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　PCR及电泳
【典题引领】　（2024·山东卷）研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L，可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaⅠ切点处插入大豆基因L的向导DNA序列，将载体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图所示。
　N代表任一碱基。
(1)用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时，所用的引物越短，引物特异性越低（填“高”或“低”）。限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaⅠ酶切大豆基因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有256种。载体信息如图甲所示，经BsaⅠ酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5′ GTTT 3′和5′ CAAT 3′。
(2)重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用抗生素卡那霉素筛选到具有该抗生素抗性的植株①～④。为了鉴定基因编辑是否成功，以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙所示，PCR产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是SacⅠ，其中纯合的突变植株是④（填序号）。
(3)实验中获得1株基因L成功突变的纯合植株，该植株具有抗生素抗性，检测发现其体细胞中只有1条染色体有T DNA插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代，其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例为1/4，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。
解析：(1)引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，用于PCR的引物长度通常为20～30个核苷酸。在利用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目的基因时，所用的引物越短，则引物的特异性就越低。根据题意可知，限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用Bsa Ⅰ酶切大豆基因组DNA，图中给出的只是载体信息，大豆基因组无法从图中看出，只能根据理论来推测，Bsa Ⅰ切割产生的黏性末端是NNNN，四个碱基最多可能有256种排列顺序。根据图甲所示的载体信息，经Bsa Ⅰ酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5′ GTTT 3′和5′ CAAT 3′。(2)根据图示信息可知，重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，其中的片段包含了卡那霉素抗性基因，因此可以通过使用卡那霉素筛选到具有该抗生素抗性的植株。分析图乙和图丙可知，目标序列中含有限制酶BamHⅠ和EcoRⅠ的识别序列，突变序列中含有限制酶BamHⅠ、EcoRⅠ和SacⅠ的识别序列，再结合电泳结果分析可知，选用的是限制酶SacⅠ切断PCR产物，根据电泳结果图可知，①和③表示杂合子，②表示纯合抗性植株，④表示纯合的突变植株。(3)根据题意可知，在实验当中获得了1株基因L成功突变的纯合植株，已知该植株具有抗生素抗性，经过检测发现其体细胞中只有1条染色体有T DNA插入。根据图示可知，抗生素抗性基因在T DNA片段上，其配子中含有抗生素抗性基因的比例为1/2，不含T DNA（对抗生素敏感）的配子比例为1/2，因此如果用抗生素来筛选该植株的自交子代，突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例应该为1/2×1/2＝1/4，突变位点纯合且具有抗生素抗性的植株所占比例应该为3/4，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。
PCR类型大汇总和电泳结果分析
1．RT－PCR：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，利用引物和逆转录酶逆转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增，从而获得目的基因或检测基因表达。RT－PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能，某些病毒的核酸检测就是依据此原理进行的。
2．实时PCR是一种定量测定样品中特定DNA片段的聚合酶链式反应（如图所示）。反应中一般使用带有荧光标记的PCR引物，从而能够通过荧光监测每次PCR循环后扩增所得的产物的量。通过连续监测下获得的反应动力学曲线，可推导出样品中模板DNA的初始含量。
