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微生物的培养和应用
【学习目标】
1、掌握培养基的分类、组成、功能及配制。
2、掌握无菌技术的内容和无菌操作技术。
3、研究培养基对微生物的选择作用
4、掌握分离、纯化特定微生物的研究思路和方法，掌握从土壤中分理处能够分解尿素的细菌并进行技术的操作过程。
【要点梳理】　
要点一、微生物的实验室培养
1、培养基：
（1）培养基的配制原则
①目的要明确（根据微生物的种类、培养目的等）。如培养基可由简单的无机物组成，生产用培养则可加入化学成分不明确的天然物质，而分类鉴定培养基必须加入已知化学成分的物质。
②营养要协调。注意各种营养物质的浓度和比例。
③pH要适宜。各种微生物适宜生长的pH范围不同。如细菌、放线菌和真菌生长的最适pH分别为：6.5～7.5、7.5～8.5和5.0～6.0。
（2）培养基的种类和用途
划分标准
培养基种类
特点
用途
物理性质
液体培养基
不加凝固剂
工业生产
半固体培养基
加凝固剂，如琼脂
观察微生物的运动、分类、鉴定
固体培养基
微生物分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种
化学成分
天然培养基
含化学成分不明确的天然物质
工业生产
合成培养基
培养基成分明确（用化学成分已知的化学物质配成）
分类、鉴定
用途
选择培养基
培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长、促进所需要的微生物的生长
培养、分离出特定微生物
鉴别培养基
根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品
鉴别不同种类的微生物
（3）选择培养基和鉴别培养基应用实例
类型
实例
选择
培养基
在培养基中加入青霉素，分离得到酵母菌和霉菌。（青霉素，可抑制细菌，放线菌的生长）。
培养基中加入高浓度食盐用于分离得到金黄色葡萄球菌。
以尿素作为唯一氮源的培养基用于分离分解尿素的细菌。
不添加氮源的培养基用于分离固氮微生物
培养基放在高温环境中培养只能得到耐高温的微生物
鉴别
培养基
伊红一美蓝培养基鉴别饮用水或乳制品中是否有大肠杆菌（若有，菌落呈黑色，并带有金属光泽）
（4）培养基中的营养要素
营养要素
含义
作用
主要来源
碳源
凡能提供所需碳元素的营养物质
构成生物体细胞的物质和一些代谢产物，有些是异养生物的能源物质
无机碳源：CO2、NaHCO3等；有机碳源：糖类、脂肪酸、花生粉饼、石油等
氮源
凡提供所需氮元素的营养物质
合成蛋白质、核酸以及含氮的代谢产物
无机氮源：N2、NH3、铵盐、硝酸盐；有机氮源：尿素、牛肉膏、蛋白胨等
生长因子
某些微生物生长必不可少的微量有机物
一般是酶和核酸的组成成分
维生素、氨基酸、碱基等
水
在生物体内含量很高，在低等生物体内含量更高
不仅是优良的溶剂而且可维持生物大分子结构的稳定
无机盐
为微生物提供除碳、氮以外的各种重要元素，包括大量元素
细胞内的组成成分，生理调节物质；某些化能自养菌的能源，酶的激活剂
要点诠释：
①微生物最常用的碳源是糖类，尤其是葡萄糖；最常用的氮源是铵盐、硝酸盐。
②对异养微生物来说。含C、H、O、N的化合物既是碳源．又是氮源。
③有些培养基不需要添加生长因子，生物自己能合成；而绝大多数微生物培养需要加入生长因子，原因是它们缺乏合成这些物质所需要的酶或合成能力有限。
2、无菌技术
（1）无菌技术的概念
在微生物培养中，获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵，其主要技术是无菌操作。无菌技术是指通过一定物理、化学的手段，防止实验室培养物被外来微生物污染，保持微生物的纯培养的技术，其中包括在微生物的分离、转接、保存等过程中防止其他微生物污染的手段。无菌技术主要围绕如何避免杂菌污染展开的，主要包括以下几方面：
①对实验操作的空间，操作者的手和衣着，进行清洁和消毒。
②将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。
③为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近或接种箱内进行。
④应避免已经灭菌处理的材料用具与周围其他物品相接触。
