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多聚酶链式反应扩增DNA片段
学习目标
1.了解PCR技术的基本操作
2.理解PCR的原理
3.讨论PCR的应用
学习重点难点
PCR的原理和PCR的基本操作
自主学习
一基础知识
1．PCR原理
填写下列表格
参与的组分 在DNA复制中的作用
解旋酶
DNA母链
合成子链的原料
DNA聚合酶
引物
DNA的两条链是反向平行的，通常将DNA的羟基末端称为 ，而磷酸基团的末端称为 。DNA聚合酶不能 开始合成DNA，而只能 ，因此，DNA复制需要引物。DNA的合成方向总是 。
在DNA的复制过程中，复制的前提是 。在体外可通过控制 来实现。在 的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为 。PCR利用了DNA的 原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合。由于PCR过程的温度高，导致DNA聚合酶失活，后来 的DNA聚合酶的发现和应用，大大增加了PCR的效率。
PCR反应需要在一定的缓冲溶液中提供： ， ，
， ，同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。
2．PCR的反应过程
PCR一般要经历 循环，每次循环可以分为 、 和 三步。从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由 延伸而成的DNA单链会与 结合，进行DNA的延伸，这样，DNA聚合酶只能
，使这段固定长度的序列成指数扩增。
3．实验操作
在实验室中，做PCR通常使用 ，它是一种薄壁塑料管。具体操作时，用微量移液器，按PCR反应体系的配方在 中依次加入各组分，，再参照下表的设置设计好PCR仪的循环程序即可。
4．操作提示
为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的 、 、 以及蒸馏水等在使用前必须进行 。PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在
储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。在微量离心管中添加反应成分时，移液管上的枪头要 。
[疑难点拨]
1.PCR技术简介
PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，它能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。这项技术有效地解决了因为样品中DNA含量太低而难以对样品进行分析研究的问题，被广泛的应用于遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和DNA序列测定等各方面。
2．细胞内参与DNA复制的各种组成成分及其作用
①解旋酶：打开DNA双链 ②DNA母链：提供DNA复制的模板 ③4种脱氧核苷酸：合成子链的原料 ④DNA聚合酶：催化合成DNA子链 ⑤引物：使DNA聚合酶能够从引物的3，端开始连接脱氧核苷酸（引物是一小段DNA或RNA，它能与DNA母链的一段碱基序列互补配对。用于PCR的引物长度通常为20—30个核苷酸）
3．DNA的合成方向
DNA的两条链是反向平行的，通常将DNA的羟基末端称为3，端，而磷酸基团的末端称为5，端。DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3，端延伸DNA链，因此，DNA复制需要引物。当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3，端开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的5，端向3，端延伸。
4．PCR的反应过程
PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可以分为变性（当温度上升到90oC以上时，双链DNA解聚为单链）、复性（温度下降到50oC左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合）和延伸（温度上升到72oC左右，溶液中的四种脱氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链）三步。从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸，这样，DNA聚合酶只能特异的复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列成指数扩增。