3．重叠延伸PCR是一种PCR定点突变技术。该技术要使用四条引物（如图所示），其中引物2和3的突起处代表与模板链不能互补的突变位点，而这两条引物有部分碱基（包括突变位点）是可以互补的。因此，分别利用引物1和2、引物3和4进行PCR后，得到的DNA片段可以通过引物2和3互补的碱基杂交在一起，再在DNA聚合酶的作用下延伸，就能成为一条完整的DNA片段。最后，用引物1和4进行扩增得到含有突变位点的DNA片段。
4．大引物PCR也是一种PCR定点突变技术，该技术需要用到三条引物进行两轮PCR，这三条引物分别是突变上游引物、常规上游引物和常规下游引物。该技术的流程（如图所示）。第一轮PCR利用突变上游引物和常规下游引物进行扩增，得到不完整的含有突变位点的DNA片段；第二轮PCR利用第一轮扩增产物中的一条DNA链作为下游大引物，它与常规上游引物一起扩增得到完整的含有突变位点的DNA片段。
5．巢式PCR是一种变异的聚合酶链式反应（如图所示），使用两对（而非一对）PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。第二对引物称为巢式引物（因为它们在第一次PCR扩增片段的内部），结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。巢式PCR的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片段，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低，巢式PCR的扩增特异性更强。
6．电泳结果分析：成功的DNA片段扩增应该产生与预期大小一致的DNA片段，如图中泳道2和3都产生了目标DNA，说明扩增成功。若出现与预期不一致的结果，可尝试从以下方面分析：
(1)未出现扩增条带可能的原因：模板DNA含有杂蛋白或热稳定DNA聚合酶的抑制剂；热稳定DNA聚合酶失活；引物出现质量问题，浓度不合适；Mg2+浓度过低；变性温度低，变性时间短；目的序列变异等。
(2)出现非特异性扩增条带（如图中泳道3）可能的原因：模板DNA出现污染；热稳定DNA聚合酶出现质量问题；引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或形成引物二聚体；Mg2+浓度过高；复性时的温度过低等。
情境练7
（总分：30分）
一、选择题（每小题4分，共20分）
1．（2024·重庆渝北区一模）反转录PCR又称逆转录PCR(RT PCR)，是以mRNA为模板进行的特殊PCR，过程如图。下列相关叙述错误的是(　C　)
A．图示过程需要控制温度，否则可能得不到产物
B．RT PCR技术中，不需要已知mRNA的全部序列
C．过程③中子链沿着模板链的5′端→3′端方向延伸
D．RT PCR技术可应用于是否被RNA病毒感染的检测
解析：图示过程需要控制温度，如变性解旋时温度需要控制在90 ℃以上，A正确；RT PCR技术中，不需要已知mRNA的全部序列，只需一段已知mRNA的部分序列即可，B正确；过程③中，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3′端开始延伸DNA链，即子链沿着模板链的3′端→5′端方向延伸，C错误；RT PCR是将RNA的逆转录和cDNA的聚合酶链式扩增相结合的技术，可应用于是否被RNA病毒感染的检测，D正确。
2．（2025·湖北武汉模拟）常规PCR只能扩增两引物间的DNA区段，要扩增已知DNA序列两侧的未知DNA序列，可用反向PCR技术。反向PCR技术扩增的原理如图所示。下列叙述错误的是(　D　)
A．酶切阶段，已知序列L中不能含有酶切时所选限制酶的识别序列
B．环化阶段，可选用E.coli DNA连接酶或T4 DNA连接酶
C．图中引物应选择引物1和引物4，且二者间不能互补配对
D．该PCR扩增每轮循环前应加入限制酶将环状DNA切割成线状
解析：在酶切阶段，已知序列L中不能含有酶切时所选限制酶的识别序列，不然会将已知序列L切断，造成序列识别混乱，A正确；T4 DNA连接酶或E.coli DNA连接酶都可以用来连接黏性末端，因此环化阶段，可选用E.coli DNA连接酶或T4 DNA连接酶，B正确；PCR过程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3′端通过碱基互补配对的方式结合，为保证延伸的是已知序列两侧的未知序列，应该选择引物1和引物4，且二者间不能互补配对，C正确；该PCR扩增只需要第一次循环前加入足够的限制酶，并不需要每轮循环前都加入，D错误。
3．（2025·河北邢台模拟）巢式PCR是一种特殊的聚合酶链式反应，使用两组不同的引物实现目标DNA片段的扩增。第一组外引物扩增出的DNA片段（中间产物）长度超出目标区域，第二组内引物称为巢式引物，其结合部位在中间产物内部的目标区域，从而扩增出目标产物，具体过程如图所示。下列说法错误的是(　C　)
A．巢式PCR的两轮扩增中所需的两对引物不同，但原料和酶相同
B．DNA的合成总是从子链的5′端向3′端延伸与耐高温的DNA聚合酶的作用有关
C．用内引物进行PCR时，扩增n次后理论上需要2n－2个引物
D．巢式PCR技术相较于传统PCR技术增强了扩增产物的特异性
解析：第一轮PCR所用引物为外引物，第二轮PCR所用引物为内引物，两次所用原料均为dNTP（四种游离的脱氧核苷酸），酶均为耐高温的DNA聚合酶，A正确；耐高温的DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从引物的3′端延伸子链，B正确；PCR为体外DNA复制，每合成一条子链即需要一个引物，扩增n次后一共有2n个DNA，新合成了2n×2－2＝2n+1－2条新链，即需要2n+1－2个引物，C错误；巢式PCR可增强扩增产物的特异性，因为如果利用外引物扩增产生了错误片段，则内引物能在错误片段上进行配对的概率低，D正确。