（2）灭菌是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。方法见下表：
灼烧灭菌法
干热灭菌法
高压蒸汽灭菌法
灭菌物品
金属物等可直接灼烧的物品
耐高温的、需要保持干燥的物品
均可用此法
一般应用
接种工具
玻璃器皿
培养基等
注意：灭菌所依据的原理基本上都是使菌体内的蛋白质和核酸发生变性，从而达到杀菌的效果。
（3）消毒是指使用较为温和的物理或化学方法杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物（不包括芽孢和孢子）。
①煮沸消毒法：在100℃煮沸5 min～6 min可以杀死微生物细胞和一部分芽孢。
②巴氏消毒法：在70℃～75℃煮30 min或在80℃煮15 min。可以杀死牛奶中的微生物，并且使牛奶的营养成分不被破坏。
③化学药剂消毒：使用化学药剂进行消毒，如用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源等。
④紫外线消毒。
要点二、制备牛肉膏蛋白胨固体培养基及纯化大肠杆菌
1．制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的一般步骤：计算→称量→溶化→灭菌→倒平板。
（1）培养基需冷却至50℃左右时开始倒平板
①原因：琼脂是一种多糖，在98℃以上熔化，在44℃以下凝固，倒平板时高于50℃则会烫手，低于50℃时若不能及时操作，琼脂会凝固。
②估计培养基温度的方法：培养基从灭菌锅中取出冷却一段时间后用手触摸，感觉上以刚不烫手为准。
（2）平板倒置原因：平板皿盖上会凝结水珠，培养基表面的温度也较高，平板倒置后，既可使培养基表面的水分更好地挥发，又可防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
（3）注意事项：倒平板时不要将培养基溅在皿盖与皿底之间，否则此培养基不能用来培养微生物。
2．纯化大肠杆菌
可以选用下述方法，在牛肉膏蛋白胨固体培养基上纯化大肠杆菌。
（1）平板划线法：通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面（如图所示）。在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，这就是菌落。
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/
培养基表面平行或分区划线
划线时要注意：
①几次灼烧接种环及目的：
a．取菌种之前灼烧的目的：杀死接种环上原有的微生物。
b．每次划线之前灼烧的目的：杀死上次划线后接种环上残留的菌种，使下次划线的菌种直接来源于上次划线的末端，使每次划线菌种数目减少。
c．划线结束灼烧的目的：杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。
②从第二次以后的划线操作总是从上一次划线末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐渐减少，最终得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
（2）稀释涂布平板法：将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。
稀释涂布平板的操作比较复杂，且各个细节均需保证“无菌”，应特别注意：
①酒精灯与培养皿的距离要合适。
②吸管头不要接触任何其他物体。
③吸管要在酒精灯火焰周围使用。
要点三、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数【微生物的培养和应用】
1. 实验原理
（1）以尿素为唯一氮源的选择培养基筛选尿素分解菌；有些微生物能产生并分泌脲酶，降解环境中的尿素做为其生长的氮源。
（2）尿素分解菌的鉴定——酸碱指示剂法
酚红作为酸碱指示剂被添加到了培养基中，其变色范围是pH6.4～8.2，在酸性情况下呈黄色，碱性情况下呈红色
（3）液体稀释涂布平板法测定微生物活菌数目
2.培养基
LB全营养细菌培养基配方：蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、琼脂糖
尿素培养基配方：葡萄糖、NaCl 、K2HPO4 、尿素、琼脂糖、酚红
