资源简介

本资料来自于资源最齐全的２１世纪教育网www.21cnjy.com
第一讲 基因工程
考点导航
1．了解基因工程的诞生。
2．概述基因工程的原理及技术。
3．掌握基因工程的应用。
4．简述蛋白质工程。
知识网络
考点梳理
（一）DNA重组技术的基本工具
1．限制性核酸内切酶——“分子手术刀”
（1）来源：主要是从原核生物中分离纯化来的。
（2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并能将每一条链上特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键切开。
（3）切割方式：①在中心轴线两侧将DNA切开，切口是黏性末端。②沿着中心轴线切开DNA，切口是平末端。
2．DNA连接酶——“分子缝合针”
（1）DNA连接酶的分类：E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶。
（2）作用及作用部位：E.coliDNA连接酶作用于黏性末端被切开的磷酸二酯键，T4DNA连接酶作用于黏性末端和平末端被切开的磷酸二酯键。
3．运载体（运输工具）：质粒 、噬菌体和动、植物病毒等
（1）必备的条件：
① 能在受体细胞中复制并稳定保存；
② 具有一至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段插入；
③ 具有标记基因，供重组 DNA的鉴定和选择；
④ 对受体细胞无害，不会影响受体细胞正常的生命活动。
（2）常用运载体——质粒：裸露的，结构简单且独立于细菌DNA之外的，具有自我复制能力的小型环状DNA分子。
(二) 基因工程的基本操作程序
1．目的基因的获取：
① 直接从生物体中提取总DNA，构建基因组DNA文库，从中调用目的基因；
② 以mRNA为模板，反转录合成互补的DNA片段，建立cDNA文库；
③ 利用聚合酶链式反应（PCR）特异性地扩增所需要的目的基因片段；
④ 化学合成。
获得原核细胞的目的基因可采取直接分离，获取真核细胞的目的基因一般是人工合成，原因是原核生物基因中无内含子，而真核生物有内含子，在转录时要被剪切掉才能生成成熟的mRNA，动、植物中内含子的剪切方式不一样，如果用直接分离的基因将无法表达；而人工合成的基因是没有内含子的。
2．基因表达载体的构建——重组质粒的构建
（1）表达载体的组成：复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因
① 复制起始位点即控制复制起始
的位点。原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。
2 启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质，但启动子本身不被转录
3 终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录
4 目的基因中的标记基因最少要有2个，1个是用来检测运载体是否进入了受体细胞，另一个是用来检测目的基因是否被拼接到运载体上；第一个标志基因要保证其完整性，能够进行表达，若受体细胞表现出该基因所控制的性状，说明运载体已进入受体细胞；第二个标志基因是插入目的基因的部位，由于目的基因的插入破坏了其结构，不能表达其所控制的性状，若受体细胞没有表达出第二个基因所控制的性状，说明目的基因已进入受体细胞。常用的标记基因是抗生素基因。
（2）构建步骤：
①用一定的限制酶切割质粒，使其出现一个有黏性末端的切口。
②用，产生相同的黏性末端。
③将切下的目的基因片段，插入到质粒的切口处，再加入适量DNA连接酶，使质粒与目的基因结合成重组质粒。
3．将目的基因导入受体细胞
（1）受体种类不同，导入方法不同
受体细胞种类 方法
植物细胞 （1）农杆菌转化法：目的基因插入Ti质粒的T-DNA→农杆菌→导入植物细胞→稳定维持和表达基因枪法花粉管通道法
