，并且培养基中需含有纤维素，才能与CR形成红色复合物，有纤维素分解菌时才能形成以纤维素分解菌为中心的透明圈。
变式训练4：为了调查某河流的水质状况，某研究小组测定了该河流水样中的细菌含量，并进行了细菌分离等工作。回答下列问题：
(1)该小组采用稀释涂布平板法检测水样中细菌的含量。在涂布接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先行培养了一段时间，这样做的目的是________________________________；
(2)该小组采用平板划线法分离水样中的细菌。操作时，接种环需通过________________灭菌，在第二次及以后的划线时，总是从上一次划线的末端开始划线，这样做的目的是________________________________________________________________________。
(3)示意图A和B中，________________表示的是用稀释涂布平板法接种培养后得到的结果。
(4)该小组将得到的菌株接种到液体培养基中并混匀，一部分进行静置培养，另一部分进行振荡培养。结果发现：振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。分析其原因是：振荡培养能提高培养液中__________________的含量，同时可使菌体与培养液充分接触，提高________________的利用率。
【答案】(1)检测培养基平板灭菌是否合格　(2)灼烧　将聚集的菌体逐步稀释以便获得单个菌落　(3)B　(4)溶解氧　营养物质
【解析】　(1)在涂布接种前，随机选取若干灭菌后的空白平板先行培养一段时间，目的是检测培养基平板灭菌是否合格。(2)用平板划线法分离水样中的细菌，操作时，接种环需通过灼烧灭菌，在第二次及以后的划线时，应从上一次划线末端开始划线，目的是将聚集的菌体逐步稀释以便获得单个菌落。(3)稀释涂布平板法接种培养后得到的结果应为图B。(4)振荡可以使细菌分散，更有利于细菌利用培养液中的营养物质，并且可以使培养液中的溶解氧增多。
1. 有些细菌可分解原油，从而消除由原油泄漏造成的土壤污染。某同学欲从受原油污染的土壤中筛选出能高效降解原油的菌株。分析回答问题：
(1)在筛选过程中，应将土壤样品稀释液接种于以________为唯一碳源的固体培养基上。从功能上讲，该培养基属于________培养基。?
(2)为了筛选出高效菌株，可比较单菌落周围分解圈的大小，分解圈大说明该菌株的降解能力________。?
(3)通常情况下，在微生物培养过程中，实验室常用的灭菌方法有灼烧灭菌、________和________等。无菌技术要求实验操作应在酒精灯_________附近进行，以避免周围环境中微生物的污染。?
2.植物秸秆中的纤维素可被某些微生物分解。回答下列问题:
(1)分解秸秆中纤维素的微生物能分泌纤维素酶,该酶是由3种组分组成的复合酶,其中的葡萄糖苷酶可将　　　　　　　　　　分解成　　　 　。?
(2)在含纤维素的培养基中加入刚果红(CR)时,CR可与纤维素形成
　　　　色复合物。用含有CR的该种培养基培养纤维素分解菌时,培养基上会出现以该菌的菌落为中心的　　　　。?
(3)为从富含纤维素的土壤中分离获得纤维素分解菌的单菌落,某同学设计了甲、乙两种培养基(成分见下表):
酵母膏
无机盐
淀粉
纤维素粉
琼脂
CR溶液
水
培养
基甲
+
+
+
+
-
+
+
培养
基乙
+
+
+
-
+
+
+
注:“+”表示有,“-”表示无。
据表判断,培养基甲　　　　(填“能”或“不能”)用于分离和鉴别纤维素分解菌,原因是　?　 ;?
培养基乙　　　　(填“能”或“不能”)用于分离和鉴别纤维素分解菌,原因是　??　 。?
3.某同学用新鲜的泡菜滤液为实验材料分离纯化乳酸菌。分离纯化所用固体培养基中因含有碳酸钙而不透明,乳酸菌产生的乳酸能溶解培养基中的碳酸钙。回答下列问题:
(1)分离纯化乳酸菌时,首先需要用　　　　对泡菜滤液进行梯度稀释,进行梯度稀释的理由是　?　　　　　　 　。?
(2)推测在分离纯化所用的培养基中加入碳酸钙的作用有　　　　　　　和　 。?
分离纯化时应挑选出　　　　　　的菌落作为候选菌。?
(3)乳酸菌在-20 ℃长期保存时,菌液中常需要加入一定量的　　　　(填“蒸馏水”“甘油”或“碳酸钙”)。?
4.空气中的微生物在重力等作用下,可以一定程度地沉降。某研究小组欲用平板收集教室空气中的微生物,以了解教室内不同高度空气中微生物的分布情况。实验步骤如下:
①配制培养基(成分:牛肉膏、蛋白胨、NaCl、X、H2O);
②制作无菌平板;
③设置空白对照组和若干实验组,进行相关操作;
④将各组平板置于37 ℃恒温箱中培养一段时间,统计各组平板上菌落的平均数。
回答下列问题:
(1)该培养基中微生物所需的氮来源于　　　　　　　　。若要完成步骤②,该培养基中的成分X通常是　　　　。?
(2)步骤③中,实验组的操作是?　 。?
(3)若在某次调查中 ,某一实验组平板上菌落平均数为 36个/平板,而空白对照组的一个平板上出现了6个菌落,这种结果说明在此次调查中出现了　　　　现象。若将30(即36-6)个/平板作为本组菌落数的平均值,该做法　　　　(填“正确”或“不正确”)。?
5.回答下列与酵母菌有关的问题:
(1)分离培养酵母菌通常使用　　　　　　(填“牛肉膏蛋白胨”“MS”或“麦芽汁琼脂”)培养基,该培养基应采用　　　　　　灭菌法灭菌。若将酵母菌划线接种在平板上,培养一段时间后可观察到菌落,菌落的含义是　?　 。?