4．（2025·江西南昌模拟）不对称PCR是利用不等量的一对引物来产生大量单链DNA(ssDNA)的方法。加入的一对引物中含量较少的被称为限制性引物，含量较多的被称为非限制性引物。PCR反应的最初的若干次循环中，其扩增产物主要是双链DNA(dsDNA)，但当限制性引物消耗完后，就会产生大量的ssDNA。不对称PCR的简单过程如图所示。假设模板DNA分子初始数量为a个，6次循环后开始扩增产生ssDNA。下列叙述错误的是(　D　)
A．限制性引物和非限制性引物均需要依据模板DNA的碱基序列来设计
B．据图可知，最后大量获得的ssDNA与图中甲链的碱基序列相同
C．该不对称PCR过程中需要(26－1)a个限制性引物
D．上述过程中子链分别沿限制性引物的5′端、非限制性引物的3′端延伸
解析：PCR扩增时需要已知目的基因两侧的碱基序列来设计引物，因此限制性引物和非限制性引物均需要依据模板DNA的碱基序列来设计，A正确；非限制性引物与乙链结合，最后大量获得的ssDNA与图中甲链的碱基序列一致，B正确；PCR扩增时引物是新子链的一部分，假设模板DNA分子初始数量为a个，6次循环后产生26个DNA分子，因此该不对称PCR过程中需要(26－1)a个限制性引物，C正确；扩增时耐高温的DNA聚合酶将4种脱氧核苷酸连接至引物的3′端，D错误。
5．重组PCR技术是一项新的PCR技术，通过重组PCR技术能将两个不同的DNA连接成为一个新DNA分子。某科研小组从猪源大肠杆菌中扩增得到LTB和ST1两个基因片段，利用重组PCR技术构建了LTB－ST1融合基因，制备过程如图1所示。图2是PCR扩增后的电泳结果，据图判断下列说法错误的是(　B　)
A．LTB和ST1基因能够融合的关键之一是引物P2、P3的部分区域能进行碱基互补配对
B．PCR扩增时，完整的引物P2、P3应位于子链的3′端才能保证扩增顺利进行
C．图1中②过程的反应体系中不用额外加入引物
D．LTB ST1融合基因最可能是图2中的条带3
解析：LTB和ST1基因能够融合的关键是P2和P3两种引物的部分区域能发生碱基互补配对，A正确；DNA的合成方向是从子链的5′端向3′端延伸的，因此PCR扩增时，完整的引物P2、P3应位于子链的5′端才能保证扩增顺利进行，B错误；②过程不需要加入引物，两条母链的起始段位置的碱基序列可以作为子链合成的引物，C正确；电泳时DNA的迁移速率主要受核酸片段长度影响，核酸片段长度越长，则迁移速率越慢，LTB ST1融合基因相对LTB、ST1基因核酸片段长度大，故最可能是图2中的条带3，D正确。
二、非选择题（共10分）
6．（10分）（2025·湖南岳阳模拟）t PA蛋白是心梗和脑血栓的急救药。为心梗患者注射大剂量的t PA蛋白会诱发颅内出血。将t PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，能显著降低出血副作用。图1是通过两次PCR操作进行定点突变获取t PA改良基因和利用质粒pCLYⅡ构建含t PA改良基因的重组质粒，然后导入大肠杆菌生产改良的t PA蛋白。回答下列问题：
(1)第二次PCR过程中至少需要2次循环才能获得双链等长t PA改良基因。若t PA改良基因的转录模板链为图中的β链，则第二次PCR操作中的引物3、引物4分别是BE。（填字母）
A．5′ CGCGAAAGAGACGGTTCA 3′（下划线为突变碱基）
B．5′ ACCCGGGCGAACATCGTA 3′
C．5′ GTAGATCTGGCCTCGAGTA 3′
D．大引物的①链
E．大引物的②链
(2)用含有新霉素的培养基培养大肠杆菌，从作用上分类该培养基属于选择培养基；该培养基的基本营养成分包括水、无机盐、氮源、碳源。
(3)改良的t PA基因约有1 600个碱基对。提取大肠杆菌的DNA，依据改良t PA基因的序列设计引物，进行PCR扩增。结果如图2所示：加样孔位于甲（填“甲”或“乙”）端。由图2可知泳道1条带中的PCR产物长度为1 600个碱基对左右，说明PCR产物不一定（填“一定”“不一定”或“不”）是改良的t PA基因，理由是PCR产物电泳结果不能说明产物的碱基对序列与t PA基因一致。
解析：(1)t PA改良基因的转录模板链为图中的β链，由图可知，引物2是为了引入突变位点，引物1是为了加入Bgl Ⅱ酶切位点（ATCT），故第一次PCR操作获得的大引物既有突变位点又有Bgl Ⅱ酶切位点。进行第二次PCR时，利用引物3，可再次加入Xma Ⅰ酶切位点（CGGG），故在题述引物中，第二次PCR操作中使用的引物有B，另外一种引物4是E（大引物的②链）。(2)研究人员将重组质粒导入大肠杆菌中，质粒上的标记基因是新霉素抗性基因，转化后的大肠杆菌需接种在含新霉素的培养基上进行筛选。筛选大肠杆菌的培养基从作用上分类，属于选择培养基。该培养基的基本营养成分包括水、无机盐、氮源、碳源。(3)分析电泳图可知，分子量越大，迁移速度越慢，离加样孔越近，所以加样孔位于甲端；由图2可知，泳道1条带中的PCR产物长度为1 600个碱基对左右，与预期相符；但PCR产物的电泳结果不能说明产物的碱基对序列与t PA基因一致，因此PCR产物不一定是改良的t PA基因。

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