动物细胞 显微注射法：目的表达载体提纯→取卵（受精卵）→显微注射→受精卵发育→新性状动物
微生物细胞 Ca2+处理细胞→感受态细胞→表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子
（2）受体种类不同，所用的受体细胞种类也不相同。
植物：可以是卵细胞（受精卵）、体细胞（可经组织培养成为完整个体）
动物：受精卵（因为体细胞的全能性受到严格限制）
（3）转化实质：目的基因整合到受体细胞染色体基因组中
4．目的基因的检测与表达
① 首先要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是采用 DNA分子杂交技术。
② 其次还要检测目的基因是否转录出了mRNA，方法是采用标记的目的基因作探针与mRNA杂交。
③ 最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原－抗体杂交。
④ 有时还需进行个体生物学水平的鉴定。如转基因抗虫植物是否出现抗虫性状。
（三） 蛋白质工程
1．实质：根据蛋白质的结构与功能之间的关系，通过改造基因，以定向改造天然蛋白质，甚至创造自然界不存在的、具有优良特性的蛋白质。
2．基本原理：预期蛋白质功能→测定蛋白质三维空间结构→推测应有的氨基酸序列→找到对应的脱氧核苷酸序列（基因）→具有预期功能的蛋白质
3．应用
（1）通过改造酶的结构，有目的地提高蛋白质的热稳定性。
（2）合成嵌合抗体。
（3）改变蛋白质的活性。
（四）蛋白质工程与基因工程区别
蛋白质工程 基因工程
实质 通过改造基因，以定向改造天然蛋白质，甚至创造自然界不存在的蛋白质 将目的基因从供体转移到受体细胞，并在受体细胞中表达
结果 合成自然界不存在的蛋白质 只能生产自然界已存在的蛋白质
联系 蛋白质工程是在基因工程基础上，延伸出的第二代基因工程
典例精析
【例1】（2009·浙江理综）下列关于基因工程的叙述，错误的是
A．目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物
B．限制性核酸内切酶和DNA连接酶是两类常用的工具酶
C．人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生物活性
D．载体上的抗性基因有利于筛选含重组DNA的细胞和促进目的基因的表达
【精析】基因工程打破了物种间的局限性，其目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物；常用的工具酶是限制性核酸内切酶和DNA连接酶；人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生物活性，必须进入高尔基体，经蛋白水解酶的作用，经过剪接才能生成有活性的胰岛素。载体上的抗性基因主要是有利于筛选含重组DNA的细胞，不能促进目的基因的表达。
【答案】 D
【例2】（2008·江苏）将动物致病菌的抗原基因导入马铃薯制成植物疫苗，饲喂转基因马铃薯可使动物获得免疫力。以下是与植物疫苗制备过程相关的图和表。
请根据以上图表回答下列问题。
（1）在采用常规PCR方法扩增目的基因的过程中，使用的DNA聚合酶不同于一般生物体内的DNA聚合酶，其最主要的特点是 。
（2）PCR过程中退火（复性）温度必须根据引物的碱基数量和种类来设定。表1为根据模板设计的两对引物序列，图2为引物对与模板结合示意图。请判断哪一对引物可采用较高的退火温度？ 。
（3）图1步骤③所用的DNA连接酶对所连接的DNA两端碱基序列是否有专一性要求？ 。
（4）为将外源基因转入马铃薯，图1步骤⑥转基因所用的细菌B通常为 。
（5）对符合设计要求的重组质粒T进行酶切，。假设所用的酶均可将识别位点完全切开，请根据图1中标示的酶切位点和表2所列的识别序列，对以下酶切结果作出判断。