(2)酵母菌液体培养时,若通入氧气,可促进　　　　　　　　　　　　(填“菌体快速增殖”“乙醇产生”或“乳酸产生”);若进行厌氧培养,可促进　　　　　　　(填“菌体快速增殖”“乙醇产生”或“乳酸产生”)。?
(3)制作面包时,为使面包松软通常要在面粉中添加一定量的酵母菌,酵母菌引起面包松软的原因是?　 。?
6. 牛奶中富含蛋白质,长期饮用有助于增强体质,但牛奶同时也是多种疾病的传播载体。国家标准是每毫升牛奶中细菌数小于30 000个。以下是牛奶消毒及细菌检测实验。分析回答:
(1)图中步骤①称为　　　　消毒法。步骤②是　　　　　　　　。?
(2)培养基中的蛋白胨可以为微生物提供　　　　　。进行步骤③操作时,应选用下列中的哪种工具?　　　　。为了避免杂菌污染,此步骤应在　　　　　附近进行。?
(3)将接种后的培养基和作为对照的　　　　　　　 　同时放入37 ℃恒温培养箱中,培养36小时。取出后统计各平板的菌落数,结果如下表所示。应该选择其中稀释倍数为　　　　　　的平板进行计数,经过消毒后的牛奶中,细菌数大约是　　　　　　个/mL。?
牛奶稀释倍数
102
103
104
平板1菌落数
87
10
1
平板2菌落数
83
12
1
平板3菌落数
85
10
0
7.秸秆回收利用是变废为宝的新兴工艺。如图是从土壤中筛选分解纤维素的细菌的过程,回答下列问题。
土壤取样→梯度稀释→选择培养→鉴别培养→菌种
(1)初次对土壤样品做实验,应该将土壤稀释的范围放　　　　一些。某同学进行严格的无菌操作,在三个培养基平板上,均滴加—定稀释倍数的土壤溶液0.1 mL,若最终统计结果平均值为560,结果是否合理?　 ,?
最可能原因是?　 。?
(2)图中选择培养时,一般采用　　　 　培养基,好处是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。培养基中加入酵母膏的作用是　?
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。鉴别培养基还需要添加　　　　　　　作为指示剂,以确定选出分解纤维素的细菌。?
(3)纤维素酶是一种复合酶,在三种酶的　　　　作用下,将纤维素分解成葡萄糖。?
8.下面是筛选抗链霉素大肠杆菌的实验步骤及相关图解。
实验步骤:
①把大量对链霉素敏感的大肠杆菌接种在不含链霉素的培养基1的表面,进行培养。
②待其长出密集的小菌落后,用影印法接种到不含链霉素的培养基2上,随即在影印到含链霉素的培养基3上,进行培养。
③在培养基3上,出现了个别抗链霉素的菌落,将其挑选出,以此类推,如图:
请分析回答:
(1)菌落是指?　　　　　 　　,从生态学角度分析,菌落实质上属于　　　　　　。?
(2)配制培养大肠杆菌的培养基,一般都含有水、碳源、无机盐和氮源等四类营养物质。试从细胞的元素组成分析,其原因是?
　　　　　　　　　　　　　　　。配制培养基时除了满足基本的营养条件外,还需满足微生物生长对特殊营养物质、　　　　 　　的要求。?
(3)从功能上看,含有链霉素的培养基3、7、11属于　　　　　　。由上图可知,原始菌种接种到培养基1、5、9的方法是　　　　　。?
(4)对2和3进行比较,在2上找到与3上相应的菌落,挑取其中一个菌落接种到　　　　　　　(填“含链霉素”或“不含链霉素”)的培养基上,如果有较多的菌落出现,则说明该抗性基因突变发生在该菌接触链霉素之　　　　(填“前”或“后”)。?
第46讲 微生物的培养与应用（解析版）
本模块是微生物的培养与应用，通过本模块，了解培养基的成分及其作用，比较分析平板划线法和稀释涂布平板法异同，了解选择培养基和鉴别培养基的区别，探究微生物培养的条件及如何分离某种微生物，微生物的控制及宣传健康生活方式。考纲对本模块内容的具体要求如下：
1. 微生物的分离和培养(理解水平)
2. 培养基对微生物的选择作用(理解应用水平)
3. 某种微生物数量的测定(应用水平)
4. 微生物在其他方面的应用（理解应用水平）
从近年的高考情况看，高考命题时往往从实验细节入手，比较注重对实验基本操作方法的考查，从考查内容上看，主要考查微生物的纯化培养操作与应用、传统发酵技术。从考查角度上看，联系生产生活实际考查微生物的计数、分离和纯化培养：结合发酵食品制作过程考查传统发酵技术原理及基本操作。
　一、　微生物的实验室培养
1.培养基
(1)概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。
(2)营养组成：一般都含有水、碳源、氮源和无机盐。此外，还需要满足微生物生长对pH、氧气以及特殊营养物质的要求。
(3)种类：按照物理性质可分为液体培养基和固体培养基。
2.无菌技术
(1)含义：指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。
(2)关键：防止外来杂菌的入侵。
(3)不同对象的无菌操作方法(连线)
3.大肠杆菌的纯化培养
(1)制备牛肉膏蛋白胨固体培养基
①操作步骤
→→→→
②倒平板的方法及注意事项
a.请用文字和箭头写出正确的倒平板操作流程：丙→乙→甲→丁。
b.甲、乙、丙中的灭菌方法是灼烧灭菌。
c.丁中的操作需要等待平板冷却凝固才能进行。
(2)纯化大肠杆菌的方法
①纯化培养原理：想方设法在培养基上得到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的菌落，即可获得较纯的菌种。
②纯化大肠杆菌的关键步骤：接种。
③常用的微生物接种方法有两种
a.平板划线法：是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。
b.稀释涂布平板法：是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。
