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第55课时　基因工程的基本工具和基本操作程序
1．概述基因工程是在遗传学、微生物学、生物化学和分子生物学等学科基础上发展而来的。2.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。3.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定等步骤。4.活动：DNA的粗提取与鉴定。5.活动：利用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段并完成电泳鉴定或运用软件进行虚拟PCR实验。
考点一　重组DNA技术的基本工具
1．基因工程的概念
2．基因工程的基本工具
(1)限制性内切核酸酶（限制酶）
①限制酶的识别序列一般由6个核苷酸组成，少数由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。
②限制酶作用的化学键只能是磷酸二酯键。
③在切割含目的基因的DNA分子时，需用限制酶切割两次此DNA分子，产生4个末端。只有这样才能使目的基因的两端都有可连接的黏性末端或平末端。
(2)DNA连接酶
①DNA连接酶连接的是两个DNA片段，而DNA聚合酶是把单个的脱氧核苷酸连接到已有的DNA片段上。
②DNA聚合酶起作用时需要以一条DNA链为模板，而DNA连接酶不需要模板。
(3)载体
(1)通过基因工程技术能够定向改造生物的遗传性状。(　√　)
(2)E.coli DNA连接酶只能连接黏性末端。(　×　)
(3)DNA连接酶具有特异性，只能连接同一种限制性内切核酸酶切割形成的黏性末端。(　×　)
(4)若两种限制酶的识别序列相同，则形成的末端一定能通过DNA连接酶相互连接。(　×　)
(5)限制性内切核酸酶识别序列越短，则该序列在DNA中出现的概率就越大。(　√　)
(6)载体质粒上常有特殊的标记基因，以便于重组DNA分子的筛选。(　√　)
(7)载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选的标记基因。(　×　)
(8)（选择性必修3 P72正文）天然的DNA分子不能直接用作基因工程载体的原因有哪些？
提示：天然的DNA分子一般不完全具备作为载体的全部条件，需要进行人工改造后才能用于基因工程操作。
考向　围绕重组DNA技术的基本工具考查科学,思维))
1．（2025·福建厦门模拟）BamH Ⅰ、Mbo Ⅰ、Sma Ⅰ三种限制酶的识别序列和切割位点依次为5′－G↓GATCC－3′、5′－↓GATC－3′、5′－CCC↓GGG－3′。如图表示某DNA片段的部分碱基序列，已知其余序列不含这三种限制酶的识别序列。下列叙述正确的是(　C　)
A．若用Sma Ⅰ完全切割该DNA，则其产物的长度为634 bp、896 bp、758 bp
B．若虚线方框内的碱基对被T—A替换，则用SmaⅠ完全切割该DNA可产生3种片段
C．若用Mbo Ⅰ和BamH Ⅰ切割该DNA，可形成相同的黏性末端
D．用Sma Ⅰ切割该DNA产生的片段，用E.coli DNA连接酶重新将其连接效率较高
解析：Sma Ⅰ的识别序列为5′ CCC↓GGG 3′，则用Sma Ⅰ完全切割该DNA会产生三个片段，即637 bp、890 bp、761 bp，A错误；若虚线方框内的碱基对被T—A替换，则用Sma Ⅰ完全切割该DNA可产生2种片段，B错误；BamH Ⅰ、Mbo Ⅰ识别的序列分别为5′ G↓GATCC 3′、5′ ↓GATC 3′，则二者切割该DNA，可形成相同的黏性末端，C正确；用Sma Ⅰ切割该DNA产生的片段为平末端，用E.coli DNA连接酶连接效率低，D错误。
2．（2024·江西卷）γ 氨基丁酸在医药等领域有重要的应用价值。利用L 谷氨酸脱羧酶(GadB)催化L 谷氨酸脱羧是高效生产γ 氨基丁酸的重要途径之一。研究人员采用如图方法将酿酒酵母S的L 谷氨酸脱羧酶基因(gadB)导入生产菌株E.coli A构建了以L 谷氨酸钠为底物高效生产γ 氨基丁酸的菌株E.coli B。下列叙述正确的是(　D　)
A．上图表明，可以从酿酒酵母S中分离得到大量目的基因gadB
B．E.coli B发酵生产γ 氨基丁酸时，L 谷氨酸钠的作用是供能
C．E.coli A和E.coli B都能高效降解γ 氨基丁酸
D．可以用其他酶替代Nco Ⅰ和Kpn Ⅰ构建重组质粒
解析：从酿酒酵母S中分离得到含有目的基因gadB序列的染色体DNA，如题图所示，若要获取大量目的基因，需要进行PCR和酶切，A错误；题意显示，用L 谷氨酸脱羧酶(GadB)催化L 谷氨酸脱羧是高效生产γ 氨基丁酸的重要途径之一，E.coliB中能表达L 谷氨酸脱羧酶(GadB)，因此可用E.coliB发酵生产γ 氨基丁酸，该过程中L 谷氨酸钠的作用不是供能，B错误；E.coliA中没有L 谷氨酸脱羧酶(GadB)，因而不能使L 谷氨酸钠脱羧，而E.coliB中含有该酶的基因，因而能使L 谷氨酸钠脱羧，高效生产γ 氨基丁酸，C错误；除了Nco Ⅰ和Kpn Ⅰ外，还有其他的限制酶可选，此外，构建重组质粒也未必非要用这两种酶，而是可以用同尾酶替代，D正确。
与DNA有关的酶的比较
名称 作用部位 作用底物 作用结果
限制酶 磷酸二酯键 DNA 将DNA切成两个或多个片段
DNA连接酶 磷酸二酯键 DNA片段 将两个DNA片段连接为一个DNA分子
DNA聚合酶或热稳定DNA聚合酶 磷酸二酯键 脱氧核苷酸 以DNA单链为模板，将单个脱氧核苷酸依次连接到DNA单链末端
DNA（水解）酶 磷酸二酯键 DNA 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
解旋酶 碱基对之间的氢键 DNA 将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链
RNA聚合酶 磷酸二酯键 核糖核 苷酸 将单个核糖核苷酸依次连接到RNA单链末端
考点二　基因工程的基本操作程序
1．目的基因的筛选与获取
(1)目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。
(2)筛选合适的目的基因
①从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。
②利用序列数据库和序列比对工具进行筛选。
(3)目的基因的获取
①人工合成目的基因。