①采用EcoRⅠ和PstⅠ酶切，得到 种DNA片断。
②采用EcoRⅠ和SmaⅠ酶切，得到 种DNA片断。
【精析】本题考查了基因工程和PCR技术。PCR过程都在比生物体高许多的温度下进行的，所用的DNA聚合酶（即Taq酶）是从嗜热性细菌体内提取并分离的，具有耐高温性；DNA分子结构中G-C碱基对（之间形成了三个氢键）比A-T碱基对（之间形成两个氢键）稳定，因此G-C碱基对含量高的序列耐高温；DNA连接酶的作用是缝合限制酶切割的粘性末端，恢复磷酸二酯键，对所连接的DNA碱基序列没有专一性要求。基因工程中如果受体细胞是植物，转化时常用农杆菌转化法。在得到重组质粒T时，目的基因和质粒都用到了EcoRl，在重组质粒中又会形成新的EcoRl酶切位点，EcoRl和Smal 酶切割质粒时保留了Pstl的切割位点，所以用EcoRl和Pstl切割时可以得到两种DNA分子。而重组质粒中已经失去了Smal酶的识别序列，只能得到一种DNA分子片段。
【答案】⑴耐高温 ⑵引物对B ⑶否 ⑷农杆菌 ⑸① 2 ② 1
【例3】目前基因工程所用的质粒载体主要是以天然细菌质粒的各种元件为基础重新组建的人工质粒，图为pBR322质粒载体简图，小箭头所指分别为限制性内切酶EcoRI、BamHI的酶切位点，ampR为青霉素抗性基因，tctR 为四环素抗性基因，P启动子，T为终止子，ori为复制原点。已知目的基因的两端分别有包括EcoRI、BamHI在内的多种酶的酶切位点。
(1) pBR322分子中有单个EcoR I限制酶作用位点，EcoR 1只能识别序列一GAATTC一，并只能在G与A之间切割。若在某目的基因的两侧各有1个EcoR I的切点，请画出目的基因两侧被限制酶EcoR I切割后所形成的黏性末端 ______________ 。
（2）将含有目的基因的DNA与pBR322质粒载体分别用EcoRI酶切，酶切产物用DNA连接酶进行连接后，其中由两个DNA片段之间连接形成的产物有 、 、 三种。若要从这些连接产物中分离出重组质粒，需要对这些连接产物进行 。
(3) pBR322分子中另有单个的BamHI限制酶作用位点，现将经BamHI处理后的质粒与用另一种限制酶BgIⅡ处理得到的目的基因，通过DNA连接酶作用恢复______ 键，成功的获得了重组质粒。说明________ 。
(4) 为了检测上述重组质粒是否导入原本无ampR和tetR的大肠杆菌，将大肠杆菌在含氨苄青霉素的培养基上培养，得到如图二的菌落。再将灭菌绒布按到培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布按到含四环素的培养基上培养，得到如图三的结果(空圈表示与图二对照无菌落的位置)。与图三空圈相对应的图二中的菌落表现型是________ ，图三结果显示，多数大肠杆菌导入的是_____。
（5）目的基因表达时，RNA聚合酶识别和结合的位点是 ，其合成的产物是 。
（6）在上述实验中，为了防止目的基因和质粒表达载体在酶切后产生的末端发生任意连接，酶切时应选用的酶时是 。
【精析】（2）DNA连接酶在连接黏性末端时，只要黏性末端能互补配对，是不区分质粒还是目的基因的，所以可产生目的基因-载体连接物、载体-载体连接物、目的基因-目的基因连接物。要想得到分离出重组质粒，需要对这些连接产物进行分离纯化；
（3）现用两种不同的酶切割也能得到重组质粒，说明两种酶切割形成的黏性末端是相同的。
（4）pBR322质粒中的两个抗性基因，1个是用来检测运载体是否进入了受体细胞，另一个是用来检测目的基因是否被拼接到运载体上，含青霉素的培养基中，酶切位点没有破坏青霉素抗性基因ampR，只要含有目的基因-载体连接物、载体-载体连接物都可以生存；在含四环素的培养基中，因为酶切位点破坏四环素抗性基因tctR，所以只有载体-载体连接产物才可能存在。