(3)菌种的保存方法
①对于频繁使用的菌种，可以采用临时保藏的方法。
②对于需要长期保存的菌种，可以采用甘油管藏的方法。
【巧学助记】
1.无菌技术
条件
结果
常用方法
应用范围
消毒
较为温和的物理或化学方法
仅杀死物体表面或内部的部分微生物
煮沸消毒法
日常用品
巴氏消毒法
不耐高温的液体
化学药剂消毒法
用酒精擦拭双手，用氯气消毒水源
灭菌
强烈的理化因素
杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子
灼烧灭菌法
接种工具
干热灭菌法
玻璃器皿、金属用具
高压蒸汽灭菌法
培养基及容器
2.两种纯化细菌的方法的比较
项目
优点
缺点
适用范围
平板划线法
可以观察菌落特征，对混合菌进行分离
不能计数
适用于好氧菌
稀释涂布平板法
可以计数，可以观察菌落特征
吸收量较少，较麻烦，平板不干燥效果不好，容易蔓延
适用于厌氧菌和兼性厌氧菌
二、微生物的筛选和计数
1.土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
项目
详细内容
实验原理
(1)能合成脲酶的细菌才能分解尿素
(2)配制以尿素为唯一氮源的培养基，能够生长的细菌就是能分解尿素的细菌
数量统计
(1)直接计数法(显微镜下用特定细菌计数板或血细胞计数板)
(2)间接计数法：稀释涂布平板法
实验流程
土壤取样→配制土壤溶液和制备培养基→系列稀释→涂布平板与培养→菌落计数
2.分解纤维素的微生物的分离
(1)纤维素酶
①组成：纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶。
②作用
纤维素纤维二糖葡萄糖
(2)纤维素分解菌的筛选
①原理
　　　　　　 　 纤维素分解菌
　　　　　　 　　　 ↓
→红色复合物红色消失，出现透明圈
②筛选方法：刚果红染色法，即通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。
③培养基：以纤维素为唯一碳源的选择培养基。
④实验流程
土壤取样：富含纤维素的环境
↓
选择培养：用选择培养基培养，以增加纤维素分解菌的浓度
↓
梯度稀释：制备系列稀释液
↓
涂布平板：将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上
↓
挑选产生透明圈的菌落
(3)分离纤维素分解菌所用的两种培养基比较
分离纤维素分解菌的实验中先用选择培养基，再用鉴别培养基。
①选择培养基为液体培养基，以纤维素作为碳源和能源的微生物可以正常生长，而其他绝大多数微生物不能正常生长。
②鉴别培养基含琼脂，为固体培养基，细菌可在培养基上形成肉眼可见的菌落。刚果红染色法应用的就是鉴别培养基。
3.结果分析与评价
内容
现象
结论
有无杂菌污染的判断
对照的培养皿中无菌落生长
未被杂菌污染
培养物中菌落数偏高
被杂菌污染
菌落形态多样，菌落数偏高
培养物中混入其他氮源
选择培养基的筛选作用
牛肉膏培养基上的菌落数目大于选择培养基上的数目
选择培养基具筛选作用
样品的稀释操作
得到2个或2个以上菌落数目在30～300的平板
操作成功
重复组的结果
若选取同一种土样，统计结果应接近
【巧学助记】
1.菌株筛选原理的比较
土壤中分解尿素的细菌
分解纤维素的微生物
①选择培养基的成分：尿素作为唯一的氮源
②鉴定方法：在培养基中加入酚红指示剂，若pH升高，指示剂变红，说明细菌能分解尿素
①选择培养基的成分：纤维素作为唯一的碳源
②鉴定方法：刚果红染色法，即刚果红与纤维素形成红色复合物，当纤维素被分解后，培养基出现以纤维素分解菌为中心的透明圈
2.选择培养基与鉴别培养基的比较
种类
制备方法
原理
用途
举例
选择培养基
培养基中加入某些化学物质
依据某些微生物对某些物质或环境条件的嗜好、抗性而设计
从众多微生物中分离所需的微生物
加入青霉素分离得到酵母菌和霉菌
鉴别培养基
培养基中加入某种指示剂或化学药品　
依据微生物产生的某种代谢产物与培养基中的特定试剂或化学药品反应，产生明显的特征变化而设计
鉴别不同种类的微生物　
伊红?美蓝培养基可以鉴别大肠杆菌
判断下列说法的对错：
1.高压灭菌加热结束时，打开放气阀使压力表指针回到零后，开启锅盖(　 　)
【答案】×
【解析】高压灭菌加热结束后，让其自然冷却后再慢慢打开排气阀以排除余气，然后才能开盖取物
2.倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上(　 　)
【答案】×
【解析】倒平板时左手拿培养皿，右手拿锥形瓶，左手将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，倒入培养基后立即盖上培养皿皿盖
3.为了防止污染，接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落(　 　)
【答案】×
【解析】接种环灼烧灭菌之后，应待其冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种
4.某研究小组从有机废水中分离微生物用于废水处理。接种后的培养皿须放在光照培养箱中培养(　 　)
【答案】×
【解析】有机废水中的微生物是分解者，不能进行光合作用，培养过程中不需要光照
5.纯化菌种时，为了得到单菌落，常采用的接种方法有平板划线法和稀释涂布平板法(　 　)
【答案】√
【解析】常用的接种方法有平板划线法和稀释涂布平板法
6.在琼脂固体培养基上长出的单个菌落含有多种细菌(　 　)
【答案】×
【解析】菌落是指单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，形成的一个肉眼可见的、具有一定形态结构的子细胞群体，所以单个菌落中通常只有一种细菌