②常用PCR特异性地快速扩增目的基因。
①在PCR过程中实际加入的为dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP），既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。
②引物是一小段单链的DNA或RNA，作为新子链的合成起点，只能结合在母链的3′端，使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。
2．基因表达载体的构建——基因工程的核心
(1)目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。
(2)基因表达载体的组成及作用
启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比
项目 启动子 终止子 起始 密码子 终止 密码子
本质 DNA DNA mRNA mRNA
位置 目的基因上游 目的基因下游 mRNA首端 mRNA尾端
功能 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA 使转录在所需要的地方停下来 翻译的起始信号（编码氨基酸） 翻译的结束信号（正常情况下， 不编码氨基酸）
(3)构建过程
3．将目的基因导入受体细胞
受体细胞 导入方法 内容
植物细胞 花粉管 通道法 ①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中； ②植物受粉后，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊
农杆菌 转化法 农杆菌细胞内的Ti质粒上的T DNA可携带目的基因整合到受体细胞的染色体DNA上
动物细胞 显微注射 技术 常用受体细胞：受精卵
原核细胞 Ca2+处 理法 用Ca2+处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态
①农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T DNA上，第二次拼接（非人工操作）是指插入目的基因的T DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上；第一次导入是导入农杆菌，第二次导入（非人工操作）是将含目的基因的T DNA导入受体细胞。
②导入的目的基因可能存在于细胞质中，也可能整合到染色体DNA上。存在于染色体DNA上的目的基因有可能通过花粉传播进入杂草或其他作物中，造成“基因污染”。
4．目的基因的检测与鉴定
(1)目的基因就是指编码蛋白质的基因。(　×　)
(2)DNA片段的PCR扩增实验中反应缓冲液中的Mg2+能够激活耐高温的DNA聚合酶。(　√　)
(3)一个基因表达载体一般包括目的基因、标记基因、起始密码子和终止密码子等结构。(　×　)
(4)培育抗虫棉时，将抗虫基因插入农杆菌Ti质粒的T DNA片段内。(　√　)
(5)若受体细胞为大肠杆菌，则需先用Ca2+处理，更利于实现转化。(　√　)
(6)若能在植物细胞中检测到相应的目的基因，则说明基因工程项目获得成功。(　×　)
(7)检测转基因抗虫棉是否具有抗虫性状时，选择转基因棉花与普通棉花分别接种等量棉铃虫进行比较。(　√　)
(8)用PCR不能直接扩增mRNA的原因是PCR是用DNA双链作模板的，不能直接用单链RNA做PCR，必须把mRNA逆转录成单链cDNA之后再做PCR。
(9)（选择性必修3 P81“资料卡”）农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，为什么能将目的基因导入受体细胞并整合到染色体DNA上？
提示：农杆菌能将Ti质粒上的T DNA转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。
【情境应用】如图是PCR反应过程示意图。
【问题探究】
(1)PCR技术需要引物的理由是DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3′端延伸DNA链。
(2)利用PCR技术扩增目的基因时需要两种引物，原因是目的基因的两条反向平行的链都作为模板，其碱基序列不同。
(3)设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物（只标注了部分碱基序列）都不合理（如图），请分别说明理由。
①第1组：引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效；
②第2组：引物Ⅰ′自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效。
(4)为检测胚乳细胞中Wx基因是否表达，科研人员提取胚乳中的总RNA，经逆转录过程获得总cDNA，通过PCR技术可在总cDNA中专一性地扩增出Wx基因的cDNA，原因是引物是依据Wx基因的一段已知序列设计合成的（或引物能与Wx基因的cDNA特异性结合）。
(5)若一个DNA分子在PCR中经过n轮循环，理论上需要消耗多少个引物？第n轮循环需要消耗多少个引物？
提示：经过n轮循环需要消耗引物数为(2n+1－2)个，第n轮循环需要消耗的引物数为2n个。
PCR扩增过程中的循环图示与规律
循环次数 1 2 3 n
DNA分子数 2 4 8 2n
含引物A（或B）的DNA分子数 1 3 7 2n－1
同时含引物A、B的DNA分子数 0＝ 21－2 2＝ 22－2 6＝ 23－2 2n－2
共消耗的引物数量 2＝ 21+1－2 6＝ 22+1－2 14＝ 23+1－2 2n+1－2
考向1结合目的基因的筛选与获取考查科学思维
1．（2025·江苏南通模拟）引物的设计是影响PCR扩增反应的效率和特异性的关键因素，相关叙述正确的是(　B　)
A．引物的碱基数量越少，则复性温度越低、目标DNA获得率越高
B．根据需要可在引物的5′端添加限制酶识别序列、点突变序列等
C．两种引物的复性温度差异较大，可减少引物与模板的非特异性结合
D．引物的G—C含量越高，结合特异性越强，越利于目标DNA的扩增