要点诠释：琼脂糖和琼脂一样都是作为凝固剂来使用的，不要误以为是和葡萄糖一样提供碳源的。只是因为琼脂里还含有含氮的物质会对实验的结果造成影响。
3.实验流程
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要点四、分解纤维素的微生物的分离
1.纤维素酶的作用机理
纤维素纤维二糖葡萄糖
纤维素酶是一种复合酶，由三种酶组成：C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖，只有在这三种酶的协同作用下，纤维素才能被彻底水解成葡萄糖。
2.纤维素分解菌的筛选
（1）筛选原理
纤维素+刚果红→红色复合物，刚果红不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。
（2）筛选方法：刚果红染色法。
在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物，当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红——纤维素的复合物就无法形成，培养基中就会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。这样，我们就可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。
3.分离分解纤维素的微生物的实验设计
分离分解纤维素的微生物的实验流程示意图如下图所示：
【典型例题】　
类型一：培养基的配制和微生物的营养
例1、（2019 全国大纲卷）某同学在①、②、③三种条件下培养大肠杆菌，这三种条件是：
①以葡萄糖为碳源的培养基，不断补充培养基，及时去除代谢产物
②以葡萄糖为碳源的培养基，不补充培养基，不去除代谢产物
③以葡萄糖和乳糖为碳源的培养基，不补充培养基，不去除代谢产物
根据培养结果绘制的一段时间内菌体数的对数随时间变化的趋势图如下：
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假设三种培养基中初始总糖量相等，则①、②、③三种条件依次对应的趋势图是
A.甲、乙、丙 B.乙、丙、甲 C.丙、甲、乙 D.丙、乙、甲
【答案】C
【解析】以葡萄糖为碳源的培养基，不补充培养基，不除去代谢产物，随着营养物质的消耗和次级代谢产物的积累，大肠杆菌的生长环境不断恶化，生存阻力增大，因此种群数量达到稳定期后会出现衰亡期，故甲图对应②，反之丙图则对应①；若培养基里加入葡萄糖和乳糖，大肠杆菌先利用葡萄糖，葡萄糖消耗完以后，大肠杆菌会经过短期的调整，诱导合成乳糖苷酶，接着继续分解利用乳糖，最后衰亡，因此乙图对应③，故选C答案。
【点评】本题考查微生物种群数量变化的相关实验。
【举一反三】：
【变式一】
（2019 江苏卷）做“微生物的分离与培养”实验时,下列叙述正确的是（ ）
A. 高压灭菌加热结束时,打开放气阀使压力表指针回到零后,开启锅盖
B. 倒平板时,应将打开的皿盖放到一边,以免培养基溅到皿盖上
C. 为了防止污染,接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落
D. 用记号笔标记培养皿中菌落时,应标记在皿底上
【答案】D
【解析】高压灭菌加热后，先切断电源，使灭菌锅温度降至100摄氏度以下，压力表的指针归零，再打开锅盖，A错误。倒平板时，培养皿打开缝隙即可，不能完全打开，B错误。接种环需冷却后再挑取菌落，C错误。
类型二：无菌操作技术和接种技术
例2、细菌培养过程中分别采用了高压蒸气、酒精、火焰灼烧等几种不同的处理，这些方法依次用于杀灭哪些部位的杂菌 ( )
A．接种针、手、培养基 　　　　B．高压锅、手、接种针
C．培养基、手、接种针　　　　 D．接种针、手、高压锅
【答案】C
【解析】高压蒸汽灭菌锅是灭菌的一个设备，通常用于培养基的灭菌。用酒精擦拭双手是消毒的一种方法。火焰灼烧，可以迅速彻底地灭菌，适用于微生物的接种工具，如接种环。微生物培养过程中的无菌操作包括消毒和灭菌两大类，分别又有各种不同的方法。对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒；将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌。