7.检测土壤中细菌总数实验操作中，确定对照组无菌后，选择菌落数在300以上的实验组平板进行计数(　 　)
【答案】×
【解析】确定对照组无菌后，选择菌落数在30～300的平板进行计数，求其平均值，再通过计算得出土壤中细菌总数
8.培养微生物的培养基分装到培养皿后进行灭菌(　 　)
【答案】×
【解析】在配制培养基的过程中要先灭菌后倒平板
一　微生物的培养和无菌技术
例1：下表为某培养基的配方，下列叙述正确的是(　　)
成分
蛋白胨
葡萄糖
K2HPO4
伊红
美蓝
蒸馏水
含量
10 g
10 g
2 g
0.4 g
0.065 g
1 000 mL
A.从物理性质看该培养基属于液体培养基，从用途看该培养基属于选择培养基
B．该培养基中属于碳源的物质主要是葡萄糖，属于氮源的物质是蛋白胨
C．该培养基缺少提供生长因子的物质
D．该培养基调节合适的pH后就可以接种使用
【答案】　B
【解析】分析表中成分可知，该培养基中没有凝固剂，为液体培养基，该培养基的营养成分齐全，但存在伊红、美蓝等鉴别物质，属于鉴别培养基，A项错误；该培养基中的蛋白胨既是唯一的氮源，也是碳源，而葡萄糖是绝大多数生物最常利用的碳源，B项正确；该培养基中存在的无机盐和蛋白胨中的某些物质可以看作是生长因子，C项错误；培养基调节完pH还要进行灭菌等操作后才能使用，D项错误。
变式训练1：微生物培养过程中，要十分重视无菌操作。现代生物学实验中的许多方面也要进行无菌操作，防止杂菌污染。请分析下列操作中错误的是(　　)
①煮沸消毒可以杀死微生物的营养细胞和部分芽孢
②接种操作要在酒精灯火焰附近进行
③无菌繁殖脱毒苗时，植物的外植体要进行消毒
④家庭制作葡萄酒时要将容器和葡萄进行灭菌
⑤培养基要进行高压蒸汽灭菌
⑥加入培养基中的指示剂和染料不需要灭菌
A．①③ B．②④ C．③⑤ D．④⑥
【答案】　D
【解析】　无菌操作包括消毒和灭菌。需进行消毒处理的有植物的外植体及操作人员的双手等，需进行灭菌的有器皿、培养基、添加剂(指示剂或染色剂)等。煮沸可以杀死微生物的营养细胞和一部分芽孢，属于消毒；为防止空气中杂菌污染，接种操作要在酒精灯火焰附近进行；家庭制作葡萄酒时所利用的微生物是葡萄表面的酵母菌，故不能灭菌；培养基常进行高压蒸汽灭菌。故④⑥操作错误。
二、　大肠杆菌的纯化方法及过程分析
例2：下图中甲是稀释涂布平板法中的部分操作，乙是平板划线法的操作结果。
下列叙述中错误的是(　　)
A．甲中涂布前要将涂布器灼烧，冷却后才能取菌液
B．对于浓度较高的菌液，如甲中的稀释倍数仅为102，则所得的菌落不一定是由单一的细胞或孢子繁殖而成
C．乙培养皿中所得的菌落都符合要求
D．乙中的连续划线的起点是上一次划线的末端
【答案】　C
【解析】灼烧后的涂布器如果没有冷却就接触菌种，会将菌体杀死，A项正确；稀释倍数过低会导致多个菌体聚集在一起繁殖成菌落，B项正确；平板划线法中最后一次划线的末端处形成的菌落才是由单一的细胞或孢子繁殖而成，这种菌落才符合要求，C项错误；连续划线中，除了第一次划线外，每一次划线的起点是上一次划线的末端，目的是使得菌体的密度越来越小，保证最后划线末端处的菌落是由单一的细胞或孢子繁殖而成的，D项正确。
变式训练2：牛奶是微生物培养的良好培养基，牛奶在饮用前都要经过巴氏消毒，以杀死有害微生物，为检测消毒前后牛奶中细菌含量变化情况，做如图1所示操作。用无菌吸管从锥形瓶中吸取1 mL生牛奶稀释液至盛有9 mL无菌水的试管中，混合均匀，如此再重复2次。请回答下列有关问题：
(1)巴氏消毒的方法是__________________，使用这种方法对生鲜牛奶进行消毒的好处是__________________。
(2)取最终的牛奶稀释液0.1 mL滴在培养基上进行涂布，应选择的涂布工具是图2中的__________________。
(3)图1中所示方法为稀释涂布平板法，理想情况下，培养一段时间后可在培养基表面形成菌落。若用该方法培养设置了3个培养皿，菌落数分别为35个、33个、34个，则可以推测生牛奶中每毫升含细菌数为__________个，运用这种方法统计的结果往往较实际值______________(填“偏大”或“偏小”)，原因是________________________________。
(4)消毒后的牛奶中绝大部分细菌被杀死，若继续用该方法检测消毒后的牛奶中细菌的数量，则在操作步骤上应做什么改动？__________________。
(5)从生牛奶取样培养得到的菌落中混有各种杂菌，从中检测出大肠杆菌的方法是在培养基中加入__________，菌落具有____________________特征的可以认定为大肠杆菌。
【答案】(1)在70～75 ℃煮30 min(或在80 ℃煮15 min)　牛奶的营养成分不被破坏　(2)B　(3)3.4×106　偏小　个别菌落可能是由2个或多个细菌形成的　(4)减少稀释次数　(5)伊红美蓝　(金属光泽的紫)黑色
【解析】　(1)巴氏消毒的方法是在70～75 ℃煮30 min或在80 ℃煮15 min，可以杀死牛奶中的微生物，并且使牛奶的营养成分不被破坏。(2)涂布使用的工具是涂布器，图B正确。(3)菌落的平均数是34个，生牛奶中每毫升含细菌数＝菌落平均数/涂布量×稀释倍数＝34个/0.1mL×104＝3.4×106个/mL。在统计菌落时，当两个或多个菌落连在一起时，平板上观察到的只是单个菌落，所以运用这种方法统计的结果往往比实际值偏小。(4)由于消毒后牛奶中绝大部分细菌被杀死，所以可减少稀释次数。(5)大肠杆菌的代谢产物会使伊红美蓝鉴别培养基出现金属光泽的紫黑色。
三、　选择培养基成分及配制方法
