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【基础梳理】
一、凝胶色谱法
1、概念：也称做 ；是根据 分离蛋白质的有效方法。
2、原理
当 不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量 的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程 ，移动速度 ，而相对分子质量 的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在 移动，路程 ，移动速度 ，从而使 不同的蛋白质分子得以分离。
二、缓冲溶液
1、作用：在一定范围内，抵制 的 对溶液pH的影响，维持pH 。
2、配制：由 种缓冲剂溶解于 中配制而成，通过调节缓冲剂的 就可以得到不同pH范围内使用的缓冲液。
三、电泳
1、概念：指 在电场的作用下发生 的过程。
2、原理：在一定的 下， 、 等生物大分子的可解离基团会带上 或 ，在 的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷 的电极移动。
3、作用：电泳利用了待分离样品中各种分子 的差异及分子本身的 、 的不同，使带电分子产生不同的 ，从而实现样品中 的分离。 4、方法：常用的电泳方法有 和 。测定蛋白质分子量时通常使用 。
四、实验操作
1、样品处理:通过 、 、 等操作收集血红蛋白溶液。
(1)红细胞的洗涤：目的是 。分离时采取 ，直至上清液中没有 ，表明红细胞已洗涤干净。
(2)血红蛋白的释放：在 和 的作用下，红细胞破裂，释放出血红蛋白。
(3)分离血红蛋白溶液：把 离心后，将试管中的液体用 过滤、除去 ，于 中静置片刻后，分离出下层的 。离心管自上而下的物质分别为
2、粗分离：即透析
(1)方法：将血红蛋白溶液装入 ，将 放入一定量适宜浓度的 中，透析
(2)目的：将 的杂质除去。
(3)原理：透析袋能使小分子自由进出，而将大分子物质保留在袋内。
3、纯化:通过凝胶色谱柱将相对分子质量较大的杂质蛋白除去。操作如下：
(1)凝胶色谱柱的制作。
(2)凝胶色谱柱的装填
①材料：本实验使用的是 。
②方法：凝胶用 充分溶胀后。配成 ，一次性 倒人色谱柱内。不能有 存在，否则就要 。
(3)样品的加入和洗脱
①a、准备：加样前，打开流出口，使柱内凝胶面上的 缓慢下降到与 平齐，关闭出口。
b、加样：用 小心地将1mL透析后的样品加到 的顶端，注意不要破坏 。
c、加样后：打开下端出口，使样品渗入 内。
②洗脱：加入 ，打开下端出口，进行 。
4、纯度鉴定：在鉴定的方法中，使用最多的是 。
3、凝胶色谱柱的装填：在装填凝胶柱时，不得有气泡存在。气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的 ，降低 。
4、蛋白质的分离：如果红色区带 地移动，说明色谱柱制作成功。
练习：
1.已知某样品中存在甲、乙、丙、丁、戊五种物质，其分子大小、电荷的性质和数量
情况如下图所示。下列叙述正确的是 (　　)
A.将样品放入透析袋中透析12 h，若分子乙保留在袋内，则分子甲也保留在袋内
B.若五种物质为蛋白质，则用凝胶色谱柱分离时，甲的移动速度最快
C.将样品以2 000 r/min的速度离心10 min，若分子戊存在于沉淀中，则分子丙也存在于沉淀中
D.若五种物质为蛋白质，用SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳分离样品中的蛋白质分子，
则分子甲和分子戊形成的电泳带相距最近
2.某同学使用下列装置或操作进行血红蛋白的提取与分离实验，请据图回答问题：
甲 乙
（1）甲、乙用于提取和分离血红蛋白，先对样品进行处理要用图 装置进行 ；乙图底端试管中首先收集到的是相对分子质量较 (大／小)的蛋白质，原因是
（2）如果用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳处理乙实验中获得的蛋白质，蛋白质迁移的取决于 。
（3）分子量测定：化学物质SDS能使蛋白质变性，解聚成单条肽链。在聚丙烯酰胺凝胶电泳中加入一定量的SDS，电泳迁移率完全取决于肽链的分子大小。右图为本实验中用SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血浆某白蛋白的结果。根据电泳结果，某同学得出“提取的血浆某白蛋白有两条肽链”的结论，这种说法可靠吗？理由是 。
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