（6）用这两种限制酶同时切割目的基因后，目的基因的两个黏性末端不同，这样目的基因就不会自连成环状；同样用这两种限制酶同时切割质粒后，质粒的两个黏性末端也不同，这样质粒也不会自连。当把切割后目的基因和切割后质粒混合后，只有目的基因和质粒才能相连。产物中只有重组质粒，而无其他的连接产物。
【答案】（1）
（2）目的基因—载体连接物 载体--载体连接物 目的基因--目的基因连接物 分离纯化
（3）磷酸二酯键两种限制酶(BamHⅠ和Bg1Ⅱ)切割得到的黏性末端相同
（4）能抗氨苄青霉素，但不能抗四环素pBR322质粒 载体--载体连接物
（5）启动子 mRNA
（6）EcoRI和BamHI
【点拨】 用EcoR I限制酶切割的是目的基因，画黏性末端时易忽略目的基因。
巩固演练
1．下列有关基因工程技术的正确叙述是 （ ）
A．重组DNA技术所用的工具酶是限制酶、连接酶和运载体
B．所有的限制酶都只能识别同一种特定的核苷酸序列
C．选用细菌作为重组质粒的受体细胞是因为细菌繁殖快
D．只要目的基因进入了受体细胞就能成功实现表达
【解析】 基因操作的工具酶有限制酶、连接酶，一种限制酶只能识别特定的核苷酸序列；目的基因进入受体细胞后，受体细胞表现出特定的性状，才说明目的基因完成了表达；基因工程的结果是让目的基因完成表达，生产出目的基因的产物，选择细菌作为受体细胞的重要条件就是能够快速繁殖。
【答案】C
2．科学家将β-干扰素基因进行定点突变导入大肠杆菌表达，使干扰素第17位的半胱氨酸改变成丝氨酸，结果大大提高β-干扰素的抗病性活性，并且提高了储存稳定性，该生物技术为 （ ）
A．基因工程 　　 B．蛋白质工程 C．基因突变 　 D．细胞工程
【解析】 基因工程是通过对基因的操作，将符合人们需要的目的基因导入适宜的生物体，原则上只能生产自然界已存在的蛋白质，蛋白质工程是指以蛋白质分子结构规律及其与生物功能的关系为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产或或生活需要。本题中合成的β-干扰素不是天然的，因此，属于蛋白质工程。
【答案】B
3．科学家运用基因工程技术将人胰岛素基因与大肠杆菌的质粒DNA分子重组，并且在大肠杆菌体内获得成功表达。图示a处为胰岛素基因与大肠杆菌质粒DNA结合的位置，它们彼此能结合的依据是 （ ）
A．基因自由组合定律 B．半保留复制原则
C．基因分离定律 D． 碱基互补配对原则
【解析】 本题考查基因工程的相关知识，重组质粒依据的是粘性末 端的碱基互补配对原则。
【答案】D
4．下列有关基因工程中限制内切酶的描术，错误的是 （ ）
A．一种限制性内切酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列
B．限制性内切酶的活性受温度的影响
C．限制性内切酶能识别和切割RNA
D．限制性内切酶可从原核生物中提取
【解析】限制内切酶主要存在于微生物中。一种限制性内切酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点切割DNA分子，它不能识别和切割RNA。由于是工具酶，其活性易受温度等外界环境的影响。
【答案】C
5．2008年诺贝尔化学奖授予了“发现和发展了水母绿色荧光蛋白“的三位科学家。将绿色荧光蛋白基因的片段与目的基因连接起来组成一个融合基因，再将该融合基因转入真核生物细胞内，表达出的蛋白质就会带有绿色荧光。绿色荧光蛋白在该研究中的主要作用是（ ）
A．追踪目的基因在细胞内的复制过程
B．追踪目的基因插入到染色体上的位置
C. 追踪目的基因编码的蛋白质在细胞内的分布
D．追踪目的基因编码的蛋白质的空间结构。
【解析】 由题干知，利用这种绿色荧光蛋白基因的片段与目的基因连接起来组成的一个融合基因，在真核生物细胞内，如果只进行基因的复制是看不见绿色荧光的，只有该基因表达产生蛋白质才能探测到绿色荧光，由此可以追踪该目的基因编码的蛋白质在细胞内的分布。
【答案】C
6．下列说法正确的是 （ ）
A．用基因工程方法培育抗虫植物也能抗病毒
