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实验：高倍显微镜的使用和观察叶绿体
实验原理
高等植物的叶绿体存在于细胞质中，叶绿体呈 色、 形，高倍显微镜下清晰可见。
实验目的
1、初步掌握高倍显微镜的使用方法。 2、观察叶绿体形态和分布。
实验程序
观察细胞质的流动
实验原理
活细胞中的细胞质处于不断流动的状态，用 的运动作为标记可观察细胞质的流动。
实验目的
1、掌握高倍显微镜的使用方法。
2、通过显微镜的实际观察的实际观察，理解细胞质流动是一种生命现象。
实验程序
光照、室温条件下水中培养黑藻
取一片幼嫩的小叶
临时装片：清水+小叶+盖玻片
低倍观察叶片细胞
高倍观察叶绿体的流动及流动方向
注意事项：
1、细胞质的流动受细胞的代谢状况和外界环境因素的影响，增进细胞代谢作用的因素，如适宜的光照、温度、PH值、生长素等，都可以促进细胞质的流动。反之，不利的环境变化和某些化学药品，如麻醉剂等，则可抑制细胞质的流动。
2、在做此实验时，如果发现细胞质不流动，或者流动很慢，应立即采取措施，加速其细胞质的流动。其方法有三种：一是进行光照，即在阳光或灯光下放置15~20分钟；二是提高盛放黑藻的水温，可加入热水将水温调至25℃左右；三是切伤一小部分叶片。
线粒体(mitochondrion)? ?? ? 线粒体是1850年发现的,1898年命名。线粒体由两层膜包被,外膜平滑,内膜向内折叠形成嵴,两层膜之间有腔,线粒体中央是基质。基质内含 有与三羧酸循环所需的全部酶类,内膜上具有呼吸链酶系及ATP酶复合体。线粒体是细胞内氧化磷酸化和形成ATP的主要场所,有细胞"动力工厂" (power plant)之称。另外,线粒体有自身的DNA和遗传体系, 但线粒体基因组的基因数量有限,因此,线粒体只是一种半自主性的细胞器。? ?? ? 线粒体的形状多种多样, 一般呈线状,也有粒状或短线状。线粒体的直径一般在0.5～1.0 μm, 在长度上变化很大, 一般为1.5～3μm, 长的可达10μm ,人的成纤维细胞的线粒体则更长,可达40μm。不同组织在不同条件下有时会出现体积异常膨大的线粒体, 称为巨型线粒体(megamitochondria)? ?? ? 在多数细胞中,线粒体均匀分布在整个细胞质中,但在某些些细胞中,线粒体的分布是不均一的,有时线粒体聚集在细胞质的边缘。在细胞质中,线粒体 常常集中在代谢活跃的区域,因为这些区域需要较多的ATP,如肌细胞的肌纤维中有很多线粒体。另外, 在精细胞、鞭毛、纤毛和肾小管细胞的基部都是线粒体分布较多的地方。线粒体除了较多分布在需要ATP的区域外,也较为集中的分布在有较多氧化反应底物的区 域,如脂肪滴,因为脂肪滴中有许多要被氧化的脂肪。
形态与分布? ?? ?线粒体一般呈粒状或杆状，但因生物种类和生理状态而异，可呈环形，哑铃形、线状、分杈状或其它形状。主要化学成分是蛋白质和脂类，其中蛋白质占线粒体干重的65-70%，脂类占25-30%。一般直径0.5~1μm，长1.5~3.0μm，在胰脏外分泌细胞中可长达10~20μm，称巨线粒体。数目一般数百到数千个，植物因有叶绿体的缘故，线粒体数目相对较少；肝细胞约1300个线粒体，占细胞体积的20%；单细胞鞭毛藻仅1个，酵母细胞具有一个大型分支的线粒体，巨大变形中达50万个；许多哺乳动物成熟的红细胞中无线粒体。通常结合在维管上，分布在细胞功能旺盛的区域。如在肝细胞中呈均匀分布，在肾细胞中靠近微血管，呈平行或栅状排列，肠表皮细胞中呈两极性分布，集中在顶端和基部，在精子中分布在鞭毛中区。线粒体在细胞质中可以向功能旺盛的区域迁移，微管是其导轨，由马达蛋白提供动力。