解析：复性温度与时间取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，引物的碱基数量越少，则复性温度越低，但能与引物发生配对的片段就越多，目标DNA获得率越低，A错误；根据需要可在引物的5′端添加限制酶识别序列、点突变序列等，以便更加准确地获得目的基因，B正确；两种引物的复性温度差异较大，导致不能同时复性，甚至一条链在延伸，一条链在复性，可增加引物与模板的非特异性结合，C错误；引物的G—C含量越高，结合特异性越强，但G—C含量过高，不利于复性，从而阻碍目标DNA的扩增，D错误。
2．（2022·辽宁卷）抗虫和耐除草剂玉米双抗12－5是我国自主研发的转基因品种。为给监管转基因生物安全提供依据，采用PCR方法进行目的基因检测，反应程序如图所示。下列叙述正确的是(　B　)
A．预变性过程可促进模板DNA边解旋边复制
B．后延伸过程可使目的基因的扩增更加充分
C．延伸过程无须引物参与即可完成半保留复制
D．转基因品种经检测含有目的基因后即可上市
解析：预变性是使模板DNA充分变性，A错误；后延伸过程是为了使目的基因的扩增更加充分，B正确；延伸过程需引物参与，C错误；转基因品种不仅需要检测是否含有目的基因，还要检测目的基因是否表达以及转基因产品可能存在的安全性问题后才可上市，D错误。
考向2围绕基因工程的基本操作程序考查科学思,维、科学探究))
3．（2023·湖北卷）用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒构建基因表达载体（重组质粒），并转化到受体菌中。下列叙述错误的是(　D　)
A．若用Hind Ⅲ酶切，目的基因转录的产物可能不同
B．若用Pvu Ⅰ酶切，在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因
C．若用Sph Ⅰ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D．若用Sph Ⅰ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）和Tet的培养基中能形成菌落
解析：若用Hind Ⅲ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，转录的产物可能不同，A正确；若用Pvu Ⅰ酶切，重组质粒和质粒中都有四环素抗性基因(TetR)，因此在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因，B正确；重组质粒的大小与质粒不同，DNA凝胶电泳技术可以分离不同大小的DNA片段，能够鉴定重组质粒构建成功与否，C正确；Sph Ⅰ的酶切位点位于四环素抗性基因中，若用Sph Ⅰ酶切，重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因(AmpR)，但四环素抗性基因(TetR)被破坏，因此携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）的培养基中能形成菌落，在含Tet的培养基中不能形成菌落，D错误。
限制酶的选择技巧
1．根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类
(1)应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图1可选择PstⅠ。
(2)不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图1不能选择SmaⅠ。
(3)为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图1也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶（但要确保质粒上也有这两种酶的切点或切割后有与之相同的末端）。
2．根据质粒的特点确定限制酶的种类
4．（2024·重庆卷）大豆是重要的粮油作物，提高大豆产量是我国农业领域的重要任务。我国研究人员发现，基因S在大豆品种DN（种子较大）中的表达量高于品种TL（种子较小），然后克隆了该基因（两品种中基因S序列无差异）及其上游的启动子序列，并开展相关研究。
　箭头表示酶的切割位置。
(1)基因S启动子的基本组成单位是脱氧核糖核苷酸（脱氧核苷酸）。
(2)通过基因工程方法，将DN克隆的“启动子D＋基因S”序列导入无基因S的优质大豆品种YZ。根据如图所示信息（不考虑未标明序列）判断构建重组表达载体时，为保证目标序列的完整性，不宜使用的限制酶是EcoRⅠ；此外，不宜同时选用酶Spe Ⅰ和Xba Ⅰ。原因是酶切后形成的片段黏性末端相同，易自我环化；不能保证目标片段与载体定向连接。
(3)为验证“启动子D＋基因S”是否连接在表达载体上，可用限制酶对重组表达载体酶切后进行电泳。电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有酶切后的空载体片段、启动子D＋基因S片段。经验证的重组表达载体需转入农杆菌，检测转入是否成功的技术是PCR。
(4)用检测后的农杆菌转化品种YZ所得再生植株YZ 1的种子变大。同时将从TL克隆的“启动子T＋基因S”序列成功导入YZ，所得再生植株YZ 2的种子也变大，但小于YZ 1。综合分析，大豆品种DN较TL种子大的原因是品种DN的基因S上游启动子效应比TL强，使得基因S表达量更高，种子更大。
解析：(1)启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，用于启动DNA的转录，是一段DNA片段，其基本组成单位是四种脱氧核糖核苷酸。(2)根据图示信息可知，“启动子D＋基因S”的DNA序列上存在EcoRⅠ的识别序列，若使用限制酶EcoRⅠ，会使目的基因序列被破坏；根据图中限制酶的识别序列及切割位点可知，限制酶Spe Ⅰ和Xba Ⅰ切割产生的黏性末端相同，若用这两种限制酶切割，形成的DNA片段在构建基因表达载体时，容易出现自我环化，以及无法保证目的基因片段与载体片段定向连接，影响目的基因在受体细胞中的表达。(3)DNA电泳可以分离不同大小的DNA片段，用限制酶对重组表达载体酶切后的产物不仅有启动子D＋基因S片段，还有酶切后的空载体片段，因此电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有酶切后的空载体片段和启动子D＋基因S片段；在分子水平上检测目的基因是否转入成功可通过PCR等技术检测受体细胞的DNA上是否插入目的基因或目的基因是否转录出mRNA。(4)根据题目信息可知，再生植株YZ 1导入的目的基因为取自品种DN的“启动子D＋基因S”序列，再生植株YZ 2导入的目的基因为取自品种TL的“启动子T＋基因S”序列，结合题干信息“两品种中基因S序列无差异”可推测：品种DN的基因S上游的启动子D的效应强于品种TL的启动子T，启动子D使基因S表达量更高，因而种子更大。