例3：选择培养基是根据某一种或某一类微生物的特殊营养要求或对一些物理、化学抗性而设计的培养基。利用这种培养基可以将所需要的微生物从混杂的微生物中分离出来。为选择酵母菌和硝化细菌，应选用的培养基分别为(　　)
A．伊红美蓝培养基、含青霉素的培养基
B．含青霉素的培养基、含氨的无机培养基
C．含氨的无机培养基、含青霉素的培养基
D．含青霉素的培养基、伊红美蓝培养基
【答案】　B
【解析】　酵母菌是真菌，通常可以用含青霉素的培养基进行选择培养，因为青霉素抑制细菌生长，但不能抑制真菌生长。硝化细菌为自养型生物，能够利用氨转变为亚硝酸和硝酸过程所释放的能量，把无机物转变为有机物以维持自身生命活动，利用含氨的无机培养基可进行硝化细菌的选择培养。
变式训练3：苯酚是工业生产排放的有毒污染物质，自然界中存在着降解苯酚的微生物。某工厂产生的废水中含有苯酚，为了降解废水中的苯酚，研究人员从土壤中筛选获得了只能降解利用苯酚的细菌菌株，筛选的主要步骤如图所示，①为土壤样品。请据图回答下列问题：
(1)②中培养目的菌株的选择培养基中应加入________作为碳源，②中不同浓度碳源的培养基______________(填“影响”或“不影响”)细菌的数量，如果要测定②中活细菌数量，常采用______________________法。
(2)④为对照，微生物在④中不生长，在⑤中生长，④与⑤培养基的主要区别在于_________________________________________________________________________；使用__________________________法可以在⑥上获得单菌落。采用固体平板培养细菌时进行倒置培养的原因是______________________________________。
(3)实验过程中如何防止其他微生物的污染？
________________________________________________________________________。
【答案】(1)苯酚　影响　稀释涂布平板　(2)④的培养基中没有加入苯酚作为碳源，⑤的培养基中加入了苯酚作为碳源　稀释涂布平板法或平板划线　防止冷凝后形成的水珠滴落在培养基上污染培养基　(3)培养基灭菌，接种环境灭菌，接种过程进行无菌操作
【解析】(1)选择降解利用苯酚的细菌的培养基是以苯酚为唯一碳源的培养基；苯酚是唯一的碳源，当苯酚消耗尽时，菌株因缺少碳源而不能继续繁殖，所以②中不同浓度的碳源会影响细菌数量；一般采用稀释涂布平板法来测定②中活菌数目。
(2)④与⑤培养基的主要区别在于④的培养基中没有加入苯酚作为碳源，⑤的培养基中加入了苯酚作为碳源；使用稀释涂布平板法或平板划线法可以在⑥上获得单菌落。采用固体平板培养细菌时要倒置培养，以防止冷凝后形成的水珠滴落在培养基上污染培养基。
(3)从制备培养基到接种与培养等全部实验过程要无菌操作：无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵：a.实验操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒；b.将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌；c.为避免周围环境中微生物污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行；d.实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。
四、　微生物的分离与计数
例4：植物秸秆中的纤维素可被某些微生物分解。回答下列问题：
(1)分解秸秆中纤维素的微生物能分泌纤维素酶，该酶是由3种组分组成的复合酶，其中的葡萄糖苷酶可将________________分解成________。
(2)在含纤维素的培养基中加入刚果红(CR)时，CR可与纤维素形成________色复合物。用含有CR的该种培养基培养纤维素分解菌时，培养基上会出现以该菌的菌落为中心的______________。
(3)为从富含纤维素的土壤中分离获得纤维素分解菌的单菌落，某同学设计了甲、乙两种培养基(成分见下表)：
酵母膏
无机盐
淀粉
纤维素粉
琼脂
CR溶液
水
培养基甲
＋
＋
＋
＋
－
＋
＋
培养基乙
＋
＋
＋
－
＋
＋
＋
注：“＋”表示有，“－”表示无。
据表判断，培养基甲________(填“能”或“不能”)用于分离和鉴别纤维素分解菌，原因是________________________________；培养基乙________(填“能”或“不能”)用于分离和鉴别纤维素分解菌，原因是_______________________________________
________________________________________________________________________。
【答案】(1)纤维二糖　葡萄糖　(2)红　透明圈　(3)不能　液体培养基不能用于分离单菌落　不能　培养基中没有纤维素，不会形成CR-纤维素红色复合物，即使出现单菌落也不能确定其为纤维素分解菌
【解析】(1)纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶，前两种酶能使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶能将纤维二糖分解成葡萄糖。(2)刚果红是一种染料，可以与培养基中的纤维素形成红色复合物，当纤维素被纤维素酶分解后，红色复合物就无法形成，培养基中就会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，我们可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。(3)纤维素分解菌的选择培养基为液体培养基，而用于分离和鉴别纤维素分解菌的培养基为固体培养基，并且培养基中需含有纤维素，才能与CR形成红色复合物，有纤维素分解菌时才能形成以纤维素分解菌为中心的透明圈。
