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《基因工程》专题
知识要点回顾
（一）DNA重组技术的基本工具
1． 基因工程的概念
（1）基因工程是按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组技术和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于它是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫DNA重组技术。如下表：
基因工程的别名 基因拼接技术或DNA重组技术
操作环境 生物体外
操作对象 基因
操作水平 DNA分子水平
基本过程 剪切→拼接→导入→表达
结果 人类需要的基因产物
（2）特点：在分子水平上改造和定向性
（3）工具：限制性内切酶---“分子手术刀”；DNA连接酶---“分子缝合针”；基因进入受体细胞的载体---“分子运输车”。
2．限制性内切酶——“分子手术刀”
（1）主要从原核生物中分离；（2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开；（3）切割后的DNA末端有两种形式： 黏性末端和平末端。
3．DNA连接酶——“分子缝合针”
T4 DNA连接酶： 既能“缝合”黏性末端，也能“缝合”平末端。
（1）种类：
E·coli DNA连接酶：只能将双链片段互补的黏性末端连接。
（2）作用实质：恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键
4． 基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
（1）运载体的作用：与目的基因结合形成重组DNA，并将目的基因导入受体细胞；（2）运载体的类型：①细菌质粒（常用）：是独立于细菌DNA之外的小型环状DNA，可以独立复制，也可以整合到细菌DNA中，随细菌DNA的复制而复制；②噬菌体或某些动植物病毒，如叶绿体或线粒体DNA等也有可能成为运载体，如把外源基因导入叶绿体中，可减少“基因污染”；（3）具备的条件：①能在宿主细胞中保存下来并大量复制；②有一个至多个限制酶切割点；③有特殊的遗传标记基因，便于筛选；此外，运载体的存在还需对宿主细胞生存没有影响。
5．实验操作分析与评价
基因工程的实验操作中，主要包括基因工具操作结果的分析，如产生几个片段，酶切位点的判断等、还包括酶切后产生黏性末端的确定等。
（二）基因工程的基本操作程序
1．目的基因的获取
目的基因是指编码蛋白质的结构基因，获取方法有①从基因文库中获取，其优点：有了基因文库，就可随时从中提取所需要的目的基因，引入受体细胞使之表达；②人工合成，可采取反转录法和根据已知氨基酸序列合成DNA；③利用PCR技术扩增目的基因，即体外大量复制DNA技术。
2．基因表达载体的构建——基因工程的核心
（1）目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可以遗传给下一代，并使目的基因能够表达和发挥作用；（2）基因表达载体的组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因。①启动子：一段特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是与RNA聚合酶结合的部位；②终止子：一段特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端，作用是使转录过程停止；③标记基因：一般为抗生素基因或荧光基因等，其作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因（目的基因是否导入成功）。
3．目的基因导入受体细胞
（1）目的：目的基因进入受体细胞内并在受体细胞内稳定维持和表达的过程；（2）受体种类不同，导入方法不同；（3）转化的含义及实质：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为转化。转化的实质是目的基因整合到受体细胞染色体基因组中，从而使受体生物获得了新的遗传特性的现象，从其变化的实质看，这种变异属于可遗传变异的基因重组。
4．目的基因的检测与鉴定
（1）导入检测：DNA分子杂交法（使用DNA探针）；（2）表达检测：①转录检测：分子杂交法检测mRNA；②翻译检测：免疫法，提取蛋白质用相应的抗体进行抗原-抗体杂交；（3）个体生物学水平鉴定：如作物抗性等。
（三）基因工程的应用
1．基因诊断、基因治疗、基因芯片
基因诊断就是利用现代分子生物学和分子遗传学的技术方法，直接检测基因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。其特点的：①以基因作为检查材料和探查目标，针对性强。②分子杂交技术选用特定基因序列作为探针，具有很高的特异性。③适用性强，诊断范围广，检测目标可为内源基因也可为外源基因。常用技术有DNA探针技术、PCR技术、基因测序技术和基因芯片等；　
基因治疗是指将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，以达到治疗疾病目的的方法。常用的方法有基因矫正、基因替补、基因置换和基因失活等。基因治疗的过程包括①治疗性基因的选择；②基因载体的选择；③靶细胞的选择；④基因转移；⑤外源基因表达的筛检；⑥回输体内。
基因芯片：将大量的特定序列的DNA片段有序地固定在尼龙膜、玻片或硅片上，从而大量、快速地对DNA分子的碱基序列进行测定和定量分析。主要应用于发现疾病的相关基因、用于许多疾病的检测。
2．基因身份证、基因兴奋剂
基因身份证是依据DNA鉴定技术（又称DNA指纹法）建立起来的，它选取若干个固定的遗传基因位点进行鉴定，基因型身份证明的号码是由多个能够表示这些遗传基因位点特征的数据来表示。利用基因型身份证明，可以 “寻亲”，找回丢失的孩子；可很快找到基因配型相近者，输血可以缩短时间找到救助者。
基因兴奋剂是指通过改良遗传学成分来使机体产生更多激素、蛋白质或其他天然物质，从而增进运动能力，使用者注射的不是那些容易在尿液中检测出的药物，而是能刺激身体发生某种改变的基因。
（四）蛋白质工程
1．蛋白质工程的概念与基本原理
（1）对蛋白质工程的概念的理解应注意几个方面：①蛋白质工程的基础：蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系；②蛋白质工程的改造对象：改造蛋白质的结构，本质上是改造控制该蛋白质合成的基因的结构；③蛋白质工程的产物：产生新的蛋白质。
（2）原理、过程和意义：①原理：中心法则的逆推；②过程：预期蛋白质的功能→设计蛋白质结构→推测氨基酸序列→推测脱氧核苷酸序列→合成DNA→表达出蛋白质；③意义：可生产出自然界从来没有过的蛋白质。
2． 蛋白质工程的实例
①干扰素是动物体内的一种蛋白质，可治疗病毒的感染和癌症，但在体外保存相当困难，通过蛋白质工程改造蛋白质后可在－70℃条件下，保存半年；②玉米体内赖氨酸的含量比较低，关键是玉米体内天冬氨酸激酶和二氢吡啶二羧酸合成酶浓度达到一定量时，就会抑制这两种酶的活性，从而影响赖氨酸含量的提高，经过蛋白质工程改造这两种酶后，分别使赖氨酸的含量提高了5倍和2倍。
3．蛋白质工程的进展和前景
蛋白质工程的进展向人们展示出诱人的前景，如通过对胰岛素的改造，使其成为一种速效性药品；再如将蛋白质工程应用与微电子方面，制成电子元件，具有体积小、耗电少、效率高等优点，但是由于蛋白质发挥功能必须依赖于它的高级结构（空间结构），这是相当复杂的，所以，目前成功的例子还不多，还需要人们的努力。
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