如何筛选出含有目的基因的受体细胞
1．原理：将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时，如果目的基因插入某种抗生素抗性基因内部，则会导致该抗生素抗性基因失活。如图，目的基因插入了四环素抗性基因内部，则四环素抗性基因失活。
2．被转化的细菌有三种：含目的基因的细菌、含重组质粒的细菌、含质粒的细菌。
3．筛选方法：将细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养，能生长的是含重组质粒的细菌和含质粒的细菌，如图中1、2、3、4、5菌落，再利用灭菌的绒布影印到含有四环素的培养基上，如图能生长的菌落为2、3、4，则在含四环素培养基上不生长的即含有重组质粒的菌落，如图中1、5菌落。最后，可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。
考点三　DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定
1．DNA的粗提取与鉴定
(1)实验原理
(2)实验步骤
①加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成丝状物。
②本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核（无DNA）。可选用鸡血细胞作为材料。
2．DNA片段的扩增及电泳鉴定
(1)实验基础
(2)PCR实验操作步骤
(3)DNA的电泳鉴定
(1)粗提取的DNA溶于2 mol/L NaCl溶液中，加入二苯胺试剂后显蓝色。(　×　)
(2)DNA的粗提取与鉴定实验中可利用DNA在酒精中溶解度较大的特点来提取DNA。(　×　)
(3)在提取白色丝状物时单向搅拌比双向搅拌更有利于获得结构完整的DNA。(　√　)
(4)电泳鉴定DNA利用了DNA在电场中会向着与它所带电荷相同的电极移动的原理。(　×　)
(5)电泳鉴定时，在带电量相同的情况下，相对分子质量越大的DNA片段距离加样孔越远。(　×　)
(6)PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定，在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。(　√　)
(7)（选择性必修3 P74“探究·实践”）DNA的粗提取实验中，过滤研磨液时能否用滤纸代替纱布？
提示：不能，因为DNA会被吸附到滤纸上而大量损失，影响最终提取的DNA量。
考向1 围绕DNA的粗提取与鉴定考查科学思维、科学探究
1．（2022·山东卷）关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是(　B　)
A．过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解
B．离心研磨液是为了加速DNA的沉淀
C．在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色
D．粗提取的DNA中可能含有蛋白质
解析：低温时DNA酶的活性较低，过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解，A正确；离心研磨液是为了使细胞碎片沉淀，B错误；在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色，C正确；细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，有的蛋白质不溶解于酒精，在体积分数为95%的冷酒精中与DNA同时析出，故粗提取的DNA中可能含有蛋白质，D正确。
2．（2024·安徽卷）下列关于“DNA粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是(　D　)
A．实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低
B．利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNA
C．DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA粗提物
D．将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应，可检测溶液中是否含有蛋白质杂质
解析：研磨液有利于DNA的溶解，将其换为蒸馏水后，DNA提取的效率会降低，A正确；DNA不溶于酒精，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精，利用该原理可初步分离DNA，B正确；DNA在NaCl溶液中的溶解度随着NaCl浓度的变化而改变，因此可用不同浓度的NaCl溶液对DNA粗提物进行纯化，C正确；在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺试剂会被染成蓝色，二苯胺试剂可用于鉴定DNA，D错误。
考向2 围绕DNA片段的扩增及电泳鉴定考查科学思维、科学探究
3．（2024·吉林卷）关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验，下列叙述正确的是(　A　)
A．琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小
B．凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置
C．在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快
D．琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来