变式训练4：为了调查某河流的水质状况，某研究小组测定了该河流水样中的细菌含量，并进行了细菌分离等工作。回答下列问题：
(1)该小组采用稀释涂布平板法检测水样中细菌的含量。在涂布接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先行培养了一段时间，这样做的目的是________________________________；
(2)该小组采用平板划线法分离水样中的细菌。操作时，接种环需通过________________灭菌，在第二次及以后的划线时，总是从上一次划线的末端开始划线，这样做的目的是________________________________________________________________________。
(3)示意图A和B中，________________表示的是用稀释涂布平板法接种培养后得到的结果。
(4)该小组将得到的菌株接种到液体培养基中并混匀，一部分进行静置培养，另一部分进行振荡培养。结果发现：振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。分析其原因是：振荡培养能提高培养液中__________________的含量，同时可使菌体与培养液充分接触，提高________________的利用率。
【答案】(1)检测培养基平板灭菌是否合格　(2)灼烧　将聚集的菌体逐步稀释以便获得单个菌落　(3)B　(4)溶解氧　营养物质
【解析】　(1)在涂布接种前，随机选取若干灭菌后的空白平板先行培养一段时间，目的是检测培养基平板灭菌是否合格。(2)用平板划线法分离水样中的细菌，操作时，接种环需通过灼烧灭菌，在第二次及以后的划线时，应从上一次划线末端开始划线，目的是将聚集的菌体逐步稀释以便获得单个菌落。(3)稀释涂布平板法接种培养后得到的结果应为图B。(4)振荡可以使细菌分散，更有利于细菌利用培养液中的营养物质，并且可以使培养液中的溶解氧增多。
1. 有些细菌可分解原油，从而消除由原油泄漏造成的土壤污染。某同学欲从受原油污染的土壤中筛选出能高效降解原油的菌株。分析回答问题：
(1)在筛选过程中，应将土壤样品稀释液接种于以________为唯一碳源的固体培养基上。从功能上讲，该培养基属于________培养基。?
(2)为了筛选出高效菌株，可比较单菌落周围分解圈的大小，分解圈大说明该菌株的降解能力________。?
(3)通常情况下，在微生物培养过程中，实验室常用的灭菌方法有灼烧灭菌、________和________等。无菌技术要求实验操作应在酒精灯_________附近进行，以避免周围环境中微生物的污染。?
【答案】 (1)原油　选择　(2)强 (3)干热灭菌　高压蒸汽灭菌　火焰
【解析】　(1)欲筛选出能高效降解原油的菌株，培养基中应只含有原油而无其他碳源，这样不能降解原油的细菌在此培养基上不能生存，这类培养基属于选择培养基。
(2)降解原油能力越强的菌株，在菌落周围形成的分解圈越大。
(3)实验室常用的灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌和高压蒸汽灭菌等。无菌技术要求整个实验过程都在酒精灯火焰附近进行，以避免周围环境中微生物的污染。
2.植物秸秆中的纤维素可被某些微生物分解。回答下列问题:
(1)分解秸秆中纤维素的微生物能分泌纤维素酶,该酶是由3种组分组成的复合酶,其中的葡萄糖苷酶可将　　　　　　　　　　分解成　　　 　。?
(2)在含纤维素的培养基中加入刚果红(CR)时,CR可与纤维素形成
　　　　色复合物。用含有CR的该种培养基培养纤维素分解菌时,培养基上会出现以该菌的菌落为中心的　　　　。?
(3)为从富含纤维素的土壤中分离获得纤维素分解菌的单菌落,某同学设计了甲、乙两种培养基(成分见下表):
酵母膏
无机盐
淀粉
纤维素粉
琼脂
CR溶液
水
培养
基甲
+
+
+
+
-
+
+
培养
基乙
+
+
+
-
+
+
+
注:“+”表示有,“-”表示无。
据表判断,培养基甲　　　　(填“能”或“不能”)用于分离和鉴别纤维素分解菌,原因是　?　 ;?
培养基乙　　　　(填“能”或“不能”)用于分离和鉴别纤维素分解菌,原因是　??　 。?
【答案】(1)纤维二糖　葡萄糖
(2)红　透明圈
(3)不能　液体培养基不能用于分离单菌落　不能　培养基中没有纤维素,不会形成CR—纤维素红色复合物,即使出现单菌落也不能确定其为纤维素分解菌
【解析】　(1)纤维素酶包括三种组分,即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶,C1酶、CX酶催化纤维素分解成纤维二糖,葡萄糖苷酶将纤维二糖分解成葡萄糖。(2)CR能与培养基中的纤维素形成红色复合物。当纤维素被纤维素酶分解后,CR—纤维素的复合物就无法形成,培养基中会出现以纤维素分解菌的菌落为中心的透明圈。(3)培养基甲中未添加琼脂,为液体培养基,液体培养基上不能形成单菌落,故不能用于分离和鉴别纤维素分解菌。培养基乙中未添加纤维素,不能和CR形成红色复合物,即使出现单菌落也不能确定为纤维素分解菌。

3.某同学用新鲜的泡菜滤液为实验材料分离纯化乳酸菌。分离纯化所用固体培养基中因含有碳酸钙而不透明,乳酸菌产生的乳酸能溶解培养基中的碳酸钙。回答下列问题:
(1)分离纯化乳酸菌时,首先需要用　　　　对泡菜滤液进行梯度稀释,进行梯度稀释的理由是　?　　　　　　 　。?