【点评】此题考查学生对无菌技术的掌握。
【举一反三】：
【变式一】
下列操作与灭菌无关的是（ ）
A．接种前用火焰灼烧接种环
B．接种前用酒精擦拭双手
C．将平板倒置，放入培养箱中培养
D．接种在酒精灯的火焰旁完成
【答案】C
【变式二】
培养基、培养皿、接种环、实验操作者的双手、空气、牛奶所采用的灭菌和消毒方法依次是（ ）
①化学消毒 ②灼烧灭菌 ③干热灭菌 ④紫外线灭菌 ⑤高压蒸汽灭菌 ⑥巴氏消毒法
A．⑤③②①④⑥ B．①②③④⑤⑥ C．⑥②③④①⑤ D．③④②①⑥⑤
【答案】A
【变式三】
关于平板划线操作正确的是（ ）
A．使用已灭菌的接种针、培养皿，在操作过程中不再灭菌
B．打开含菌种的试管，需通过火焰灭菌，取出菌种后，需马上塞上棉塞
C．将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线即可
D．最后将平板倒置，放在培养箱中
【答案】D
【解析】在平板划线时，已灭过菌的接种针在每次划线后，都必须用灼烧灭菌法灭菌，以防杂菌污染，A错；盛有菌种的试管在打开或重新塞棉塞前，都需通过火焰灼烧灭菌，B错；在划线过程中，培养皿盖应打开一条缝隙，进行接种，接种完毕后，迅速盖上培养皿盖，以防止杂菌污染，C错；平板凝固后，须将平板倒置。
类型三：利用选择培养基筛选菌株的实验方法和步骤
例3、探究如何从土壤中分离自生固氮菌与计数。
实验原理
农田的表层土壤中，自生固氮菌的含量比较多。将用表层土壤制成的稀泥浆，接种到无氮培养基上进行培养。在这种情况下。只有自生固氮菌才能生长繁殖。用这种方法，可以将自生固氮菌与其他细菌分离开来。
材料用具
农田的表层土壤、无氮培养基、牛肉膏蛋白胨培养基、盛9 mL无菌水的大试管若干。无菌移液管、无菌涂布器、无菌培养皿、盛90 mL无菌水的锥形瓶、酒精灯、恒温箱。
方法步骤
（1）倒平板。分别将无氮培养基、牛肉膏蛋白胨培养基倒平板，应在________操作。
（2）制备土壤稀释液。取土样10 g加入盛有90 mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。用无菌移液管吸取上清液1 mL，转至9 mL无菌水的大试管中，依次稀释到107倍稀释度。为实现无菌操作，试管口和移液管应在离火焰________cm处。
（3）涂布。按照由107～103稀释度的顺序分别吸取0.1 mL进行平板涂布，每个稀释度下，无氮培养基应至少涂布________个平板，牛肉膏蛋白胨培养基涂布________个平板。
（4）培养放人恒温箱内，在适宜温度条件下培养3 d～4 d。一般每隔________小时统计一次，选取________时的记录作为结果，这样可以防止________。
（5）细菌的计数。当菌落数目稳定时，选取菌落数在________的平板进行计数。如果测试的平均值为50，则每克样品中的菌落数是________。（稀释度是105）
（6）预期结果。相同稀释度下，牛肉膏蛋白胨平板上的菌落数________（填“多于”或“少于”）无氮培养基上的数目。理由是________。
【答案】
（1）酒精灯火焰旁
（2）1～2
（3）3 1
（4）24 菌落数目稳定 因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目
（5）30～300 5×107
（6）多于 无氮培养基上可以生存和繁殖的只是土壤中的固氮菌，而牛肉膏蛋白胨培养基上几乎允许土壤中所有菌类的生存
【解析】考查微生物的分离及计数。要分离自生固氮菌，采用选择培养基分离的方法，缺乏氮源的培养基可用来分离自生固氮微生物，而其他微生物因缺乏氮源不能生长。实验步骤一般是：配制无氮培养基→灭菌→倒平板→系列稀释→涂布平板→培养→观察并计数。实验中要注意无菌操作和设计对照实验等。
【点评】本题考查微生物分离实验中对照实验的设计。
【举一反三】：
【变式一】
用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下几种统计结果，正确的是（ ）
A．涂布了2个平板，统计的菌落数是230
B．涂布了2个平板，统计的菌落数是215和260，取平均值238
C．涂布了3个平板，统计的菌落数分别是2l、212和256，取平均值163
D．涂布了3个平板，统计的菌落数分别是210、240和250，取平均值233
【答案】D