超微结构? ?? ? 线粒体由内外两层膜封闭，包括外膜、内膜、膜间隙和基质四个功能区隔。在肝细胞线粒体中各功能区隔蛋白质的含量依次为：基质67%，内膜21%，外8%膜，膜间隙4%。1、外膜 (out membrane)含40%的脂类和60%的蛋白质，具有孔蛋白（porin）构成的亲水通道，允许分子量为5KD以下的分子通过，1KD以下的分子可自由通过。标志酶为单胺氧化酶。它是包围在线粒体外面的一层单位膜结构。厚6nm, 平整光滑, 上面有较大的孔蛋白, 可允许相对分子质量在5kDa左右的分子通过。外膜上还有一些合成脂的酶以及将脂转变成可进一步在基质中代谢的酶。2、内膜 （inner membrane）含100种以上的多肽，蛋白质和脂类的比例高于3:1。心磷脂含量高（达20%）、缺乏胆固醇，类似于细菌。通透性很低，仅允许不带电荷的小分子物质通过，大分子和离子通过内膜时需要特殊的转运系统。如：丙酮酸和焦磷酸是利用H+梯度协同运输。线粒体氧化磷酸化的电子传递链位于内膜，因此从能量转换角度来说，内膜起主要的作用。内膜的标志酶为细胞色素C氧化酶。它是位于外膜内层的一层单位膜结构, 厚约6nm。内膜对物质的通透性很低, 只有不带电的小分子物质才能通过。内膜向内折褶形成许多嵴, 大大增加了内膜的表面积。内膜含有三类功能性蛋白:①呼吸链中进行氧化反应的酶; ②ATP合成酶复合物; ③一些特殊的运输蛋白, 调节基质中代谢代谢物的输出和输入。3、膜间隙(intermembrane space)是内外膜之间的腔隙，延伸至嵴的轴心部，腔隙宽约6-8nm。由于外膜具有大量亲水孔道与细胞质相通，因此膜间隙的pH值与细胞质的相似。标志酶为腺苷酸激酶。它是内膜和嵴包围着的线粒体内部空间, 含有很多蛋白质和脂类,催化三羧酸循环中脂肪酸和丙酮酸氧化的酶类, 也都存在于基质中。此外, 还含有线粒体DNA、 线粒体核糖体、tRNAs、rRNAs以及线粒体基因表达的各种酶。基质中的标志酶是苹果酸脱氢酶。4、基质（matrix）为内膜和嵴包围的空间。除糖酵解在细胞质中进行外，其他的生物氧化过程都在线粒体中进行。催化三羧酸循环，脂肪酸和丙酮酸氧化的酶类均位于基质中，其标志酶为苹果酸脱氢酶。基质具有一套完整的转录和翻译体系。包括线粒体DNA（mtDNA），70S型核糖体，tRNAs 、rRNA、DNA聚合酶、氨基酸活化酶等。基质中还含有纤维丝和电子密度很大的致密颗粒状物质，内含Ca2+、Mg2+、Zn2+等离子。 线粒体内膜向基质折褶形成的结构称作嵴(cristae), 嵴的形成使内膜的表面积大大增加。嵴有两种排列方式:一是片状(lamellar), 另一是管状(tubular)。在高等动物细胞中主要是片状的排列, 多数垂直于线粒体长轴。在原生动物和植物中常见的是管状排列。线粒体嵴的数目、形态和排列在不同种类的细胞中差别很大。一般说需能多的细胞,不仅线粒体多,而且线粒体嵴的数目也多。线粒体内膜的嵴上有许多排列规则的颗粒称为线粒体基粒(elementary particle)，每个基粒间相距约10 nm。基粒又称偶联因子1(coupling factor 1),简称F1,实际是ATP合酶(ATP synthase),又叫F0 F1 ATP酶复合体, 是一个多组分的复合物。