(2)推测在分离纯化所用的培养基中加入碳酸钙的作用有　　　　　　　和　 。?
分离纯化时应挑选出　　　　　　的菌落作为候选菌。?
(3)乳酸菌在-20 ℃长期保存时,菌液中常需要加入一定量的　　　　(填“蒸馏水”“甘油”或“碳酸钙”)。?
【答案】 (1)无菌水　泡菜滤液中菌的浓度高,直接培养很难分离得到单菌落　(2)鉴别乳酸菌　中和产生的乳酸(或酸)　具有透明圈　(3)甘油
【解析】　(1)在对泡菜滤液进行梯度稀释时,要防止杂菌污染,因此需要用无菌水;进行梯度稀释的原因是泡菜滤液中乳酸菌等菌的浓度高,若直接培养,很难分离得到单菌落。(2)已知分离纯化乳酸菌所用固体培养基,因含有碳酸钙而不透明,而乳酸菌产生的乳酸能溶解培养基中的碳酸钙,因此培养基中加入碳酸钙的作用:一是可鉴别乳酸菌,二是能中和乳酸菌产生的乳酸。分离纯化时,挑选出具有透明圈的菌落即为乳酸菌,可作为候选菌。(3)长期保存菌种时,常采用甘油管藏的方法,在菌液中加入一定量的甘油,充分混匀后放于-20 ℃的冷冻箱中保存。
4.空气中的微生物在重力等作用下,可以一定程度地沉降。某研究小组欲用平板收集教室空气中的微生物,以了解教室内不同高度空气中微生物的分布情况。实验步骤如下:
①配制培养基(成分:牛肉膏、蛋白胨、NaCl、X、H2O);
②制作无菌平板;
③设置空白对照组和若干实验组,进行相关操作;
④将各组平板置于37 ℃恒温箱中培养一段时间,统计各组平板上菌落的平均数。
回答下列问题:
(1)该培养基中微生物所需的氮来源于　　　　　　　　。若要完成步骤②,该培养基中的成分X通常是　　　　。?
(2)步骤③中,实验组的操作是?　 。?
(3)若在某次调查中 ,某一实验组平板上菌落平均数为 36个/平板,而空白对照组的一个平板上出现了6个菌落,这种结果说明在此次调查中出现了　　　　现象。若将30(即36-6)个/平板作为本组菌落数的平均值,该做法　　　　(填“正确”或“不正确”)。?
【答案】(1)牛肉膏、蛋白胨　琼脂　(2)将各实验组平板分别放置在教室不同高度的位置上,开盖暴露一段时间　(3)污染　不正确
【解析】(1)牛肉膏、蛋白胨均可为微生物提供碳源和氮源。依据无菌平板可知该培养基为固体培养基,常用凝固剂为琼脂。
(2)该实验的目的是用平板收集教室空气中的微生物来了解教室内不同高度空气中微生物的分布情况,故实验组的操作应是将各实验组平板分别放置在教室不同高度的位置上,开盖暴露一段时间。
(3)空白对照组若出现菌落,则说明其已被杂菌污染,不能再起对照作用,故若将30(即36-6)个/平板作为本组菌落数的平均值,该做法不正确。
5.回答下列与酵母菌有关的问题:
(1)分离培养酵母菌通常使用　　　　　　(填“牛肉膏蛋白胨”“MS”或“麦芽汁琼脂”)培养基,该培养基应采用　　　　　　灭菌法灭菌。若将酵母菌划线接种在平板上,培养一段时间后可观察到菌落,菌落的含义是　?　 。?
(2)酵母菌液体培养时,若通入氧气,可促进　　　　　　　　　　　　(填“菌体快速增殖”“乙醇产生”或“乳酸产生”);若进行厌氧培养,可促进　　　　　　　(填“菌体快速增殖”“乙醇产生”或“乳酸产生”)。?
(3)制作面包时,为使面包松软通常要在面粉中添加一定量的酵母菌,酵母菌引起面包松软的原因是?　 。?
【答案】(1)麦芽汁琼脂　高压蒸汽　由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体
(2)菌体快速增殖　乙醇产生
(3)酵母菌分解葡萄糖会产生CO2,CO2使面包松软
【解析】　(1)牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用广泛的细菌培养基;MS培养基是满足植物细胞的营养和生理需要的培养基;麦芽汁琼脂培养基通常用于酵母菌(真菌)的培养、鉴定及菌种保存。培养基的灭菌方法为高压蒸汽灭菌法。菌落是指由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体。(2)酵母菌为兼性厌氧型微生物,在有氧条件下进行有氧呼吸为酵母菌的繁殖提供能量,在无氧条件下,酵母菌进行无氧呼吸产生乙醇。(3)面包松软是因为制作过程中加入的酵母菌可以分解葡萄糖产生大量的CO2,CO2遇热膨胀,使得制作的面包松软多孔。
6. 牛奶中富含蛋白质,长期饮用有助于增强体质,但牛奶同时也是多种疾病的传播载体。国家标准是每毫升牛奶中细菌数小于30 000个。以下是牛奶消毒及细菌检测实验。分析回答:
(1)图中步骤①称为　　　　消毒法。步骤②是　　　　　　　　。?
(2)培养基中的蛋白胨可以为微生物提供　　　　　。进行步骤③操作时,应选用下列中的哪种工具?　　　　。为了避免杂菌污染,此步骤应在　　　　　附近进行。?