B．基因工程在畜牧业上应用的目的是培育体型巨大、品质优良的动物
C．任何一种假单孢杆菌都能分解四种石油成分，因此，假单孢杆菌是“超级细菌”
D．基因工程在农业生产上的应用主要是培育高产、稳产、品质优良和具有抗性的农作物
【解析】 本题考查基因工程的应用。用基因工程方法培育的抗虫植物(如抗虫棉)不能抗病毒，二者不是一回事；科学家培养超级动物的更重要的目的是利用某些特定的外源基因在哺乳动物体内表达，获得人类所需要的各类物质(如激素、酶、抗体等)；每一种假单孢杆菌只能分解石油中的某一种成分，科学家利用生物工程的方法，把能分解三个烃类的基因转移到能分解另一种烃类的假单孢杆菌内，创造出了能同时分解四种烃类的超级细菌。
【答案】 D
7．如果通过转基因技术，成功改造了某血友病女性的造血干细胞，使其凝血功能全部恢复正常。当她与正常男性结婚，婚后所生子女的表现型为 （ ）
A．儿子、女儿全部正常
B．儿子、女儿中各一半正常
C．儿子全部有病，女儿全部正常
D．儿子全部正常，女儿全部有病
【解析】 通过转基因技术改造人的造血干细胞，就是将健康人的正常基因导入患者体内，合成凝血因子，恢复正常的凝血功能。血友病为X染色体上的隐性遗传病，本题中完成转基因的细胞只有造血干细胞，而正常的体细胞和精原细胞没有进行转基因，女性患者所产生的卵细胞仍然含有血友病基因，所以，所生男孩都患病。
【答案】 C
8．多聚酶链式反应(PCR)是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。PCR过程一般经历下述三十多次循环：95℃下使模板DNA变性、解链→55℃下复性（引物与DNA模板链结合）→72℃下引物链延伸（形成新的脱氧核苷酸链）。下列有关PCR过程的叙述中不正确的是（ ）
A．变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键，也可利用解旋酶实现
B．复性过程中引物与DNA模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成
C．延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP、四种核糖核苷酸
D．PCR与细胞内DNA复制相比所需要酶的最适温度较高
【解析】 本题考查PCR扩增过程。解题的关键是要全面理解PCR扩增过程。DNA分子被破坏是指DNA分子被解旋成两条长链，破坏的部位是连接两条长链之间的氢键，方法有多种，用解旋酶、高温等都可使DNA解旋，A项正确。B中引物有引物两种，分别与模板DNA链3′端的互补序列互补配对。C中的原料不正确，合成DNA的原料是四种脱氧核苷酸。PCR技术中DNA合成过程中的温度在70～75 ℃，所以，D选项正确。
【答案】 C
9．2003年在中国大地上最惨烈的事件就是“非典”侵袭、肆虐着人体的健康，夺取了许多人宝贵的生命。医院人满为患，“非典”与“发热”、“疑似”混杂在一起，让医生难以区分。我国科学工作者日夜奋战，利用基因工程迅速研制出“非典”诊断盒。其作用机理是 （ ）
　A．治疗“非典”利用的是抗原—抗体反应
　B．诊断“非典”利用的是DNA分子杂交原理
　C．诊断“非典”利用的是抗原—抗体反应
　D．治疗“非典”利用的是DNA分子杂交原理
　　【解析】 “非典”系由于“非典”病毒所致，其诊断过程是利用了DNA分子杂交原理，应用“非典”病毒的RNA进行逆转录，可得到DNA探针，再利用DNA探针对血液中的非典”病毒进行诊断；治疗“非典”利用的是抗原一抗体反应，“非典”病毒属于抗原，可引起机体产生免疫反应。
　　【答案】B
10．下表有关基因表达的选项中，不可能的是 （ ）
基因 表达的细胞 表达产物
A 细菌抗虫蛋白基因 抗虫棉叶肉细胞 细菌抗虫蛋白
B 人酪氨酸酶基因 正常人皮肤细胞 人酪氨酸酶
C 动物胰岛素基因 大肠杆菌工程菌细胞 动物胰岛素
D 兔血红蛋白基因 兔成熟红细胞 兔血红蛋白