【解析】 在设计实验时，一定要涂布至少3个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性，所以A、B不正确。C项虽涂布了3个平板，但是，其中1个平板的计数结果与另两个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单用3个平板的计数值来求平均值。
【巩固练习】
单项选择题：
1．自然界中存在着许多微生物，它们是自然界中不可缺少的生物。下列有关自然界中各种微生物的叙述，正确的是（ ）
A．所有微生物在细胞结构上都无成形的细胞核
B．只有附着在豆科植物根部的微生物才能进行生物固氮
C．所有微生物在生态系统中均属于分解者
D．维生素是某些微生物生长和发育所必需的生长因子
2．下列有关微生物营养物质的叙述中，正确的是（ ）
A．是碳源的物质不能同时是氮源 B．凡是碳源都能提供能量
C．除水以外的无机物只提供无机盐 D．有些无机氮源也能提供能量
3．下列操作与灭菌无关的是（ ）
A．接种前用火焰灼烧接种环 B．培养皿等放在高压蒸汽锅中进行处理
C．培养基在50℃时搁置斜面 D．接种在酒精灯的火焰旁完成
4．所有细菌都具有的特征是（ ）
A．都是异养生物 B．仅在有水条件下繁殖
C．仅在有氧条件下生长 D．生存温度都超过80℃
5．牛奶、玻璃吸管、接种环、培养基、空气的灭菌方式依次是（ ）
①灼烧灭菌 ②巴氏消毒 ③干热灭菌 ④紫外线消毒 ⑤高压蒸汽灭菌
A．②③①⑤④ B．②⑤③①④ C．②①③⑤④ D．⑤①③②④
6．高温灭菌的原理是（ ）
A．每种微生物生长的最适温度都是一定的
B．微生物对于高温环境不适应
C．高温破坏了细胞内的蛋白质、核酸，影响其生命活动
D．高温降低了环境中氧的浓度
7．在涂布平板操作时错误的是（ ）
A．将涂布器在酒精灯火焰上灼烧，直至烧红
B．取少量菌液滴加在培养基表面
C．将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却8～10 s再用
D．涂布时可转动培养皿，使涂布均匀
8．下列有关培养基配制原则表述正确的是（ ）
A．任何培养基都必须加入碳源、氮源、矿质元素、水及生长因子
B．碳源和氮源必须具有一定比例，碳元素的含量最多，其次为氮元素
C．微生物的生长除受营养因素影响外，还受pH、氧、渗透压的影响
D．固体培养基一定需要加入琼脂
9．在培养基的配制过程中，有如下步骤，其正确顺序为（ ）
①溶化 ②调pH ③加棉塞 ④包扎 ⑤培养基的分装 ⑥称量
A．①②⑥⑤③④ B．⑥①②⑤③④ C．⑥①②⑤④③ D．①②⑤④⑥③
10．要将从土壤中提取的自生固氮菌与其他细菌分离开来，应将它们接种在（ ）
A．含五大类营养物质的培养基上 B．加入某种指示剂的鉴别培养基上
C．含蛋白胨等营养物质的培养基上 D．无氮的选择培养基上
11．下列叙述错误的是（ ）
A．培养乳酸菌时需要在培养基中添加维生素
B．培养霉菌时需将培养基的pH调至碱性
C．培养细菌时需将培养基的pH调至中性或微碱性
D．培养厌氧微生物时需要提供无氧的条件
非选择题
1．（2019新课标卷Ⅱ）为了调查某河流的水质状况，某研究小组测定了该河流水样中的细菌含量，并进行了细菌的分离等工作。回答下列问题：
（1）该小组采用稀释涂布平板法检测水样中的细菌含量。在涂布接种前，随机取若干灭菌后的空平板先行培养了一段时间，这样做的目的是 ；然后，将1mL水样稀释100倍，在3个平板上用涂布法分别接入0.1mL稀释液；经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为39、38和37。据此可得出每升水样中的活菌数为 。
（2）该小组采用平板划线法分离水样中的细菌。操作时，接种环通过 灭菌，在第二次及以后划线时，总是从上一次的末端开始划线。这样做的目的是 。
（3）示意图A和B中， 表示的是用稀释涂布平板法接种培养后得到的结果。
（4）该小组将得到的菌株接种到液体培养基中并混匀，一部分进行静置培养，另一部分进行振荡培养。结果发现：振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。分析其原因是：振荡培养能提高培养液的 的含量，同时可以使菌体与培养液充分接触，提高 的利用率。