解析：琼脂糖凝胶的浓度会影响DNA分子在凝胶中的迁移速率等，琼脂糖凝胶的浓度通常是根据所需分离的DNA片段大小来选择的。对于较大的DNA片段，比如基因组DNA或质粒DNA，通常选择较低浓度的琼脂糖凝胶，因为它们需要更大的孔径来有效迁移。而对于较小的DNA片段，比如PCR产物或酶切片段，则需要选择较高浓度的琼脂糖凝胶，以提供更好的分离效果，A正确。凝胶载样缓冲液中指示剂通常是一种颜色较深的染料，可以作为电泳进度的指示分子，当指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳，B错误。在琼脂糖凝胶电泳中，当电场作用时，DNA片段是向正极迁移的，而不是向负极迁移；同时，DNA片段的迁移速率与其大小成反比，即DNA片段越长，迁移速率越慢，C错误。琼脂糖凝胶中的DNA分子需染色后，才可在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来，D错误。
DNA片段的扩增及电泳鉴定
1．PCR中的解旋过程：PCR过程中不需要解旋酶，需要通过升高温度来打开氢键，但此时的温度不会破坏磷酸二酯键，因此，DNA加热变性后变为单链，并未分解成单体。
2．PCR需要两种引物，它们分别是能与两条DNA母链的一段碱基序列互补配对的核酸单链。用于PCR的引物长度通常为20～30个核苷酸，引物自身不能有连续4个碱基的互补序列，两种引物之间不能有连续4个碱基的互补序列。
3．PCR循环之前，常要进行一次预变性，预变性的目的是增加大分子模板DNA彻底变性的概率。
4．判断DNA扩增成功的方法：①可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果。②电泳检测的方法，可以通过在紫外灯下直接观察DNA带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。
1．（2024·山东卷）关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是(　A　)
A．整个提取过程中可以不使用离心机
B．研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中
C．鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变
D．仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰
解析：在DNA的粗提取与鉴定实验中，可以不使用离心机，A正确；研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后，DNA在上清液中，应取上清液倒入烧杯中，B错误；鉴定过程中用沸水浴加热，DNA双螺旋结构会发生改变，C错误；加入二苯胺试剂后，沸水浴处理的时间为5分钟，且要等到冷却后再观察结果，这样才可以观察到较为明显的显色反应，设置一个对照组可以排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰，D错误。
2．（2024·湖南卷）某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时，发现DNA完全没有被酶切，分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是(　B　)
A．限制酶失活，更换新的限制酶
B．酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等
C．质粒DNA突变导致酶识别位点缺失，更换正常质粒DNA
D．酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA甲基化不敏感的限制酶
解析：限制酶失活会使DNA完全不被酶切，此时应更换新的限制酶，A正确；酶切条件不合适通常会使切割效果不好，需调整反应条件如温度和pH等，调整酶的用量没有作用，B错误；质粒DNA突变会导致限制酶识别位点缺失，进而造成限制酶无法进行切割，此时应更换正常质粒DNA，C正确；质粒DNA上酶切位点被甲基化修饰，会导致对DNA甲基化敏感的限制酶无法进行酶切，此时应换用对DNA甲基化不敏感的限制酶，D正确。
3．（2023·新课标卷）某同学拟用限制酶（酶1、酶2、酶3和酶4）、DNA连接酶为工具，将目的基因（两端含相应限制酶的识别序列和切割位点）和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是(　C　)
A．质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coli DNA连接酶连接
B．质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接
C．质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接
D．质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coli DNA连接酶连接
解析：酶3切割后得到的是平末端，用E.coli DNA连接酶连接平末端的效率较低，A错误；质粒用酶3切割后得到的是平末端，目的基因用酶1切割后得到的是黏性末端，二者不能连接，B错误；质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4 DNA连接酶连接后，还能保证目的基因在质粒上的连接方向，此重组表达载体的构建方案最合理且高效，C正确；若用酶2和酶4切割质粒和目的基因，会破坏质粒上的抗生素抗性基因，连接形成的基因表达载体缺少标记基因，无法进行后续的筛选，且酶2和酶4切割后产生相同的黏性末端，目的基因和质粒可能会发生自身环化和反向连接，D错误。
4．（2024·新课标卷）某研究小组将纤维素酶基因(N)插入某种细菌(B1)的基因组中，构建高效降解纤维素的菌株(B2)。该小组在含有N基因的质粒中插入B1基因组的M1与M2片段；再经限制酶切割获得含N基因的片段甲，片段甲两端分别为M1与M2；利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组，得到菌株B2。酶切位点(Ⅰ～Ⅳ)、引物(P1～P4)的结合位置、片段甲替换区如图所示，→表示引物5′→3′方向。回答下列问题：
(1)限制酶切割的化学键是磷酸二酯键。为保证N基因能在菌株B2中表达，在构建片段甲时，应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，原因是不破坏N基因及其启动子和终止子，且能保证N基因可以在菌株B2中正常表达。