【解析】兔成熟的红细胞无任何细胞器，兔血红蛋白基因导入内无法进行基因的表达，即不能生成兔血红蛋白。
【答案】 D
11．通过DNA重组技术使原有基因得以改造的动物称为转基因动物。运用这一技术使羊奶中含有人体蛋白质，下图表示了这一技术的基本过程，在该工程中所用的基因“剪刀”能识别的序列和切点是一G↓GATCC一，请回答：
（1）从羊染色体中“剪下羊蛋白质基因的酶是 。人体蛋白质基因“插入”后连接在羊体细胞染色体中时需要的酶是 。
（2）请画出质粒被切割形成黏性末端的过程图。
（3）人体蛋白质基因之所以能“插入”到羊的染色体内，原因是
，“插入”时常用的工具是 。
【解析】本题考查基因工程的基本操作，在基因工程中用到的工具酶有限制性内切酶和DNA连接酶，在对运载体和目的基因进行切割的时候，一般选用同一种限制性内切酶，从而切出相同的粘性末端，当插入目的基因时常用DNA连接酶把二者之间的磷酸二酯键连上。
【答案】（1）限制性内切酶；DNA连接酶；
（2）
（3）有互补的碱基序列；细菌质粒或病毒
12．右下图是将人的生长激素基因导入细菌B细胞内制造“工程菌”示意图，所用载体为质粒A。已知细菌B细胞内不含质粒A，也不含质粒A上的基因，质粒A导入细菌B后，其上的基因能得到表达。请回答下列问题。
（1）人工合成目的基因的途径一般有哪两条？ （2）如何将目的基因和质粒结合成重组质粒？ （3）目前把重组质粒导入细菌细胞时，效率还不高，导入完成后得到的细菌，实际上有的根本没有导入质粒，有的导入的是普通质粒A，只有少数导入的是重组质粒。此外可以通过如下步骤鉴别得到的细菌是否导入了质粒A或重组质粒：
将得到的细菌涂布在一个含有氨苄青霉素的培养基上，能够生长的就导入了质粒A或重组质粒，反之则没有。使用这种方法鉴别的原因是
。
（4）若把通过鉴定证明导入了普通质粒A或重组质粒的细菌放在含有四环素的培养基上培养，会发生的现象是　 　　　 ，原因是　　　 　。
（5）导入细菌B细胞中的目的基因成功表达的标志是什么？
　　　 　
【解析】 此题是对基因操作“四步曲”比较全面的考查，而且注意联系实际。（1）、（2）两题考查的都是基因工程中最基本的识记知识；
（3）检测质粒或重组质粒是否导入受体细胞，均需利用质粒上某些标记基因的特性。即对已经做了导入处理的、本身无相应特性的受体细胞进行检测，根据受体细胞是否具有相应的特性来确定。抗氨苄青霉素基因在质粒A和重组质粒上，且它与目的基因是否插入无关，所以，用含氨苄青霉素这种选择培养基培养经导入质粒处理的受体细胞，凡能生长的则表明质粒导入成功；不能生长的则无质粒导入。
（4）抗四环素基因不仅在质粒A上，而且它的位置正是目的基因插入之处，因此当目的基因插入质粒A形成重组质粒时，此处的抗四环素基因的结构和功能就会被破坏，含重组质粒的受体细胞就不能在含四环素的培养基上生长，而质粒A上无目的基因插入的，抗四环素基因结构是完整的，这种受体细胞就能在含四环素的培养基上生长。
【答案】 （1）①将从细胞中提取分离出的目的基因作为模板，转录成mRNA单链DNA双链DNA；②据蛋白质中氨基酸序列mRNA中碱基序列DNA碱基序列目的基因。
（2）①用一定的限制酶切割质粒，使其出现一个有粘性末端的切口；②用同种限制酶切割目的基因，产生相同的粘性末端；③将切下的目的基因片段插入到质粒的切口处，再加入适量的DNA连接酶，使质粒与目的基因结合成重组质粒。
（3）普通质粒A和重组质粒都含有抗氨苄青霉素基因。
（4）有的能生长，有的不能生长。导入普通质粒A的细菌能生长，因为普通质粒A上有抗四环素基因；导入重组质粒的细菌不能生长，因为目的基因插在抗四环素基因中，抗四环素基因的结构被破坏。
（5）受体细胞通过转录、翻译合成相应的蛋白质，即人的生长激素。
13．为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。
⑴获得耐盐基因后，构建重组DNA分子所用的限制性内切酶作用于图中的 处，DNA连接酶作用于 处。（填“a”或“b”）