2．选择培养是微生物学中最强有力的技术手段之一。主要是指利用不同微生物问生命活动特点的不同，制定环境条件，使仅适应该条件的微生物生长旺盛，从而使其在群落中的数量大大增加，人们能够更容易地从中分离到所需的特定微生物。选择条件可根据所需分离的微生物的特点，从物理、化学、生物及综合多个方面进行选择，如温度、pH、紫外线、高压、光照、氧气、营养等许多方面。如图描述了采用选择方法从土壤中分离能降解酚类化合物对羟基苯甲酸的微生物的实验过程。
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（1）本实验所需培养基为________，碳源为________。
（2）实验原理是________。
（3）①→③重复培养的目的是________。
（4）⑤的菌落中大部分是降解________的微生物。
（5）⑥为________组，⑦为________组，设置⑥的目的是________。
（6）⑤→⑥采用________法，接种到⑥的培养基中，在操作过程中为防止污染应注意的事项是________。
3．（2019 江苏模拟 )人工瘤胃模仿了牛羊等反刍动物的胃,可用来发酵处理秸秆,提高秸秆的营养价值。
为了增强发酵效果,研究人员从牛胃中筛选纤维素酶高产菌株,并对其降解纤维素能力进行了研究。 请回答下列问题:
(1)在样品稀释和涂布平板步骤中,下列选项不需要的是 (填序号)。
①酒精灯 ②培养皿 ③显微镜 ④无菌水
(2)在涂布平板时,滴加到培养基表面的菌悬液量不宜过多的原因是 。
(3)向试管内分装含琼脂的培养基时,若试管口粘附有培养基,需要用酒精棉球擦净的原因是 。
(4)刚果红可以与纤维素形成红色复合物,但并不与纤维素降解产物纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。 研究人员在刚果红培养基平板上,筛到了几株有透明降解圈的菌落(见下图)。 图中降解圈大小与纤维素酶的
有关。 图中降解纤维素能力最强的菌株是 (填图中序号)。
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(5)研究人员用筛选到的纤维素酶高产菌株 J1 和 J4,在不同温度和 pH 条件下进行发测得发酵液中酶活性的结果见下图,推测菌株 更适合用于人工瘤胃发酵,理是 。
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4．（2019 山东模拟）乳糖酶能够催化乳糖水解为葡萄糖和半乳糖，具有重要应用价值。乳糖酶的制备及固定化步骤如下：
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(1)筛选产乳糖酶的微生物L时，宜用_______/___作为培养基中的唯一碳源。培养基中琼脂的作用是___________。从功能上讲，这种培养基属于___________。
(2)培养微生物L前，宜采用__________方法对接种环进行灭菌。
(3)纯化后的乳糖酶可用电泳法检测其分子量大小。在相同条件下，带电荷相/同的蛋白质电泳速度越快，说明其分子量越___________.
(4)乳糖酶宜采用化学结合法（共价键结合法）进行固定化，可通过检测固定化乳糖酶的___________确定其应用价值。除化学结合法外，酶的固定化方法还包括___________、_____________、离子吸附法及交联法等。
【答案与解析】
一、单项选择题：
1．【答案】D
【解析】 微生物中既有真核生物也有原核生物；固氮菌既有共生的，也有自生的；微生物中既有分解者，也有消费者，还有生产者；微生物生命活动中需要的生长因子有碱基、氨基酸、维生素等。
2．【答案】D
【解析】含氮的有机物往往既是碳源又是氮源；二氧化碳是碳源但是它不能提供能量；无机物中除水和无机盐外还有碳源、氮源、生长因子等；氨是无机氮源，同时也是硝化细菌的能源物质。
3．【答案】C
【解析】50℃时搁置斜面有利于斜面的形成，与灭菌无关。
4．【答案】B
【解析】根据细菌能否合成有机含碳化合物，将其分为自养型和异养型两类；在异化方面，根据其氧化分解有机物时是否需要氧气，可分为需氧型和厌氧型，如乳酸菌等在无氧条件下生存；不同细菌生长的最适温度也有差异，但所有细菌的繁殖都离不开水。
5．【答案】A
【解析】对于不耐高温的液体消毒，用巴氏消毒法，如牛奶；吸管等为既耐高温又要保持干燥的玻璃器皿，一般用干热灭菌；接种环往往用灼烧灭菌，培养基用高压蒸汽灭菌，比较彻底；空气灭菌往往用紫外线照射，以杀死物体表面及空气中的微生物。