(2)CRISPR/Cas9技术可以切割细菌B1基因组中与向导RNA结合的DNA。向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G—C和C—G、A—T、U—A。
(3)用引物P1和P2进行PCR可验证片段甲插入了细菌B1基因组，所用的模板是菌株B2基因组；若用该模板与引物P3和P4进行PCR，实验结果是不能扩增出目的基因。
(4)与秸秆焚烧相比，利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点是不污染环境、增加土壤养分（答出2点即可）。
解析：(1)限制酶切割的化学键为磷酸二酯键。在构建片段甲时，应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，不破坏N基因及其启动子和终止子，且能保证N基因可以在菌株B2中正常表达。(2)RNA的碱基组成有A、U、G、C，DNA的碱基组成为A、T、G、C，向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G—C、C—G、A—T、U—A。(3)用引物P1和P2进行PCR可扩增N基因，验证片段甲插入了细菌B1基因组，所用的模板是菌株B2基因组；用该模板与引物P3和P4进行PCR，因为P4不能与模板链结合，实验结果是不能扩增出目的基因。(4)与秸秆焚烧相比，利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点是不污染环境、增加土壤养分。
课时作业55
（总分：50分）
一、选择题（每小题3分，共30分）
1．（2025·江苏淮安联考）下列有关“DNA的粗提取与鉴定”“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验的叙述中，错误的是(　A　)
A．可将提取到的白色丝状物直接与二苯胺试剂充分混匀，沸水浴加热后变蓝
B．PCR反应体系中需加入耐高温的DNA聚合酶，该酶可在延伸过程中起作用
C．琼脂糖溶液混合的核酸染料与DNA分子结合，便于在紫外灯下观察
D．DNA的粗提取与鉴定实验可利用DNA不溶于酒精而某些蛋白质溶于酒精来粗提DNA
解析：将白色丝状物溶于2 mol/L的NaCl溶液中，然后向试管中加入二苯胺试剂，沸水浴加热5 min，试管冷却后溶液呈现蓝色，A错误；PCR反应体系中需加入耐高温的DNA聚合酶，当温度上升到72 ℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在该酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链，B正确；琼脂糖溶液混合的核酸染料能与DNA分子结合，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来，C正确；DNA的粗提取与鉴定实验中利用DNA不溶于酒精而某些蛋白质溶于酒精的原理，可以初步粗提取DNA，D正确。
2．（2025·辽宁沈阳联考）PCR和琼脂糖凝胶电泳是基因工程中常用的两种技术，下列对其中所用试剂和操作的叙述正确的是(　D　)
A．PCR扩增时加入的各物质中仅有脱氧核苷酸会被消耗
B．在PCR过程中，变性、复性、延伸三个阶段的温度依次降低
C．琼脂糖凝胶电泳需要将DNA和含有指示剂的电泳缓冲液混合后注入加样孔
D．当DNA分子较大时可适当降低凝胶浓度或增大电压以提高电泳速度
解析：在PCR过程中，引物也会被消耗，成为新合成的DNA的一部分，A错误；变性、复性、延伸三个阶段的温度依次为90 ℃以上、50 ℃左右、72 ℃左右，并不是依次降低，B错误；与DNA混合的是含指示剂的凝胶载样缓冲液，不是电泳缓冲液，C错误；电泳过程中，DNA分子移动速度与凝胶浓度、DNA分子大小和构象、电压等有关，故当DNA分子较大时可适当降低凝胶浓度或增大电压以提高电泳速度，D正确。
3．（2025·山西吕梁联考）DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶。下列相关叙述正确的是(　B　)
A．所有的限制酶都具有专一性，不同限制酶切割产生的黏性末端都不同
B．限制酶和DNA连接酶分别能催化磷酸二酯键的断裂和形成
C．限制酶识别序列越短，则相应酶切位点在DNA中出现的概率越小
D．DNA连接酶可以将游离的单个脱氧核苷酸连接成双链结构
解析：所有的限制酶都具有专一性，不同限制酶切割产生的黏性末端可能相同，A错误；限制酶能够识别特定的DNA序列并催化磷酸二酯键的断裂，而DNA连接酶能够催化磷酸二酯键的形成，将DNA片段连接起来，B正确；限制酶识别序列越短，则相应酶切位点在DNA中出现的概率越大，因为短序列在DNA中出现的频率较高，C错误；DNA连接酶的功能是将DNA片段连接起来，而不是将游离的单个脱氧核苷酸连接成双链结构，D错误。
4．（2025·甘肃兰州模拟）胰岛素可用于治疗糖尿病，我国科学家打破国外技术垄断，研发了拥有自主知识产权的重组人胰岛素药物，下列叙述错误的是(　D　)
A．用PCR技术扩增人胰岛素基因时，每次循环包括变性、复性、延伸三步
B．构建人胰岛素基因表达载体时，需使用限制性内切核酸酶和DNA连接酶
C．大肠杆菌细胞经Ca2+处理后，更容易吸收重组的人胰岛素基因表达载体
D．抗原—抗体杂交法不能检测人胰岛素基因表达载体是否导入大肠杆菌细胞
解析：用PCR技术扩增人胰岛素基因时，每次循环一般可以分为变性、复性和延伸三步，A正确。在构建人胰岛素基因表达载体时，首先用限制性内切核酸酶切割含有目的基因的DNA片段和载体，再利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处，这样就形成了一个重组DNA分子，B正确。大肠杆菌细胞经Ca2+处理后，细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，更容易吸收重组的人胰岛素基因表达载体，C正确。抗原—抗体杂交法可以检测人胰岛素基因是否在大肠杆菌中翻译成胰岛素，若抗原—抗体杂交结果为阳性，说明人胰岛素基因在大肠杆菌中表达，则可以说明人胰岛素基因表达载体导入了大肠杆菌细胞中，D错误。
5．（2024·四川成都一模）某环状DNA分别用限制酶1和限制酶2完全切割后进行扩增产物的琼脂糖凝胶电泳，结果如图所示（注：kb表示千碱基对数，M代表标准对照）。下列叙述错误的是(　A　)