⑵将重组DNA分子导入水稻受体细胞的常用方法有农杆菌转化法和 法。
⑶由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要利用 技术，该技术的核心是 和 。
⑷为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素标记的 做探针进行分子杂交检测，又要用 方法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性。
〖解析〗本题综合考查了基因工程的基本工具、基本操作程序和植物细胞工程等知识，属于识记内容，要求简单。（1）限制性核酸内切酶破坏的是相邻两个脱氧核苷酸的磷酸和脱氧核糖之间的化学键。DNA连接酶的作用部位也是该处，但作用与限制酶正好相反。
（2）重组DNA导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法，也可以使用基因枪法或花粉管通道法。
（3）目的基因的受体细胞是植物体细胞或受精卵，因此，要经过植物组织培养过程才能成为植株。该过程的核心是脱分化和再分化。
（4）目的基因是否导入受体细胞，用DNA分子杂交技术进行检测，即以带有放射性的目的基因的单链为探针，检测受体细胞中是否含有能与探针进行配对杂交的DNA（目的基因）。检测目的基因是否表达，可以用个体检验的方法，将植物栽培到高浓度盐的环境中（如盐碱地），然后观察其生活状况。
【答案】⑴ a a
⑵基因枪法（花粉管通道法）
⑶植物组织培养 脱分化 再分化
⑷耐盐基因（目的基因） 一定浓度的盐水浇灌（移植到盐碱地中）
14．利用动物乳腺生产产品的技术称为动物乳腺反应器技术。2005年我省青岛“崂山奶山羊乳腺生物反应器的研制”项目通过鉴定，该项目生产的药用蛋白具有表达效率高、成本低、安全性高、易于分离纯化的优点，可产生乙肝表面抗原及抗凝血酶Ⅲ等医药产品，造福人类健康。下图为利用生物技术获得生物这一新品种和抗虫棉的过程，据图回答：
　　⑴在基因工程中，A表示 ，如果直接从苏云金杆菌中获得抗虫基因，①过程使用的酶区别于其他酶的特点是 ，B表示 。
　　⑵在研究过程中，研究人员首先从相关基因组中获取了目的基因，并采用____ 技术对目的基因进行了扩增，然后将目的基因与质粒等载体组合形成了重组载体。在重组载体的构建过程中需要的工具酶有______________________________。
　　⑶基因表达载体的构建是基因工程的核心，一个完整的基因表达载体至少包括哪些部分 。
　　⑷将目的基因导入受体细胞的过程中，在③过程中一般是采用 方法，在②过程中一般采用 方法，受体细胞一般是 。
　　⑸由于转基因表达产物存在于山羊的乳汁中，检测其体内是否出现药用蛋白，在分子水平上的检测方法及结果是什么 。
　　⑹要确定目的的基因（抗虫基因）导入棉花细胞后，是否能稳定遗传并表达，需进行检测和鉴定工作，请写出在个体水平上的鉴定过程： 。
　　【解析】 主要考查基因工程的工具、步骤和应用。基因工程的工具有限制酶、DNA连接酶、运载体等，其中限制酶具有专一性：一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切点上切割DNA分子。基因工程包括四个步骤：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。目的基因的获取一般有3种途径：从基因文库中获取目的基因；利用PCR技术扩增目的基因；通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。一个完整的基因表达载体至少包括目的基因、启动子、终止子、标记基因等部分。基因基因的检测与鉴定有四种方法：采用DNA分子杂交技术检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因，检测目的基因是否转录出了mRNA，检测目的基因是否翻译成蛋白质，进行个体生物学水平的鉴定（进行抗虫或抗病的接种实验）。
