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二 微生物的选择培养与计数教案
【教学目标】
课程标准与本节相对应的要求是：举例说明通过调整培养基的配方可有目的地培养某种微生物；概述平板划线法和实习涂布平板法是实验室中进行微生物分离和纯化的常用方法；概述稀释涂布平板法和显微镜计数法是测定微生物数量的常用方法。据此，结合教材内容，确定本节教学目标：
1.能运用生物与环境相适应的观点，解释选择培养基筛选微生物的原理
2.能按照科学探究的要求，应用稀释涂布平板法和微生物数量测定的方法，设计从土壤中分离分解尿素的细菌，并进行计数的方案
3.依据设计的方案，运用无菌操作技术和微生物分离、培养的方法初步分离出目标菌
4.尝试解决生产、生活中与微生物选择培养、计数等有关的实际问题
【教学重难点】
1、教学重点
（1）微生物选择培养的原理
（2）土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
2、教学难点
（1）土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
【新课导入】
生物界中微生物数量繁多，种类庞杂，要想从中分离出需要的特定微生物并不容易，尤其当要分离的微生物在混合的菌群中不是优势种群时，仅通过一般的平板划线法或稀释涂布平板法很难实现，该怎么办呢？
【新课讲解】
选择培养基
寻找耐高温的DNA聚合酶
1973年，科学家从美国黄石国家公园的热泉中筛选出水生栖热菌，进而从这种菌中提取出耐高温的DNA聚合酶。
聚合酶链式反应（PCR）是一种在体外扩增DNA片段的技术，此项技术要求使用耐高温的DNA聚合酶。
筛选原因：水生栖热菌能在70-80℃高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。
1.实验室中微生物筛选的原理
人为提供有利于目的菌生长的条件（包括营养、温度和PH等），同时抑制或阻止其他微生物的生长。
2.选择培养基的概念
在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基称为选择培养基。
3.选择培养基的类型（见课件）
{思考·讨论}选择培养基配方的设计
尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化学性质稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素施入土壤后，会被土壤中的某些细菌分解成NH3，再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。而这些细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，脲酶催化尿素分解产生NH3，NH3可以作为细菌生长的氮源。
讨论：
1.如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？
提示：设计一种选择培养基,尿素作为唯一氮源。
2.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？
提示：区别：只是用尿素作为唯一氮源，培养基的其他营养成分基本相同。
微生物的选择培养
1．分解尿素的细菌的分离
分解尿素的细菌能合成脲酶，该酶能催化尿素分解产生NH3，以此作为细菌生长的氮源。要将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方设计思路是培养基中除含有细菌必需的碳源、水、无机盐外，只含有尿素一种氮源。
2．稀释涂布平板法分离分解尿素的细菌
土壤中细菌的数量庞大，要想得到能分解尿素的细菌的纯培养物，必须要对土样进行充分稀释，然后再将菌液涂布到制备好的选择培养基上，操作过程如下：
采集土样→将10 g土样加入盛有90 mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。取1 mL上清液加入盛有9 mL无菌水的试管中，依次等比稀释→取0.1 mL菌液，滴加到培养基表面→将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中→将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布→用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀→涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30～37 ℃的恒温箱中培养1～2 d。
播放土壤中分解尿素的分离与计数视频回答相关问题
展示稀释涂布平板法过程和结果的图解，提出“如何进行微生物的计数？”
用稀释涂布平板法计数微生物的方法
(1)稀释涂布平板操作要求：按照平行重复原则，每一稀释度的菌液涂布3个或3个以上的平板。
(2)计数的时机：当各平板上菌落数目稳定时进行计数。
(3)选择可用于计数的平板：选择菌落数在30～300的平板(相同稀释度的平板均符合该特点)进行计数，然后取平均值。
(4)每克样品中的菌株数＝某一稀释度下平板上生长的平均菌落数÷涂布平板时所用的稀释液的体积×稀释倍数。
是否还有其他微生物的数量测定方法？
微生物的数量测定
①稀释涂布平板法——间接计数法
②显微镜直接计数法——直接计数法
方法1：稀释涂布平板法
原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过计数平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
要求:
①选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证 获得菌落数为30-300、适于计数的平板。
②同一稀释度至少对3个平板进行重复计数，然后求平均值；
缺点: 统计的菌落数往往比活菌的实际数目少