6．【答案】C
【解析】蛋白质是生物体生命活动的承担者和体现者，核酸可控制生物体的代谢活动。高温可使蛋白质和核酸变性失活，从而影响微生物的生命活动。
7．【答案】A
【解析】涂布器为玻璃器具，不应在酒精灯火焰上灼烧，应在体积分数为70％的酒精中消毒。
8．【答案】C
【解析】有些微生物可自己合成碳源、氮源或生长因子等，所以培养这些微生物时培养基中可不加入碳源、氮源、生长因子等，如培养自养型微生物的培养基中可不加碳源。培养基中的碳源、氮源需要有一定的比例，碳源一般是微生物需求量最大的营养成分，但有些培养基可不含碳源或氮源。固体培养基是在液体培养基中加入凝固剂而制成的，但琼脂不是唯一的凝固剂。
9．【答案】B
【解析】本题主要考查培养基的配制过程。培养基的配制步骤：称量→溶化→调pH→培养基的分装→加棉塞→包扎。
10．【答案】D
【解析】能在无氮培养基上生长的只有自生固氮菌（共生固氮菌不能独立生存）。
11．【答案】B
【解析】配制培养基时，一般都加入碳源、氮源、水、无机盐，除此以外，还需考虑微生物生长所需要的适宜pH、特殊营养物质及氧气等，培养霉菌时需要将培养基的pH调至酸性。
二、非选择题
1．【答案】
（1）检测培养基平板灭菌是否合格 3.8×10
（2）灼烧； 将聚集的菌体逐步稀释以便获得单个菌落
（3）B ⑷、溶解氧 营养物质
【解析】
为了确定培养基的灭菌是否合格，微生物学实验一般会设置空白对照：随机取若干灭菌后的空平板培养一段时间，观察培养基上是否有菌落生成；利用平板菌落计数法的计算公式估算水样中的活菌数：
（2）接种时接种环需要灼烧灭菌；在第二次及以后划线时，总是从上一次的末端开始划线，这样做的目的是：通过划线次数的增加，使每次划线时菌体的数目逐渐减少，以便得到菌落。
（3）由题图可知B图为平板划线法接种的结果（菌落相对均匀分布）。
（4）震荡培养可以增加液体培养基的氧气含量，促进好氧型微生物的生长；另外震荡培养还可以使菌体与培养液充分接触，提高营养物质的利用率。
2．【答案】
（1）选择培养基 对羟基苯甲酸
（2）利用以对羟基苯甲酸为唯一碳源的选择培养基，经富集培养，选择出能降解酚类化合物对羟基苯甲酸的微生物
（3）增大分解对羟基苯甲酸微生物的比例
（4）对羟基苯甲酸
（5）对照实验说明通过富集培养的确得到了欲分离的目标微生物
（6）单细胞挑取接种环在火焰上灼烧灭菌，烧红的接种环在火焰旁冷却，同时打开皿盖挑取菌落接种到试管中，并塞好棉塞，接种环在火焰上灼烧，杀灭残留物
【解析】选择培养又称为增殖培养，主要是利用不同微生物的生长繁殖对环境和培养基的特殊要求进行富集培养和分离。要从土壤中分离能降解酚类化合物对羟基苯甲酸的微生物，必须根据该微生物的特点，采用以对羟基苯甲酸为唯一碳源的培养基进行选择培养。设置对照实验的目的是说明通过选择培养的确得到了欲分离的目标微生物。
3．【答案】 （1）③（1分）
（2）培养基表面的菌悬液会出现积液，导致菌体堆积，影响分离效果（1分）
（3）避免培养基污染棉塞 （1分）
（4）量与/活性（1分） ① （1分）
（5）J4（1分）
发酵过程中会产热和产酸，J4菌株在较高温度和酸性环境下酶的活性更高（2分）
【解析】（1）稀释过程中需要无菌水，并需要酒精灯进行灭菌。
涂布平板时，滴加的菌液一般为1mL,避免浓度大影响效果。
试管口沾有培养基容易滋生杂菌，故应擦净。
纤维素酶活性越大，透明圈越大，图中降解纤维素能力最强的是1
发酵过程中会产生较多热量和有机酸，J4酶更适合高温和酸性环境。
4．【答案】（1）乳糖 凝固剂 选择培养基 （各1分）
（2）灼烧 （1分）
（3）小 （2分）
（4）（/酶）活性[或（酶）活力] 包埋法 物理吸附法（注：两空可颠倒）
（各2分）
【解析】（1）乳糖酶能够催化乳糖水解，筛选乳糖酶微生物时，宜用乳糖作为唯一碳源；培养基中的琼脂主要是起到凝固作用，是凝固剂；从功能上讲属于选择性培养基。
（2）为了避免杂菌污染，对接种环等接种工具可采用灼烧灭菌。
（3）用电泳法纯化乳糖酶时，则其分子量越小，电泳速度越快。
（4）固定化乳糖酶时，可通过检测固定化乳糖酶的活性（或活力）来确定其应用价值。固定酶/化的方法包括化学结合法、包埋法、物理吸附法、离子吸附法及交联法等。

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