　　【答案】 ⑴目的基因 一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且在特定的位点上切割DNA分子 重组DNA ⑵PCR（聚合酶链式反应） 限制酶、DNA连接酶
⑶一个完整的基因表达载体至少包括目的基因、启动子、终止子、标记基因等部分。
⑷农杆菌转化法 显微注射技术 受精卵 ⑸从转基因羊的乳汁中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交 如果出现杂交带，表明奶牛中出现了抗原蛋白；如果不出现杂交带，表明奶牛中未出现抗原蛋白。⑹让害虫吞食转基因棉花的叶子，观察害虫的存活情况，以确定其是否具有抗虫性状。
15．根据实验原理和材料用具，设计实验确定细菌质粒的抗菌素基因所控制的抗菌素的类别。
实验原理：作为运载体的质粒，需要有标记基因，这一标记基因是抗菌素抗性基因。有抗性基因的质粒可用作运载体。
材料用具：青霉素、四环素各10万单位溶液，菌种试管，灭菌的含细菌培养基的培养皿，酒精灯，接种环，一次性注射器，无菌水，恒温箱
方法步骤：
第一步：取3个含培养基的培养皿，分别编号为1、2、3号，用三支注射器分别向3个培养基中注入1ml无菌水，、青霉素液、四环素液，并使之均匀分布之整个培养基表面。
第二步： 。
第三步： 。
结果预期：
。
【解析】 运载体中所携带的一些抗性基因（如氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因）及发光基因等，能控制一些特殊物质的合成，利用这些特殊物质可以筛选运载体或重组运载体，这些基因就叫做标志基因。目的基因中的标志基因最少要有2个，1个是用来检测运载体是否进入了受体细胞，另一个是用来检测目的基因是否被拼接到运载体上；第一个标志基因要保证其完整性，能够进行表达，若受体细胞表现出该基因所控制的性状，说明运载体已进入受体细胞；第二个标志基因是插入目的基因的部位，由于目的基因的插入破坏了起结构，不能表达其所控制的性状，若受体细胞没有表达出第二个基因所控制的性状，说明目的基因已进入受体细胞。
【答案】 第二步：将接种环在酒精灯上灼烧，在酒精灯旁用接种环挑取等量菌种，分别培养在三个不同的培养基上，置于恒温箱内，培养一段时间。
第三步：将接种后的培养基放在37℃的恒温箱中培养24小时。
预期结果：①1号培养基内细菌正常生长，2、3号内的细菌死亡，说明细菌无抗青霉素基因，无抗四环素基因；②1、2号培养基内细菌正常生长，3号培养基内细菌死亡，说明细菌有抗青霉素基因，无抗四环素基因；③1、3号培养基内细菌正常生长，2号培养基内细菌死亡，说明细菌质粒无抗青霉素基因，有抗四环素基因；④1、2、3号培养基内细菌都正常生长，说明细菌质粒既有抗青霉素基因，又有抗四环素基因。www.
目的基因的获取
基因表达载体的构建
从自然界中已有的物种中分离出来
用人工的方法合成
要点：同种限制酶切割目的基因与质粒
将目的基因导入受体细胞
受体细胞种类：大肠杆菌、枯草杆菌、土壤脓杆菌、酵母菌和动植物细胞
导入方法：显微注射法、农杆菌转化法、Ca＋处理细胞法等
检测对象：①检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因 ②检测目的基因是否转录出了mRNA ③检测目的基因是否翻译成蛋白质
目的基因的监测与鉴定
检测方法：分子检测法——①和②都是DNA分子杂交技术，③抗原－抗体杂交法
形态检测法——可根据目标性状的有无来判断目的基因是否表达
用限制酶切割
—C CTAG﹐G—
—G GATCC—
—CCTAG G—
21世纪教育网 -- 中国最大型、最专业的中小学教育资源门户网站。 版权所有@21世纪教育网

展开更多......

收起↑