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生物宝典之4——现代生物技术
内容 要求
4-1基因工程 基因工程的基本操作原理与技术：工具酶的主要类型、特性及作用操作步骤应用与前景 Ⅰ
基因工程的基本操作原理与技术
1．基因工程的概念：基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。
2．基因工程的原理及技术 原理：基因重组
技术：基因工程的基本工具
（1）限制性核酸内切酶（限制酶）
来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。
功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。
结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。
（2）DNA连接酶
两种DNA连接酶（E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶）的比较：
连接酶来源于T4噬菌体，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。
与DNA聚合酶作用的异同: DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。
（3）载体
载体具备的条件：①能在受体细胞中复制并稳定保存。②具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。
最常用的载体是 质粒,它是一种小型环状DNA、独立于细菌拟核之外，并具有自我复制能力。
其它载体： 噬菌体、动植物病毒
3.基因工程的基本操作程序
第一步：目的基因的获取
原核基因采取直接分离获得，真核基因是人工合成。人工合成目的基因的常用方法有反转录法_和化学合成法_。
PCR技术扩增目的基因 （1）原理：DNA双链复制
（2）过程：第一步：加热至90～95℃DNA解链；第二步：冷却到55～60℃，引物结合到互补DNA链；第三步：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成。
第二步：构建基因表达载体
组成：＋启动子目的基因＋终止子＋标记基因
（1）启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。
（2）终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段 ，位于基因的尾端。
（3）标记基因的作用：鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素基因。
第三步：将目的基因导入受体细胞_
将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是 农杆菌转化法，其次还有 基因枪法和 花粉管通道法等。
将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是 显微注射技术。此方法的受体细胞多是 受精卵。
将目的基因导入微生物细胞：
重组细胞导入受体细胞后，筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达。
第四步：目的基因的检测和鉴定
首先要检测 转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是采用 DNA分子杂交技术。
其次还要检测 目的基因是否转录出了mRNA，方法是采用 用标记的目的基因作探针与mRNA杂交。
最后检测 目的基因是否翻译成蛋白质，方法是从转基因生物中提取 蛋白质，用相应的 抗体进行 抗原－抗体反应。
有时还需进行 个体生物学水平的鉴定。如 转基因抗虫植物是否出现抗虫性状。
4.基因工程的应用
1.植物基因工程：抗虫、抗病、抗逆转基因植物，利用转基因改良植物的品质。
2.动物基因工程：提高动物生长速度、改善畜产品品质、用转基因动物生产药物。
3.基因治疗：把正常的外源基因导入病人体内，使该基因表达产物发挥作用。
5.蛋白质工程的概念
蛋白质工程是指通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。（基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质）
蛋白质工程的基本原理：它可以根据人的需求来设计蛋白质的结构，又称为第二代的基因工程。
基本途径：从预期的蛋白质功能出发，设计预期的蛋白质结构，推测应有的氨基酸序列，找到相对应的脱氧核苷酸序列（基因）以上是蛋白质工程特有的途径；以下按照基因工程的一般步骤进行。（注意：目的基因只能用人工合成的方法）
内容 要求
4-2克隆技术 克隆的定义和理论基础 Ⅱ
植物组织培养的原理 Ⅱ
动物的细胞培养与体细胞克隆 Ⅰ
细胞融合 Ⅰ
单克隆抗体 Ⅰ
植物细胞工程
1.理论基础（原理）：细胞全能性
2.植物组织培养技术（植物细胞工程的基础技术）
（1）过程：离体的植物器官、组织或细胞 ―――→愈伤组织 ―――→试管苗 ――→植物体
（2）用途：微型繁殖、作物脱毒、制造人工种子、单倍体育种、细胞产物的工厂化生产。
①植物繁殖
微型繁殖：可以高效快速地实现种苗的大量繁殖
作物脱毒：采用茎尖组织培养来除去病毒（因为植物分生区附近的病毒极少或没有）
人工种子：以植物组织培养得到的胚状体、不定芽、顶芽和腋芽等为材料，经人工薄膜包装得到的种子。
②作物新品种培育
单倍体育种：
过程：植株（AaBb）通过减数分裂得到花粉（AB、Ab、aB、ab四种类型）；对花粉进行花药离体培养（技术是植物组织培养）；得到单倍体植株；对其幼苗时期进行秋水仙素处理；得到了正常的纯合二倍体植株（AABB、AAbb、aaBB、aabb四种类型）。