(3)将接种后的培养基和作为对照的　　　　　　　 　同时放入37 ℃恒温培养箱中,培养36小时。取出后统计各平板的菌落数,结果如下表所示。应该选择其中稀释倍数为　　　　　　的平板进行计数,经过消毒后的牛奶中,细菌数大约是　　　　　　个/mL。?
牛奶稀释倍数
102
103
104
平板1菌落数
87
10
1
平板2菌落数
83
12
1
平板3菌落数
85
10
0
【答案】(1)巴氏　系列稀释(或梯度稀释)　
(2)碳源、氮源(和维生素)　B　酒精灯火焰
(3)一个未接种的培养基　102　8 500
【解析】 (1)80 ℃恒温水浴15 min是巴氏消毒法,步骤②是进行系列稀释(或梯度稀释)。
(2)培养基中的蛋白胨可以为微生物提供碳源、氮源(和维生素),③是接种,因为需要计数,需用稀释涂布平板法,接种工具是涂布器;为了避免杂菌污染,此步骤应在酒精灯火焰附近进行。
(3)统计各平板的菌落数时,应选择菌落数在30～300的计数,经过消毒后的牛奶中,细菌数大约是(87+83+85)÷3×102=8 500(个)。
　
7.秸秆回收利用是变废为宝的新兴工艺。如图是从土壤中筛选分解纤维素的细菌的过程,回答下列问题。
土壤取样→梯度稀释→选择培养→鉴别培养→菌种
(1)初次对土壤样品做实验,应该将土壤稀释的范围放　　　　一些。某同学进行严格的无菌操作,在三个培养基平板上,均滴加—定稀释倍数的土壤溶液0.1 mL,若最终统计结果平均值为560,结果是否合理?　 ,?
最可能原因是?　 。?
(2)图中选择培养时,一般采用　　　 　培养基,好处是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。培养基中加入酵母膏的作用是　?
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。鉴别培养基还需要添加　　　　　　　作为指示剂,以确定选出分解纤维素的细菌。?
(3)纤维素酶是一种复合酶,在三种酶的　　　　作用下,将纤维素分解成葡萄糖。?
【答案】 (1)宽(大)　不合理　微生物数量太多,稀释倍数不够　(2)液体　能够使微生物充分利用培养基中的营养成分　为纤维素分解菌提供碳源、氮源和生长因子(或特殊营养物质)　刚果红　(3)协同
【解析】 (1)为保证选择出的菌落数在30～300间的平板上计数,初次对土壤样品做实验,应该将土壤稀释的范围放宽些。若最终统计结果平均值为560,说明微生物数量太多,稀释倍数不够。(2)对纤维素分解菌进行选择培养时用液体培养基,其中的纤维素是唯一的碳源,可以起到对纤维素分解菌的富集作用,获得大量的菌体。纤维素分解菌的培养基中酵母膏能提供的主要营养物质有碳源、氮源、生长因子。鉴别培养基还需要添加刚果红作为指示剂。(3)纤维素酶是一种复合酶,在三种酶的协同作用下,将纤维素分解成葡萄糖。
8.下面是筛选抗链霉素大肠杆菌的实验步骤及相关图解。
实验步骤:
①把大量对链霉素敏感的大肠杆菌接种在不含链霉素的培养基1的表面,进行培养。
②待其长出密集的小菌落后,用影印法接种到不含链霉素的培养基2上,随即在影印到含链霉素的培养基3上,进行培养。
③在培养基3上,出现了个别抗链霉素的菌落,将其挑选出,以此类推,如图:
请分析回答:
(1)菌落是指?　　　　　 　　,从生态学角度分析,菌落实质上属于　　　　　　。?
(2)配制培养大肠杆菌的培养基,一般都含有水、碳源、无机盐和氮源等四类营养物质。试从细胞的元素组成分析,其原因是?
　　　　　　　　　　　　　　　。配制培养基时除了满足基本的营养条件外,还需满足微生物生长对特殊营养物质、　　　　 　　的要求。?
(3)从功能上看,含有链霉素的培养基3、7、11属于　　　　　　。由上图可知,原始菌种接种到培养基1、5、9的方法是　　　　　。?
(4)对2和3进行比较,在2上找到与3上相应的菌落,挑取其中一个菌落接种到　　　　　　　(填“含链霉素”或“不含链霉素”)的培养基上,如果有较多的菌落出现,则说明该抗性基因突变发生在该菌接触链霉素之　　　　(填“前”或“后”)。?
【答案】 (1)由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体　种群　(2)细胞的组成元素都是从环境的营养物质中摄取的　pH、氧气　(3)选择培养基　稀释涂布平板法　(4)含链霉素　前
【解析】　(1)菌落是指由单个细胞或一堆同种细胞在适宜固体培养基表面或内部生长繁殖到一定程度,形成肉眼可见的子细胞群体,从生态学角度分析,菌落实质上属于种群。(2)C、H、O、N、P、S是构成细胞原生质的基本元素,都要从环境的营养物质中摄取,所以配制培养微生物的培养基,一般都含有水、碳源、无机盐和氮源等四类营养物质,配制培养基时除了满足基本的营养条件外,还需满足微生物生长对特殊营养物质、pH、氧气的要求。(3)含有链霉素的培养基3、7、11只允许对链霉素有抗性的微生物生长,从功能上看属于选择培养基;由上图可知,原始菌种接种到培养基1、5、9的方法是稀释涂布平板法。(4)培养基2和培养基3上相同的菌落,是具有抗链霉素性状的大肠杆菌,将2中一个菌落接种到含链霉素的培养基上培养,如果出现较多的菌落,则说明该抗性基因突变发生在该菌接触链霉素之前。

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