5．PCR技术与DNA的复制
PCR反应是通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。PCR反应的实质就是DNA复制，所以有关PCR反应的题目与DNA复制的原理相同，计算方法也大体相同。例如：PCR反应中的目的片段一般以2n的方式积累，其中n为反应循环次数。一个DNA片段在30次循环后反应物中大约有10亿个这样的片段。（230）
[典例解析]]
一个由15N标记的DNA分子，放在没有标记的环境中培养，利用PCR循环5次后标记的DNA分子总数的（ ）
A 1/10 B 1/5 C 1/16 D1/25
答案：C
解析：一个DNA分子利用PCR技术循环5次后产生的DNA分子数目为2n。而DNA的复制是半保留复制，其特点是：新形成的DNA双链，一条是来自亲代DNA分子的母链，另一条是新形成的子链。这样最初由15N标记的DNA分子复制后，其标记的两条链就分别进入两个子代DNA分子中，这样两个子代DNA分子被标记了。以后均是在没有标记的环境中培养，不论经过多少次复制，最初标记的两条链始终存在于两个DNA分子中，这样经过n次循环后，标记的DNA分子中2/2n,即1/2n-1。
巩固提高
一．选择题
1．DNA分子复制时，解旋的两条链中（ ）
A仅一条作为复制模板
B两条链作为模板并复制出两个不同的DNA分子
C两条链作为模板并复制出两个相同的DNA分子
D两条链作为模板，各自合成一条子链，然后两条母链重新结合为原来的双螺旋分子，两条新链结合成一个全新的DNA分子
2.下列关于DNA复制过程的正确顺序是（ ）
①互补碱基对之间氢键断裂②互补碱基对之间形成氢键③DNA分子在解旋酶的作用下解旋④以解旋后的母链为模板进行碱基互补配对⑤子链与母链盘旋成双螺旋状结构
A①③④②⑤ B①④②⑤③ C①③⑤④② D③①④②⑤
3.下列各项过程中，遵循“碱基互补配对原则”的有（ ）
①DNA复制②RNA复制③转录④翻译⑤逆转录
A①②③④⑤ B①②③④ C①②③⑤ D①③④⑤
4.实验室内模拟生物体DNA的复制必需的一组条件是（ ）
①酶②游离的脱氧核苷酸③ATP④DNA分子⑤mRNA⑥tRNA⑦适宜的温度⑧适宜的酸碱度
A①②③④⑤⑥ B②③④⑤⑥⑦ C②③④⑤⑦⑧ D①②③④⑦⑧
5.利用PCR技术，把一个双链DNA分子当作第一代，经过3次循环，在第四代DNA分子中，有几条第一代脱氧核苷酸的长链？（ ）
A 2 B 4 C 8 D 16，
6.关于DNA分子的叙述中，正确的是（ ）
A .DNA的两条链是极性相同，同向平行 B.DNA的两条链是极性相同，反向平行
C.DNA的两条链中极性不同，反向平行的 D.DNA的两条链是极性不同，同向平行
7.假设PCR反应中，只有一个DNA的片段作为模板，请计算在30次循环后，反应物中大约有多少这样的DNA片段（ ）
A 215 B 230 C 260 D 231
8.DNA的合成方向总是（ ）延伸。
A从DNA分子的左端向右端 B从DNA分子的右端向左端
C从子链的5，端向3，端 D从子链的3，端向5，端
9.要使PCR反应在体外的条件下顺利地进行，需要严格的控制（ ）
A 氧气的浓度 B酸碱度 C温度 D 大气的湿度
10.DNA分子经PCR反应循环一次后，新合成的那条子链的脱氧核苷酸的序列应与（ ）
A模板母链相同 B非模板母链相同 C两条模板母链相同 D两条模板母链都不相同
二．非选择题
1．PCR技术是把某一DNA片段在实验条件下，合成许许多多相同片段的一种方法，利用这种技术能快速而特异的扩增任何要求的目的基因或者DNA分子片段，“人类基因组计划”的研究中常用到这种技术。请结合有关知识，回答有关此技术的一些问题：
⑴PCR技术能把某一DNA片段进行扩增，依据的原理是：
⑵在实验条件下，DNA分子进行扩增，除了所要扩增的DNA片段处，还需要 、和 、 等条件。
⑶某DNA片段有160个碱基，其中有腺嘌呤35个，若让该DNA分子扩增三次（即复制三次）至少需要腺嘌呤脱氧核苷酸和鸟嘌呤脱氧核苷酸的数目分别是 和 个。
2．将大肠杆菌置于含15N的培养基上培养。这样，后代大肠杆菌细胞中的DNA双链均被15N标记。然后将被15N标记的大肠杆菌作为亲代转到普通培养基中，繁殖两代。亲代、第一代、第二代大肠杆菌DNA的状况如图所示。
⑴第一代大肠杆菌DNA贮存的遗传信息与亲代大肠杆菌DNA贮存的遗传信息完全相同的原因是 。
⑵如果将第二代大肠杆菌的DNA分子总量作为整体1，其中，带有15N的第二代大肠杆菌DNA分子约占总量的 %。
⑶如果将第二代大肠杆菌的DNA含量作为整体1，其中含15N标记的第二代大肠杆菌的DNA含量（脱氧核苷酸单链）约占总量的 %
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