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实验八 叶绿体中色素的提取和分离
一．实验原理：
色素提取原理：
利用相似相溶原理，色素可以溶解于酒精、丙酮等有机溶剂中，形成色素液。
色素分离原理：
由于四种色素在层析液的溶解度不同，因而四种色素在滤纸上的扩散速度也不同，从而将它们分离开来。
二．实验材料：
新鲜的绿色叶片、干燥的定性滤纸、烧杯、研砵、玻璃漏斗、尼龙布、毛细吸管、剪刀、小试管、培养皿盖、药勺、量筒、天平。
药品：丙酮、层析液、二氧化硅、碳酸钙。
三．实验过程：
（一）。制备色素滤液：
1．取叶：
称取5克新鲜的绿色植物叶片，然后剪碎，放入研砵中；
2。研磨：
A．研砵中分别加入以下物质：
二氧化硅：为了使研磨充分；
碳 酸钙：保护色素免受破坏；
丙 酮：作为色素的溶剂。
思考题：
研磨时要使叶绿素能够提取出来，要破坏多少层膜？
提示：应该是3层，一层细胞膜，两层叶绿体膜。
碳酸钙保护色素的原理是什么？
因为叶绿素极易分解，在研磨过程中，细胞结构被破坏，细胞液中的有机酸释放出来，很容易破坏叶绿素分子，为了缓冲研磨液中的PH值一，可以加入碳酸钙，来中和释放出来的有机酸，从而避免了叶绿素被破坏。
B．充分迅速地研磨；
充分是为了彻底破坏细胞结构，迅速是为了防止丙酮挥发；
防止挥发采取的措施：
在研砵上加一个中间有洞的纸，把玻璃棒插在中间研磨可以减少挥发。
3．取滤液：
在一支试管上插入一个小漏斗，中间用脱脂棉或者尼龙布作为过滤用，迅速倒入研磨滤液，进行过滤，然后在试管口用棉花塞紧。
思考题：
为什么要迅速倒入？为什么要用棉花塞紧试管管口？
同样为了防止丙酮挥发；
同时由于色素极容易被光和空气所破坏，所以要避光和隔绝空气保存。
（二）制备滤纸条：
1。干燥处理过的定性滤纸；
为何干燥处理？
有利于层析液在滤纸上的扩散；
2．规格：
6㎝×1㎝
3．处理：
在滤纸的一端，剪去两角，大约距1㎝处，角度约45°；
剪角的目的是什么？
因为在靠近两侧的层析液扩散的速度比较快，剪去两角后，扩大了两侧层析液扩散的距离，可以调整层析液扩散处于同一平面。
(4). 距1㎝处用铅笔画一条细线；
作为将来画滤液细线的标记；
不能用有机墨水笔来画，因为墨水会溶解于层析液中，而且有机墨水也会在滤纸上扩散。
（三）画滤液细线：
用毛细吸管吸取色素滤液，沿铅笔细线处画滤液细线；
用力要均匀，细线要细、齐、直；
因为如果不细、齐，将来层析时会导致色素带的重叠；
待滤液干后，再重复画二到三次；
是为了增加滤液细线上色素的量，实验效果明显。
（四）纸层析：
1。层析液的量：
大约是3ml，
原则：烧杯中层析液的深度不得超过滤纸条上的滤液细线；
2．插入滤纸条：
有滤液细线的一端朝下，略微斜靠着烧杯内壁，轻轻地插入层析液中。
注意：
不能让滤纸条上的滤液细线触及到层析液;
因为，色素同样可以溶解到层析液中；
用培养皿盖盖住烧杯口；
为了防止层析液中的丙酮、苯等有毒物质挥发出来。
使烧杯中的层析液蒸气处于饱和状态，有利于层析液的扩散。
（五）观察结果：
一般是从上到下来进行观察比较色素带，主要从以下几个方面，颜色、溶解度、分子式、扩散速度、含量等。
名 称 胡萝卜素 叶黄素 叶 绿 素a 叶 绿 素b
颜 色 橙黄色 黄色 蓝绿色 黄绿色
溶 解 度 最大 较大 大 较小
分 子 式 C40H56 C40H56O2 C55H72O5N4Mg C55H72O6N4Mg
含 量 最少 较少 最多 多
相邻间距离 叶黄素———— 叶绿素a ———— 叶绿素b 最大 最小
分 子 量 最小 最大
扩 散速度 最快 最慢
（六）．叶色变化：
正常绿色：
正常绿叶中的叶绿素和类胡萝卜素的分子之比是3：1，所以正常叶片的颜色呈现绿色；
叶色变黄：
寒冷时，叶绿素分子易被破坏，类胡萝卜素分子较为稳定，呈现出类胡萝卜素分子的颜色，呈现黄色；
叶色变红：
秋天降温时，植物体为适应寒冷，体内积累了较多的可溶性糖，有利于形成红色的花青素，而叶绿素因气温低逐渐分解，叶子呈现红色。

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