线粒体的半自主性
? ?? ? 1963年M. 和 S. Nass发现线粒体DNA（mtDNA）后，人们又在线粒体中发现了RNA、DNA聚合酶、RNA聚合酶、tRNA、核糖体、氨基酸活化酶等进行DNA复制、转录和蛋白质翻译的全套装备，说明线粒体具有独立的遗传体系。? ?? ? 虽然线粒体也能合成蛋白质，但是合成能力有限。线粒体1000多种蛋白质中，自身合成的仅十余种。线粒体的核糖体蛋白、氨酰tRNA 合成酶、许多结构蛋白， 都是核基因编码， 在细胞质中合成后，定向转运到线粒体的，因此称线粒体为半自主细胞器。? ?? ? 利用标记氨基酸培养细胞，用氯霉素和放线菌酮分别抑制线粒体和细胞质蛋白质合成的方法，发现人的线粒体DNA编码的多肽为细胞色素c氧化酶的3个亚基，F0的2个亚基，NADH脱氢酶的7个亚基和细胞色素b等13条多肽。此外线粒体DNA还能合成12S和16SrRNA及22种tRNA。? ?? ? mtDNA分子为环状双链DNA分子，外环为重链（H），内环为轻链（L ）。基因排列非常紧凑，除与mtDNA复制及转录有关的一小段区域外，无内含子序列。每个线粒体含数个m tDNA，动物m tDNA 约16-20kb，大多数基因由H链转录， 包括2个rRNA ， 14个tRNA 和12个编码多肽的mRNA ， L链编码另外8个tRNA和一条多肽链。mtDNA上的基因相互连接或仅间隔几个核苷酸序列， 一些多肽基因相互重叠， 几乎所有阅读框都缺少非翻译区域。很多基因没有完整的终止密码， 而仅以T或TA 结尾，mRNA的终止信号是在转录后加工时加上去的? ?? ? 线粒体在形态，染色反应、化学组成、物理性质、活动状态、遗传体系等方面，都很像细菌，所以人们推测线粒体起源于内共生。按照这种观点，需氧细菌被原始真核细胞吞噬以后，有可能在长期互利共生中演化形成了现在的线粒体。在进化过程中好氧细菌逐步丧失了独立性，并将大量遗传信息转移到了宿主细胞中，形成了线粒体的半自主性。? ? 线粒体遗传体系确实具有许多和细菌相似的特征，如：①DNA为环形分子，无内含子；②核糖体为70S型；③RNA聚合酶被溴化乙锭抑制不被放线菌素D所抑制；④tRNA、氨酰基-tRNA合成酶不同于细胞质中的；⑤蛋白质合成的起始氨酰基tRNA是N-甲酰甲硫氨酰tRNA，对细菌蛋白质合成抑制剂氯霉素敏感对细胞质蛋白合成抑制剂放线菌酮不敏感。? ?? ? 此外哺乳动物mtDNA的遗传密码与通用遗传密码有以下区别：①UGA不是终止信号，而是色氨酸的密码；②多肽内部的甲硫氨酸由AUG和AUA两个密码子编码，起始甲硫氨酸由AUG，AUA，AUU和AUC四个密码子编码；③AGA，AGG不是精氨酸的密码子，而是终止密码子，线粒体密码系统中有4个终止密码子（UAA，UAG，AGA，AGG）。 ? mtDNA表现为母系遗传。其突变率高于核DNA，并且缺乏修复能力。有些遗传病，如Leber遗传性视神经病，肌阵挛性癫痫等均与线粒体基因突变有关。

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