优点：明显缩短育种年限
③突变体利用：在组织培养中会出现突变体，通过从有用的突变体中选育出新品种（如筛选抗病、抗盐、含高蛋白的突变体）
④细胞产物的生产：通过能够产生对人们有利的产物的细胞进行组织培养，从而让它们能够产生大量的细胞产物。
（3）地位：是培育转基因植物、植物体细胞杂交培育植物新品种的最后一道工序。
3.植物体细胞杂交技术
（1）过程：
（2）诱导融合的方法：物理法包括离心、振动、电刺激等。化学法一般是用聚乙二醇（PEG）作为诱导剂。
（3）意义：克服了远缘杂交不亲和的障碍。
动物细胞工程
1.动物细胞培养
（1）概念：动物细胞培养是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和繁殖。
（2）动物细胞培养的流程：取动物组织块（动物胚胎或幼龄动物的器官或组织）→剪碎→用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞→制成细胞悬液→转入培养瓶中进行原代培养→贴满瓶壁的细胞重新用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞继续传代培养。
（3）细胞贴壁和接触抑制：悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。细胞数目不断增多，当贴壁细胞分裂生长到表面相互抑制时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。
（4）动物细胞培养需要满足以下条件
①无菌、无毒的环境：培养液应进行无菌处理。通常还要在培养液中添加一定量的抗生素，以防培养过程中的污染。此外，应定期更换培养液，防止代谢产物积累对细胞自身造成危害。
②营养：合成培养基成分：糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等。通常需加入血清、血浆等天然成分。
③温度：适宜温度：哺乳动物多是36.5℃＋0.5℃；pH：7.2～7.4。
④气体环境：95%空气＋5%CO2。O2是细胞代谢所必需的，CO2的主要作用是维持培养液的pH。
（5）动物细胞培养技术的应用：制备病毒疫苗、制备单克隆抗体、检测有毒物质、培养医学研究的各种细胞。
2.动物体细胞核移植技术和克隆动物
例如克隆羊多利：甲羊的乳腺细胞核和乙羊的去核卵细胞重组，转入丙羊子宫发育，丙羊产出多利。
3.动物细胞融合：是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。
（1）动物细胞融合与植物原生质体融合的原理基本相同，诱导动物细胞融合的方法与植物原生质体融合的方法类似，常用的诱导因素有聚乙二醇、灭活的病毒、电刺激等。
（2）动物细胞融合与植物体细胞杂交的比较：
细胞工程 植物体细胞杂交 动物细胞融合
理论基础 细胞的全能性、细胞膜的流动性 细胞增殖、细胞膜的流动性
融合前处理 酶解法去除细胞壁（纤维素酶、果胶酶） 注射特定抗原，免疫处理正常小鼠
诱导手段 物理法:离心、振动、电激化学法：聚乙二醇（PEG） 物理法:离心、振动、电激化学法：聚乙二醇生物法：灭活的病毒（灭活的仙台病毒）
诱导过程 第一步：原生质体的制备（酶解法）第二步：原生质体融合（物、化法）第三步：杂种细胞的筛选和培养第四步：杂种植株的诱导与鉴定 正常小鼠免疫处理动物细胞的融合（物、化、生法）杂交瘤细胞的筛选与培养专一抗体检验阳性细胞培养单克隆抗体的提纯
用途和意义 克服远缘杂交的不亲和障碍，大大扩展杂交的亲本组合范围应用：白菜-甘蓝等杂种植株 制备单克隆抗体诊断、治疗、预防疾病，例如“生物导弹”治疗癌症
4.单克隆抗体
（1）抗体：一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。
（2）单克隆抗体的制备过程：
对免疫小鼠注射特定的抗原蛋白（目的使小鼠产生了效应B细胞）；提取B淋巴细胞；同时用动物细胞培养的方法培养骨髓瘤细胞并提取；促使它们细胞融合[注：融合的结果是有很多不符合要求的；如有2个B淋巴细胞融合的细胞等，所以要进行筛选]；在特定的选择培养基上筛选出融合的杂种细胞[特点是能迅速大量增殖，又能产生专一的抗体]；然后对它进行克隆化培养和抗体检测[筛选出能够分泌所需抗体的杂种细胞]；最后将杂交瘤细胞在体外做大规模培养或注射入小鼠腹腔内增殖，从细胞培养液或小鼠腹水中可得到大量的单克隆抗体。
（3）杂交瘤细胞的特点：既能大量繁殖，又能产生专一的抗体。
（4）单克隆抗体的优点：特异性强，灵敏度高，并能大量制备。
（5）单克隆抗体的作用：作为诊断试剂：准确识别各种抗原物质的细微差异，并跟一定抗原发生特异性结合，具有准确、高效、简易、快速的优点。用于治疗疾病和运载药物：主要用于治疗癌症治疗，可制成“生物导弹”，也有少量用于治疗其它疾病。
内容 要求
生态工程的原理 Ⅰ
生态工程的原理
1．生态工程建设的目的：遵循自然界物质循环的规律,充分发挥资源的生产潜力,防止环境污染,达到经济效益和生态效益的同步发展。
2.基本原理：
物质循环再生原理[如无废弃物农业]；物种多样性原理[提高生态系统的抵抗力稳定性]；协调与平衡原理[处理生物与环境的协调与平衡，考虑环境容纳量]；整体性原理[考虑自然系统、经济系统和社会系统的统一]；系统性和工程学原理[系统的结构决定功能原理：考虑系统内部不同组分之间的结构，通过改变和优化结构，达到改善系统功能的目的；系统整体性原理：实现总体功能大于各部分之和的效果]
②
植物细胞A
植物细胞B
杂种细胞
愈伤组织
杂种植株
①
③
④
⑤
图（2）

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