A．该DNA总长度不可能为14 kb
B．该DNA上至少有2个酶1的切割位点
C．该DNA上至少有1个酶2的切割位点
D．同时用酶1和酶2切割该DNA，电泳结果至少呈现2个条带
解析：限制酶2切割后有7 kb这一种条带，若限制酶2切割后有两条7 kb条带，则DNA总长度可能为14 kb，A错误；该DNA是环状DNA，经限制酶1切割后产生了两种条带，说明至少有2个酶1切割位点，B正确；该环状DNA总长度最少为7 kb，限制酶2切割后有7 kb这一种条带，则该DNA上至少有1个酶2的切割位点，C正确；限制酶1切割后产生了6 kb和1 kb两种条带，若酶2切割酶1作用产生的6 kb片段，产生1 kb和5 kb的片段，则切割产物电泳后出现2个条带，D正确。
6．（2025·河北邢台模拟）PCR引物的3′端为结合模板DNA的关键碱基，5′端无严格限制，可用于添加限制酶切点等序列。据图分析，下列叙述正确的是(　A　)
A．PCR第5轮循环消耗了16对引物
B．脱氧核苷酸作为扩增的原料会依次连接到5′端
C．PCR反应体系中需要加入脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶、Ca2+等
D．用图中引物扩增至少4轮循环后才能获得两端均添加限制酶切点的目的产物
解析：PCR第5轮循环消耗了25-1＝16对引物，A正确；进行PCR时，子链从引物的3′端延伸，因此脱氧核苷酸作为扩增的原料会依次连接到3′端，B错误；PCR反应体系中需要加入脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶和扩增缓冲液（含Mg2+）等物质，不需要添加Ca2+，C错误；用题图引物扩增至少3轮循环才能获得两端均添加限制酶切点的目的产物，D错误。
7．（2025·江西南昌模拟）限制酶是基因工程中必需的工具之一，下表表示五种限制酶的识别序列及切割位点。下列关于限制酶的叙述，错误的是(　C　)
限制酶 EcoR Ⅰ BamH Ⅰ Sau3A Ⅰ
识别位点
限制酶 Mfe Ⅰ EcoR Ⅴ —
识别位点 —
A.EcoR Ⅰ和EcoR Ⅴ切割DNA片段产生的末端分别为黏性末端和平末端
B．EcoR Ⅰ和Mfe Ⅰ切割产生的DNA片段能被E.coli DNA连接酶连接在一起
C．BamH Ⅰ和Sau3A Ⅰ切割产生的DNA片段，连接后一定能被BamH Ⅰ切割
D．以上五种限制酶均能识别双链DNA的特定序列，并切开特定部位的磷酸二酯键
解析：根据表中酶切位点，EcoR Ⅰ和EcoR Ⅴ切割DNA片段产生的末端分别为黏性末端和平末端，A正确；根据表格中EcoR Ⅰ和Mfe Ⅰ的识别序列和切割位点可知，EcoR Ⅰ和Mfe Ⅰ切割产生的DNA片段能被E.coli DNA连接酶连接在一起，B正确；BamH Ⅰ和Sau3A Ⅰ切割后产生的黏性末端是相同的，因此二者切割后产生的黏性末端能够相连，连接后仍然存在GATC的序列，能被Sau3A Ⅰ切割，但是BamH Ⅰ不一定能切割，C错误；限制酶具有专一性，题中五种限制酶均能识别双链DNA的特定序列，并切开特定部位的磷酸二酯键，D正确。
8．（2025·广东揭阳联考）利用PCR获得目的基因后，用限制酶EcoR Ⅰ同时处理目的基因与质粒，拼接后可得到重组基因表达载体，其部分DNA片段如下图所示。下列有关引物的分析正确的是(　A　)
A．可通过PCR技术获取大量目的基因
B．检测目的基因是否插入质粒且方向是否正确时，应选用引物1和引物4进行PCR
C．若设计的引物与模板不完全配对，可适当提高PCR复性的温度
D.DNA聚合酶能与引物结合，并从引物的5′端连接脱氧核苷酸
解析：可通过PCR技术获取大量目的基因，A正确；引物结合在模板链的3′端，检测目的基因是否插入质粒且方向是否正确时，应选用引物2和引物4进行PCR，B错误；若设计的引物与模板不完全配对，可适当降低PCR复性的温度，以便引物与模板链结合，C错误；DNA聚合酶能与引物结合，并从引物的3′端连接脱氧核苷酸，D错误。
9．（2025·湖北荆州模拟）如图为构建苘麻抗除草剂基因A重组质粒的技术流程，其中Npt Ⅱ是卡那霉素抗性基因，GUS基因仅在真核细胞中表达，表达产物可催化底物呈蓝色。下列说法错误的是(　C　)
A．PCR扩增A基因时可在引物中加入Pst Ⅰ和Xho Ⅰ的酶切位点
B．在培养基中添加卡那霉素可初步筛选导入重组质粒的农杆菌
C．用农杆菌转化植物愈伤组织选择呈现蓝色的组织进行培养
D．启动子若为除草剂诱导型启动子，将减少细胞物质和能量浪费
解析：PCR扩增A基因后，为使A基因能与质粒结合形成重组质粒，需要在A基因的两侧加入相应的限制酶的酶切位点，即在引物中加入Pst Ⅰ和Xho Ⅰ的酶切位点，A正确；由图可知，卡那霉素抗性基因是标记基因，因此在培养基中添加卡那霉素可初步筛选导入重组质粒的农杆菌，B正确；由题可知，重组表达载体中不含GUS基因，因此不能选择呈现蓝色的组织进行培养，C错误；启动子若为除草剂诱导型启动子，使用除草剂才可诱导该基因表达，将减少细胞物质和能量浪费，D正确。
10．（2025·福建漳州模拟）幽门螺杆菌(Hp)感染会引发胃炎、消化性溃疡等多种疾病。研究人员将Hp的Ipp20基因作为目的基因，用限制酶Xho Ⅰ和Xba Ⅰ切割，通过基因工程制备相应的疫苗，质粒及操作步骤如图所示。下列相关叙述错误的是(　C　)
A.Ipp20基因整合到大肠杆菌的DNA中属于基因重组
B．基因表达载体导入之前，可用Ca2+处理大肠杆菌
C．培养基A中添加了氯霉素，培养基B中添加了潮霉素
D．能用来生产Hp疫苗的大肠杆菌在菌落3和5中
解析：基因重组是指控制不同性状的基因发生重新组合，主要发生在有性生殖过程中，但通过基因工程将不同来源的DNA进行拼接，可以赋予生物新的遗传特性，也属于基因重组的范畴，故利用基因工程将Ipp20基因整合到大肠杆菌的DNA中属于基因重组，A正确；原核细胞作为受体细胞时，可用Ca2+处理受体细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，更容易将基因表达载体导入其中，B正确；该过程使用了限制酶Xho Ⅰ和Xba Ⅰ切割质粒和Ipp20基因，结合图示可知，在构建目的基因表达载体的过程中氯霉素抗性基因被切割掉，保留了潮霉素抗性基因，不管是正常质粒还是重组质粒都含有潮霉素抗性基因，但只有正常质粒才同时含有氯霉素抗性基因和潮霉素抗性基因，因此，可以先用含有潮霉素的培养基A筛选出导入正常质粒、重组质粒的大肠杆菌，再采用同位影印的方法接种到含有氯霉素的培养基B中，此时含有重组质粒的大肠杆菌不能在含有氯霉素的培养基B上生长，从而与培养基A（对照）相比会消失一些菌落，对照两个平板上减少的菌落就是符合要求的大肠杆菌菌落，结合图示可知，符合要求的大肠杆菌菌落是3和5，C错误，D正确。