原因：当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计的结果一般用菌落数而不是活菌数表示。
如何从平板上的菌落数推测出每克（每ml）样品中的菌落数？
统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计3个平板，计算出平板菌落数的平均值，然后按公式进行计算。
每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M
C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。
方法2：显微镜直接计数法
血细胞计数板：常用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数
细菌计数板：对细菌等较小的细胞进行观察和计数；
优点：快速、直观
缺点：
①不能区分死菌和活菌→偏大
②不适于对运动细菌的计数。
③个体小的细菌在显微镜下难以观察。
{探究 实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数}
提出问题
（1）如何从土壤中分离出能够分解尿素的细菌；
（2）统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌。
基础知识
绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，利用以尿素作为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。
实验过程
（1）土壤取样
①取样地点要求：细菌适宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长。
②取样过程：铲去表层土（一般3cm左右）。细菌绝大部分分布在距地表3～8cm的土壤层。
③注意事项：取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。操作完成后一定要洗手。
（2）制备培养基
①选择培养基：以尿素为唯一氮源。
②牛肉膏蛋白胨培养基：作为对照组，来判断选择培养基是否具有选择作用。
③KH2PO4和Na2HPO4的作用是：提供无机盐；调节pH。
（3）样品的稀释与涂布平板
测细菌时，一般选用1×104、1×105、×106倍稀释的稀释液进行平板培养。
在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，应选择一个比较宽的范围，将1×103～1×107倍稀释的稀释液分别涂布到平板上培养，以保证能从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数。
注意：
①每个浓度至少设置4个平板，1、2、3平板是选择培养基（实验组，三个重复），4为牛肉膏蛋白胨培养基（用以判断选择培养基是否具有选择作用）。
②如何验证培养基中是否含有杂菌？
设置2个平板作为对照：不涂布稀释液的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基。
（4）微生物的培养与观察
①培养条件：不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。（细菌一般在30-37℃的温度下培养1-2d）
②观察：每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。（一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等）
操作提示
1.将涂布器从酒精中取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧。不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。
2.要按照前面学习过的无菌操作的方法，进行规范操作。取土样时用的铁铲和取样纸袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。
3.本实验使用的平板和试管较多，为了避免混淆，最好在使用前做好标记。例如，在标记培养皿时应该注明组别、培养日期和平板上培养样品的稀释度等。
4.本实验耗时较长，需要事先规划时间，以便提高实验效率，在操作时有条不紊。
结果分析与评价
1.结合对照组，分析培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出一些菌落。
提示：如果没有接种的培养基上没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。如果接种后的完全培养基上的菌落数明显多于选择培养基上的菌落数，说明选择培养基筛选出了一些尿素分解菌。
2.你是否获得了某一稀释度下菌落数为30-300的平板？在这一稀释度下，是否至少有2个平板的菌落数接近？
提示：如果得到了两个或多个菌落数为30～300的平板，说明稀释度合适，操作比较成功，能够进行菌落的计数。
3.你统计的每克土样中能分解尿素的细菌的菌落数是多少？与其他同学统计的结果接近吗？如果差异很大,可能是什么原因引起的？
提示：如果是用同一土样进行的操作，数据应该比较接近。如果差异很大，就需要从操作是否规范、培养基配制是否合理等方面查找原因。
进一步探究
本活动只是初步筛选了能分解尿素的细菌,对分离的菌种进行鉴定还需要借助生物化学的方法。你可以查阅相关资料,进一步设计实验来鉴定自己分离的菌种。
方法：在培养基中加入酚红指示剂——鉴别培养基
①液体培养基可以直接看液体的变色情况；
②固体培养基上可以观察菌落周围是否出现红色环带。
【板书】
微生物的选择培养与计数
1.选择培养基：概念
2.微生物的选择培养
分解尿素的细菌的分离
3.微生物的数量测定
稀释涂布平板法、显微镜直接计数法

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