二、非选择题（共20分）
11．（10分）（2025·广东梅州开学考）半乳糖醇可作为新型甜味剂应用于糖果、面包等食品工业。酿酒酵母长期用于食品加工业，具有很强的食品安全性与大规模发酵能力。为构建酿酒酵母工程菌株生产半乳糖醇，回答下列问题：
(1)为将木糖还原酶基因（如图1）准确连接至pRS313质粒（如图2）内，需在引物1、2的5′端分别引入限制酶B、A的识别位点，经PCR扩增得到木糖还原酶基因。对目的基因和pRS313质粒进行限制酶B、A双酶切处理，目的是防止目的基因和质粒反向连接（或确保目的基因和质粒定向连接）和防止目的基因和质粒的自身环化。经酶切后的目的基因和质粒经DNA连接酶连接得到重组质粒（表达载体）。
　氨苄青霉素作用于细菌的细胞壁，抑制细菌细胞壁的合成。
(2)将重组质粒导入大肠杆菌（填“酿酒酵母”或“大肠杆菌”）中，采用稀释涂布平板法将菌液接种至含有氨苄青霉素的LB平板上进行筛选。挑取单菌落进行DNA测序，测序验证正确后，利用质粒提取试剂盒提取重组质粒。
(3)将重组质粒导入酿酒酵母时，需利用醋酸锂 Tris EDTA缓冲液 PEG共同处理酿酒酵母，其中EDTA的作用是抑制DNA酶的活性，防止导入细胞的重组质粒被破坏（被降解）。
(4)取各重组菌株制成等浓度的菌液，等量接种到含等量D－半乳糖的培养基中，发酵12 h后立即离心并分离沉淀和上清液以终止发酵。测定上清液中半乳糖醇的含量，比较各重组菌株单位时间内半乳糖醇的产量，结果表明导入黑曲霉木糖还原酶基因anxr的pRS313 anxr的工程菌株是优势菌株。这属于对个体性状（填“基因”“基因表达产物”或“个体性状”）的检测，检测时需以非转基因的酿酒酵母菌株作为阴性对照。
(5)pRS313 anxr工程菌株中D－半乳糖的代谢途径如图3，为进一步提高D－半乳糖转化为半乳糖醇的效率；研究者对工程菌中的半乳糖激酶基因进行敲除（去除），通过DNA测序筛选成功改造的菌株。据图分析，除木糖还原酶和半乳糖激酶外，限制半乳糖醇产量的因素还有NADPH的含量、D 半乳糖的转运（吸收）速率（写出2点即可）。
解析：(1)对目的基因和pRS313质粒进行限制酶B、A双酶切处理，目的是防止目的基因和质粒反向连接和防止目的基因和质粒的自身环化。经酶切后的目的基因和质粒经DNA连接酶连接得到重组质粒。(2)重组质粒导入大肠杆菌中进行扩增，采用稀释涂布平板法进行接种，筛选成功导入重组质粒的大肠杆菌。(3)EDTA可以抑制DNA酶的活性，防止导入细胞的重组质粒被破坏。(4)基因表达产物是木糖还原酶，因此检测半乳糖醇的产量属于对个体性状的检测，需要以非转基因的酿酒酵母菌株作为阴性对照。(5)由图可知，D 半乳糖在半乳糖激酶的催化下会转化为其他物质，降低半乳糖醇的产量，因此对工程菌的半乳糖激酶基因要进行敲除。由图可知，除了酶，限制半乳糖醇产量的因素还有NADPH的含量、D 半乳糖的转运速率等。
12．（10分）（2025·辽宁沈阳联考）研究表明，基因S参与水稻盐碱胁迫的应答过程，该基因过表达可降低水稻植株对盐碱胁迫的敏感性。现利用基因S获得过表达基因SP（由强启动子驱动S基因的编码区过表达），从而培育耐盐碱水稻新品种。回答下列问题：
(1)如图1所示，可利用PCR技术从水稻基因组DNA中扩增目的基因S，欲使获得的基因S两端携带限制酶识别序列，需要在引物的5′端添加。所用的引物越短，引物特异性越低（填“高”或“低”）。
(2)限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端。构建如图基因表达载体时，需用Sac Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切割目的基因和质粒，酶切后质粒上保留的黏性末端序列应为5′ AGCT 3′和5′ AATT 3′。潮霉素抗性基因和基因S转录时的模板链不是（填“是”或“不是”）同一条链。
(3)据信息可知，过表达基因SP由强启动子和基因S编码区（答出2部分即可）组成，重组载体通过农杆菌导入水稻细胞，可使用潮霉素筛选具有该抗生素抗性的水稻植株。
(4)已知水稻细胞中也存在基因S，由于含有普通启动子而无法高效表达，导致水稻无法耐盐碱。现获得有上述抗生素抗性水稻甲～丁，为进一步鉴定甲～丁的基因型，通过PCR技术将相应启动子与基因S整体扩增出来，应选择图2中的引物组合是C和D。部分序列信息及可选用的酶切位点如图3所示，PCR产物利用Kpn Ⅰ完全酶切后的电泳结果如图4所示。据图可判断甲的基因型为SPS。
解析：(1)图中目的基因可用PCR技术扩增，引物的3′端用于延伸合成子链，5′端可以添加限制酶识别序列。所用的引物越短，引物特异性越低。(2)据图1目的基因两侧的限制酶识别序列可知，应选用Sac Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切割目的基因和质粒。Sac Ⅰ切割后形成的黏性末端序列为5′ AGCT 3′，EcoR Ⅰ切割后形成的黏性末端序列为5′ AATT 3′。潮霉素抗性基因和基因S的启动子方向相反，说明转录的方向相反，转录的模板链方向均为3′端→5′端，因此潮霉素抗性基因和基因S转录时的模板链不是同一条链。(3)过表达基因需要前面连接强启动子。Ti质粒中只有T DNA才能整合到水稻细胞染色体DNA上，即在标记基因中只有潮霉素抗性基因能随之整合，因此选择潮霉素筛选具有该抗生素抗性的水稻植株。(4)要把相应启动子和基因S整体扩增，而引物结合在模板链的3′端，因此选择的引物组合为C和D。基因S由普通启动子和基因S编码区等构成，其部分碱基序列为
5′…GCAATTGGCCTACCCACCTGACGAATCCAA…3′，基因SP由强启动子和基因S编码区等组成，其部分碱基序列为
5′…GCAATTGGCCTAGGTACCTGACGAATCCAA…3′。同时扩增后，基因SP中含有Kpn Ⅰ的酶切位点，酶切后形成两条较小的条带，即图4的下面两条，而基因S中没有Kpn Ⅰ的酶切位点，酶切后形成一个条带，位于最上方。因此甲、丙的基因型均为SPS，乙、丁的基因型为SPSP。

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